JPWO2005083073A1

JPWO2005083073A1 - Ｄｎａエンザイムおよびその活性制御方法

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Publication number: JPWO2005083073A1
Application number: JP2006510451A
Authority: JP
Inventors: 浩之浅沼; 小宮山　真; 真小宮山; 大次郎松永; 壮倉持
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2025-02-24
Also published as: WO2005083073A1; EP1724343B1; TW200528467A; JP4653080B2; US20070203331A1; DE602005020431D1; EP1724343A4; EP1724343A1

Abstract

これまでのＤＮＡエンザイムに比し大幅にＲＮＡ切断活性を向上させたＤＮＡエンザイム、および、光照射により可逆的にＤＮＡエンザイムのＲＮＡ切断活性を制御することができる活性制御方法を提供する。ＤＮＡエンザイムの触媒活性ループの３’側の端に、アゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されているＤＮＡエンザイム、およびＤＮＡエンザイムのＲＮＡ切断活性を制御するにあたり、アゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されているＤＮＡエンザイムに対し、特定波長の光を照射することにより該有機基を平面構造と非平面構造とに可逆的に構造異性化させることによる活性制御方法である。

Description

本発明は、ＤＮＡエンザイムおよびその活性制御方法に関し、詳しくは、天然の４つの塩基のみで構成されるＤＮＡエンザイムよりＲＮＡ切断活性を大幅に向上させたＤＮＡエンザイム、および、特定波長の光照射によるＤＮＡエンザイムの活性制御方法に関する。

ＲＮＡを配列選択的に加水分解することが可能となれば、メッセンジャーＲＮＡのレベルでの遺伝子発現を抑制することが可能となり、遺伝子に基づく疾病の治療への応用が期待できる。天然に存在するＲＮＡ分解酵素はたんぱく質ではなく、ＲＮＡのみから構成されており、リボザイムと呼ばれている。しかしＲＮＡは不安定で分解されやすいため、より安定なＤＮＡ加水分解酵素（人工酵素）が求められていた。その要請に対し、１９９７年にアメリカのＪｏｙｃｅらによって世界で初めて天然のＤＮＡのみから構成されるＲＮＡ加水分解酵素が提案された（非特許文献１）。

ＤＮＡのみから構成されるＲＮＡ加水分解酵素は一般的にＤＮＡエンザイム（デオキシリボザイム、ＤＮＡザイム）と称され、ｉｎｖｉｔｒｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法により開発された人工リボヌクレアーゼであり、生体内金属であるＭｇ^２＋をコファクターとすることからｉｎｖｉｖｏでの応用が可能である。その具体的内容は非特許文献１に開示され、８−１７型のＤＮＡエンザイムと１０−２３型のＤＮＡエンザイムがあり、その配列式は以下のようになっている。

上記配列式中の矢印は切断部位を示す。切断部位における基質ＲＮＡの塩基配列は、８−１７型のＤＮＡエンザイムの場合はＧＡとなり、１０−２３型のＤＮＡエンザイムの場合はＹ（ＵまたはＣ）Ｒ（ＡまたはＧ）となる。ＤＮＡエンザイムの配列は基質ＲＮＡと相補的な配列となる。ただし、８−１７型のＤＮＡエンザイムにおけるＣＣＧＡＧＣＣＧＧＡＣＧＡ（配列番号１）や１０−２３型のＤＮＡエンザイムにおけるＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ（配列番号２）は触媒活性ループであり、基質ＲＮＡと相補的ではない。

一方、光照射による遺伝子発現制御に関しては、非特許文献２に報告されており、その遺伝子発現制御は、アゾベンゼンをＤＮＡの側鎖に導入した人工ＤＮＡを用いることにより行われる。具体的には、アゾベンゼンは特定波長の光照射によりトランス体（平面構造）とシス体（非平面構造）とに可逆的に構造異性化されるため、このアゾベンゼンの特性を利用することにより、ＤＮＡの二重鎖の形成と解離の光制御、三重鎖形成の光制御等を行うことが可能となる。
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94.4262-4266(1997) Journal of Japanese Society for Biomaterials 21.290-296(2003)

