JPWO2005078100A1

JPWO2005078100A1 - 薬剤耐性を獲得した癌細胞の検出方法

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Publication number: JPWO2005078100A1
Application number: JP2005517852A
Authority: JP
Inventors: 稲澤　譲治; 譲治稲澤; 幸一郎安居
Original assignee: BML Inc
Current assignee: BML Inc
Priority date: 2004-02-13
Filing date: 2004-02-13
Publication date: 2007-08-30
Also published as: WO2005078100A1; EP1715041A4; US20090143236A1; EP1715041A1

Abstract

本発明の目的は、薬剤耐性癌細胞を検出可能な新たな遺伝子マーカーを見いだし、かつ、当該マーカーを用いた薬剤耐性癌細胞の効率的かつ網羅的な検出手段を提供することである。本発明では、特に副作用が重篤で、癌患者に投与する頻度が高い制癌剤として、カンプトテシン類、シスプラチン類、エトポシド類、アドリアマイシン（ＡＤＭ）およびシトシンアラビノシド類の薬剤耐性癌細胞株と親癌細胞株における遺伝子増幅または欠失を解析することにより、癌細胞の薬剤耐性獲得に関連する新たな遺伝子マーカーとして、ＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＢ６遺伝子、ＡＢＣＢ８遺伝子、ＡＢＣＢ１０遺伝子、ＡＢＣＣ４遺伝子、ＡＢＣＣ９遺伝子、ＡＢＣＤ３遺伝子、ＡＢＣＤ４遺伝子、ＡＢＣＥ１遺伝子、ＡＢＣＦ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ２Ｌ１０、ＢＣＬ２Ｌ１、および、ＢＣＬ２Ａ１からなる群のＡＢＣトランスポーター系遺伝子またはＢＣＬ２ファミリー遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の増幅を検出することにより、当該被験癌細胞における制癌剤に対する薬剤耐性の獲得を検出し得ることを見いだした。

Description

本発明は、染色体の欠失或いは増幅を伴う、制癌剤に対する薬剤耐性を獲得した癌細胞の検出方法に関する発明である。

これまで、数多くの制癌剤が癌を治療するために使用されているが、重篤な副作用の発生、並びに反復投与により薬剤の効果の消失や不応答性等が重要な問題となっている。それは多くの場合、制癌剤耐性獲得細胞の出現に由来する。薬剤耐性は癌細胞での遺伝子の変化に起因する。その遺伝子産物は、薬剤の細胞内への輸送を低下させる或いは薬剤の細胞内から外への排出を促進させる、薬剤の不活性化、薬剤の解毒を促進させる、プロドラック（前駆体）から活性型への転換を抑制する、薬剤の標的蛋白質量の低下或いは活性の低下を誘導する、ＤＮＡ修復の活性を増大させる、アポトーシスの誘導を抑制すること等がその理由として上げられる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｕｍｏｕｒｓ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７５，７−１２，１９９５）。癌細胞で上記耐性付与が複数同時に起こる場合もある。
薬剤耐性癌細胞ではＭｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（多剤耐性蛋白質：ＭＤＲ及びＭＲＰ）と命名された細胞膜に局在するトランスポーターによる細胞からの薬剤の汲み出しが重要な役割を果たしている。例えば、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）或いはＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）遺伝子の増幅とその結果起こる過剰発現はかなりの数の薬剤耐性細胞に認められる（Ｋｕｗａｎｏ，Ｍ．，Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｔ．，Ｈａｙａｋａｗａ，Ｈ．，Ｏｎｏ，Ｍ．，Ｗａｄａ，Ｍ．，Ｉｚｕｍｉ，Ｈ．ａｎｄＫｏｈｎｏ，Ｋ．：ＴｈｅｂａｓｉｃａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＡＢＣｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ，Ｙ−ｂｏｘ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＹＢ−１）ａｎｄａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄｆａｃｔｏｒｓｉｎｈｕｍａｎｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．，９４，９−１４，２００３）。ＭＤＲをコードする遺伝子群の過剰発現をＤＮＡチップで検出する方法、並びに、その蛋白質群をそれぞれ特異的な抗体を用いて検出する方法等が薬剤耐性癌細胞の検出法として用いられている。ＭＤＲは、ＡＴＰＢｉｎｄｉｎｇＣａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）を有する蛋白質（ＡＢＣ蛋白質という）に属し、分子量３００−２，０００程度の両親媒性化合物をＡＴＰ加水分解のエネルギーを利用して細胞内から細胞外に排出する。
一方、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）を用いてプライマリー癌細胞と癌細胞株を解析すると、薬剤耐性と関連するクロモソームの特定領域の変化が見出される。（Ｗａｓｅｎｉｕｓ，Ｖ．Ｍ．，Ｊｅｋｕｎｅｎ，Ａ．，Ｍｏｎｎｉ，Ｏ．，Ｊｏｅｎｓｕｕ，Ｈ．，Ａｅｂｉ，Ｓ．，Ｈｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄＫｎｕｕｔｉｌａ，Ｓ．：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｃｈａｎｇｅｓｏｃｃｕｒｒｉｎｇｄｕｒｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｃｉｓｐｌａｔｉｎｉｎｈｕｍａｎｏｖａｒｉａｎｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ．ＧｅｎｅｓＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓＣａｎｃｅｒ，１８，２８６−２９１，１９９７；Ｒａｏ，Ｐ．Ｈ．，Ｈｏｕｌｄｓｗｏｒｔｈ，Ｊ．，Ｐａｌａｎｉｓａｍｙ，Ｎ．，Ｍｕｒｔｙ，Ｖ．Ｖ．，Ｒｅｕｔｅｒ，Ｖ．Ｅ．，Ｍｏｔｚｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｏｓｌ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄＣｈａｇａｎｔｉ，Ｒ．Ｓ．：Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃｉｓｐｌａｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｈｕｍａｎｍａｌｅｇｅｒｍｃｅｌｌｔｕｍｏｒｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５８，４２６０−４２６３，１９９８；Ｒｏｏｎｅｙ，Ｐ．Ｈ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｍａｒｓｈ，Ｓ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｐ．Ｇ．，Ｈａｉｔｅｓ，Ｎ．Ｅ．，Ｃａｓｓｉｄｙ，Ｊ．ａｎｄＭｃＬｅｏｄ，Ｈ．Ｌ．：ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅｓｙｎｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５８，５０４２−５０４５，１９９８；Ｌｅｙｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．，Ｋｅｌｌａｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｈａｒｒａｐ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄＨｉｏｒｎｓ，Ｌ．Ｒ．：Ｇｅｎｏｍｉｃｉｍｂａｌａｎｃｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｐｌａｔｉｎｕｍａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５５，７７−８４，１９９９；Ｓｔｒｕｓｋｉ，Ｓ．，Ｄｏｃｏ−Ｆｅｎｚｙ，Ｍ．，Ｔｒｕｓｓａｒｄｉ，Ａ．，Ｍａｓｓｏｎ，Ｌ．，Ｇｒｕｓｏｎ，Ｎ．，Ｕｌｒｉｃｈ，Ｅ．，Ｐｒｏｕｌｔ，Ｍ．，Ｊａｒｄｉｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｐｏｔｒｏｎ，Ｇ．ａｎｄＣｏｒｎｉｌｌｅｔ−Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｐ．：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｏｃｉａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｎｏｎ−Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩＩｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｎｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｂｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＧｅｎｅｓＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓＣａｎｃｅｒ，３０，１３６−１４２，２００１）。
薬剤耐性癌細胞に特徴的なゲノムの増幅並びに欠失は制癌剤耐性に寄与している可能性が高いと考えられるので、この領域を同定することは極めて重要である。しかしながら、癌細胞の薬剤応答性は多様であり、現在までに見いだされている知見では、薬剤耐性細胞を検出するには十分ではなく、新たなマーカーを見いだすことが必要であることは疑いがない。また、薬剤耐性癌細胞の解析を系統的に行い、癌細胞の薬剤耐性能を効率的かつ網羅的に検査できる方法もまた、未だ確立されていない。
よって、本発明が解決すべき課題は、薬剤耐性癌細胞を検出可能な新たな遺伝子マーカーを見いだし、かつ、当該マーカーを用いた薬剤耐性癌細胞の効率的かつ網羅的な検出手段を提供することにある。

