WO2005083073A1 - Ｄｎａエンザイムおよびその活性制御方法 - Google Patents

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dna
dna enzyme
nitro
substituted
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Hiroyuki Asanuma
Makoto Komiyama
Daijiro Matsunaga
Takeshi Kuramochi
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Japan Science And Technology Agency
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical

Definitions

  • the present invention relates to a DNA enzyme and a method for controlling its activity. More specifically, the present invention relates to a DNA enzyme whose RNA-cleaving activity is greatly improved compared to a DNA enzyme consisting of only natural four bases, and a specific wavelength. The present invention relates to a method for controlling the activity of a DNA enzyme by light irradiation.
  • RNA hydrolase consisting of only natural DNA
  • RNA hydrolase composed solely of DNA is generally called DNA enzyme (DNA ribozyme, DNAzyme), and is a human elibonuclease developed by an in vitro selection method and is a metal in vivo. Since Mg 2+ is used as a cofactor, it can be applied in vivo.
  • DNA enzyme DNA ribozyme, DNAzyme
  • Mg 2+ is used as a cofactor, it can be applied in vivo.
  • the base sequence of the substrate RNA at the cleavage site is GA for the 8-17 type DNA enzyme, and Y (U or C) R (A or G) for the 10-23 type DNA enzyme.
  • the sequence of the DNA enzyme is complementary to the substrate RNA.
  • CCGAGCCGG ACGA SEQ ID NO: 1 in the 8-17 type DNA enzyme
  • GGCTAGCTACAA CGA SEQ ID NO: 2 in the 10-23 type DNA enzyme are catalytically active loops and are not complementary to substrate RNA.
  • Non-Patent Document 2 control of gene expression by light irradiation is reported in Non-Patent Document 2, and the control of gene expression is performed by using artificial DNA in which azobenzene is introduced into the side chain of DNA.
  • azobenzene is reversibly structurally isomerized into a trans-form (planar structure) and a cis-form (non-planar structure) by irradiation with light of a specific wavelength.
  • Non-Patent Document 1 Proceedings of the National Academy of sciences of the United States of America 94.4262-4266 (1997)
  • Non-Patent Document 2 Journal of Japanese Society for Biomaterials 21.290-296 (2003) Disclosure of Invention
  • Non-Patent Document 1 has a very low activity as compared with a natural ribozyme whose RNA cleavage activity itself is never high. So DNAenza It is hoped that the high activity of the film is high.
  • an object of the present invention is to provide a DNA enzyme which has significantly improved RNA cleavage activity as compared with the conventional DNA enzyme.
  • Another object of the present invention is to provide an activity control method capable of reversibly controlling the RNA cleavage activity of a DNA enzyme by light irradiation.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found that the above object can be achieved by introducing a nucleotide residue having a planar structure into a predetermined site of a DNA enzyme.
  • the inventors have completed the DNA enzyme of the present invention.
  • the DNA enzyme of the present invention comprises, at the end of the catalytic activity loop of the DNA enzyme on the third end, an organic group selected from the group consisting of azobenzene, spiropyran, stilbene, and derivatives thereof! Is characterized by the fact that the nucleotide residue to which is linked is introduced!
  • the present inventors can reversibly convert the planar structure into a non-planar structure by irradiating the DNA enzyme with light having a specific wavelength, whereby the DNA enzyme can be reshaped. It has been found that the RNA cleavage activity can be controlled and the above-mentioned other objects can be achieved, and the activity control method of the present invention has been completed.
  • some organic groups selected from the group consisting of azobenzene, spiropyran, stilbene and derivatives thereof are bound.
  • the organic group is reversibly structurally changed into a planar structure and a non-planar structure. To do.
  • the DNA enzyme of the present invention into which a nucleotide residue having a planar structure has been introduced has a significantly greater RNA cleavage activity than a DNA enzyme consisting of only four natural bases. To improve. Further, according to the method for controlling the activity of a DNA enzyme of the present invention, it becomes possible to reversibly control the cleavage activity of a DNA enzyme by irradiation with light of a specific wavelength, and light control of gene expression in vivo can be expected. .
  • the DNA enzyme of the present invention is selected from the group consisting of azobenzene, spiropyran, stilbene, and derivatives thereof having a planar structure at the 3 ′ end of the catalytic activity loop of the DNA enzyme described in Non-Patent Document 1.
  • Nucleotide residue to which the organic group is bonded is introduced and chemically modified.
  • the base sequence of Kagami DNA Enzyme is complementary to the substrate RNA except for the catalytically active loop.
  • the nucleotide sequence of RNA is not particularly limited.
  • the DNA engine of the present invention is represented, for example, by the following formula.
  • A represents a catalytically active loop end
  • B represents a nucleotide or an oligonucleotide
  • X represents any organic group selected from the group consisting of azobenzene, spiropyran, stilbene, and derivatives thereof.
  • R is unsubstituted or substituted with a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, or a carboxyl group, which is an alkyl group or an alkoxy group having 11 to 20, preferably 1 to 10, and more preferably 114 carbon atoms;
  • water An acid group; a halogen atom; an amino group; a nitro group;
  • X is preferably azobenzene or a derivative thereof. Further, any intervening group may be present at the bonding portion with the nucleotide residue. Examples of X include an organic group represented by the following formula (1), (II) or ( ⁇ ).
