JP4109559B2 - オリゴヌクレオチドとポリエチレンオキシドのコンジュゲート - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学、薬剤学の分野で有用なオリゴヌクレオチドの誘導体、より具体的には各種環境下で安定に存在しうるオリゴヌクレオチドのコンジュゲートに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子を生体内の標的部位へ送達するためのキャリアとして、改変レトロウイルス、改変アデノウイルス等に加えて、安全性の観点から、合成キャリア、例えば、カチオニックリポソーム、膜融合リポソーム、ポリカチオン（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリ−Ｌ−リジン、キトサン）、ポリカチオン含有ブロックコポリマー等の使用が検討されてきた。就中、片岡を初めとする本発明者の一部により提案されたポリイオンコンプレックスミセル（ＰＩＣミセル）を利用するＤＮＡの送達系は、一般的に、薬物内包ミセルの安定性、標的細胞もしくは組織内への移行性、組織内での薬物の安定性が良く、期待されうる送達系である（例えば、非特許文献１、同２、特許文献１参照。）。より具体的には非特許文献１にはポリ（エチレンオキシド）−block−ポリリジンをプラスミドＤＮＡのキャリアとして用いた場合の動物の組織または細胞への移行性等が、同２にはポリ（エチレンオキシド）−block−ポリ［メタクリル酸２−（Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチル）］がプラスミドＤＮＡの好ましいキャリアになりうることが、そして特許文献１にはポリ（エチレンオキシド）−block−ポリ（エチレンイミン）も、上記のものと同様なキャリアとして機能することが記載されている。
【０００３】
しかしながら、低分子ＤＮＡはＰＩＣミセルに内包した場合、ＤＮＡそれ自体または薬物内包ミセルの安定性が充分でないこともある。このようなミセルの安定化を図る目的で、ポリカチオン性ポリマー鎖間で−ＳＳ−結合を形成することも提案されている（特許文献２参照）。具体的には、特許文献２には非特許文献１に記載されているようなポリ（ポリエチレンオキシド）−block−ポリ（リジン）のリジン残基中にメルカプトアルキル基を導入し、かようなメルカプト基を介してポリマー鎖間でジスルフィド結合（−ＳＳ−）を形成することにより、ＰＩＣミセルの安定化が図られている。なお、こうして形成された−ＳＳ−結合は、動物細胞中に存在することが知られているグルタチオン等により開裂されうることが記載されている。
【０００４】
【非特許文献１】
Kataoka et al. Macromolecules ２９（１９９６）８５５６〜８５５７
【０００５】
【非特許文献２】
Kataoka et al. Macromolecules ３２（１９９９）６８９２−６８９４
【０００６】
【特許文献１】
特開２００１−０４８９７８号公報
【０００７】
【特許文献２】
特開２００１−１４６５５６号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、限定されるものでないが、特に、オリゴＤＮＡを初めとする修飾されていてもよいオリゴヌクレオチドの安定な送達系を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、修飾されていてもよいオリゴヌクレオチドをポリ（エチレンオキシド）に共有結合させたコンジュゲートとすることにより、従来の高分子量ＤＮＡのキャリアとの複合体［コンプレックス（イオンコンプレックス、カチオニックリポソーム、ＰＩＣミセル等）］として安定に存在し得、しかも、オリゴヌクレオチドそれ自体も動物の組織もしくは細胞内での安定性が向上することを見出した。また、このようなコンジュゲートは本発明者らの知る限り、文献未載の化合物である。
【００１０】
したがって、本発明によれば、下記の一般式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドとポリエチレンオキシドのコンジュゲートが提供される。
【００１１】
Ａ−Ｌ1−Ｌ2−ＰＥＧ （Ｉ）
式中、Ａはリボースの３′もしくは５′ヒドロキシル基末端においてリン酸エステル結合を介して−Ｌ1−Ｌ2−ＰＥＧに結合した修飾されていてもよいオリゴヌクレオチドの残基を表し、
Ｌ1は酸素原子もしくは硫黄原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基を表し、そして
Ｌ2は連結基を表し、そして
ＰＥＧは末結合末端に、連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンドの残基を担持するポリ（エチレンオキシ基）を表す。
【００１２】
また、本発明によれば、このようなコンジュゲートの生体内送達内のキャリアに担持もしくは内包させるための使用、例えば、該コンジュゲートとポリカチオンの複合体も提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明にいうオリゴヌクレオチドは、所謂、「オリゴ」が意味する数個から１０数個のヌクレオチドからなるものに限定されず、最大、１００個までのヌクレオチドからなるものも包含する。
【００１４】
また、各ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の向きは、通常、３′→５′もしくは５′→３′であるが、ヌクレオチドの種類によっては、２′→５′もしくは５′→２′であってもよく、また、これらの結合様式が混在していてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを構成するいずれのものであってもよい。
【００１５】
「修飾されていてもよい」とは、天然のＤＮＡまたはＲＮＡにみられる各ヌクレオチドの塩基におけるアミノ基のアルキル化、アシル化、またはヒドロキシル基による置換、リン酸ジエステル結合に関与しないリボースのヒドロキシル基（例えば、２′−ＯＨ）のアルキル化等によって修飾されていてもよいことを意味する。さらに、糖残基またはペプチジル（アミノ酸残基）により、−Ｌ1−Ｌ2−ＰＥＧに結合した末端と反対側の末端のヒドロキシル基を介して、あるいは末端もしくはリン酸ジエステル結合を有するヌクレオチドの塩基もしくはリボース部位が修飾されているオリゴヌクレオチドも、本発明にいうオリゴヌクレオチドに包含される。限定されるものでないが、本発明で用いることを意図しているオリゴヌクレオチドの例としては、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、３′末端をＳＨ化したドーパミンＤ２受容体アンチセンスＤＮＡが挙げられる。
【００１６】