本発明者は、特に副作用が重篤で、癌患者に投与する頻度が高い制癌剤として、カンプトテシン（ＣＰＴ）類、シスプラチン（ＣＤＤＰ）類、エトポシド（ＶＰ−１６）類、アドリアマイシン（ＡＤＭ）およびシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）類の薬剤耐性癌細胞株と親癌細胞株における遺伝子増幅または欠失を解析することにより、癌細胞の薬剤耐性獲得に関連する新たな遺伝子マーカーを見いだし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、被験癌細胞における、ＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＢ６遺伝子、ＡＢＣＢ８遺伝子、ＡＢＣＢ１０遺伝子、ＡＢＣＣ４遺伝子、ＡＢＣＣ９遺伝子、ＡＢＣＤ３遺伝子、ＡＢＣＤ４遺伝子、ＡＢＣＥ１遺伝子、ＡＢＣＦ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ２Ｌ１０、ＢＣＬ２Ｌ１、および、ＢＣＬ２Ａ１からなる群のＡＢＣトランスポーター系遺伝子またはＢＣＬ２ファミリー遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の増幅を検出することにより、当該被験癌細胞における制癌剤に対する薬剤耐性の獲得を検出する検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
（１）本検出方法
上記に列挙した制癌剤のうち、「カンプトテシン類」としては、カンプトテシンの他に、カンプトテシン誘導体として、第一製薬が開発したＤＸ−８９５１、イタリア・メナリーニ社が開発したＴ−０１２８、イギリス・スミスクライン・ビーチャム社が開発した塩酸ノギテカンが挙げられる。「シスプラチン類」は、白金製剤（プラチナを含有する）ともいい、シスプラチン、ビンブラスチン、カルボプラチンが挙げられる。「エトポシド類」として、エトポシドの他に、エトポシド誘導体として、日本化薬が開発したＮＫ６１１（エトポシド誘導体錠）が挙げられる。「シトシンアラビノシド類」として、シトシンアラビノシドの他に、シトシンアラビノシド誘導体として、そのフッ素化誘導体であるゲムシタビンが挙げられる。
本検出方法において、制癌剤に対する耐性獲得のマーカーとして定義される上記に列挙した遺伝子の中で、ＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＢ６遺伝子、ＡＢＣＢ８遺伝子、ＡＢＣＢ１０遺伝子、ＡＢＣＣ４遺伝子、ＡＢＣＣ９遺伝子、ＡＢＣＤ３遺伝子、ＡＢＣＤ４遺伝子、ＡＢＣＥ１遺伝子およびＡＢＣＦ２遺伝子は、いずれもＡＴＰＢｉｎｄｉｎｇＣａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）トランスポーター系蛋白質をコードする遺伝子である。
ＡＢＣトランスポーターファミリーに属する蛋白質は、イオンから高分子蛋白質に至るまで非常に広範囲の物質のトランスポートに関与している。ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）遺伝子とＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）遺伝子は細胞内からの薬剤の流出を増大させることにより多数の薬剤に対する耐性を誘導することが知られている（Ｌｉｎｇ，Ｖ．：Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｌｅｖａｎｃｅ，ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０，Ｓ３−Ｓ８，１９９７）。また、ＡＢＣ１１遺伝子はカンプトテシン耐性白血病株で増幅しており、その過剰発現はタキソール耐性を誘導することが知られている（Ｃｈｉｌｄｓ，Ｓ．，Ｙｅｈ，Ｒ．Ｌ．，Ｈｕｉ，Ｄ．ａｎｄＬｉｎｇ，Ｖ．：Ｔａｘｏｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉｓｔｅｒｇｅｎｅｏｆＰ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５８，４１６０−４１６７，１９９８）。
本発明は、上記３種類の遺伝子に加えて、新たに上記の１０種類のＡＢＣトランスポーター遺伝子群（ＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＢ６遺伝子、ＡＢＣＢ８遺伝子、ＡＢＣＢ１０遺伝子、ＡＢＣＣ４遺伝子、ＡＢＣＣ９遺伝子、ＡＢＣＤ３遺伝子、ＡＢＣＤ４遺伝子、ＡＢＣＥ１遺伝子およびＡＢＣＦ２遺伝子）が薬剤耐性に関与することを明らかにした。例えば、エトポシド耐性ヒト大腸癌（ＨＴ−２９／ＥＴＰ）細胞で増幅しているクロモソーム１６ｐ１２−ｐ１３の領域ではＡＢＣＣ１遺伝子よりもむしろＡＢＣＡ３遺伝子が増幅しかつ過剰発現しており、従って、ＡＢＣＡ３遺伝子がＡＢＣＣ１遺伝子よりもアンプリコン（遺伝子増幅を示す領域）として可能性が高いことが判明した。ＡＢＣＣ９遺伝子はＡＴＰ−感受性Ｋ＋チャネルの構成要素をコードする遺伝子である（Ｓｅｉｎｏ，Ｓ．ＡＴＰ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ：ａｍｏｄｅｌｏｆｈｅｔｅｒｏｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ／ｒｅｃｅｐｔｏｒａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６１，３３７−３６２，１９９９）。ＡＢＣＣ９遺伝子はエトポシド耐性を示す肺癌（ＳＫ３／ＶＰ１６）細胞と卵巣癌（ＳＫＯＶ３／ＶＰ）細胞で増幅していることが判明した。前者の細胞ではＡＢＣＣ９遺伝子の発現上昇が確認された。その他、後述するように、ＡＢＣＡ３遺伝子の増幅がエトポシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＢ６遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＢ８遺伝子の増幅がシスプラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＢ１０遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＣ４遺伝子の増幅がシスプラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＤ４遺伝子の増幅がアドリアマイシンに対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＥ１遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＦ２遺伝子の増幅がシスプラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であることが明らかとなった。
また、本検出方法において、制癌剤に対する耐性獲得のマーカーとして定義される上記に列挙した他の遺伝子である、ＢＣＬ２ファミリー遺伝子は、制癌剤によるアポトーシス死を抑制する働きをする遺伝子である。本作用を利用して癌細胞に多剤耐性を付与することから、ＢＣＬ２は、多剤耐性蛋白質と推定される。抗アポトーシスの作用を有する、特定のＢＣＬ２ファミリーの遺伝子（ＢＣＬ２遺伝子、ＢＣＬＸＬ遺伝子、ＭＣＬ１遺伝子）は、その過剰発現により、癌細胞に対して臨床的に使用される薬剤に耐性を誘導することが判明している（ＲｅｅｄＪ．Ｃ．Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７，２９４１−２９５３，１９９９）。
本発明では、上記の他のＢＣＬ２ファミリーの遺伝子（ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ１遺伝子およびＢＣＬ２Ａ１遺伝子）もまた、薬剤耐性獲得の指標として用いることが可能であることを見いだした。すなわち、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子の増幅が、カントプテシン類、シスプラチン類、エトポキシド類またはシトシンアラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子の増幅が、カントプテシン類、シスプラチン類またはシトシンアラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＢＣＬ２Ｌ１遺伝子の増幅が、カントプテシン類、シスプラチン類、エトポキシド類またはシトシンアラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であることが明らかとなった（後述する）。
上に列挙した、新規の癌細胞の薬剤耐性獲得のマーカーとして用いることが可能な、ＡＢＣトランスポーター系遺伝子およびＢＣＬ２ファミリー遺伝子は、個々が独立した遺伝子であり、かつ、本来的癌細胞の変異の多様性を鑑み、さらに本明細書の実施例においても、個々のマーカー毎に指標となる癌細胞の薬剤耐性獲得が異なる場合が多い。よって、上に列挙した遺伝子マーカー一つ一つが、独立した遺伝子マーカーとしての価値を有するものであるといえる。また、逆に、これらの一つ一つの遺伝子マーカーを多数組み合わせて、その検出結果を勘案することにより、網羅的な制癌剤耐性の検出が可能となる。
また、上記の新規に提供される制癌剤に対する耐性獲得の遺伝子マーカーに加えて、既知の同遺伝子マーカーを組み合わせて検出を行い、被験癌細胞の制癌剤に対する耐性の獲得を、いっそう的確に行うことができる。
かかる既知の制癌剤に対する耐性獲得の遺伝子マーカーとしては、例えば、ＡＢＣＢ１遺伝子、ＡＢＣＣ１遺伝子、ＡＢＣＢ１１遺伝子等のＡＢＣトランスポーター系遺伝子；ＢＣＬ２遺伝子、ＭＣＬ１遺伝子、ＢＣＬＸＬ遺伝子等のＢＣＬ２ファミリーの遺伝子；ＤＣＫ１遺伝子、ＴＯＰ１遺伝子等のＤＮＡ合成関連遺伝子を例示することができる。これらのうち、ＡＢＣトランスポーター系遺伝子とＢＣＬ２ファミリーの遺伝子については、上述した通りである。
ＤＣＫ１遺伝子、ＴＯＰ１遺伝子等のＤＮＡ合成関連遺伝子は、以下のような遺伝子である。
シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）はデオキシシチジンリン酸化酵素（ＤＣＫ）により活性型リン酸化体（１−β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に変化する。それがＤＮＡへ取り込まれることにより殺細胞効果を発揮する。従って、ＤＣＫ酵素活性の低下はＡｒａ−Ｃに対する耐性を誘導することが報告されてぃる（Ｆｕｎａｔｏ，Ｔ．，Ｓａｔｏｕ，Ｊ．，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｍａｋｉ，Ｓ．，Ｍｉｕｒａ，Ｔ．，Ｋａｋｕ，Ｍ．，ａｎｄＳａｓａｋｉ，Ｔ：ＩｎｖｉｔｒｏｌｅｕｋｅｍｉａｃｅｌｌｍｏｄｅｌｓｏｆＡｒａ−Ｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２４，５３５−５４１，２０００）。本明細書においても、Ａｒａ−Ｃ耐性白血病（Ｋ５６２／ＡＣ）細胞ではＤＣＫ遺伝子が半接合体で、その結果、ＤＣＫ遺伝子発現が減少し、Ａｒａ−Ｃ耐性を誘導していることを開示した。
トポイソメラーゼ（Ｔｏｐｏ）ＩとＴｏｐｏＩＩαは、１本鎖ＤＮＡ並びに２本鎖ＤＮＡにニックを入れ、複製中にＤＮＡ鎖を分離させることによりＤＮＡ複製を予定通り進行させる。カンプトテシン（ＣＰＴ）はＴｏｐｏＩ、をエトポシド（ＶＰ−１６）はＴｏｐｏＩＩαを阻害することによりＤＮＡ複製を阻害する。これまでの知見により、細胞内ＴｏｐｏＩ、ＴｏｐｏＩＩαのレベルと薬剤感受性が相関することが知られている。すなわち、両酵素の濃度が高いと制癌剤感受性が高く、その濃度が低いと制癌剤感受性が低いことが知られている（Ｙａｎａｓｅ，Ｋ．，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｔｓｕｋａｈａｒａ，Ｓ．，Ｏｈ−Ｈａｒａ，Ｔ．，Ａｎｄｏｈ，Ｔ．，ａｎｄＴｓｕｒｕｏ，Ｔ．：ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｏｆＤＮＡｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩｍＲＮＡｉｎａｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｕｂｌｉｎｅｏｆｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｊａｐ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，９１，５５１−５５９，２０００；ＭｃＬｅｏｄ，Ｈ．Ｌ．，ａｎｄＫｅｉｔｈ，Ｗ．Ｎ．：ＶａｒｉａｔｉｏｎｉｎｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩｇｅｎｅｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒａｓａｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒｉｎｔｒｉｎｓｉｃｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７４，５０８−５１２，１９９６；Ｗｉｔｈｏｆｆ，Ｓ．，Ｋｅｉｔｈ，Ｗ．Ｎ．，Ｋｎｏｌ，Ａ．Ｊ．，Ｃｏｕｔｔｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｈｏａｒｅ，Ｓ．Ｆ．，Ｍｕｌｄｅｒ，Ｎ．Ｈ．，ａｎｄｄｅＶｒｉｅｓ，Ｅ．Ｇ．：ＳｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆａｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｆｅｗｅｒＤＮＡｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩＩａｇｅｎｅｃｏｐｉｅｓｉｎａｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｅｌｌｌｉｎｅｐａｎｅｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７４，５０２−５０７，１９９６；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｔｓｕｋａｈａｒａ，Ｓ．，Ｏｈ−ｈａｒａＴ．，Ｉｓｏｅ，Ｔ．，ａｎｄＴｓｕｒｕｏ，Ｔ：ＤｅｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＮＡｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩｉｎｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｕｍｏｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５０，６９２５−６９３０，１９９０）。後述するように、ＴＯＰ１遺伝子発現のレベルは３種類のカンプトテシン耐性細胞、カンプトテシン耐性大腸癌（ＨＴ−２９／ＣＰＴ）細胞並びにカンプトテシン耐性胃癌（Ｓｔ−４／ＣＰＴ）細胞、すなわち、試験した全てのカンプトテシン耐性細胞で低かった。その理由は、ＴＯＰ１遺伝子コピー数がそれらの親株より低いためであった。ＴＯＰ１遺伝子が局在する染色体２０ｑの領域の増幅が大腸癌細胞、胃癌細胞で起こっていることが知られている（Ｋｎｕｕｔｉｌａ，Ｓ．，Ｂｊｏｒｋｑｖｉｓｔ，Ａ．Ｍ．，Ａｕｔｉｏ，Ｋ．，Ｔａｒｋｋａｎｅｎ，Ｍ．，Ｗｏｌｆ，Ｍ．，Ｍｏｎｎｉ，Ｏ．，Ｓｚｙｍａｎｓｋａ，Ｊ．，Ｌａｒｒａｍｅｎｄｙ，Ｍ．Ｌ．，Ｔａｐｐｅｒ，Ｊ．，Ｐｅｒｅ，Ｈ．，Ｅｌ−Ｒｉｆａｉ，Ｗ．，Ｈｅｍｍｅｒ，Ｓ．，Ｗａｓｅｎｉｕｓ，Ｖ．Ｍ．，Ｖｉｄｇｒｅｎ，Ｖ．，ａｎｄＺｈｕ，Ｙ．：ＤＮＡｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｈｕｍａｎｎｅｏｐｌａｓｍｓ：ｒｅｖｉｅｗｏｆｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５２，１１０７−１１２３，１９９８）。実際、本明細書においても、ＴＯＰ１遺伝子のコピー数が親株の感受性細胞で有意に多い、すなわち、ＨＴ−２９細胞で５倍に、Ｓｔ−４細胞で６倍に増大していたことを開示した。また、カンプトテシン耐性大腸癌（ＨＴ２９／ＣＰＴ）細胞で、２対のＴＯＰ１遺伝子の１対はＴＯＰ１欠失体であることを見出した。その結果、ＴＯＰ１遺伝子発現の低下が直接カンプトテシン耐性の原因であることが明らかとなった。
また、５種類のエトポシド耐性細胞は、その親株よりＴＯＰ２Ａ遺伝子発現が低く、染色体上の遺伝子コピー数は各々３コピーに減少していた。従って、ＴＯＰ１とＴＯＰ２Ａ遺伝子コピー数の減少がそれらの遺伝子発現を減少させ、カンプトテシン耐性並びにエトポシド耐性をもたらすと結論付けられる。さらに、チミジン合成酵素遺伝子並びにデヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ遺伝子もそれらのコピー数の減少は薬剤耐性を誘起することが容易に考えられる。
本検出方法は、例えば、ＣＧＨ法、フローサイトメトリー法、ＥＬＩＳＡ法、ＤＮＡチップ法、定量ＰＣＲ法により行うことが可能であり、ＤＮＡチップ法またはＣＧＨ法を行うことが好適であり、ＣＧＨ法を行うことが特に好適である。
「フローサイトメトリー法」は、例えば、リンパ性白血病細胞で発現しているＡＢＣ蛋白質を測定する場合、まず、そのＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識ＣＤ４５モノクローナル抗体を用いて、リンパ球をフローサイトメトリーにより分取する。次に、Ｃｙ３等の蛍光色素標識抗ＡＢＣ蛋白質抗体を用いて、リンパ性白血病細胞で発現しているＡＢＣ蛋白質を測定することができる。本法は癌細胞膜表面に発現している蛋白質の検出に適している。
「ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）法」は、例えば、２種類の抗ＡＢＣ蛋白質抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ法が一般的である。これ以外にも１種類の抗ＡＢＣ蛋白質を使用する競合法がある。前者の方法は１種類の抗ＡＢＣ蛋白質抗体をプレート上に固相し、癌細胞抽出液を加えて抗体と結合したＡＢＣ蛋白質をもう一方の抗体で検出する方法である。具体的には、もう一方の抗体を標識する、あるいは、その抗体をアルカリホスファターゼ標識抗体、ペルオキシダーゼ標識抗体等で検出する方法である。本法は特異的抗体を使用することにより、細胞内で発現するどのような蛋白質にも適用可能である。
「ＤＮＡチップ法」は、癌細胞で発現しているｍＲＮＡを定量する方法である。例えば、基盤上にＡＢＣ蛋白質群をコードする遺伝子を一部有する合成オリゴヌクレオチドを固定する（ｃＤＮＡを固定することもできる）。癌細胞から調製したＲＮＡをリバーストランスクリプターゼによりｃＤＮＡを合成する時に標識を行う。本標識ｃＤＮＡと基盤上の合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、結合した標識の量をスキャンすることによりｍＲＮＡの発現量を測定することができる。本発明は、このＤＮＡチップ法で用いることができるＤＮＡチップ、すなわち、「ＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＢ６遺伝子、ＡＢＣＢ８遺伝子、ＡＢＣＢ１０遺伝子、ＡＢＣＣ４遺伝子、ＡＢＣＣ９遺伝子、ＡＢＣＤ３遺伝子、ＡＢＣＤ４遺伝子、ＡＢＣＥ１遺伝子、ＡＢＣＦ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ１遺伝子、および、ＢＣＬ２Ａ１遺伝子からなる群のＡＢＣトランスポーター系遺伝子またはＢＣＬ２ファミリー遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を含有するＤＮＡ（ｃＤＮＡであっても合成オリゴヌクレオチドであってもよい）」を定着させたＤＮＡ定着基盤をも提供する発明である（基盤の素材、製造工程等は、後述するＣＧＨアレイとして用いるＤＮＡ定着基盤に準ずる）。
「定量ＰＣＲ法」は、被験ＤＮＡの特定遺伝子（癌細胞の薬剤耐性獲得によって増幅または欠失する遺伝子）を含む領域をリアルタイムＰＣＲ法にて増幅させて、当該被験ＤＮＡ由来のリアルタイムＰＣＲ増幅産物とコントロール（健常細胞のＤＮＡ由来の同一の遺伝子増幅用プライマーを用いて同一の条件でＰＣＲ法による遺伝子増幅を行った結果得られた遺伝子増幅産物）の生成物を定量し比較することにより、当該特定遺伝子の増幅または欠失を検出する方法である。
（２）ＣＧＨ（ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＧｅｎｏｍｉｃＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法、または、ＤＮＡチップ法による本検出方法
この態様の本検出方法は、それぞれ異なる蛍光色素で標識した対照ＤＮＡと薬剤耐性の獲得を検出する対象となる被験癌細胞のＤＮＡを、上記ＤＮＡ定着基盤上において同時に接触させてハイブリダイズを行うことにより得られる蛍光色を指標として、被験ＤＮＡの特定領域の増幅または欠失を定量的に検出する、薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法である。
ＣＧＨ法またはＤＮＡチップ法に用いるヒトＤＮＡの定着基盤
これらのＤＮＡ検出法に用いるＤＮＡ定着基盤（本発明は、当該ＤＮＡ定着基盤をも提供する発明である）に定着させるヒトＤＮＡは、選択する検出法に応じて選択することが可能である、すなわち、本検出方法の態様として、ＤＮＡチップ法を行う場合には、ｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドが挙げられる。また、ＣＧＨ法を行う場合には、ゲノムＤＮＡが挙げられる。
ＤＮＡの採取、調製は、常法により行うことも可能であり、特に対照ＤＮＡは市販品を用いることも可能である。
本検出方法において特に好適な態様として、ＣＧＨ法を、特定のゲノムＤＮＡ領域を有するＢＡＣ（ＢａｃｔｅｒｉａｌＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、ＹＡＣ（ＹｅａｓｔＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡ、または、ＰＡＣＤＮＡ（ＰｈａｇｅＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡから得られる複数種類の遺伝子増幅産物が、当該遺伝子増幅産物毎に定着している基盤を用いる態様を挙げることができる。
すなわち、癌細胞の制癌剤に対する耐性の獲得に伴い、増幅または欠失しているゲノムの領域は巨大である場合も認められる。このように、本定着基盤においては、一単位として巨大な遺伝子が反映されているゲノムＤＮＡを定着する必要があり、かかる必要性を満足することができる程度に、許容される遺伝子の組み込み容量が大きな、ＢＡＣＤＮＡ、ＹＡＣＤＮＡ、または、ＰＡＣＤＮＡ（以下、ＢＡＣＤＮＡ等ともいう）を用いる必要がある。本発明に用いることができるＢＡＣＤＮＡ等は、常法により、用いるゲノムを組み込んで得られる遺伝子ライブラリーから選択してもよいし、市販されている遺伝子ライブラリーから選択してもよい。各目的に応じて選択されるべきＢＡＣＤＮＡまたはＰＡＣＤＮＡについては後述する。選択されたクローンが組み込まれた宿主を培養し、ＢＡＣＤＮＡ等の精製を行うことができる。
このように通常に得られるＢＡＣＤＮＡ等は、ゲノムＤＮＡ定着基盤を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずＢＡＣＤＮＡ等を、４塩基認識酵素、例えば、ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩ等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションを行う。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の３‘−末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列部分を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各ＢＡＣＤＮＡ等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを、検出用プローブとして用いることもできる。
このようにして無尽蔵化したＢＡＣＤＮＡ等（これ以外の態様のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドでも同様）を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
固体基盤としては、ガラス、プラスチック、メンブレン、３次元アレイ等があげられ、スライドガラス等のガラス基板が好ましい。ガラス等の固体基盤は、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基盤をコートすることがより好ましい。
上記の無尽蔵化したＤＮＡ（これ以外の態様のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドでも同様）を基盤上にスポットする濃度は、好ましくは１０ｐｇ／μｌ〜５μｇ／μｌ、より好ましくは１ｎｇ／μｌ〜２００ｎｇ／μｌである。スポットする量は好ましくは１ｎｌ〜１μｌ、より好ましくは１０ｎｌ〜１００ｎｌである。また、基盤に定着させる個々のスポットの大きさ及び形状は、特に限定されないが、例えば、大きさは直径０．０１〜１ｍｍであり得、上面から見た形状は円形〜楕円形であり得る。乾燥スポットの厚みは、特に制限はないが、１〜１００μｍである。さらに、スポットの個数は、特に制限はないが、使用する基盤あたり１０〜５０，０００個、より好ましくは１００〜５，０００個である。それぞれのＤＮＡはＳｉｎｇｕｌａｒからＱｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅの範囲でスポットするが、Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ或いはＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることが好ましい。
乾燥スポットの調製は、例えば、スポッターを用いて無尽蔵化したＢＡＣＤＮＡ等（これ以外の態様のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドでも同様）を基盤上にたらして、複数のスポットを形成した後、スポットを乾燥することにより製造することができる。スポッターとしてインクジェト式プリンター、ピンアレイ式プリンター、バブルジェット式プリンターが使用できるが、インクジェット式プリンターを使用することが好ましい。例えば、ＣａｒｔｅｓｉａｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米）のハイスループットインクジェット分注システムＳＱシリーズ等を使用できる。
このようにして無尽蔵化したＢＡＣＤＮＡ等（これ以外の態様のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドでも同様）を基盤上、好適には固体基盤上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基盤を製造することができる。
検出の態様
上述したＤＮＡ定着基盤を用いて、被験ＤＮＡの特定領域の増幅または欠失を定量的に検出する場合、特定領域のゲノムＤＮＡ等の断片が、好適には網羅的に定着している本定着基盤に、それぞれ異なる蛍光色素で標識した対照ゲノムＤＮＡ等（正常細胞または正常組織のゲノムＤＮＡ等）と被験ゲノムＤＮＡ等（薬剤耐性を獲得しているか否かを検出する対象となる癌細胞または癌組織のゲノムＤＮＡ等）を同時に接触させてハイブリダイズを行うことにより得られる蛍光色を指標として、被験ゲノムＤＮＡ等の特定領域の増幅または欠失を定量的に検出する検出方法である。
被験ゲノムＤＮＡ等の特定領域の増幅または欠失を定量的または定性的に検出することにより、被験癌細胞の制癌剤に対する耐性の獲得の有無、耐性の種類等を明らかにすることができる。
ヒトゲノムＤＮＡ等は市販品を使用することが可能であり、健常人から採血した血漿より、常法により抽出することもできる。また、癌患者本人の正常組織から常法に従い得ることも可能である。
対照ゲノムＤＮＡ等（正常細胞または正常組織のゲノムＤＮＡ等）と被験ゲノムＤＮＡ等（薬剤耐性を獲得しているか否かを検出する対象となる癌細胞または癌組織のゲノムＤＮＡ等）は、それぞれ異なる蛍光色素、例えば、Ｃｙ３とＣｙ５等、を常法（例えば、ｄＣＴＰを用いたニックトランスレーション法）により標識することができる。このｄＣＴＰを用いたニックトランスレーション法を行う標識キットは、ＰａｎＶｅｒａ社（日本代理店：宝酒造株式会社）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ＣＡ、ＵＳＡ）等で販売されている。標識ＤＮＡをＣＧＨアレイにプリントしたＤＮＡとハイブリダイズする時にはＣｏｔ−１ＤＮＡ、ホルムアミド、ＤｅｘｔｒａｎＳｕｌｆａｔｅ、ＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ／１５ｍＭＳｏｄｉｕｍＣｉｔｒａｔｅ）、Ｙｅａｓｔｔ−ＲＮＡ、ＳＤＳ（ＳｏｄｉｕｍＤｅｏｘｙｓｕｌｆａｔｅ）を加えることがより好ましい。また、標識ＤＮＡを含む溶液を熱変性させて加えることが好ましい。ハイブリダイズする容器として、ロッキング機能付プラットフォームに乗せることが可能であり、少量の溶液を用いて本定着基盤上でまんべんなく接触できる容器、例えば、ハイブリマンを用いることがより好ましい。ハイブリダイゼーションの温度は３０〜７０℃が好適であり、３８〜４５℃がより好適である。ハイブリダイズの時間は、１２〜２００時間が好適であり、４０〜８０時間がより好適である。本定着基盤の洗浄はホルムアミド、ＳＳＣ溶液等を用いて室温で行うことができる。この本定着基盤の洗浄は、非特異的シグナルをできるだけなくすために重要なステップであり、室温で洗浄後、同洗浄液を用いて４０〜６０℃で洗浄し、さらに、ＳＳＣ−ＳＤＳを含む溶液中５０℃で洗浄を行い、リン酸バッファー／ＮＰ−４０を含む溶液に静置し、最後にＳＳＣを含む溶液中で振とうすることがより好ましい。
また、本検出方法において、ハイブリダイズを行った本定着基盤における蛍光の発生の内容を把握するためには、例えば、スキャナーを用いることができる。当該スキャナーとしては、例えば、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＫ．Ｋ．、東京）等を挙げることができる。結果の解析は、例えば、対照ゲノムＤＮＡをＣｙ５で、被験癌細胞由来のゲノムＤＮＡをＣｙ３で標識する場合、本定着基盤上のＣｙ３蛍光強度の平均とＣｙ５蛍光強度の平均を同じ値に補正することが好適である。さらに、各ＢＡＣＤＮＡ（各ピクセル）上でＣｙ３／Ｃｙ５のＲａｔｉｏを求めＬｏｇ_２Ｒａｔｉｏの値で表示することが好適である。当該蛍光の強度比（肉眼的には蛍光色）を指標とすることにより、被験癌細胞から得られるゲノムＤＮＡ検体において、検出目的とする遺伝子の特定部分の増幅や欠失が認められるかを定量的（もちろん定性的にも）に検出することができる。

図１下記細胞株のメタフェーズクロモソームを用いた蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる遺伝子増幅並びに欠失の解析した結果を表す写真である。
（Ａ）ヒト大腸癌細胞ＨＴ−２９株、（Ｂ）エトポシド耐性ヒト大腸癌細胞ＨＴ−２９／ＥＴＰ株、（Ｃ）ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３株、（Ｄ）エトポシド耐性ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３／ＶＰ株、（Ｅ）ヒト白血病Ｋ５６２株、（Ｆ）シトシンアラビノシド耐性ヒト白血病Ｋ５６２／ＡＣ株、（Ｇ）ヒト大腸癌細胞ＨＴ−２９株、（Ｈ）カンプトテシン耐性ヒト大腸癌細胞ＨＴ−２９／ＣＰＴ株
ＨＴ−２９細胞はＡＢＣＡ３遺伝子に由来する緑色蛍光とＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）遺伝子に由来する赤色蛍光が３ヶ所に検出された（Ａ）。ＨＴ−２９／ＥＴＰ細胞ではＡＢＣＡ３遺伝子に由来する緑色蛍光が全染色体中の７ヶ所に、ＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）遺伝子に由来する赤色蛍光が全染色体中の５ヶ所に検出された（Ｂ）。ＳＫＯＶ３細胞でＡＢＣＡ３遺伝子に由来する緑色蛍光は７ヶ所に、ＨＮＦ３Ａ遺伝子に由来する赤色蛍光は４ヶ所に検出された（Ｃ）。ＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞ではＢＣＬ２Ｌ２遺伝子に由来する緑色蛍光は６ヶ所に、ＨＮＦ３Ａ遺伝子に由来する赤色蛍光は４ヶ所に検出された（Ｄ）。Ｋ５６２細胞ではＤＣＫ遺伝子に由来する緑色蛍光が１ヶ所検出された（Ｅ）。Ｋ５６２／ＡＣ細胞ではＤＣＫ遺伝子に由来する緑色蛍光が１ヶ所検出された（Ｆ）。ＨＴ−２９細胞ではＴＯＰ１に由来する緑色蛍光が５ヶ所検出された（Ｇ）。ＨＴ−２９／ＣＰＴ細胞ではＴＯＰ１に由来する緑色蛍光が２ヶ所検出された（Ｈ）。
（Ａ）と（Ｂ）ではＡＢＣＡ３遺伝子とＡＢＣＣ１遺伝子が非常に近い部位に局在するために、緑色蛍光と赤色蛍光が重なり黄色を呈している。蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションで使用したＢａｃｔｅｒｉａｌＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）並びにＰ１−ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＰＡＣ）を下記に示した。

ＨＴ−２９／ＥＴＰ細胞染色体上のアンプリコン（遺伝子増幅を示す領域）のマップは１６ｐ１２−ｐ１３にあり、ＡＢＣＡ３遺伝子とＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）遺伝子が隣接して存在する（Ｉ）。ＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞染色体上のアンプリコンは１４ｑ１１−ｑ２１にあり、ＢＣＬ２Ｌ遺伝子とＨＮＦ３Ａ遺伝子が存在する（Ｊ）。
蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）はＹａｓｕｉ，Ｋ．，Ｉｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｙ．，Ｐｉｍｋａｈａｏｋｈａｍ，Ａ．，Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｑ．，Ｎａｒｕｔｏ，Ｔ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｙ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ａｎｄＩｎａｚａｗａ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｗｉｔｈｉｎａｎａｍｐｌｉｃｏｎａｔ１４ｑ１２−ｑ１３ｉｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＧｅｎｅｓＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓＣａｎｃｅｒ，３２，１１２−１１８，２００１の方法に従って行った。
（Ｉ）と（Ｊ）はＢＡＣ並びにＰＡＣ（それらの番号を記載）を標識プローブに用いてＦＩＳＨを行い、エトポシド耐性大腸癌（ＨＴ−２９／ＥＴＰ）細胞並びにエトポシド耐性卵巣癌（ＳＫＯＶ３／ＶＰ）細胞のクロモソーム上での検出部位を→で図中に表示した。その結果をクロモソーム上での局在部位、その領域内に存在するＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄｓｉｔｅ）、その領域をカバーするＢＡＣ並びにＰＡＣクローン名、それらのＢＡＣ並びにＰＡＣをプローブに用いてＨＴ−２９／ＥＴＰ細胞における本クロモソーム領域の増幅を平均コピー数で表した。ＡＢＣＡ３遺伝子、ＭＲＰ１遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ遺伝子、ＨＮＦ３Ａ遺伝子が存在するクロモソームの領域を矢印で示した。ＨＴ−２９／ＥＴＰ細胞並びにＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞の蛍光写真の右上にはプローブに用いたＢＡＣ名或いはＰＡＣ名を記載した。
図２薬剤耐性細胞株におけるＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＣ１（ＭＰＲ１）遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子及びＡＢＣＣ９遺伝子の過剰発現を示す図面である。
（Ａ）ＨＴ−２９細胞及びＨＴ−２９／ＥＴＰ細胞におけるＡＢＣＡ３及びＡＢＣＣ１（ＭＲＰ）遺伝子発現のＮｏｒｔｈｅｒｎブロット法による解析。これら２種類の細胞から２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、常法によりＮｏｒｔｈｅｒｎブロットを行い、上記２種類の遺伝子発現量を測定した。ＡＢＣＡ３遺伝子及びＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）遺伝子を検出するためのプローブとして各々ＩＭＡＧＥクローン１７９５７６及び２２０５２９７（ＩｎｃｙｔｅＧｅｎｏｍｉｃｓ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を使用した。ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子プローブはサンプル間の誤差を修正するためのスタンダードとして使用した。
（Ｂ）ＳＫＯＶ３細胞及びＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞におけるＢＣＬ２Ｌ２遺伝子発現のＮｏｒｔｈｅｒｎブロット法による解析。これら２種類の細胞から２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、常法を用いてＮｏｒｔｈｅｒｎブロットを行い、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子発現量を測定した。ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子を検出するためのプローブは２種類のプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＡＴＡＡＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧ−３’（配列番号１）とＲｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴ−３’（配列番号２））を用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅し、調製した。ＧＡＰＤＨ遺伝子プローブはサンプル間の誤差を修正するためのスタンダードとして使用した。
（Ｃ）ＳＫ３細胞、ＳＫ３／ＶＰ細胞、並びにＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞を用いてＡＢＣＣ９ｍＲＮＡの発現解析。これらの細胞よりＲＮＡを調製し、リアルタイム逆転写一ＰＣＲ法（Ｙａｓｕｉ，Ｋ．，Ａｒｉｉ，Ｓ．，Ｚｈａｏ，Ｃ．，Ｉｍｏｔｏ，Ｉ．，Ｕｅｄａ，Ｍ．，Ｎａｇａｉ，Ｈ．，Ｅｍｉ．，Ｍ．ａｎｄＩｎａｚａｗａＪ．：ＴＦＤＰ１，ＣＵＬ４ＡａｎｄＣＤＣ１６ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｔａｒｇｅｔｓｆｏｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｔ１３ｑ３４ｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３５，１４７６−１４８４，２００２）を用いてＡＢＣＣ９遺伝子ｍＲＮＡを定量した。サンプル間の差を標準化するために、ＡＢＣＣ９遺伝子と対照遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルの比を求め、ＳＫ３細胞での比（ＡＢＣＣ９発現量／ＧＡＰＤＨ発現量）を１とし、各細胞でのＡＢＣＣ９遺伝子発現量の相対比を図示した。
図３親株と比較した薬剤耐性細胞株のＢＣＬ２ファミリー遺伝子の発現を示す図面である。
各細胞で対照遺伝子（ＧＡＰＤＨ）と目的とする遺伝子の発現量の比を求めた。各薬剤耐性細胞の親株の比を１として、各薬剤耐性細胞での発現量の比を示した。遺伝子発現量はリアルタイム逆転写ＰＣＲにより測定した。
左欄には薬剤耐性癌細胞名、各バーグラフの上欄には検討した遺伝子名、下欄には上欄に示した遺伝子の発現量を親株と比較した値で示した。
図４カスパーゼ活性並びにＢＣＬ２ファミリー遺伝子発現とエトポシド耐性との関係を示す図面である。
（Ａ）エトポシド（ＶＰ−１６）処理を行った卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３とＳＫＯＶ３／ＶＰ）のカスパーゼ活性を示している。
カスパーゼ活性の測定はカロリメトリックＣａｓｐＡＣＥアッセイシステム（ＰｒｏｍｅｇａＣｏ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて説明書に従って行った。ＳＫＯＶ３細胞とＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞を１００μｇ／ｍｌのＶＰ−１６、ＶＰ−１６とカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、或いは培地（コントロール）だけの存在下で２４時間培養した。細胞をリシスバッファーを用いて溶解し、４℃で１５，０００ｘｇ２０分間遠心分離を行い、その上清（１００μｇ蛋白質含有）をカスパーゼ活性測定のための基質（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ）と共に３７℃で４時間インキュベーションを行い、４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、その活性を求めた。
（Ｂ）ＢＣＬ２Ｌ２アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理をしたＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞でのＢＣＬ２Ｌ２ｍＲＮＡの発現レベルを示している。
ＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞を無処理、トランスフェクション試薬であるオリゴフェクタミン処理、ホスホロチオエート骨格を有するＢＣＬ２Ｌ２アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＢＣＬ２Ｌ２ｃＤＮＡの２３７４番から２３９４番までの配列：５’−ＡＧＣＣＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡ−３’（配列番号３））をオリゴフェクタミン処理によりトランスフェクションした場合、スクランブル配列のホスホロチオエート骨格を有するコントロールオリゴヌクレオチド（配列：５’−ＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＧＡ−３’（配列番号４））をオリゴフェクタミン処理によりトランスフェクションした場合の各々について、ＲＮＡを抽出し、リアルタイム逆転写ＰＣＲ法により、ＢＣＬ２Ｌ２ｍＲＮＡ量を測定した。
（Ｃ）ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子の発現抑制によるＳＫＯＶ３／ＶＰ３細胞のエトポシドＶＰ−１６に対する感受性の増大について示している。
ホスホロチオエート骨格を有するＢＣＬ２Ｌ２アンチセンスオリゴヌクレオチドをオリゴフェクタミン処理によりトランスフェクション、スクランブル配列のホスホロチオエート骨格を有するコントロールオリゴヌクレオチドをオリゴフェクタミン処理によりトランスフェクション、並びに、無処理の条件でＳＫＯＶ３／ＶＰ３細胞を処理し、２４時間後に図に示した各濃度のＶＰ−１６存在下で細胞を４８時間培養した。ＳＫＯＶ３／ＶＰ３細胞の生存率をトランスフェクション７２時間後にＣｅｌｌ−ＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（同仁化学研究所、熊本）を用いてテトラゾリウムアッセイ法により測定した。生存率を％で表示したが、％は上記処理条件下で測定された吸光度をＶＰ−１６無添加・無処理の条件下で測定された吸光度で割り算し求めた。各々の値は５回の実験の平均値で、その値は各プロット上の平均値±ＳＤで表示した。

薬剤耐性癌細胞に特異的に認められる特定のゲノムＤＮＡ領域の変化
ＳｕｂｔｒａｃｔｉｖｅＣＧＨ法は親株のゲノムとそれから誘導した薬剤耐性細胞のゲノム各領域のコピー数を比較し、差し引くことにより遺伝子の増幅の度合いと欠失を定量的に算出する方法である。本法を用いて、親株と比較して２３種類の薬剤耐性癌細胞で見出された遺伝子の増幅・欠失の変化を表１に示した。

１９種類（全細胞種の８３％に相当）の薬剤耐性細胞はＤＮＡコピー数が変化していた。１細胞の全染色体当たり異常が起こっている箇所は０から１２ヶ所の範囲であり、平均値は３．７ヶ所であった。遺伝子増幅は０から７ヶ所の範囲で、平均値が２．１ヶ所であった、欠失は０から６ヶ所の範囲で、平均値が１．６ヶ所であった。遺伝子増幅は４細胞（全細胞種の１７％に相当）で共通してクロモソーム１４ｑに見出され、３細胞（全細胞種の１３％に相当）で共通してクロモソーム４ｐ、６ｑ、７ｑ、１３ｑに見出された。数コピー以上の増幅がカンプトテシン耐性肺癌（Ａ５４９／ＣＰＴ）細胞のクロモソーム２ｑ２３−ｑ３４領域に、シスプラチン耐性膀胱癌（Ｔ２４／ＤＤＰ１０）細胞のクロモソーム４ｐに、エトポシド耐性肺癌（ＳＫ３／ＶＰ１６）細胞のクロモソーム７ｑ２１−ｑ２２領域に、シトシンアラビノシド耐性白血病（Ｋ５６２／ＡＣ）細胞のクロモソーム１５ｑ２１−ｑ２４領域に検出された。遺伝子欠失は４細胞（全細胞種の１７％に相当）でクロモソーム５ｐと１１ｐに、３細胞（全細胞種の１３％に相当）でクロモソーム１１ｑと２０ｑに検出された。８種類のシスプラチン耐性細胞を試験し、共通に認められるクロモソーム増幅の最小領域は３ｐ２２−ｐ２６（大腸癌ＨＴ−２９／ｃＤＤＰ細胞と膀胱癌Ｔ２４／ＤＤＰ１０細胞）、４ｐ１５−ｐ１６（膀胱癌Ｔ２４／ＤＤＰ５、Ｔ２４／ＤＤＰ７及びＴ２４／ＤＤＰ１０細胞）、及び５ｐ１５（大腸癌ＨＴ−２９／ｃＤＤＰ細胞と膀胱癌Ｔ２４／ＤＤＰ１０細胞）であった。シスプラチン耐性細胞で共通して欠失しているクロモソームの領域は、５ｐ（膀胱癌ＫＫ４７／ＤＤＰ１０細胞並びにＫＫ４７／ＤＤＰ２０細胞）、１３ｑ１４−ｑ３４（膀胱癌Ｔ２４／ＤＤＰ５及びＴ２４／ＤＤＰ１０細胞）、及び１５ｑ１１−ｑ２１（大腸癌ＨＴ−２９／ＣＤＤＰ並びに膀胱癌Ｔ２４／ＤＤＰ１０細胞）であった。さらに、１０種類のエトポシド耐性癌細胞で２種類のクロモソーム領域の変化が共通して検出された。それは、クロモソーム１６ｐ１２−ｐ１３領域の増幅（大腸癌ＨＴ−２９／ＥＴＰ細胞、白血病Ｋ５６２／ｅｔｏｐ２０細胞及び白血病Ｋ５６２ｅｔｏｐ８０細胞）とクロモソーム２０ｑ１２−ｑ１３の領域の欠失（肺癌ＳＫ３／ＶＰ細胞及び卵巣癌ＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞）である。クロモソーム１１ｐ１１−ｐ１４領域の欠失は３種類すべてのカンプトテシン耐性細胞（大腸癌ＨＴ−２９／ＣＰＴ、肺癌Ａ５４９／ＣＰＴ及び胃癌Ｓｔ−４／ＣＰＴ細胞）で共通に認められた。次に、これらのクロモソーム領域の増幅並びに欠失領域に含まれる薬剤耐性と密接に関連する遺伝子群の同定を進めた。

ＡＢＣトランスポーター遺伝子の増幅と過剰発現
ＡＢＣトランスポーターをコードするヒト遺伝子として４８種類がこれまで知られている（Ｄｅａｎ，Ｍ．，Ｈａｍｏｎ，Ｙ．ａｎｄＣｈｉｍｉｎｉ，Ｇ．：ＴｈｅｈｕｍａｎＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．，４２，１００７−１０１７，２００１）。ここで試験した薬剤耐性細胞中では２０種類のＡＢＣトランスポーター遺伝子が増幅していた。その中で、１７種類の遺伝子の増幅をＦＩＳＨ法で確認した。
１３種類のＡＢＣトランスポーターは親株と比較すると１９種類の薬剤耐性細胞で確実に増幅していた（表２）。

特に、ＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）遺伝子、ＡＢＣＣ９（ＳＵＲ２）遺伝子はコピーナンバーで２コピー以上の増幅が認められた。ＣＧＨ法によりクロモソーム１６ｐ１２−ｐ１３領域で遺伝子増幅が検出されたエトポシド耐性大腸癌ＨＴ−２９／ＥＴＰ細胞では、クロモソーム１６ｐ１３．３に局在するＡＢＣＡ３遺伝子のＦＩＳＨ法で求めたコピー数は７コピーで、１６ｐ１３．１に局在するＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）遺伝子のそれは５コピーであった。一方、ＨＴ−２９／ＥＴＰ細胞の親株（ＨＴ−２９）では両遺伝子のコピー数は３コピーで、より低い値を示した（図１ＡとＢ）。この結果は親株が耐性株と比較しエトポシドに感受性がより高いことを示している。ＦＩＳＨ法を用いて、エトポシド耐性大腸癌（ＨＴ−２９／ＥＴＰ）細胞で増幅されたＡＢＣＡ３遺伝子が局在するクロモソームの最小の染色体領域をＢＡＣクローン番号ＲＰ１１−３３４Ｄ３（マーカーＤ１６Ｓ５２５を含む）とＲＰ１１−９５Ｐ２（マーカーＳＨＧＣ−１１８３８を含む）の間に同定した（図１１）。クロモソーム７ｑ２１に局在するＡＢＣＢ１遺伝子のＦＩＳＨ法で求めたコピー数はエトポシド耐性肺癌（ＳＫ３／ＶＰ１６）細胞では１１コピーであり、親細胞の３コピーと比較すると顕著に高い値であった。クロモソーム１２ｐ１２．１に局在するＡＢＣＣ９遺伝子のＦＩＳＨ法で求めたコピー数はエトポシド耐性肺癌（ＳＫ３／ＶＰ１６）細胞とエトポシド耐性卵巣癌（ＳＫＯＶ３／ＶＰ）細胞では５コピーであり、親株の２コピーより有意に高い値である。次に、これらの遺伝子の増幅はそのｍＲＮＡの高発現を誘導すると考えられるので、その確認をおこなった。親株並びにその親株より得られた薬剤耐性細胞からＲＮＡを抽出し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロッティングを行うと親株の大腸癌ＨＴ−２９細胞と比較して、エトポシド耐性ＨＴ−２９／ＥＴＰ細胞はＡＢＣＡ３遺伝子発現が１０．６倍、ＡＢＣＣ１遺伝子発現が２．６倍増大していた（図２Ａ）。この結果より両遺伝子はクロモソーム１６ｐ１２−１３領域に存在するが、ＡＢＣＡ３遺伝子はＡＢＣＣ１遺伝子よりもよりエトポシド耐性を付与するより重要な遺伝子である。ＡＢＣＢ１遺伝子発現はエトポシド耐性肺癌（ＳＫ３／ＶＰ１６）細胞では親細胞（ＳＫ３）よりも３．３倍高い発現を示した。ＡＢＣＣ９遺伝子発現はＳＫ３／ＶＰ１６細胞では親細胞よりも１３．３倍高い発現を示した。一方、それはエトポシド耐性卵巣癌（ＳＫＯＶ３／ＶＰ）細胞ではその親細胞（ＳＫＯＶ３）と比較して１．６倍の発現を示すのみであった（図２Ｃ）。従って、細胞種により薬剤耐性に関与するＡＢＣトランスポーター遺伝子が異なることが示唆される。薬剤耐性を解析するためには、広範囲のＡＢＣトランスポーター遺伝子群を網羅的に解析することが必要となる。

ＢＣＬ２ファミリーに属する抗アポトーシス蛋白質をコードする遺伝子の増幅と高発現
ＢＣＬ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ１（ＢＣＬＸＬ）遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ２（ＢＣＬＷ）遺伝子、ＢＣＬ２Ａ１遺伝子、ＭＣＬ１遺伝子及びＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子の各遺伝子群はＢＣＬ２ファミリーに属し、抗アポトーシスの作用を有する制御蛋白質である（Ｇｒｏｓｓ，Ａ．，ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄＫｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｊ．：ＢＣＬ−２ｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓａｎｄｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１３，１８９９−１９１１，１９９９）。
ＢＣＬ２Ｌ１（ＢＣＬＸＬ）遺伝子を除く５種類の遺伝子は薬剤耐性細胞で遺伝子増幅が認められた。ＦＩＳＨを用いた解析で、それぞれの親株と比較して、エトポシド耐性卵巣癌（ＳＫＯＶ３／ＶＰ）細胞ではＢＣＬ２Ｌ２遺伝子の増幅、カンプトテシン耐性大腸癌（ＨＴ−２９／ＣＰＴ）細胞ではＭＣＬ１遺伝子の増幅、シトシンアラビノシド耐性白血病（Ｋ５６２／ＡＣ）細胞ではＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子の増幅が起こっていた（表２）。この場合、エトポシド耐性卵巣癌（ＳＫＯＶ３／ＶＰ）細胞ではその親細胞と比較して、クロモソーム１４ｑ１１−ｑ２１の領域が増幅しており、クロモソーム１４ｑ１１．２−ｑ１２に局在するＢＣＬ１Ｌ２遺伝子のＦＩＳＨ法により求めたコピー数は６コピーであった（図１、ＣとＤ）。
Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ３ファミリー遺伝子であるＨＮＦ３Ａ遺伝子はクロモソーム１４ｑ１２にマップされ、食道癌であるＥｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｓのクロモソーム１４ｑ１２−ｑ１３上にこの領域の増幅を誘起するアンプリコンとして見出されている。エトポシド耐性卵巣癌細胞で、ＨＮＦ３Ａ遺伝子のＦＩＳＨ法で求めたコピー数は４コピーであった（図１Ｄ）。ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子はエトポシド耐性細胞株ＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞においてクロモソーム１４ｑ１１−ｑ２１領域でのアンプリコンとして可能性の高い領域に存在している。さらに、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子を含むアンプリコンはマーカーＤ１４Ｓ８７９（ＢＡＣクローンＲＰ１１−１４６Ｅ１３）とＳＨＧＣ−１０１６４（ＢＡＣクローンＲＰ１１−１４４Ｃ１８）の間に存在する（図１Ｊ）。Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロット法によりＢＣＬ２Ｌ２遺伝子の発現を検討した所、親株と比較してＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞ではその遺伝子発現は３．３倍に増大していた（図２Ｂ）。
次に、上記６種類のＢＣＬ２ファミリー遺伝子発現を２２種類の薬剤耐性細胞で比較した（図３）。ＢＣＬ２遺伝子発現は４種類の薬剤耐性細胞で親株と比較して２倍以上の高レベル発現を示した。同様にＢＣＬ２Ｌ１（ＢＣＬＸＬ）遺伝子発現は１種類の薬剤耐性癌細胞で、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子発現は３種類の薬剤耐性癌細胞で、ＭＣＬ１遺伝子発現は１種類の薬剤耐性癌細胞でＢＣＬ２Ａ１遺伝子発現は１種類の薬剤耐性癌細胞で、ＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子発現は５種類の薬剤耐性癌細胞でそれぞれの親株と比較して２倍以上の高レベル発現を示した（図２Ｂと図３）。
ＭＣＬ１遺伝子はカンプトテシン耐性大腸癌ＨＴ−２９／ＣＰＴ細胞で、ＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子はシトシンアラビノシド耐性白血病Ｋ５６２／ＡＣ細胞で、それらの遺伝子増幅に比例して高い発現をしていた（表２と図３）。従って、ＢＣＬ２ファミリー遺伝子の高発現は制癌剤耐性を誘導することが判明し、その遺伝子増幅の解析は薬剤耐性能を検査上で重要であることが判明した。

エトポシド（ＶＰ−１６）により誘導されたアポトーシスに対するＢＣＬ２Ｌ２の影響
制癌剤によるアポトーシスの誘導に対するＢＣＬ２Ｌ２遺伝子発現の影響を検討した。ヒト卵巣癌ＳＫＯＶ３細胞とエトポシド耐性卵巣癌ＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞を１００μｇ／ｍｌのＶＰ−１６存在下で２４時間培養し、ｃａｓｐａｓｅ−３の活性化に伴うアポトーシスを測定した。その結果、カスパーゼ活性は親株と比較するとエトポシド耐性ＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞では約１／２に低下した（図４Ａ）。次に、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子の役割を解析するために、ＢＣＬ２Ｌ２のアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理し、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子発現を抑制した条件でＶＰ−１６の影響を検討した。トランスフェクション試薬（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）単独、ＢＣＬ２Ｌ２のセンスオリゴヌクレオチド（スクランブル配列のコントロールオリゴヌクレオチド）は影響しないが、ＢＣＬ２Ｌ２のアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加するとＢＣＬ２Ｌ２遺伝子発現が低下した（図４Ｂ）。この条件でＳＫＯＶ３／ＶＰ細胞のエトポシド（ＶＰ−１６）に対する感受性が増大した（図４Ｃ）。従って、ＢＣＬ２ファミリー遺伝子の増幅がカスパーゼ活性を低下させ、制癌剤耐性を誘導しているといえる。

ＤＣＫ、ＴＯＰ１、ＴＯＰ２Ａの遺伝子コピー数と発現レベル
シトシンアラビノシド耐性白血病Ｋ５６２／ＡＣ細胞はデオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）遺伝子が局在するクロモソーム４ｑの領域を欠失、カンプトテシン耐性大腸癌ＨＴ−２９／ＣＰＴ細胞はトポイソメラーゼ１（ＴＯＰ１）が局在するクロモソーム２０ｑを欠失する。一方、ＴＯＰ２Ａが局在するクロモソーム１７ｑ２１−２２の領域は５種類のエトポシド（ＶＰ−１６）耐性細胞では増幅・欠失は認められない（表１）。シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、カンプトテシン（ＣＰＴ）及びエトポシド（ＶＰ−１６）耐性細胞で、ＦＩＳＨ法を用いてＤＣＫ遺伝子、ＴＯＰ１遺伝子、ＴＯＰ２Ａ遺伝子のコピー数を求め、リアルタイム逆転写−ＰＣＲ法によりそれらの発現レベルを測定した（表３）。

親株と比較してシトシンアラビノシド耐性白血病（Ｋ５６２／ＡＣ）細胞はＤＣＫ遺伝子のＦＩＳＨ法により求めたコピー数は１コピーであった。これはＡｒａ−Ｃ耐性細胞における２対の遺伝子中で１対の欠失を示している（図１ＥとＦ）。ＤＣＫ遺伝子の発現はヒト白血病Ｋ５６２細胞で明らかに検出されたが、シトシンアラビノシド耐性白血病Ｋ５６２／ＡＣ細胞では検出されなかった。大腸癌ＨＴ−２９細胞はＴＯＰ１遺伝子を５コピー有しているが、カンプトテシン耐性大腸癌ＨＴ−２９／ＣＰＴ細胞では２コピーであり、顕著に低下していた（図１ＧとＨ）。同様に、親株胃癌（Ｓｔ−４）細胞ではＴＯＰ１のコピー数は６コピーであったが、カンプトテシン耐性胃癌（Ｓｔ−４／ＣＰＴ）細胞では３コピーに減少し、３種類のカンプトテシン耐性細胞株ではすべて３コピー以下に減少していた。ＴＯＰ２Ａ遺伝子のコピー数はそれぞれの親株と比較して、カンプトテシン耐性大腸癌ＨＴ−２９／ＥＴＰ細胞、エトポシド耐性白血病（Ｋ５６２／ｅｔｏｐ２０及びＫ５６２／ｅｔｏｐ８０）細胞で減少し、ＴＯＰ２Ａ遺伝子発現は５種類すべてのエトポシド耐性細胞株で低下していた。
従って、ＤＣＫ遺伝子、ＴＯＰ１遺伝子及びＴＯＰ２Ａ遺伝子のコピー数の減少は制癌剤の耐性と密接に関係しており、クロムソームのこれらの遺伝子の増幅並びに欠失を解析することは癌細胞の制癌剤耐性能を検査する上で極めて重要である。

癌細胞及び癌組織の薬剤耐性能を診断するＣＧＨアレイの作成
ＡＢＣトランスポーターファミリーに属するＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＢ１遺伝子、ＡＢＣＢ６遺伝子、ＡＢＣＢ８遺伝子、ＡＢＣＢ１０遺伝子、ＡＢＣＢ１１遺伝子、ＡＢＣＣ１遺伝子、ＡＢＣＣ４遺伝子、ＡＢＣＣ９遺伝子、ＡＢＣＤ３遺伝子、ＡＢＣＤ４遺伝子、ＡＢＣＥ１遺伝子及びