JP2012165672A - 1塩基認識能を増幅する人工核酸コンジュゲート - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的ポリヌクレオチド中の第一領域の配列と相補する配列からなる第一の一本鎖人工核酸と、上記標的ポリヌクレオチド中の第二領域の配列と相補する配列からなる第二の一本鎖人工核酸と、上記第一の一本鎖人工核酸及び上記第二の一本鎖人工核酸の間に連結している親水性ポリマーとを備える、人工核酸コンジュゲートを提供する。
【選択図】図6
Description
本実施形態は、標的ポリヌクレオチド中の第一領域の配列と相補する配列からなる第一の一本鎖人工核酸と、上記標的ポリヌクレオチド中の第二領域の配列と相補する配列からなる第二の一本鎖人工核酸と、上記第一の一本鎖人工核酸及び上記第二の一本鎖人工核酸の間に連結している親水性ポリマーとを備える、人工核酸コンジュゲートである。
(-CH2-CH2-O-)n (nは正の整数であり、PEGの重合度を表す)
と表すことが可能であり、好ましくは、哺乳類の体温で柔軟性を発揮し,かつ溶解性を向上できるn=2〜27,より好ましくはn=6〜18,更に好ましくはn=11〜13である。
本実施形態は、標的ポリヌクレオチド中の第一領域の配列と相補する配列からなる第一の一本鎖人工核酸と、上記標的ポリヌクレオチド中の第二領域の配列と相補する配列からなる第二の一本鎖人工核酸との間に親水性ポリマーを連結する工程を含む、人工核酸コンジュゲートの作製方法である。
本実施形態は、上記の人工核酸コンジュゲートを含有する、遺伝子発現調節剤である。
本実施形態は、上記の人工核酸コンジュゲートを含有する、遺伝子疾患治療薬である。
プラスミドの構築
5’-GCCACCATGGAAGACGCC-3’(配列番号:1)及び5’-AGCTCGCTCGAGACACGGCGATCTTTC-3’(配列番号:2) プライマーを用いて、pGL3コントロールベクター(promega)をテンプレートするPCRを行い、ホタル(Photinus pyralis)のルシフェラーゼ遺伝子をコードする1.7-kbpのDNA断片を得た。制限酵素でNcoI 及びXhoIで消化した後、pIVEX-2.3d発現ベクター(Roshe Diagnostics)にライゲースした(pIVEX2.3d-Luc+)(図1)。pIVEX2.3d-Luc+には、T7 RNAポリメラーゼと原核細胞の溶解物の組み合わせにもとづくインビトロ発現に必要な全ての調節エレメントを含んでいる。ライゲースしたpIVEX2.3d-Luc+を、ヒートショック法により大腸菌へ形質転換し、LB培地にて37℃、12時間、培養した後、プラスミドpIVEX2.3d-Luc+をアルカリ/SDS法にて精製した。精製したプラスミドを上記プライマーを用いて、PCRを行い、得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動法により泳動した。予想される分子量にバンドが検出されたことから、Luc+遺伝子の導入が確認され、目的とするプラスミドpIVEX2.3d-Luc+を得た。
粗PNA-PEGコンジュゲート及び粗PNAオリゴマーは、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC;JASCO PU-2089i-plus 4溶媒グラジェントイナートポンプ付きJASCO HPLC system及びJASCO MD-2015plus 多重波長 UV-vis 検出器)を用いて精製した。カラムは、ODSカラム(Inertsil ODS-3, 粒径10μm, 孔径120A, 10.0 mm I.D. x 250mm, GL Science)を使用した。精製は、流速4.0ml/min、温度25℃、A-B 直線勾配(溶液A:0.1% TFA含有H2O, 溶液B:0.1% TFA含有CH3CN)の条件で行い、詳細は表1に表す。溶出したPNA-PEGコンジュゲート及びPNAオリゴマーを分画し、凍結乾燥し-80℃に保管した。
PNAオリゴマー及びPNA-PEGコンジュゲートの純度は、分析カラム(GL science ODS-3, 粒径 5μm, 孔径 120 Å, 4.6mm I.D. x 250mm)を用いたRP-HPLCで、流速を1.0ml/minとし、A-B直線勾配(溶液A:0.1% TFA含有H2O, 溶液B: 0.1% TFA含有CH3CN、条件は表1と同じ)で、温度25℃の条件で測定した。それぞれの純度は、90%以上であった(表2)。