このようなオリゴヌクレオチドには、通常のＤＮＡおよびＲＮＡの方向付けに基づいて、３′末端側（すなわち、リボースの５′位はリン酸ジエステル結合に関与している。）の３′ヒドロキシル基か、または５′末端側（すなわち、リボースの３′位はリン酸ジエステル結合に関与している。）の５′ヒドロキシル基を介するリン酸エステル結合を形成するように式−Ｌ1−Ｌ2−ＰＥＧで表される基が結合している（なお、本発明において「結合」という場合、特記しない限り共有結合を意味する。）。
【００１７】
該式中のＬ1は、酸素原子もしくは硫黄原子、好ましくは酸素原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基であることができる。このようなアルキレン基は、分岐していてもよく、したがって、限定されるものでないが、
【００１８】
【化１】
【００１９】
等が例示される。
【００２０】
Ｌ2は連結基を表し、本発明の目的に沿う限り、Ａ−Ｌ1部とＰＥＧ部とを連結しうるいかなる基、例えば、アルキレン基（上記の例示を参照。）、アリレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯ−ＮＨ−、−ＳＯ−から選ばれる１種以上からなるものであってもよい。限定されるものでないが、Ｌ2の例としては、−ＳＳ−、−ＳＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯ−、−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ−、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ−、−ＳＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＣＨ2−、−ＳＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ−が挙げられる。このような連結基のうち、生理学的条件下（動物の組織、細胞、体液等に含まれるペプチダーゼ、エステラーゼ、還元性物質等の存在下）で開裂されうる基、例えば−ＳＳ−基、−ＣＯＯ−もしくは−ＯＣＯ−基を連結基内に少なくとも１個含むものが好ましい。
【００２１】
−ＰＥＧは未結合末端（Ｌ2との結合末端のもう一方の末端）に連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンドの残基を担持するポリ（エチレンオキシド）基を表す。具体的には、−ＰＥＧは、式（ＩＩ）
−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−Ｌ3−Ｘ （ＩＩ）
式中、Ｌ3は上記のＬ2について定義したのと同様な連結基または単結合であり、Ｘは水素原子もしくは、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル等）、アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル等）、ヒドロキシル基、アルデヒド（もしくはホルミル基：−ＣＨＯ）、アセタール化ホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基（なお、「保護された」と称する場合の保護基は、限定されるものでないが、ペプチド合成で慣用されるアミノ基およびカルボキシル基に対する保護基を意味する。）からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンド（例、ビオチン、ハプテン、ホルモン、酵素の基質等）の残基であり、
ｎは５〜５００の整数である、
で表されるポリ（エチレンオキシド）基である。
【００２２】
式（ＩＩ）または−Ｌ2−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−Ｌ3−Ｘをもたらすポリ（エチレンオキシド）誘導体は、本発明者らの一部によって提案されたヘテロテレケリック親疎水性ブロックコポリマーを製造する際の、中間段階である、ポリ（エチレンオキシド）セグメントの形成に従って（例えば、ＷＯ ９６／３３２３３、ＷＯ ９６／３２４３４、ＷＯ ９７／０６２０２、前述の特許文献１および２参照。）、または必要により、それらに当業技術分野で周知の技法を加えて製造することができる。
【００２３】
限定されるものでないが、典型的なポリ（エチレンオキシド）誘導体の製造法は次に示す反応スキームに従って実施できる。
スキーム１：
【００２４】
【化２】
【００２５】
スキーム２：
【００２６】
【化３】
【００２７】
なお、以上の反応スキームに示す各反応段階の条件は、前述の特許文献１および国際公開パンフレットを参照できる。
【００２８】
次に、一般式（Ｉ）におけるＬ2に−ＳＳ−結合または−ＣＯＯ−結合を有するオリゴヌクレオチドとポリエチレンオキシドのコンジュゲートは、例えば、次に示す反応スキームに従って製造できる。
スキーム３：
【００２９】
【化４】
【００３０】
スキーム４：
【００３１】
【化５】
【００３２】
ｏｌｉｇｏ−ＮＴ：
【００３３】
【化６】
【００３４】
Ｘ：水素またはヒドロキシル基
Ｂ：各種塩基の残基
Ｒ：水素または修飾基
ｍ：１０〜１００
こうして製造される本発明に従うコンジュゲートは、必要により、さらにリガンドを付する反応に供してもよい。例えば、（ｆ）または（ｇ）で表されるコンジュゲートのアセタール化ホルミル基［(ＣＨ3ＣＨ2Ｏ)ＣＨ−］を酸加水分解に供してホルミル基（−ＣＨＯ）に転化し、次いで、必要によりアミノ基を導入したリガンドとの反応により、リガンドを導入することもできる。
【００３５】
以上に従って提供されるコンジュゲートは、例えば、非特許文献１または２、特許文献１に記載されるようなポリ（エチレンオキシド）−block−ポリ（リジン）、ポリ（エチレンオキシド）−block−ポリ［メタクリル酸２−（Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチル）］、ポリ［エチレンオキシド）−block−ポリ（エチレンイミン）等を用い、それらに記載されたＤＮＡの内包ＰＩＣミセルの形成法に従って、該コンジュゲート内包ＰＩＣミセルを提供できる。また、本発明に従うコンジュゲートは、上記のようなブロックコポリマーのみならず、ポリカチオン（例えば、上記のブロックコポリマーのカチオン形成可能なセグメント、またはオリゴーもしくはポリアルギニン、ｔａｔ、ＫＡＬＡを含有するオリゴマーまたはホモポリマー）との複合体またはイオンコンプレックス、カチオニックリポソーム内へ封入したコンプレックとしても提供できる。
【００３６】
かようなコンジュゲート内包ＰＩＣミセルは、ミセルも比較的安定である。
【００３７】
【実施例】
本発明を具体例を挙げてさらに具体的に説明する。
製造例１：アセタール−ＰＥＯ−アクリレートの製造
【００３８】
【化７】
【００３９】