非特許文献１に示されるＤＮＡエンザイムはＲＮＡ切断活性そのものは決して高くなく、天然のリボザイムと比較すると活性は非常に低いものである。そこでＤＮＡエンザイムの高活性化が望まれている。

また、ＤＮＡエンザイムのＲＮＡ切断活性を制御することは極めて困難とされており、反応系内の条件を変化させることなく、外部刺激、例えば、光照射により、可逆的に活性制御することができれば、その有用性は大幅に向上し得るものである。

そこで、本発明の目的は、これまでのＤＮＡエンザイムに比し大幅にＲＮＡ切断活性を向上させたＤＮＡエンザイムを提供することにある。

また、本発明の他の目的は、光照射により可逆的にＤＮＡエンザイムのＲＮＡ切断活性を制御することができる活性制御方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＤＮＡエンザイムの所定の部位に平面構造を有するヌクレオチド残基を導入することにより、上記目的を達成し得ることを見出し、本発明のＤＮＡエンザイムを完成するに至った。

即ち、本発明のＤＮＡエンザイムは、ＤＮＡエンザイムの触媒活性ループの３’側の端に、アゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されていることを特徴とするものである。

また、本発明者らは、上記ＤＮＡエンザイムに特定波長の光を照射することで上記平面構造を非平面構造に可逆的に構造異性化させることができ、これによりＤＮＡエンザイムのＲＮＡ切断活性を制御することができ、上記他の目的を達成し得ることを見出し、本発明の活性制御方法を完成するに至った。

即ち、本発明の活性制御方法は、ＤＮＡエンザイムのＲＮＡ切断活性を制御するにあたり、アゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されているＤＮＡエンザイムに対し、特定波長の光を照射することにより該有機基を平面構造と非平面構造とに可逆的に構造異性化させることを特徴とするものである。

平面構造を有するヌクレオチド残基が導入された本発明のＤＮＡエンザイムは、天然の４つの塩基のみで構成されるＤＮＡエンザイムと比較し、ＲＮＡ切断活性が大幅に向上する。また、本発明のＤＮＡエンザイムの活性制御方法によれば、特定波長の光の照射により可逆的にＤＮＡエンザイムの切断活性を制御することが可能となり、ｉｎｖｉｖｏでの遺伝子発現の光制御が期待できる。

以下、本発明の実施の好適形態を具体的に説明する。
本発明のＤＮＡエンザイムは、前記非特許文献１記載のＤＮＡエンザイムの触媒活性ループの３’側の端に、平面構造を有するアゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入され、化学修飾されたものである。かかるＤＮＡエンザイムの塩基配列は触媒活性ループを除き、基質ＲＮＡと相補的な塩基である。ただし、ＲＮＡの塩基配列は、特に制限されるものではない。

本発明のＤＮＡエンザイムは、例えば、次式で表される。

上記式中、Ａは触媒活性ループ端を表し、Ｂはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表す。また、Ｘはアゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基を表す。Ｒは未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜４のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜４のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。

前記Ｘは、好ましくは、アゾベンゼンまたはその誘導体である。また、ヌクレオチド残基との結合部にいかなる介在基を有していてもよい。Ｘとしては、例えば、次式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される有機基を挙げることができる。

上記式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）中、Ｒ^１、Ｒ^１１、Ｒ^２１は夫々直接の結合；未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０、好ましくは１〜１０、更に好ましくは１〜４のアルキレン基、または未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０、好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜４のアルケニレン基である。Ｑは、直接の結合、酸素原子、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−ＣＯ−基または−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−ＮＨ−基、但しｎ＝１〜５である。Ｒ^２〜Ｒ^１０、Ｒ^１２〜Ｒ^２０、Ｒ^２２〜Ｒ^３０は夫々独立に、未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０、好ましくは１〜１０、更に好ましくは１〜４のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０、好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜４のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。

本発明に係るヌクレチド残基の導入されたＤＮＡエンザイムの合成は、既知の手法、例えば、The Journal of Organic Chemistry 62.846-852(1997)、Tetrahedron Letters 39.9019-9022(1998)およびAngewandte Chemie International edition 40.2671-2673(2001)に記載の手法に従い、行うことができる。夫々のヌクレオチド残基に対応するホスホアミダイトモノマーを合成し、既存のＤＮＡ合成機を使用することにより、所望のヌクレオチド残基を導入したＤＮＡエンザイムを合成することができる。この場合、ポリメチレン鎖は様々な長さのものを用いることができるが、未置換またはアルキル基で置換されたエチレン鎖またはトリメチレン鎖が好ましい。また、この場合、導入すべき有機基は、エチレン鎖の場合にはいずれかの炭素原子に、トリメチレン鎖の場合には中央の炭素原子に共有結合的に導入するのが好ましい。

次に、ＤＮＡエンザイムのＲＮＡ切断活性を制御する方法について説明する。先ず、特定波長の光を照射することにより平面構造と非平面構造とに構造異性化するアゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されたＤＮＡエンザイムを用い、これに特定波長の光を照射する。これにより平面構造と非平面構造とに可逆的に前記有機基を構造異性化させることができ、ＲＮＡ切断活性が制御可能となる。ここで、ＤＮＡエンザイムの塩基配列は触媒活性ループを除き、基質ＲＮＡと相補的な塩基である。ただし、ＲＮＡの塩基配列は、特に制限されるものではない。

また、前記ヌクレオチド残基の導入位置が触媒活性ループの３’側の端であれば本発明のＤＮＡエンザイムとなり、高いＲＮＡ切断活性を示すことになるが、本発明の活性制御方法は前記導入位置は特に制限されるものではなく、基質ＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド中であってもよい。かかるＤＮＡエンザイムは、例えば、次式で表される。

上記式中、ＡおよびＢは水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表す。但し、ＡおよびＢが共に水素原子である場合はない。Ｘはアゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基を表す。Ｒは未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜４のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜４のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。

前記Ｘは、好ましくは、アゾベンゼンまたはその誘導体である。この場合、光照射による可逆的な構造異性化による酵素活性の制御機能を害しない限り、ベンゼン環にいかなる置換基を有していてもよく、また、ヌクレオチド残基との結合部にいかなる介在基を有していてもよいが、好ましくはアゾベンゼンのパラ位の置換基および介在基は、ベンゼン環と共鳴構造をとらない基とする。

パラ位におけるカルボキシル基、アミノ基、ニトロ基のような置換基およびパラ位におけるアミド結合は、パラ位に共鳴構造をとるため、アゾベンゼンはシス体（非平面構造）とトランス体（平面構造）へ熱的に異性化しやすくなるためである。なお、メタ位の置換基はニトロ基以外の基であることが好ましい。Ｘとしては、例えば、次式（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）で表される有機基を挙げることができる。

上記式（ＩＶ）、（Ｖ）および（ＶＩ）中、Ｒ^３１、Ｒ^４１、Ｒ^５１は夫々直接の結合；未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０、好ましくは１〜１０、更に好ましくは１〜４のアルキレン基、または未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０、好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜４のアルケニレン基である。Ｑは、直接の結合、酸素原子、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−ＣＯ−基または−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−ＮＨ−基、但しｎ＝１〜５である。Ｒ^３２〜Ｒ^３７、Ｒ^３９、Ｒ^４０、Ｒ^４２〜Ｒ^４７、Ｒ^４９、Ｒ^５０、Ｒ^５２〜Ｒ^５７、Ｒ^５９、Ｒ^６０は夫々独立に、未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０、好ましくは１〜１０、更に好ましくは１〜４のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０、好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜４のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す。また、Ｒ^３８、Ｒ^４８、Ｒ^５８は、夫々独立に、未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０、好ましくは１〜１０、更に好ましくは１〜４のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０、好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜４のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；またはハロゲン原子を表す。また、好ましくは、式（ＩＶ）中において−Ｑ−Ｒ^３１−はアゾベンゼンと共鳴構造をとらない介在基である。