RP-HPLCで精製した後、目的とするPAN-PEGコンジュゲート及びPNAオリゴマーの分子量をMALDI-TOF/MS(Bulker)により評価した。シナピン酸飽和溶液(0.1% TFA含有アセトニトリル: 水)をマトリクスとし、サンプル溶液と混合した後にターゲットをキャストした(表2)。いずれのサンプルも、計算による予測値の2Da以内であることからいずれのサンプルも精製度の高いサンプルが得られた。
合成したPNA-PEGコンジュゲート及びPNAオリゴマー
ルシフェラーゼ発現抑制のターゲット領域として、T7プロモーター領域(T7領域)とルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンを含む領域(ATG領域)を選択した。作製したT7領域に対応するPNA-PEGコンジュゲート及びその1塩基置換体を図3に示す。また、ATG領域に対応する、作製したPNA-PEGコンジュゲート、PNAオリゴマー及びその1塩基置換体も図3に示した。図3中のT7領域及びATG領域の塩基配列のうち、PNA-PEGコンジュゲートがハイブリダイズする塩基配列は、斜体で示している。一方、PNA -PEGコンジュゲートのうち、下線を引いた塩基は置換した塩基を示す。
精製したPNA-PEGコンジュゲートとPNAオリゴマーの可溶性を比較するために、それぞれ50μM分、HEPES(pH7.5)に溶かし目視観察を行った。PNA-PEGコンジュゲートは、速やかに可溶化するのに対して、PNAオリゴマーは、沈殿することが確認され、軽く懸濁することで可溶化された。このことから、PNA-PEGコンジュゲートは、優れた可溶性を示すことが明らかとなった(データは示さず)。精製したPNA-PEGコンジュゲートをウシ胎仔血清(FBS)に溶かし酵素安定性を試験した。比較対象は、プライマー5’-TCCCGCGAAATTAATACGAC-3’ (配列番号:3)及び 5’-CAGAGTGCTTTTGGCGAAG-3’ (配列番号:4)を用いてpIVEX2.3d-Luc+プラスミドをテンプレートとするPCRで得られた1kbpのDNA断片を用いた。1kbpのDNA断片及びPNA-PEGコンジュゲートをFBSに溶かし(1kbp DNA:100nM/50%FBS、PNA-PEGコンジュゲート(PP_ATG01):100μM/50%FBS),37℃で、インキュベートした。インキュベートした1kbpのDNA断片を1%アガロースゲルを用いたアガロースゲル電気泳動法で検出した(図4a)。インキュベートしたPNA-PEGコンジュゲートは、逆相クロマトグラフィー(RPLC)(GL science ODS-3, 粒径 5μm, 孔径 120 Å, 4.6 mm I.D. x 250 mm)に反応液を5μlアプライして溶出時間を測定した(図4b)。インキュベートした1kbpのDNA断片及びPNA-PEGコンジュゲートの分解した割合を図4cにまとめた。
PNA-PEGコンジュゲートと対応するDNAテンプレートとでハイブリダイズする複合体の融解曲線は、温度制御ユニットを備えるJASCO J-820 CD spectrometer (JASCO)を用いて測定した。各PNA-PEGコンジュゲートをハイブリダイズバッファー(10 mM リン酸緩衝液, pH 7.0, 10 mM NaCl)に溶解した。対応するDNAテンプレートは、T7領域は、5’-ATTAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3’(配列番号:5)とし、ATG領域は、5’-CCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3’(配列番号:6)とした。PNA-PEGコンジュゲートと対応するDNAテンプレート溶液を混合し、総濃度を5.0 μMとした。降温・昇温過程における吸光度を測定(測定条件:測定波長260 nm, 応答: 2秒, 帯域幅: 2nm, スキャン速度: 1℃/min)し、得られた融解曲線からTm値を測定器のプログラムに従い算出した。
更に、RNA鎖とPNA-PEGコンジュゲートの熱変性試験を行った。PNA-PEGコンジュゲートと対応するRNAテンプレートとで形成する複合体の融解曲線は、温度制御ユニットを備えるJASCO J-820 CD spectrometer(JASCO)を用いて測定した。各PNA-PEGコンジュゲートをハイブリダイズバッファー(10 mM リン酸緩衝液, pH 7.0, 10 mM NaCl)に溶解した。対応するRNAテンプレート(synRNA)は、5’-CCAUGGAAGACGCCAAAAACAUAAAG-3’(配列番号:7)とした。PNA-PEGコンジュゲートと対応するRNAテンプレート溶液を混合し、総濃度を5.0 μMとした。降温・昇温過程における吸光度を測定(測定条件:測定波長260 nm, 応答: 2秒, 帯域幅: 2nm, スキャン速度: 1℃/min)し、得られた融解曲線からTm値を測定器のプログラムに従い算出した。
無細胞タンパク質発現系によるルシフェラーゼの発現と評価
PNA-PEGコンジュゲートがタンパク質発現を抑制することができるか否かを無細胞タンパク質合成システムで実験した。無細胞タンパク質合成システムは、Roche社製 RTS100 E. coli HY Kit (大腸菌由来)を用いた。製造元プロトコールに従い、各反応液を混合した50μlの標準反応液(12 μl 大腸菌溶解液, 10 μl 反応混合液, 12 μl アミノ酸, 1 μl メチオニン、5 μl 再構成バッファー、1.0 μg プラスミドpIVEX2.3d-Luc+ /2 μl (H2O)、及び 8 μl バッファー)を30℃で4時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現量を、ONE-Glo Luciferase Assay system (promega)を用いて定量した。定量は、ルミノメータによる相対発光強度から評価した。コントロールは、空ベクター(pIVEX-2.3d)を用いた。
Claims (15)
- 標的ポリヌクレオチド中の第一領域の配列と相補する配列からなる第一の一本鎖人工核酸と、前記標的ポリヌクレオチド中の第二領域の配列と相補する配列からなる第二の一本鎖人工核酸と、前記第一の一本鎖人工核酸及び前記第二の一本鎖人工核酸の間に連結している親水性ポリマーと、を備える、人工核酸コンジュゲート。
- 前記第一の一本鎖人工核酸が自己の5‘末端を介して前記親水性ポリマーと連結し、且つ前記第二の一本鎖人工核酸が自己の3‘末端を介して前記親水性ポリマーと連結している、請求項1記載のコンジュゲート。
- 前記第一領域が4塩基以上18塩基以下の領域である、請求項1又は2記載のコンジュゲート。
- 前記第二領域が4塩基以上18塩基以下の領域である、請求項1〜3のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 前記一本鎖人工核酸が、ペプチド核酸、ペプチド核酸類縁体及びこれらを構成する単量体の共重合体からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 前記標的ポリヌクレオチド中の第一領域及び第二領域が互いに離れている、請求項1〜5のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 前記標的ポリヌクレオチド中の第一領域及び第二領域の間が、6塩基以上38塩基以下の領域を挟んで離れている、請求項1〜6のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 前記親水性ポリマーが、重量平均分子量100〜50000 Daである請求項1〜7のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、キチン、キトサン及びこれらを構成する単量体の共重合体からなる群より選択される、請求項1〜8のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の人工核酸コンジュゲートを含有する遺伝子発現調節剤。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の人工核酸コンジュゲートを含有する遺伝子疾患治療薬。
- 前記遺伝子疾患が、染色体上に存在する1対の遺伝子における、異常ヘテロ接合体により発症する遺伝子疾患である、請求項11記載の遺伝子疾患治療薬。
- 前記疾患が、遺伝子をコードする塩基配列中の1塩基変異で生じる異常ヘテロ接合体により発症する遺伝子疾患である、請求項11又は12記載の遺伝子疾患治療薬。
- 前記遺伝子疾患が、鎌状赤血球症である、請求項11〜13のいずれかに記載の遺伝子疾患治療薬。
- 標的ポリヌクレオチド中の第一領域の配列と相補する配列からなる第一の一本鎖人工核酸と、前記標的ポリヌクレオチド中の第二領域の配列と相補する配列からなる第二の一本鎖人工核酸との間に、親水性ポリマーを連結する工程を含む、人工核酸コンジュゲートの作製方法。
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