アルゴン下、ナスフラスコ中、室温において、開始剤３,３−ジエトキシ−１−プロパノール１.０ｍｍｏｌ（０.１６ｍｌ）を溶媒テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２５ｍｌにマイクロシリンジで加え、Ｋ−ナフタレン１.０ｍｍｏｌ（０.３２５ｍｏｌ／１−ＴＨＦ溶液、３.１ｍｌ）を加えて１０分間メタル化を施した。次いで、エチレンオキシド１１０ｍｍｏｌ（５.５ｍｌ）を加えて水冷下で２日間撹拌し、アニオン開環重合を行った。その後、トリエチルアミンを３倍モル量３.０ｍｍｏｌ（０.４２ｍｌ）と停止剤としてアクリロイルクロライドを３倍モル量３.０ｍｍｏｌ（０.２４ｍｌ）を順次加え、室温において１日停止反応を行った。その後、２−プロパノール沈澱（２ｌ）、遠心分離（５０００×ｇ、４５分間）、減圧乾燥、ベンゼン凍結乾燥により精製を行った。この生成物の収量は５.０ｇ（９８％）であった。
【００４０】
ゲルパーミエーションクロマトグラフィーの測定により、得られたポリマーは単峰性であり、その数平均分子量は４８３０であり、仕込み分子量５０８０とほぼ一致していた。
【００４１】
同様にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）の測定においても、得られたポリマーは単峰性であり、その数平均分子量は４４６０であった。また、これらのピークの測定値と計算値を比較した結果、このポリマーはエチレンオキシド骨格を主鎖に有し、α−末端にアセタール基、ω−末端にアクリレート基を有するヘテロテレケリックポリエチレンオキシドであることが確認された。
【００４２】
さらに、得られたポリマーの重ＤＭＳＯ中での 1Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）スペクトルより、このポリマーの平均分子量は４８７０と計算された。またこのポリマーはエチレンオキシド骨格を主鎖に有し、α−末端にアセタール基、ω−末端にアクリレート基を有するヘテロテレケリックポリエチレンオキシドであることが確認された。
【００４３】
実施例１：オリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートの製造
【００４４】
【化８】
【００４５】
オリゴＤＮＡ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ １.３４μｍｏｌ（８.１ｍｇ）と３０倍モル量のアセタール−ＰＥＯ−アクリレート４０.２μｍｏｌ（１９４.８ｍｇ）を試験管に加え、アルゴン置換を行った。次いで、ｐＨ８に調整した蒸留水３００μｌをマイクロシリンジで加え室温において６時間撹拌し、マイケル付加反応を行った。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、オリゴＤＮＡの消費とオリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートの生成を確認し、凍結乾燥により粗生成物を２０３.２ｍｇ得た。その後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ １０／１０）による分取、純水に対する透析（区画分子量３５００、１、２、４、６、８、１２時間後に水を交換）を１日行うことで精製を行った。この生成物の収量は６.１ｍｇ（４２％）であった。
【００４６】
ゲルパーミエーションクロマトグラフィーの測定により、得られたポリマーは単峰性であり、その数平均分子量は９９１０であり、理論分子量１０８６０とほぼ一致していた（図１参照）。
【００４７】
さらに、得られたポリマーのＤ2Ｏ中での 1Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）スペクトルより、α−末端にアセタール基を有し、主鎖がエステル結合を介しエチレンオキシド骨格と核酸骨格からなるオリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートであることが確認された（図２参照）。
製造例２：アセタール−ＰＥＧ−ＯＳＯ2ＣＨ3の製造
アルゴン下、ナスフラスコ中において、脱水溶媒ＴＨＦ３０ｍＬに開始剤３,３−ジエトキシ−１−プロピルアルコール０.１６ｍＬ（１ｍｍｏｌ）を加えた。そして、カリウムナフタレン等モル量を用いてアルコキシドを形成させた後、エチレンオキシド７.０ｍＬ（１４０ｍｍｏｌ）を加え２日間室温下で重合した。そして、トリエチルアミン１.２５ｍＬ（９ｍｍｏｌ）とカリウムナフタレン０.５ｍｍｏｌをポリマー溶液に加えた。さらに、停止反応として、メタンスルホニルクロリド０.５４ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦに溶解させたところへ、このポリマー溶液を滴下することによって、停止末端へのメタンスルホニル基の導入を行った。その後、クロロホルムと飽和食塩水にて抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムを用いて脱水した。ロータリーエバポレーターにて濃縮後、エーテル再沈、吸引ろ過にてポリマーを回収し、最後にベンゼン凍結乾燥にて白色のポリマーを得た。
製造例３：アセタール−ＰＥＧ−Ｓ(Ｃ＝Ｓ)ＯＣＨ2ＣＨ3の製造
減圧乾燥したＯ−エチルジチオ炭酸カリウムに脱水ＴＨＦ７５ｍＬとＤＭＦ１.５ｍＬを加え撹拌した。そして、この溶液を同じく減圧乾燥させたアセタール−ＰＥＧ−ＯＳＯ2ＣＨ3 １.５５ｇ（Ｍn６１００）に加えて、室温にて４時間反応させた。その後、クロロホルムと飽和食塩水にて抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムを用いて脱水した。ロータリーエバポレーターにて濃縮後、エーテル再沈、吸引ろ過にてポリマーを回収し、最後にベンゼン凍結乾燥にて白色のポリマーを得た。
製造例４：アセタール−ＰＥＧ−ＳＳｐｙｌの合成
脱水ＴＨＦ中にアセタール−ＰＥＧ−Ｓ(Ｃ＝Ｓ)ＯＣＨ2ＣＨ3 １６０ｍｇと２−ピリジルジスルフィド５８６ｍｇ（１００倍モル量）を溶解させたところへ、ｎ−プロピルアミン３.５ｍＬ（１.４ｍＭ）を加えて室温下３時間反応させた。そして、上記の精製法を二回繰り返してベンゼン凍結乾燥させた。
【００４８】
実施例２：
（１） オリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートと直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）からなるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルの製造。
【００４９】
オリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲート３.０ｍｇを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ７.４）に溶解させた後、０.１・ｍのフィルターで濾過しゴミを除いた。次に、この溶液をＥｘＧｅｎ５００（直鎖状ＰＥＩ）の正電荷とオリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートの負電荷の比が１となるように添加した。さらに、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ７.４、０.３Ｍ Ｎａｃｌ）を混合溶液と同量加え、６時間静置しＰＩＣミセルを形成させた。
【００５０】
得られたＰＩＣミセルの粒径および粒径分布は、動的光散乱測定法（ＤＬＳ）によって評価した。ＤＬＳ測定より、ＰＩＣミセルの粒径の分布は単峰性であり、分布の程度も比較的狭いことが示された（ｄw／ｄn＝１.１３）。また、ＰＩＣミセルの平均粒径は１０２.５ｎｍであった（図３参照）。
（２） 弱酸性条件下におけるＰＩＣミセルの加水分解（エステル結合の切断）上記で得られたＰＩＣミセルをｐＨ５.５に調整し、所定時間ごとにサンプリングしゲルろ過クロマトグラフィー（Superose ６ ＨＲ）を測定した（図４参照）。ｐＨ５.５の酸性条件下におけるゲルろ過クロマトグラフィーは、時間経過と共にＰＩＣミセルのピークが底分子量側にシフトし、それに伴いＰＥＯのピークが現れた。また、４時間後には沈殿物が系内に確認された。一方、ｐＨ７.４の条件下では、ＰＩＣミセルは安定に存在していることが明らかとなった。このように、オリゴＤＮＡとＰＥＯのつなぎ目にあるエステル結合がｐＨの変化により切断されることが明らかとなった。
製造例５：オリゴＤＮＡ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨの製造
実施例１で用いたオリゴＤＮＡ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨは、次のような機器、操作を用いることにより製造できる。
（ａ） ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機：Applied biosystem ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ
Synthesizer
（ｂ） 合成プロトコール：２−Ｎ−イソブチリルデオキシグアノシン、６−Ｎ−ベンゾイルデオキシアデノシン、４−Ｎ−ベンゾイルデオキシシチジン、およびデオキシチミジンの５′−Ｏ−ジメチルトリチル、３′−Ｏ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホオスホロアミダイト）体を利用する標準プロトコール
（ｃ） 合成カラム：３′−thiolmodifierＣ３−ＳＳＣＰＧカラム（GlenResea rch 社）１マイクロモルカラム
なお、オリゴヌクレオチドのカラムからの切り出しと脱保護は、該ＣＰＧカラムから固相単体を取り出し、密閉容器中、２８％アンモニア水中５５℃で約４時間加熱し、合成オリゴヌクレオチドのカラムからの切り出しとアミノ基の脱保護を行った。こうして得られたオリゴヌクレオチドの精製は、下記のＨＰＬＣ条件で行い、保持時間約２０分付近のピークを単離した。単離された画分を凍結乾燥に供し溶媒を留去した。
【００５１】
カラム：nacalai tesque ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ（４.６×２５０ｍｍ）
溶 媒：Ａ：Ｏ．１ＭＴＥＡＡバッファー Ｂ：ＣＨ3ＣＮ
Ｂ１Ｏ％→４０％／２０分、４０％→１００％／３０分［直線的濃度勾配（linear gradient）］
流 速：１.０ｍｌ／分
ＵＶ−検出：２５４ｎｍ
次に、オリゴヌクレオチドの５′−Ｏ−ジメトキシトリチル基の脱保護は、１０％酢酸水溶液に精製オリゴヌクレオチドを溶解し、室温で約１時間放置後することにより実施し、次いで上記のＨＰＬＣ条件で保持時間約１４分のピークを単離し精製した。
【００５２】
精製後凍結乾燥により溶媒を留去した。
【００５３】
最後に、チオール基保護基の脱保護は、６０ｍＭジチオスレイトールの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）に精製オリゴヌクレオチドを溶解し、室温で約１時間放置することにより実施した。上記のＨＰＬＣ条件で保持時間約１４分のピークを単離し精製した。次いで、精製後凍結乾燥により溶媒を留去することにより目的のオリゴヌクレオチドを得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴＤＮＡとアセタール−ＰＥＯ−アクリレートの反応溶液（ａ：反応前、ｂ：反応後）およびオリゴＤＮＡ−ＰＥＯ−コンジュゲート（ｃ）のゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる測定結果である。
【図２】オリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートの 1Ｈ−ＮＭＲによる測定結果である。
【図３】オリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートと直鎖状ＰＥＩとからなるＰＩＣミセルのＤＬＳによる測定結果である。
【図４】ｐＨ５.５と７.４におけるＰＩＣミセルの時間経過ごとのゲルろ過クロマトグラフィーの結果である。（Ａ）および（Ｂ）はそれそれｐＨ５.５およびｐＨ７．４におけるＰＩＣミセルの加水分解の経時的変化を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学、薬剤学の分野で有用なオリゴヌクレオチドの誘導体、より具体的には各種環境下で安定に存在しうるオリゴヌクレオチドのコンジュゲートに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子を生体内の標的部位へ送達するためのキャリアとして、改変レトロウイルス、改変アデノウイルス等に加えて、安全性の観点から、合成キャリア、例えば、カチオニックリポソーム、膜融合リポソーム、ポリカチオン（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリ−Ｌ−リジン、キトサン）、ポリカチオン含有ブロックコポリマー等の使用が検討されてきた。就中、片岡を初めとする本発明者の一部により提案されたポリイオンコンプレックスミセル（ＰＩＣミセル）を利用するＤＮＡの送達系は、一般的に、薬物内包ミセルの安定性、標的細胞もしくは組織内への移行性、組織内での薬物の安定性が良く、期待されうる送達系である（例えば、非特許文献１、同２、特許文献１参照。）。より具体的には非特許文献１にはポリ（エチレンオキシド）−block−ポリリジンをプラスミドＤＮＡのキャリアとして用いた場合の動物の組織または細胞への移行性等が、同２にはポリ（エチレンオキシド）−block−ポリ［メタクリル酸２−（Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチル）］がプラスミドＤＮＡの好ましいキャリアになりうることが、そして特許文献１にはポリ（エチレンオキシド）−block−ポリ（エチレンイミン）も、上記のものと同様なキャリアとして機能することが記載されている。
【０００３】
しかしながら、低分子ＤＮＡはＰＩＣミセルに内包した場合、ＤＮＡそれ自体または薬物内包ミセルの安定性が充分でないこともある。このようなミセルの安定化を図る目的で、ポリカチオン性ポリマー鎖間で−ＳＳ−結合を形成することも提案されている（特許文献２参照）。具体的には、特許文献２には非特許文献１に記載されているようなポリ（ポリエチレンオキシド）−block−ポリ（リジン）のリジン残基中にメルカプトアルキル基を導入し、かようなメルカプト基を介してポリマー鎖間でジスルフィド結合（−ＳＳ−）を形成することにより、ＰＩＣミセルの安定化が図られている。なお、こうして形成された−ＳＳ−結合は、動物細胞中に存在することが知られているグルタチオン等により開裂されうることが記載されている。
【０００４】
【非特許文献１】
Kataoka et al. Macromolecules ２９（１９９６）８５５６〜８５５７
【０００５】
【非特許文献２】
Kataoka et al. Macromolecules ３２（１９９９）６８９２−６８９４
【０００６】
【特許文献１】
特開２００１−０４８９７８号公報
【０００７】
【特許文献２】
特開２００１−１４６５５６号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、限定されるものでないが、特に、オリゴＤＮＡを初めとする修飾されていてもよいオリゴヌクレオチドの安定な送達系を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、修飾されていてもよいオリゴヌクレオチドをポリ（エチレンオキシド）に共有結合させたコンジュゲートとすることにより、従来の高分子量ＤＮＡのキャリアとの複合体［コンプレックス（イオンコンプレックス、カチオニックリポソーム、ＰＩＣミセル等）］として安定に存在し得、しかも、オリゴヌクレオチドそれ自体も動物の組織もしくは細胞内での安定性が向上することを見出した。また、このようなコンジュゲートは本発明者らの知る限り、文献未載の化合物である。
【００１０】
したがって、本発明によれば、下記の一般式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドとポリエチレンオキシドのコンジュゲートが提供される。
【００１１】
Ａ−Ｌ1−Ｌ2−ＰＥＧ （Ｉ）
式中、Ａはリボースの３′もしくは５′ヒドロキシル基末端においてリン酸エステル結合を介して−Ｌ1−Ｌ2−ＰＥＧに結合した修飾されていてもよいオリゴヌクレオチドの残基を表し、
Ｌ1は酸素原子もしくは硫黄原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基を表し、そして
Ｌ2は連結基を表し、そして
ＰＥＧは末結合末端に、連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンドの残基を担持するポリ（エチレンオキシ基）を表す。
【００１２】
また、本発明によれば、このようなコンジュゲートの生体内送達内のキャリアに担持もしくは内包させるための使用、例えば、該コンジュゲートとポリカチオンの複合体も提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明にいうオリゴヌクレオチドは、所謂、「オリゴ」が意味する数個から１０数個のヌクレオチドからなるものに限定されず、最大、１００個までのヌクレオチドからなるものも包含する。
【００１４】
また、各ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の向きは、通常、３′→５′もしくは５′→３′であるが、ヌクレオチドの種類によっては、２′→５′もしくは５′→２′であってもよく、また、これらの結合様式が混在していてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを構成するいずれのものであってもよい。
【００１５】
「修飾されていてもよい」とは、天然のＤＮＡまたはＲＮＡにみられる各ヌクレオチドの塩基におけるアミノ基のアルキル化、アシル化、またはヒドロキシル基による置換、リン酸ジエステル結合に関与しないリボースのヒドロキシル基（例えば、２′−ＯＨ）のアルキル化等によって修飾されていてもよいことを意味する。さらに、糖残基またはペプチジル（アミノ酸残基）により、−Ｌ1−Ｌ2−ＰＥＧに結合した末端と反対側の末端のヒドロキシル基を介して、あるいは末端もしくはリン酸ジエステル結合を有するヌクレオチドの塩基もしくはリボース部位が修飾されているオリゴヌクレオチドも、本発明にいうオリゴヌクレオチドに包含される。限定されるものでないが、本発明で用いることを意図しているオリゴヌクレオチドの例としては、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、３′末端をＳＨ化したドーパミンＤ２受容体アンチセンスＤＮＡが挙げられる。
【００１６】
このようなオリゴヌクレオチドには、通常のＤＮＡおよびＲＮＡの方向付けに基づいて、３′末端側（すなわち、リボースの５′位はリン酸ジエステル結合に関与している。）の３′ヒドロキシル基か、または５′末端側（すなわち、リボースの３′位はリン酸ジエステル結合に関与している。）の５′ヒドロキシル基を介するリン酸エステル結合を形成するように式−Ｌ1−Ｌ2−ＰＥＧで表される基が結合している（なお、本発明において「結合」という場合、特記しない限り共有結合を意味する。）。
【００１７】
該式中のＬ1は、酸素原子もしくは硫黄原子、好ましくは酸素原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基であることができる。このようなアルキレン基は、分岐していてもよく、したがって、限定されるものでないが、
【００１８】
【化１】
等が例示される。
【００２０】
Ｌ2は連結基を表し、本発明の目的に沿う限り、Ａ−Ｌ1部とＰＥＧ部とを連結しうるいかなる基、例えば、アルキレン基（上記の例示を参照。）、アリレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯ−ＮＨ−、−ＳＯ−から選ばれる１種以上からなるものであってもよい。限定されるものでないが、Ｌ2の例としては、−ＳＳ−、−ＳＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯ−、−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ−、−ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ−、−ＳＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＣＨ2−、−ＳＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ−が挙げられる。このような連結基のうち、生理学的条件下（動物の組織、細胞、体液等に含まれるペプチダーゼ、エステラーゼ、還元性物質等の存在下）で開裂されうる基、例えば−ＳＳ−基、−ＣＯＯ−もしくは−ＯＣＯ−基を連結基内に少なくとも１個含むものが好ましい。