  • Each of the lengths 11 and R 21 is a direct bond; unsubstituted or substituted with a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, or a carboxyl group, each having 1 to 20, preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 10 carbon atoms.
  • Q is a direct bond, an oxygen atom, a (CH) NH—CO— group or a — (CH) CO—NH— group, where n
  • R 2 — R 10 , R 12 — R 2 °, and R 22 — R 3 ° are each independently 1 to 1 carbon atoms that are unsubstituted or substituted with a halogen atom, hydroxyl group, amino group, nitro group, or carboxyl group. 20, preferably 1-10, more preferably 1-14 alkyl or alkoxy groups; Substituted or substituted with a halogen, hydroxyl, amino, nitro or carboxyl group, has 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 4 alkenyl or alkynyl groups; hydroxyl group A halogen atom; an amino group; a nitro group; or a carboxyl group.
  • the organic group to be introduced is preferably introduced covalently to any carbon atom in the case of an ethylene chain, or to the central carbon atom in the case of a trimethylene chain.
  • RNA cleavage activity of the DNA enzyme a method for controlling the RNA cleavage activity of the DNA enzyme will be described.
  • a nucleotide to which any one of organic groups selected from the group consisting of azobenzene, spiropyran, stilbene, and derivatives thereof is bonded to form a planar structure and a non-planar structure by irradiating light of a specific wavelength.
  • this is irradiated with light of a specific wavelength.
  • the organic group can be reversibly structurally isomerized into a planar structure and a non-planar structure, and the RNA cleavage activity can be controlled.
  • the base sequence of the DNA enzyme is a base complementary to the substrate RNA, except for the catalytically active loop.
  • the base sequence of RNA is not particularly limited.
  • the DNA enzyme of the present invention is obtained, and the ability to exhibit high RNA cleavage activity.
  • the introduction position is not particularly limited, and may be in an oligonucleotide complementary to the substrate RNA.
  • a powerful DNA enzyme is represented, for example, by the following equation.
  • a and B represent a hydrogen atom, a nucleotide or an oligonucleotide. However, A and B are not both hydrogen atoms.
  • X represents any organic group selected from the group consisting of azobenzene, spiropyran, stilbene, and derivatives thereof.
  • R is unsubstituted or substituted with a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, or a carboxyl group, and is an alkyl or alkoxy group having 1 to 20, preferably 1 to 10, and more preferably 114 carbon atoms;
  • the X is preferably azobenzene or a derivative thereof.
  • any substituent may be present on the benzene ring as long as the function of controlling the enzyme activity by reversible structural isomerism due to light irradiation is not impaired.
  • it may have an intervening group, it is preferable that the substituent at the para-position of azobenzene and the intervening group are groups that do not form a resonance structure with the benzene ring.
  • Substituents such as a carboxyl group, an amino group, and a nitro group in the nora position and an amide bond in the para position take a resonance structure in the para position, so that azobenzene is a cis form (non-planar structure) and trans form. This is because it becomes thermally heterogeneous (flat structure).
  • the substituent at the meta position is preferably a group other than the -toro group.
  • Examples of X include an organic group represented by the following formula (IV), (V) or (VI).
  • R 31 , R 41 and R 51 are each a direct bond; unsubstituted or substituted with a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group or a carboxyl group.
  • the number of carbon atoms in the alkylene group is 1 to 20, preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 4, or unsubstituted or substituted by a halogen atom, hydroxyl group, amino group, nitro group or carboxyl group. 2-20, preferably 2-10, and more preferably 2-4 alkenylene groups.
  • Q is a direct bond, an oxygen atom, a (CH) NH—CO— group or
  • R — R, R, R, R — R, R, R, R, R, R 6 are each independently unsubstituted or substituted with a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, or a carboxyl group
  • the light to be irradiated for the purpose of structural isomerization of the organic group if the isomerization of the organic group is possible, light of all wavelengths in the ultraviolet region and in the infrared region can be used. 300 nm or more that does not damage A is preferable. For example, by irradiating 300-400 nm light (UV light), one isomer is structurally isomerized to another isomer, and by irradiating light (visible light) of 400 nm or more, the opposite change is observed. Can wake up.
  • UV light UV light
  • visible light visible light
  • 3-aminobenzoic acid VII was dissolved in acetic acid, a solution of nitrosobenzene in acetic acid was mixed with the mixture, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours to obtain a crude product of 3-ferazobenzoic acid VIII.
  • the obtained crude product was purified by recrystallization using ethanol. It was.
  • the obtained 3-phenylazobenzoic acid VIII is reacted with D-threonol in N, N-dimethylformamide (DMF) in the presence of dicyclohexylcarbodiimide and 1-hydroxybenzotriazole.
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • the obtained ⁇ -conjugated product IX was separated and purified by column chromatography, and then purified in a pyridine-dichloromethane mixed solvent according to the method described in Angewandte Chemie International edition 40.2671-2673 (2001).
  • a pyridine-dichloromethane mixed solvent By reacting 4,4, dimethoxytrityl chloride in the presence of dimethylaminopyridine, the crude product of the compound X, in which one hydroxyl group is protected by a 4,4'-dimethoxytrityl (DMT) group, is obtained.
  • DMT 4,4'-dimethoxytrityl
  • a phosphoramidite monomer XI (b) was synthesized in the same manner as described above except that 4-phenylazobenzoic acid was used instead of 3-phenylazobenzoic acid VIII.
  • a phosphoramidite monomer XI (c) was synthesized in exactly the same manner as described above except that paramethyl red was used instead of 3-phenylazobenzoic acid VIII.
  • DNA-modified DNA enzyme into which the azobenzene derivative of the present invention was introduced was synthesized.
  • a 10-23 type DNA enzyme was synthesized.
  • the chemically modified DNA enzyme was synthesized using an ABI394-type DNA synthesizer, and the above-obtained phosphoamidite monomers XI (a)-(c) and the commercially available phosphoamidite monomers corresponding to the four natural bases were synthesized.
  • a DNA enzyme of the present invention (DNA-1A: SEQ ID NO: 4, DNA-1B: SEQ ID NO: 5, DNA-1C: SEQ ID NO: 6) having the following base sequence was synthesized.
  • DNA-N SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 3 a DNA enzyme composed of only four natural bases
  • Table 1 The base sequence is shown in Table 1 below.
  • the underlined nucleotide sequence represents a catalytic activity loop.
  • RNA used as the substrate is as follows. To fluorescently label the substrate RNA,
  • Fluorescein isothiocyanate (FITC) was introduced.
  • DNA-1 A SEQ ID NO: 4
  • DNA-1B SEQ ID NO: 5
  • DNA-1C SEQ ID NO: 6)
  • RNA cleavage experiments were performed according to the procedure. First, 4 ⁇ L of the DNA Enzyme aqueous solution, 4 / z L of the substrate RNA aqueous solution, and 4 L of the buffer aqueous solution are collected in a microtube, and sufficiently collected at room temperature. Stir to 'mix. The final concentration of each substance contained in the reaction solution was prepared as follows.
  • Tris-HCl 50mmol / L
  • RNA cut is quantified by exciting FITC with 470 nm light using a fluoro imager (FLA-3000: manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) and monitoring the fluorescence intensity at 520 nm. It has become.
  • FLA-3000 manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.
  • a DNA enzyme was additionally synthesized according to the method of Synthesis Example 1.
  • the base sequence is shown in Table 3 below.
  • the underlined nucleotide sequence represents the catalytic activity loop
  • a reaction solution was prepared at room temperature according to exactly the same procedure as in Example 13-13. Next, this was transferred to a thermostat at 37 ° C, and irradiated with ultraviolet light through a UV-D36C filter (made by Asahi Techno Glass) using a UV-A fluorescent lamp (FL6BL-1A: made by Toshiba). For a reaction time. Under these conditions, the intensity of the UV light was less than 100 ⁇ j / cm 2 . In addition, a reaction solution having the same composition was reacted under exactly the same conditions except that UV light was not irradiated.
  • RNA cleavage activity can be controlled by irradiation with light even in A-enzyme.