前記有機基を構造異性化させるために照射する光は、該有機基の異性化が可能ならば紫外領域から赤外領域までのすべての波長の光を用いることができるが、ＤＮＡを損傷させない３００ｎｍ以上が好ましい。例えば、３００〜４００ｎｍの光（ＵＶ光）を照射することにより、一の異性体から他の異性体に構造異性化し、４００ｎｍ以上の光（可視光）を照射することにより、その逆の変化を起こすことができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明をするが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

合成例１
「アゾベンゼン誘導体導入ＤＮＡエンザイムの合成」
以下のスキームにて合成を行った。

先ず、３−アミノ安息香酸ＶＩＩを酢酸に溶解させ、これにニトロソベンゼンの酢酸溶液を混合し、１２時間室温で攪拌することで、３−フェニルアゾ安息香酸ＶＩＩＩの粗生成物を得た。次に、得られた粗生成物をエタノールを用い、再結晶を行うことにより精製した。得られた３−フェニルアゾ安息香酸ＶＩＩＩとＤ−トレオニノールをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、ジシクロヘキシルカルボジイミドと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下にて反応させることにより３−フェニルアゾ安息香酸ＶＩＩＩとＤ−トレオニノールとがアミド結合によって結合された化合物ＩＸの粗生成物を得た。

次に、得られた化合物ＩＸをカラムクロマトグラフ法で分離精製した後、Angewandte Chemie International edition 40.2671-2673(2001)記載の手法に従い、ピリジン・ジクロロメタン混合溶媒中で４−ジメチルアミノピリジンの存在下にて４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを反応させることにより、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基で一方の水酸基を保護した化合物Ｘの粗生成物を得た。得られた化合物Ｘをカラムクロマトグラフ法で分離精製した。次に、The Journal of Organic Chemistry 62.846-852(1997)、Tetrahedron Letters 39.9019-9022(1998)記載の手法に従い、得られた化合物Ｘと２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトをアセトニトリル中で、１Ｈ−テトラゾ−ル存在下にて反応させることにより、もう一方の水酸基にホスホロアミジドが付加したホスホアミダイトモノマーＸＩ（ａ）の粗生成物を得た後、カラムクロマトグラフ法で分離精製した。

また、３−フェニルアゾ安息香酸ＶＩＩＩの代わりに４−フェニルアゾ安息香酸を用いる以外は上記と全く同様の方法によって、ホスホロアミダイトモノマーＸＩ（ｂ）を合成した。更に、３−フェニルアゾ安息香酸ＶＩＩＩの代わりにパラ−メチルレッドを用いる以外は上記と全く同様の方法によってホスホロアミダイトモノマーＸＩ（ｃ）を合成した。

最後に、本発明であるアゾベンゼン誘導体を導入した化学修飾ＤＮＡエンザイムの合成を行った。本実施例では、１０−２３型のＤＮＡエンザイムを合成した。化学修飾ＤＮＡエンザイムの合成はＡＢＩ３９４型ＤＮＡ合成機を使用し、上記の得られたホスホアミダイトモノマーＸＩ（ａ）〜（ｃ）と４つの天然の塩基に対応する市販のホスホアミダイトモノマーを用い、下記の塩基配列を持つ本発明のＤＮＡエンザイム（ＤＮＡ−１Ａ：配列番号４、ＤＮＡ−１Ｂ：配列番号５、ＤＮＡ−１Ｃ：配列番号６）を合成した。通常のプロトコルに従い、粗生成物を得た後、その粗生成物をゲル精製、高速液体クロマトグラフィー精製を行い精製した。また、比較例として、天然の４つの塩基のみで構成されるＤＮＡエンザイム（ＤＮＡ−Ｎ：配列番号３）も、上記と同様の手法で合成した。夫々の塩基配列を下記の表１に示す。塩基配列中、下線部の引かれた塩基配列は触媒活性ループを表す。

全てのＤＮＡエンザイムはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより同定した。また、基質として用いたＲＮＡの配列は以下の通りである。基質ＲＮＡを蛍光ラベルするために、５’末端に次式、

で表されるフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）を導入した。
５’−（ＦＩＴＣ）−ＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＵＵＣＡＧ−３’（配列番号７）

実施例１〜３、比較例１
「ＲＮＡ切断実験」
合成例１にて合成したＤＮＡエンザイム（ＤＮＡ−Ｎ：配列番号３、ＤＮＡ−１Ａ：配列番号４、ＤＮＡ−１Ｂ：配列番号５、ＤＮＡ−１Ｃ：配列番号６）を用いて、以下の手順に従ってＲＮＡ切断実験を行った。まず、ＤＮＡエンザイムの水溶液を４μＬ，基質ＲＮＡの水溶液４μＬ、更にバッファー水溶液４μＬをマイクロチューブに採取し、室温で十分に攪拌・混合した。反応液中に含まれる各物質の最終濃度は以下の通りとなるように調製した。
ＤＮＡエンザイム：１６μｍｏｌ／Ｌ
基質ＲＮＡ：１．６μｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム：１０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化ナトリウム：１ｍｏｌ／Ｌ

次に、得られた反応溶液を３７℃に調整した恒温槽に移し、比較例１（ＤＮＡ−Ｎ：配列番号３）および実施例１〜２（ＤＮＡ−１Ａ：配列番号４、ＤＮＡ−１Ｂ：配列番号５）は１時間、実施例３（ＤＮＡ−１Ｃ：配列番号６）は４０分間、反応させた。その後、尿素１０ｍｏｌ／Ｌとエチレンジアミン四酢酸５０ｍｍｏｌ／Ｌを含む水溶液を１２μＬ加えて反応を停止させ、アクリルアミドゲル電気泳動法によりＲＮＡの切断断片と未切断のＲＮＡを分離した。最後に、このゲルをフルオロイメージャー（ＦＬＡ−３０００：富士写真フイルム社製）を用いて４７０ｎｍの光でＦＩＴＣを励起し、５２０ｎｍの蛍光強度をモニターすることで、ＲＮＡの切断量を定量化した。その切断結果を下記の表２に示す。

表２に示す結果より、ＤＮＡエンザイムの触媒活性ループの３’側の端に平面性の高い分子を化学的に導入することで、天然の塩基のみから形成される従来のＤＮＡエンザイムより、高いＲＮＡ切断活性を有することが確認された。また、メタ−アゾ（実施例１）、パラ−アゾ（実施例２）、メチルレッド（実施例３）の三者とも同程度のＲＮＡ切断活性を有することから、平面状物質であれば、インターカレートして安定化させることができると考えられる。

実施例４〜７、比較例２
「ＲＮＡ切断活性の光制御」
合成例１の方法に準拠して、ＤＮＡエンザイムを追加合成した。その塩基配列を下記の表３に示す。塩基配列中、下線の引かれた塩基配列は触媒活性ループを表す。

得られたＤＮＡエンザイムを用い、実施例１〜３と全く同様の手順に従い、室温で反応溶液を調製した。次に、これを３７℃の恒温槽に移し、ＵＶ−Ａ蛍光ランプ（ＦＬ６ＢＬ−Ａ：東芝製）を用いてＵＶ−Ｄ３６Ｃフィルター（朝日テクノグラス製）を通した紫外光を照射しながら所定の時間反応させた。この条件下でのＵＶ光の強度は、１００μＪ／ｃｍ^２以下であった。また、同じ組成の反応溶液を、ＵＶ光を照射しない事以外は全く同じ条件で反応させた。その後、実施例１〜３と同様に尿素−ＥＤＴＡ溶液を加えて反応を停止させ、アクリルアミドゲル電気泳動法によりＲＮＡの切断断片と未切断のＲＮＡを分離した。最後に、このゲルをフルオロイメージャー（ＦＬＡ−３０００：富士写真フイルム社製）を用いて４７０ｎｍの光でＦＩＴＣを励起し、５２０ｎｍの蛍光強度をモニターすることで、ＲＮＡの切断量を定量化した。その切断結果を下記の表４に示す。