【００２１】
−ＰＥＧは未結合末端（Ｌ2との結合末端のもう一方の末端）に連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンドの残基を担持するポリ（エチレンオキシド）基を表す。具体的には、−ＰＥＧは、式（ＩＩ）
−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−Ｌ3−Ｘ （ＩＩ）
式中、Ｌ3は上記のＬ2について定義したのと同様な連結基または単結合であり、Ｘは水素原子もしくは、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル等）、アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル等）、ヒドロキシル基、アルデヒド（もしくはホルミル基：−ＣＨＯ）、アセタール化ホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基（なお、「保護された」と称する場合の保護基は、限定されるものでないが、ペプチド合成で慣用されるアミノ基およびカルボキシル基に対する保護基を意味する。）からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンド（例、ビオチン、ハプテン、ホルモン、酵素の基質等）の残基であり、
ｎは５〜５００の整数である、
で表されるポリ（エチレンオキシド）基である。
【００２２】
式（ＩＩ）または−Ｌ2−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−Ｌ3−Ｘをもたらすポリ（エチレンオキシド）誘導体は、本発明者らの一部によって提案されたヘテロテレケリック親疎水性ブロックコポリマーを製造する際の、中間段階である、ポリ（エチレンオキシド）セグメントの形成に従って（例えば、ＷＯ ９６／３３２３３、ＷＯ ９６／３２４３４、ＷＯ ９７／０６２０２、前述の特許文献１および２参照。）、または必要により、それらに当業技術分野で周知の技法を加えて製造することができる。
【００２３】
限定されるものでないが、典型的なポリ（エチレンオキシド）誘導体の製造法は次に示す反応スキームに従って実施できる。
スキーム１：
【００２４】
【化２】
スキーム２：
【００２６】
【化３】
なお、以上の反応スキームに示す各反応段階の条件は、前述の特許文献１および国際公開パンフレットを参照できる。
【００２８】
次に、一般式（Ｉ）におけるＬ2に−ＳＳ−結合または−ＣＯＯ−結合を有するオリゴヌクレオチドとポリエチレンオキシドのコンジュゲートは、例えば、次に示す反応スキームに従って製造できる。
スキーム３：
【００２９】
【化４】
スキーム４：
【００３１】
【化５】
ｏｌｉｇｏ−ＮＴ：
【００３３】
【化６】
Ｘ：水素またはヒドロキシル基
Ｂ：各種塩基の残基
Ｒ：水素または修飾基
ｍ：１０〜１００
こうして製造される本発明に従うコンジュゲートは、必要により、さらにリガンドを付する反応に供してもよい。例えば、（ｆ）または（ｇ）で表されるコンジュゲートのアセタール化ホルミル基［(ＣＨ3ＣＨ2Ｏ)ＣＨ−］を酸加水分解に供してホルミル基（−ＣＨＯ）に転化し、次いで、必要によりアミノ基を導入したリガンドとの反応により、リガンドを導入することもできる。
【００３５】
以上に従って提供されるコンジュゲートは、例えば、非特許文献１または２、特許文献１に記載されるようなポリ（エチレンオキシド）−block−ポリ（リジン）、ポリ（エチレンオキシド）−block−ポリ［メタクリル酸２−（Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチル）］、ポリ［エチレンオキシド）−block−ポリ（エチレンイミン）等を用い、それらに記載されたＤＮＡの内包ＰＩＣミセルの形成法に従って、該コンジュゲート内包ＰＩＣミセルを提供できる。また、本発明に従うコンジュゲートは、上記のようなブロックコポリマーのみならず、ポリカチオン（例えば、上記のブロックコポリマーのカチオン形成可能なセグメント、またはオリゴーもしくはポリアルギニン、ｔａｔ、ＫＡＬＡを含有するオリゴマーまたはホモポリマー）との複合体またはイオンコンプレックス、カチオニックリポソーム内へ封入したコンプレックとしても提供できる。
【００３６】
かようなコンジュゲート内包ＰＩＣミセルは、ミセルも比較的安定である。
【００３７】
【実施例】
本発明を具体例を挙げてさらに具体的に説明する。
製造例１：アセタール−ＰＥＯ−アクリレートの製造
【００３８】
【化７】
アルゴン下、ナスフラスコ中、室温において、開始剤３,３−ジエトキシ−１−プロパノール１.０ｍｍｏｌ（０.１６ｍｌ）を溶媒テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２５ｍｌにマイクロシリンジで加え、Ｋ−ナフタレン１.０ｍｍｏｌ（０.３２５ｍｏｌ／１−ＴＨＦ溶液、３.１ｍｌ）を加えて１０分間メタル化を施した。次いで、エチレンオキシド１１０ｍｍｏｌ（５.５ｍｌ）を加えて水冷下で２日間撹拌し、アニオン開環重合を行った。その後、トリエチルアミンを３倍モル量３.０ｍｍｏｌ（０.４２ｍｌ）と停止剤としてアクリロイルクロライドを３倍モル量３.０ｍｍｏｌ（０.２４ｍｌ）を順次加え、室温において１日停止反応を行った。その後、２−プロパノール沈澱（２ｌ）、遠心分離（５０００×ｇ、４５分間）、減圧乾燥、ベンゼン凍結乾燥により精製を行った。この生成物の収量は５.０ｇ（９８％）であった。
【００４０】
ゲルパーミエーションクロマトグラフィーの測定により、得られたポリマーは単峰性であり、その数平均分子量は４８３０であり、仕込み分子量５０８０とほぼ一致していた。
【００４１】
同様にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）の測定においても、得られたポリマーは単峰性であり、その数平均分子量は４４６０であった。また、これらのピークの測定値と計算値を比較した結果、このポリマーはエチレンオキシド骨格を主鎖に有し、α−末端にアセタール基、ω−末端にアクリレート基を有するヘテロテレケリックポリエチレンオキシドであることが確認された。
【００４２】
さらに、得られたポリマーの重ＤＭＳＯ中での 1Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）スペクトルより、このポリマーの平均分子量は４８７０と計算された。またこのポリマーはエチレンオキシド骨格を主鎖に有し、α−末端にアセタール基、ω−末端にアクリレート基を有するヘテロテレケリックポリエチレンオキシドであることが確認された。
【００４３】
実施例１：オリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートの製造
【００４４】
【化８】
オリゴＤＮＡ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ １.３４μｍｏｌ（８.１ｍｇ）と３０倍モル量のアセタール−ＰＥＯ−アクリレート４０.２μｍｏｌ（１９４.８ｍｇ）を試験管に加え、アルゴン置換を行った。次いで、ｐＨ８に調整した蒸留水３００μｌをマイクロシリンジで加え室温において６時間撹拌し、マイケル付加反応を行った。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより、オリゴＤＮＡの消費とオリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートの生成を確認し、凍結乾燥により粗生成物を２０３.２ｍｇ得た。その後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ １０／１０）による分取、純水に対する透析（区画分子量３５００、１、２、４、６、８、１２時間後に水を交換）を１日行うことで精製を行った。この生成物の収量は６.１ｍｇ（４２％）であった。
【００４６】
ゲルパーミエーションクロマトグラフィーの測定により、得られたポリマーは単峰性であり、その数平均分子量は９９１０であり、理論分子量１０８６０とほぼ一致していた（図１参照）。
【００４７】
さらに、得られたポリマーのＤ2Ｏ中での 1Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）スペクトルより、α−末端にアセタール基を有し、主鎖がエステル結合を介しエチレンオキシド骨格と核酸骨格からなるオリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートであることが確認された（図２参照）。
製造例２：アセタール−ＰＥＧ−ＯＳＯ2ＣＨ3の製造
アルゴン下、ナスフラスコ中において、脱水溶媒ＴＨＦ３０ｍＬに開始剤３,３−ジエトキシ−１−プロピルアルコール０.１６ｍＬ（１ｍｍｏｌ）を加えた。そして、カリウムナフタレン等モル量を用いてアルコキシドを形成させた後、エチレンオキシド７.０ｍＬ（１４０ｍｍｏｌ）を加え２日間室温下で重合した。そして、トリエチルアミン１.２５ｍＬ（９ｍｍｏｌ）とカリウムナフタレン０.５ｍｍｏｌをポリマー溶液に加えた。さらに、停止反応として、メタンスルホニルクロリド０.５４ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦに溶解させたところへ、このポリマー溶液を滴下することによって、停止末端へのメタンスルホニル基の導入を行った。その後、クロロホルムと飽和食塩水にて抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムを用いて脱水した。ロータリーエバポレーターにて濃縮後、エーテル再沈、吸引ろ過にてポリマーを回収し、最後にベンゼン凍結乾燥にて白色のポリマーを得た。
製造例３：アセタール−ＰＥＧ−Ｓ(Ｃ＝Ｓ)ＯＣＨ2ＣＨ3の製造
減圧乾燥したＯ−エチルジチオ炭酸カリウムに脱水ＴＨＦ７５ｍＬとＤＭＦ１.５ｍＬを加え撹拌した。そして、この溶液を同じく減圧乾燥させたアセタール−ＰＥＧ−ＯＳＯ2ＣＨ3 １.５５ｇ（Ｍn６１００）に加えて、室温にて４時間反応させた。その後、クロロホルムと飽和食塩水にて抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムを用いて脱水した。ロータリーエバポレーターにて濃縮後、エーテル再沈、吸引ろ過にてポリマーを回収し、最後にベンゼン凍結乾燥にて白色のポリマーを得た。
製造例４：アセタール−ＰＥＧ−ＳＳｐｙｌの合成
脱水ＴＨＦ中にアセタール−ＰＥＧ−Ｓ(Ｃ＝Ｓ)ＯＣＨ2ＣＨ3 １６０ｍｇと２−ピリジルジスルフィド５８６ｍｇ（１００倍モル量）を溶解させたところへ、ｎ−プロピルアミン３.５ｍＬ（１.４ｍＭ）を加えて室温下３時間反応させた。そして、上記の精製法を二回繰り返してベンゼン凍結乾燥させた。
【００４８】
実施例２：
（１） オリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートと直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）からなるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルの製造。
【００４９】
オリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲート３.０ｍｇを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ７.４）に溶解させた後、０.１・ｍのフィルターで濾過しゴミを除いた。次に、この溶液をＥｘＧｅｎ５００（直鎖状ＰＥＩ）の正電荷とオリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートの負電荷の比が１となるように添加した。さらに、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ７.４、０.３Ｍ Ｎａｃｌ）を混合溶液と同量加え、６時間静置しＰＩＣミセルを形成させた。
【００５０】
得られたＰＩＣミセルの粒径および粒径分布は、動的光散乱測定法（ＤＬＳ）によって評価した。ＤＬＳ測定より、ＰＩＣミセルの粒径の分布は単峰性であり、分布の程度も比較的狭いことが示された（ｄw／ｄn＝１.１３）。また、ＰＩＣミセルの平均粒径は１０２.５ｎｍであった（図３参照）。
（２） 弱酸性条件下におけるＰＩＣミセルの加水分解（エステル結合の切断）上記で得られたＰＩＣミセルをｐＨ５.５に調整し、所定時間ごとにサンプリングしゲルろ過クロマトグラフィー（Superose ６ ＨＲ）を測定した（図４参照）。ｐＨ５.５の酸性条件下におけるゲルろ過クロマトグラフィーは、時間経過と共にＰＩＣミセルのピークが底分子量側にシフトし、それに伴いＰＥＯのピークが現れた。また、４時間後には沈殿物が系内に確認された。一方、ｐＨ７.４の条件下では、ＰＩＣミセルは安定に存在していることが明らかとなった。このように、オリゴＤＮＡとＰＥＯのつなぎ目にあるエステル結合がｐＨの変化により切断されることが明らかとなった。
製造例５：オリゴＤＮＡ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨの製造
実施例１で用いたオリゴＤＮＡ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＨは、次のような機器、操作を用いることにより製造できる。
（ａ） ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機：Applied biosystem ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ
Synthesizer
（ｂ） 合成プロトコール：２−Ｎ−イソブチリルデオキシグアノシン、６−Ｎ−ベンゾイルデオキシアデノシン、４−Ｎ−ベンゾイルデオキシシチジン、およびデオキシチミジンの５′−Ｏ−ジメチルトリチル、３′−Ｏ−（Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホオスホロアミダイト）体を利用する標準プロトコール
（ｃ） 合成カラム：３′−thiolmodifierＣ３−ＳＳＣＰＧカラム（GlenResea rch 社）１マイクロモルカラム
なお、オリゴヌクレオチドのカラムからの切り出しと脱保護は、該ＣＰＧカラムから固相単体を取り出し、密閉容器中、２８％アンモニア水中５５℃で約４時間加熱し、合成オリゴヌクレオチドのカラムからの切り出しとアミノ基の脱保護を行った。こうして得られたオリゴヌクレオチドの精製は、下記のＨＰＬＣ条件で行い、保持時間約２０分付近のピークを単離した。単離された画分を凍結乾燥に供し溶媒を留去した。
【００５１】
カラム：nacalai tesque ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ（４.６×２５０ｍｍ）
溶 媒：Ａ：Ｏ．１ＭＴＥＡＡバッファー Ｂ：ＣＨ3ＣＮ
Ｂ１Ｏ％→４０％／２０分、４０％→１００％／３０分［直線的濃度勾配（linear gradient）］
流 速：１.０ｍｌ／分
ＵＶ−検出：２５４ｎｍ
次に、オリゴヌクレオチドの５′−Ｏ−ジメトキシトリチル基の脱保護は、１０％酢酸水溶液に精製オリゴヌクレオチドを溶解し、室温で約１時間放置後することにより実施し、次いで上記のＨＰＬＣ条件で保持時間約１４分のピークを単離し精製した。
【００５２】
精製後凍結乾燥により溶媒を留去した。
【００５３】
最後に、チオール基保護基の脱保護は、６０ｍＭジチオスレイトールの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）に精製オリゴヌクレオチドを溶解し、室温で約１時間放置することにより実施した。上記のＨＰＬＣ条件で保持時間約１４分のピークを単離し精製した。次いで、精製後凍結乾燥により溶媒を留去することにより目的のオリゴヌクレオチドを得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴＤＮＡとアセタール−ＰＥＯ−アクリレートの反応溶液（ａ：反応前、ｂ：反応後）およびオリゴＤＮＡ−ＰＥＯ−コンジュゲート（ｃ）のゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる測定結果である。
【図２】オリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートの 1Ｈ−ＮＭＲによる測定結果である。
【図３】オリゴＤＮＡ−ＰＥＯコンジュゲートと直鎖状ＰＥＩとからなるＰＩＣミセルのＤＬＳによる測定結果である。
【図４】ｐＨ５.５と７.４におけるＰＩＣミセルの時間経過ごとのゲルろ過クロマトグラフィーの結果である。（Ａ）および（Ｂ）はそれそれｐＨ５.５およびｐＨ７．４におけるＰＩＣミセルの加水分解の経時的変化を示す。
Claims (10)
- 一般式（Ｉ）
Ａ−Ｌ1−Ｌ2−ＰＥＧ （Ｉ）
式中、Ａはリボースの３′もしくは５′ヒドロキシル基末端においてリン酸エステル結合を介してＬ1−Ｌ2−ＰＥＧに結合した修飾されていてもよいオリゴヌクレオチドの残基を表し、
Ｌ1は酸素原子もしくは硫黄原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基を表し、
Ｌ2は連結基を表し、そして
ＰＥＧは未結合末端に、連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンドの残基を担持するポリ（エチレンオキシ）基を表し、かつ、Ｌ2が主鎖に生理学的条件下で開裂しうる結合を有する連結基である、
で表されるオリゴヌクレオチドとポリエチレンオキシドのコンジュゲート。 - Ｌ1が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ 2 （ＣＨ 3 ）ＣＨ−、−ＣＨ2（ＣＨ2）2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−および−ＣＨ2ＣＨ2（ＯＣＨ2ＣＨ2）2−からなる群より選ばれる請求項１記載のコンジュゲート。
- Ｌ2の連結基が主鎖にエステル結合（−ＣＯＯ−）またはジスルフィド結合（−ＳＳ−）を有する請求項１または２記載のコンジュゲート。
- Ｌ2の連結基が主鎖にジスルフィド結合（−ＳＳ−）を有する請求項１記載のコンジュゲート。
- −ＰＥＧが式（ＩＩ）
−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n−Ｌ3−Ｘ
式中、Ｌ3は単結合またはＬ2について定義したのと同様な連結基であり、
Ｘは水素原子もしくは、アルキル基、アラルキル基、ヒドロキシル基、ホルミル基、アセタール化されたホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンドを表し、ｎが５〜５００の整数である請求項１〜４のいずれかに記載のコンジュゲート。 - オリゴヌクレオチドが最大１００個までのヌクレオチドからなる請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート。
- オリゴヌクレオチドがオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーからなる群より選ばれる請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート。
- ポリカチオン性セグメントを含むホモポリマーと請求項１〜７のいずれかに記載のコンジュゲートを含有する複合体。
- ポリカチオン性セグメントがポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸ジ−Ｃ1-3アルキルアミノエチル、オリゴアルギニン、ｔａｔおよびＫＡＬＡからなる群より選ばれる請求項８記載の複合体。
- 水溶液中でポリイオンコンプレックスミセルを形成するための請求項８または９記載の複合体。
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