  • the highly active DNA enzyme of the present invention By using the highly active DNA enzyme of the present invention, it becomes possible to more efficiently suppress gene expression at the level of the messenger RNA as compared with the related art.
  • the ability to control the enzyme activity of the DNA enzyme by light irradiation makes it possible to reversibly control gene expression. Thus, its usefulness can be expected in various fields of biotechnology.

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Abstract

　これまでのＤＮＡエンザイムに比し大幅にＲＮＡ切断活性を向上させたＤＮＡエンザイム、および、光照射により可逆的にＤＮＡエンザイムのＲＮＡ切断活性を制御することができる活性制御方法を提供する。 　ＤＮＡエンザイムの触媒活性ループの３’側の端に、アゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されているＤＮＡエンザイム、およびＤＮＡエンザイムのＲＮＡ切断活性を制御するにあたり、アゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されているＤＮＡエンザイムに対し、特定波長の光を照射することにより該有機基を平面構造と非平面構造とに可逆的に構造異性化させることによる活性制御方法である。

Description

明 細 書
DNAェンザィムおよびその活性制御方法
技術分野
[0001] 本発明は、 DNAェンザィムおよびその活性制御方法に関し、詳しくは、天然の 4つ の塩基のみで構成される DNAェンザィムより RNA切断活性を大幅に向上させた D NAェンザィム、および、特定波長の光照射による DNAェンザィムの活性制御方法 に関する。
背景技術
[0002] RNAを配列選択的に加水分解することが可能となれば、メッセンジャー RNAのレ ベルでの遺伝子発現を抑制することが可能となり、遺伝子に基づく疾病の治療への 応用が期待できる。天然に存在する RNA分解酵素はたんぱく質ではなぐ RNAの みから構成されており、リボザィムと呼ばれている。しかし RNAは不安定で分解され やすいため、より安定な DNA加水分解酵素 (人工酵素）が求められていた。その要 請に対し、 1997年にアメリカの Joyceらによって世界で初めて天然の DNAのみから 構成される RNA加水分解酵素が提案された (非特許文献 1)。
[0003] DNAのみから構成される RNA加水分解酵素は一般的に DNAェンザィム（デォキ シリボザィム、 DNAザィム）と称され、 in vitro selection法により開発された人エリ ボヌクレアーゼであり、生体内金属である Mg2+をコファクターとすることから in vivo での応用が可能である。その具体的内容は非特許文献 1に開示され、 8— 17型の D NAェンザィムと 10— 23型の DNAェンザィムがあり、その配列式は以下のようになつ ている。
[0004]
Figure imgf000003_0001
10 - 23型の DNAェンザィム
[0005] 上記配列式中の矢印は切断部位を示す。切断部位における基質 RNAの塩基配 列は、 8— 17型の DNAェンザィムの場合は GAとなり、 10— 23型の DNAェンザィム の場合は Y(Uまたは C)R(Aまたは G)となる。 DNAェンザィムの配列は基質 RNAと 相補的な配列となる。ただし、 8— 17型の DNAェンザィムにおける CCGAGCCGG ACGA (配列番号 1)や 10— 23型の DNAェンザィムにおける GGCTAGCTACAA CGA (配列番号 2)は触媒活性ループであり、基質 RNAと相補的ではない。
[0006] 一方、光照射による遺伝子発現制御に関しては、非特許文献 2に報告されており、 その遺伝子発現制御は、ァゾベンゼンを DNAの側鎖に導入した人工 DNAを用いる ことにより行われる。具体的には、ァゾベンゼンは特定波長の光照射によりトランス体 (平面構造)とシス体 (非平面構造)とに可逆的に構造異性化されるため、このァゾべ ンゼンの特性を利用することにより、 DNAの二重鎖の形成と解離の光制御、三重鎖 形成の光制御等を行うことが可能となる。
非特許文献 1： Proceedings of the National Academy of sciences of the United States of America 94.4262-4266(1997)
非特許文献 2 : Journal of Japanese Society for Biomaterials 21.290-296(2003) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 非特許文献 1に示される DNAェンザィムは RNA切断活性そのものは決して高くな ぐ天然のリボザィムと比較すると活性は非常に低いものである。そこで DNAェンザ ィムの高活性ィ匕が望まれて 、る。
[0008] また、 DNAェンザィムの RNA切断活性を制御することは極めて困難とされており、 反応系内の条件を変化させることなぐ外部刺激、例えば、光照射により、可逆的に 活性制御することができれば、その有用性は大幅に向上し得るものである。
[0009] そこで、本発明の目的は、これまでの DNAェンザィムに比し大幅に RNA切断活性 を向上させた DN Aェンザィムを提供することにある。
[0010] また、本発明の他の目的は、光照射により可逆的に DNAェンザィムの RNA切断 活性を制御することができる活性制御方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、 DNAェンザィムの所定 の部位に平面構造を有するヌクレオチド残基を導入することにより、上記目的を達成 し得ることを見出し、本発明の DNAェンザィムを完成するに至った。
[0012] 即ち、本発明の DN Aェンザィムは、 DNAェンザィムの触媒活性ループの 3，側の 端に、ァゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から 選ばれる!/ヽずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されて!ヽることを特 徴とするちのである。
[0013] また、本発明者らは、上記 DNAェンザィムに特定波長の光を照射することで上記 平面構造を非平面構造に可逆的に構造異性ィ匕させることができ、これにより DNAェ ンザィムの RNA切断活性を制御することができ、上記他の目的を達成し得ることを見 出し、本発明の活性制御方法を完成するに至った。
[0014] 即ち、本発明の活性制御方法は、 DNAェンザィムの RNA切断活性を制御するに あたり、ァゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から 選ばれる ヽずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入されて!ヽる DNAェ ンザィムに対し、特定波長の光を照射することにより該有機基を平面構造と非平面構 造とに可逆的に構造異性ィ匕させることを特徴とするものである。
発明の効果
[0015] 平面構造を有するヌクレオチド残基が導入された本発明の DNAェンザィムは、天 然の 4つの塩基のみで構成される DNAェンザィムと比較し、 RNA切断活性が大幅 に向上する。また、本発明の DNAェンザィムの活性制御方法によれば、特定波長の 光の照射により可逆的に DNAェンザィムの切断活性を制御することが可能となり、 in vivoでの遺伝子発現の光制御が期待できる。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 以下、本発明の実施の好適形態を具体的に説明する。
本発明の DNAェンザィムは、前記非特許文献 1記載の DNAェンザィムの触媒活 性ループの 3'側の端に、平面構造を有するァゾベンゼン、スピロピラン、スチルベン およびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基が結合されたヌクレ ォチド残基が導入され、化学修飾されたものである。カゝかる DNAェンザィムの塩基 配列は触媒活性ループを除き、基質 RNAと相補的な塩基である。ただし、 RNAの 塩基配列は、特に制限されるものではない。
[0017] 本発明の DN Aェンザィムは、例えば、次式で表される。
Figure imgf000005_0001
[0018] 上記式中、 Aは触媒活性ループ端を表し、 Bはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ ドを表す。また、 Xはァゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体か らなる群から選ばれるいずれかの有機基を表す。 Rは未置換またはハロゲン原子、水 酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 1一 20、好ましく は 1一 10、より好ましくは 1一 4のアルキル基もしくはアルコキシ基;未置換またはハロ ゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 2— 20、好ましくは 2— 10、より好ましくは 2— 4のァルケ-ル基もしくはアルキ-ル基；水 酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；または力ルポキシル基を表す。
[0019] 前記 Xは、好ましくは、ァゾベンゼンまたはその誘導体である。また、ヌクレオチド残 基との結合部にいかなる介在基を有していてもよい。 Xとしては、例えば、次式 (1)、 (I I)または (ΠΙ)で表される有機基を挙げることができる。
Figure imgf000006_0001
—
Figure imgf000006_0002
[0020] 上記式 (1)、（Π)および (ΠΙ)中、
Figure imgf000006_0003
尺11、 R21は夫々直接の結合;未置換もしくはハ ロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 1 一 20、好ましくは 1一 10、更に好ましくは 1一 4のアルキレン基、または未置換もしくは ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 2— 20、好ましくは 2— 10、更に好ましくは 2— 4のァルケ-レン基である。 Qは、直接 の結合、酸素原子、 （CH ) NH— CO—基または—（CH ) CO— NH—基、但し n
2 n 2 n
= 1一 5である。 R2— R10、 R12— R2°、 R22— R3°は夫々独立に、未置換またはハロゲ ン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 1一 2 0、好ましくは 1一 10、更に好ましくは 1一 4のアルキル基もしくはアルコキシ基;未置 換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭 素原子数 2— 20、好ましくは 2— 10、更に好ましくは 2— 4のァルケ-ル基もしくはァ ルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す
[0021] 本発明に係るヌクレチド残基の導入された DNAェンザィムの合成は、既知の手法 、例えば、 The Journal of Organic Chemistry 62.846—852(1997)、 Tetrahedron Letters 39.9019— 9022(1998)および Angewandte Chemie International edition 40.2671-2673(2001)に記載の手法に従い、行うことができる。夫々のヌクレオチド残 基に対応するホスホアミダイトモノマーを合成し、既存の DNA合成機を使用すること により、所望のヌクレオチド残基を導入した DNAェンザィムを合成することができる。 この場合、ポリメチレン鎖は様々な長さのものを用いることができる力 未置換または アルキル基で置換されたエチレン鎖またはトリメチレン鎖が好ましい。また、この場合
、導入すべき有機基は、エチレン鎖の場合にはいずれかの炭素原子に、トリメチレン 鎖の場合には中央の炭素原子に共有結合的に導入するのが好ましい。
[0022] 次に、 DNAェンザィムの RNA切断活性を制御する方法について説明する。先ず 、特定波長の光を照射することにより平面構造と非平面構造とに構造異性ィ匕するァ ゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれる いずれかの有機基が結合されたヌクレオチド残基が導入された DNAェンザィムを用 い、これに特定波長の光を照射する。これにより平面構造と非平面構造とに可逆的 に前記有機基を構造異性化させることができ、 RNA切断活性が制御可能となる。こ こで、 DNAェンザィムの塩基配列は触媒活性ループを除き、基質 RNAと相補的な 塩基である。ただし、 RNAの塩基配列は、特に制限されるものではない。
[0023] また、前記ヌクレオチド残基の導入位置が触媒活性ループの 3 '側の端であれば本 発明の DNAェンザィムとなり、高い RNA切断活性を示すことになる力 本発明の活 性制御方法は前記導入位置は特に制限されるものではなぐ基質 RNAと相補的な オリゴヌクレオチド中であってもよい。力かる DNAェンザィムは、例えば、次式で表さ れる。
Figure imgf000008_0001
[0024] 上記式中、 Aおよび Bは水素原子、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを表す。伹 し、 Aおよび Bが共に水素原子である場合はない。 Xはァゾベンゼン、スピロピラン、ス チルベンおよびこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれかの有機基を表す。 Rは未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換 された炭素原子数 1一 20、好ましくは 1一 10、より好ましくは 1一 4のアルキル基もしく はアルコキシ基;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ ル基で置換された炭素原子数 2— 20、好ましくは 2— 10、より好ましくは 2— 4のアル ケニル基もしくはアルキ-ル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカル ボキシル基を表す。
[0025] 前記 Xは、好ましくは、ァゾベンゼンまたはその誘導体である。この場合、光照射に よる可逆的な構造異性ィヒによる酵素活性の制御機能を害しない限り、ベンゼン環に いかなる置換基を有していてもよぐまた、ヌクレオチド残基との結合部にいかなる介 在基を有して ヽてもよ ヽが、好ましくはァゾベンゼンのパラ位の置換基および介在基 は、ベンゼン環と共鳴構造をとらない基とする。
[0026] ノラ位におけるカルボキシル基、アミノ基、ニトロ基のような置換基およびパラ位に おけるアミド結合は、パラ位に共鳴構造をとるため、ァゾベンゼンはシス体 (非平面構 造）とトランス体 (平面構造)へ熱的に異性ィ匕しゃすくなるためである。なお、メタ位の 置換基は-トロ基以外の基であることが好ましい。 Xとしては、例えば、次式 (IV)、 (V )または (VI)で表される有機基を挙げることができる。
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
上記式 (IV)、 （V)および (VI)中、 R31、 R41、 R51は夫々直接の結合;未置換もしく はハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子 数 1一 20、好ましくは 1一 10、更に好ましくは 1一 4のアルキレン基、または未置換も しくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素 原子数 2— 20、好ましくは 2— 10、更に好ましくは 2— 4のァルケ-レン基である。 Q は、直接の結合、酸素原子、 (CH ) NH— CO—基または— (CH ) CO— NH—
2 n 2 n
-υ- /α 7 -. |-^- j. -, 32 -, 37 -, 39 -,40 π42 π 47 π49 π 50 π 52 π 57 π 59 基、伹し η= 1— 5である。 R — R 、R 、R 、R — R 、R 、R 、R — R 、R 、 R6は夫々独立に、未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボ キシル基で置換された炭素原子数 1一 20、好ましくは 1一 10、更に好ましくは 1一 4 のアルキル基もしくはアルコキシ基;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、 ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 2— 20、好ましくは 2— 10、更に 好ましくは 2— 4のァルケ-ル基もしくはアルキ-ル基；水酸基；ハロゲン原子；ァミノ 基; -トロ基;またはカルボキシル基を表す。また、 R38、 R48、 R58は、夫々独立に、未 置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された 炭素原子数 1一 20、好ましくは 1一 10、更に好ましくは 1一 4のアルキル基もしくはァ ルコキシ基;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル 基で置換された炭素原子数 2— 20、好ましくは 2— 10、更に好ましくは 2— 4のァルケ -ル基もしくはアルキ-ル基;水酸基;またはハロゲン原子を表す。また、好ましくは、 式 (IV)中にお 、て Q— R31—はァゾベンゼンと共鳴構造をとらな 、介在基である。
[0028] 前記有機基を構造異性化させるために照射する光は、該有機基の異性ィ匕が可能 ならば紫外領域力も赤外領域までのすべての波長の光を用いることができるが、 DN Aを損傷させない 300nm以上が好ましい。例えば、 300— 400nmの光（UV光）を 照射することにより、一の異性体から他の異性体に構造異性化し、 400nm以上の光 (可視光)を照射することにより、その逆の変化を起こすことができる。
実施例
[0029] 以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明をするが、本発明はこれら実施例 に限定されるものではない。
[0030] 合成例 1
「ァゾベンゼン誘導体導入 DNAェンザィムの合成」
以下のスキームにて合成を行った。
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
先ず、 3—ァミノ安息香酸 VIIを酢酸に溶解させ、これにニトロソベンゼンの酢酸溶液 を混合し、 12時間室温で攪拌することで、 3—フエ-ルァゾ安息香酸 VIIIの粗生成物 を得た。次に、得られた粗生成物をエタノールを用い、再結晶を行うことにより精製し た。得られた 3—フエ-ルァゾ安息香酸 VIIIと D—トレオ-ノールを N, N—ジメチルホ ルムアミド（DMF)中で、ジシクロへキシルカルボジイミドと 1ーヒドロキシベンゾトリアゾ ールの存在下にて反応させることにより 3—フエ-ルァゾ安息香酸 VIIIと D—トレオニノ ールとがアミド結合によって結合されたィ匕合物 IXの粗生成物を得た。
[0031] 次に、得られたィ匕合物 IXをカラムクロマトグラフ法で分離精製した後、 Angewandte Chemie International edition 40.2671-2673(2001)記載の手法に従い、ピリジン'ジク ロロメタン混合溶媒中で 4ージメチルァミノピリジンの存在下にて 4, 4，ージメトキシトリ チルクロリドを反応させることにより、 4, 4'ージメトキシトリチル (DMT)基で一方の水 酸基を保護したィ匕合物 Xの粗生成物を得た。得られたィ匕合物 Xをカラムクロマトグラフ 法で分離精製した。次に、 The Journal of Organic Chemistry 62.846-852(1997)、 Tetrahedron Letters 39.9019- 9022(1998)記載の手法に従い、得られた化合物 Xと 2 —シァノエチルー N, N, Ν' , N'—テトライソプロピルホスホロジアミダイトをァセトニトリ ル中で、 1H—テトラゾール存在下にて反応させることにより、もう一方の水酸基にホス ホロアミジドが付加したホスホアミダイトモノマー XI (a)の粗生成物を得た後、カラムク 口マトグラフ法で分離精製した。
[0032] また、 3 フエ-ルァゾ安息香酸 VIIIの代わりに 4 フエ二ルァゾ安息香酸を用いる 以外は上記と全く同様の方法によって、ホスホロアミダイトモノマー XI (b)を合成した 。更に、 3—フエ-ルァゾ安息香酸 VIIIの代わりにパラーメチルレッドを用いる以外は 上記と全く同様の方法によってホスホロアミダイトモノマー XI (c)を合成した。
[0033] 最後に、本発明であるァゾベンゼン誘導体を導入したィ匕学修飾 DNAェンザィムの 合成を行った。本実施例では、 10— 23型の DNAェンザィムを合成した。化学修飾 D NAェンザィムの合成は ABI394型 DNA合成機を使用し、上記の得られたホスホア ミダイトモノマー XI (a)一（c)と 4つの天然の塩基に対応する市販のホスホアミダイトモ ノマーを用い、下記の塩基配列を持つ本発明の DNAェンザィム（DNA— 1A：配列 番号 4、 DNA— 1B :配列番号 5、 DNA— 1C :配列番号 6)を合成した。通常のプロトコ ルに従い、粗生成物を得た後、その粗生成物をゲル精製、高速液体クロマトグラフィ 一精製を行い精製した。また、比較例として、天然の 4つの塩基のみで構成される D NAェンザィム（DNA— N :配列番号 3)も、上記と同様の手法で合成した。夫々の塩 基配列を下記の表 1に示す。塩基配列中、下線部の引かれた塩基配列は触媒活性 ループを表す。
[0034] [表 1]
DNA
塩基配列
ェンザィム
DNA - N
5' CTGAAGGGGGCTAGCTACAACGATTCTTCCT 3' (配列番号 3)
DNA一 1A
5' - CTGAAGGGGGCTAGCTACAACGAX^TTCTTCCT - 3'
(配列番号 4)
DNA一 1B
5， - CTGAAGGGGGCTAGCTACAACGAXBTTCTTCCT - 3' (配列番号 5)
DNA - 1C
5' CTGAAGGGGGCTAGCTACAACGAX^TTCTTCCT 3' (配列番号 6)
[0035] 全ての DNAェンザィムは MALDI— TOFMSにより同定した。また、基質として用 いた RNAの配列は以下の通りである。基質 RNAを蛍光ラベルするために、 5 '末端 に次式、
Figure imgf000013_0001
で表されるフルォレセインイソチオシアナート (FITC)を導入した。
5 ' - (FITC) -AGGAAGAAGCCCUUCAG-3 ' (配列番号 7)
[0036] ¾施例 ί一 3、 t m
「RNA切断実験」
合成例 1にて合成した DNAェンザィム（DNA— N：配列番号 3、 DNA— 1 A：配列番 号 4、 DNA— 1B :配列番号 5、 DNA— 1C :配列番号 6)を用いて、以下の手順に従つ て RNA切断実験を行った。まず、 DNAェンザィムの水溶液を 4 μ L,基質 RNAの 水溶液 4 /z L、更にバッファー水溶液 4 Lをマイクロチューブに採取し、室温で十分 に攪拌 '混合した。反応液中に含まれる各物質の最終濃度は以下の通りとなるように 調製した。
DN Aェンザィム： 16 mol/L
基質 RNA: 1. 6 μ mol/L
Tris-HCl: 50mmol/L
塩化マグネシウム： lOmmolZL
塩化ナトリウム： ImolZL
[0037] 次に、得られた反応溶液を 37°Cに調整した恒温槽に移し、比較例 1 (DNA-N：配 列番号 3)および実施例 1一 2 (DNA— 1A:配列番号 4、 DNA— 1B:配列番号 5)は 1 時間、実施例 3 (DNA - 1C :配列番号 6)は 40分間、反応させた。その後、尿素 10m olZLとエチレンジァミン四酢酸 50mmolZLを含む水溶液を 12 L加えて反応を停 止させ、アクリルアミドゲル電気泳動法により RNAの切断断片と未切断の RNAを分 離した。最後に、このゲルをフルォロイメージヤー（FLA— 3000 :富士写真フィルム社 製）を用いて 470nmの光で FITCを励起し、 520nmの蛍光強度をモニターすること で、 RNAの切断量を定量化した。その切断結果を下記の表 2に示す。
[0038] [表 2]
Figure imgf000014_0001
[0039] 表 2に示す結果より、 DNAェンザィムの触媒活性ループの 3'側の端に平面性の 高 ヽ分子を化学的に導入することで、天然の塩基のみから形成される従来の DNA ェンザィムより、高い RNA切断活性を有することが確認された。また、メターァゾ (実施 例 1)、パラーァゾ (実施例 2)、メチルレッド (実施例 3)の三者とも同程度の RNA切断 活性を有することから、平面状物質であれば、インター力レートして安定ィ匕させること ができると考えられる。
[0040] 実施例 4一 7、比較例 2
「RNA切断活性の光制御」
合成例 1の方法に準拠して、 DNAェンザィムを追加合成した。その塩基配列を下 記の表 3に示す。塩基配列中、下線の引かれた塩基配列は触媒活性ループを表す
[0041] [表 3]
Figure imgf000015_0001
[0042] 得られた DN Aェンザィムを用い、実施例 1一 3と全く同様の手順に従 ヽ、室温で反 応溶液を調製した。次に、これを 37°Cの恒温槽に移し、 UV— A蛍光ランプ (FL6BL 一 A：東芝製)を用いて UV— D36Cフィルター（朝日テクノグラス製)を通した紫外光を 照射しながら所定の時間反応させた。この条件下での UV光の強度は、 lOO ^j/c m2以下であった。また、同じ組成の反応溶液を、 UV光を照射しない事以外は全く同 じ条件で反応させた。その後、実施例 1一 3と同様に尿素一 EDTA溶液を加えて反応 を停止させ、アクリルアミドゲル電気泳動法により RNAの切断断片と未切断の RNA を分離した。最後に、このゲルをフルォロイメージヤー（FLA— 3000 :富士写真フィル ム社製）を用いて 470nmの光で FITCを励起し、 520nmの蛍光強度をモニターする ことで、 RNAの切断量を定量化した。その切断結果を下記の表 4に示す。
[0043] [表 4] DNA 切断量 (%)
ェンザィム 反応時間
UV光照射下 UV光未照射
DNA N
比較例 2 37.3 37.6 4時間
(配列番号 3)
DNA一 1A
実施例 4 12.4 38.8 1時間
(配列番号 4)
DNA - 1B
実施例 5 21.7 39.0 1時間
(配列番号 5)
DNA一 2A
実施例 6 18.0 29.4 4時間
(配列番号 8)
DNA - 3A
実施例 7 12.3 18.5 4時間
(配列番号 9)
[0044] 表 4に示す結果より、特定波長の光の照射により平面構造と非平面構造とに構造異 性化する有機基が結合された残基が触媒活性ループの 3 '側の端または基質 RNA と相補的なオリゴヌクレオチド中に導入された DNAェンザィムに対し、特定波長の光 を照射することにより該有機基を平面構造と非平面構造とに可逆的に構造異性化さ せることで、 RNA切断活性を制御できることが確認された。また、平面構造と非平面 構造とに構造異性化する有機基が結合されたヌクレオチド残基を触媒活性ループの 3 '側の端および基質 RNAと相補的なオリゴヌクレオチド中の両方に導入された DN Aェンザィムにおいても、光照射により RNA切断活性を制御することができると考え られる。
産業上の利用可能性
[0045] 本発明の高活性 DNAェンザィムを使用することで、従来と比較し、メッセンジャー R NAのレベルでの遺伝子発現の抑制を効率的に行うことが可能となる。また、光照射 により DNAェンザィムの酵素活性を制御することができることにより、遺伝子発現を 可逆的に制御することが可能となる。これにより、バイオテクノロジーの種々の分野に おいて、その有用性が期待できる。

Claims

請求の範囲
DNAェンザィムの触媒活性ループの 3，側の端に、ァゾベンゼン、スピロピラン、ス チルベンおよびこれらの誘導体力 なる群力 選ばれるいずれかの有機基が結合さ れたヌクレオチド残基が導入されていることを特徴とする DNAェンザィム。
次式、
Figure imgf000017_0001
(上記式中、 Aは触媒活性ループ端を表し、 Bはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ ドを表し、 Xはァゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる 群力 選ばれるいずれかの有機基を表し、 Rは水素原子または炭素原子数 1一 4の アルキル基を表す)で表される請求項 1記載の DNAェンザィム。
前記 Xが次式 (1)、（II)または (111)、
Figure imgf000018_0001
—
Figure imgf000018_0002
(上記式中、
Figure imgf000018_0003
1、 R21は夫々直接の結合;未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、 アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 1一 20のアルキレン基、 または未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で 置換された炭素原子数 2— 20のァルケ-レン基であり、 Qは直接の結合、酸素原子 、— (CH ) NH— CO—基または— (CH ) CO— NH—基、但し n= l— 5であり、 R2
2 n 2 n
一 R1C>、 R12— R2、 R22— R3は夫々独立に、未置換またはハロゲン原子、水酸基、ァ ミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 1一 20のアルキル基もしく はアルコキシ基;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ ル基で置換された炭素原子数 2— 20のァルケ-ル基もしくはアルキニル基；水酸基； ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシル基を表す)で表される請求項 2 記載の DNAェンザィム。
DNAェンザィムの RNA切断活性を制御するにあたり、ァゾベンゼン、スピロピラン 、スチルベンおよびこれらの誘導体力 なる群力 選ばれる 、ずれかの有機基が結 合されたヌクレオチド残基が導入されて 、る DNAェンザィムに対し、特定波長の光 を照射することにより該有機基を平面構造と非平面構造とに可逆的に構造異性化さ せることを特徴とする DNAェンザィムの活性制御方法。
[5] 前記ヌクレオチド残基の導入位置が触媒活性ループの 3 '側の端である請求項 4記 載の DNAェンザィムの活性制御方法。
[6] 前記 DN Aェンザィムが次式、
Figure imgf000019_0001
(上記式中、 Aは触媒活性ループ端を表し、 Bはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド を表し、 Xはァゾベンゼン、スピロピラン、スチルベンおよびこれらの誘導体からなる群 力 選ばれるいずれかの有機基を表し、 Rは水素原子または炭素原子数 1一 4のァ ルキル基を表す)で表される請求項 5記載の DNAェンザィムの活性制御方法。
前記 Xが次式 (IV)、（V)または (VI)、
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
(上記式中、 R31、 R41、 R51は夫々直接の結合;未置換もしくはハロゲン原子、水酸基 、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 1一 20のアルキレン基 、または未置換もしくはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で 置換された炭素原子数 2— 20のァルケ-レン基であり、 Qは直接の結合、酸素原子 、— (CH ) NH— CO—基または— (CH ) CO— NH—基、但し n= l— 5であり、 R32
2 n 2 n
一 R37、 R39、 R40、 R42— R47、 R49、 R50、 R52— R57、 R59、 R60は夫々独立に、未置換ま たはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原 子数 1一 20のアルキル基もしくはアルコキシ基;未置換またはハロゲン原子、水酸基 、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 2— 20のァルケ-ル 基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシ ル基であり、 R38、 R48、 R58は、夫々独立に、未置換またはハロゲン原子、水酸基、ァ ミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数 1一 20のアルキル基もしく はアルコキシ基;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ ル基で置換された炭素原子数 2— 20のァルケ-ル基もしくはアルキニル基；水酸基； またはハロゲン原子を表す)で表される請求項 6記載の DNAェンザィムの活性制御 方法。
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