表４に示す結果より、特定波長の光の照射により平面構造と非平面構造とに構造異性化する有機基が結合された残基が触媒活性ループの３’側の端または基質ＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド中に導入されたＤＮＡエンザイムに対し、特定波長の光を照射することにより該有機基を平面構造と非平面構造とに可逆的に構造異性化させることで、ＲＮＡ切断活性を制御できることが確認された。また、平面構造と非平面構造とに構造異性化する有機基が結合されたヌクレオチド残基を触媒活性ループの３’側の端および基質ＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド中の両方に導入されたＤＮＡエンザイムにおいても、光照射によりＲＮＡ切断活性を制御することができると考えられる。

本発明の高活性ＤＮＡエンザイムを使用することで、従来と比較し、メッセンジャーＲＮＡのレベルでの遺伝子発現の抑制を効率的に行うことが可能となる。また、光照射によりＤＮＡエンザイムの酵素活性を制御することができることにより、遺伝子発現を可逆的に制御することが可能となる。これにより、バイオテクノロジーの種々の分野において、その有用性が期待できる。

Claims

ＤＮＡエンザイムの触媒活性ループの３’側の端に、アゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されていることを特徴とするＤＮＡエンザイム。
次式、

（上記式中、Ａは触媒活性ループ端を表し、Ｂはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｘはアゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基を表し、Ｒは水素原子または炭素原子数１〜４のアルキル基を表す）で表される請求項１記載のＤＮＡエンザイム。
前記Ｘが次式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）、

（上記式中、Ｒ^１、Ｒ^１１、Ｒ^２１は夫々直接の結合；未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０のアルキレン基、または未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０のアルケニレン基であり、Ｑは直接の結合、酸素原子、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−ＣＯ−基または−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−ＮＨ−基、但しｎ＝１〜５であり、Ｒ^２〜Ｒ^１０、Ｒ^１２〜Ｒ^２０、Ｒ^２２〜Ｒ^３０は夫々独立に、未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す）で表される請求項２記載のＤＮＡエンザイム。
ＤＮＡエンザイムのＲＮＡ切断活性を制御するにあたり、アゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されているＤＮＡエンザイムに対し、特定波長の光を照射することにより該有機基を平面構造と非平面構造とに可逆的に構造異性化させることを特徴とするＤＮＡエンザイムの活性制御方法。
前記ヌクレオチド残基の導入位置が触媒活性ループの３’側の端である請求項４記載のＤＮＡエンザイムの活性制御方法。
前記ＤＮＡエンザイムが次式、

（上記式中、Ａは触媒活性ループ端を表し、Ｂはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表し、Ｘはアゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基を表し、Ｒは水素原子または炭素原子数１〜４のアルキル基を表す）で表される請求項５記載のＤＮＡエンザイムの活性制御方法。
前記Ｘが次式（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）、

（上記式中、Ｒ^３１、Ｒ^４１、Ｒ^５１は夫々直接の結合；未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０のアルキレン基、または未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０のアルケニレン基であり、Ｑは直接の結合、酸素原子、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ−ＣＯ−基または−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−ＮＨ−基、但しｎ＝１〜５であり、Ｒ^３２〜Ｒ^３７、Ｒ^３９、Ｒ^４０、Ｒ^４２〜Ｒ^４７、Ｒ^４９、Ｒ^５０、Ｒ^５２〜Ｒ^５７、Ｒ^５９、Ｒ^６０は夫々独立に、未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基であり、Ｒ^３８、Ｒ^４８、Ｒ^５８は、夫々独立に、未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数１〜２０のアルキル基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数２〜２０のアルケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；またはハロゲン原子を表す）で表される請求項６記載のＤＮＡエンザイムの活性制御方法。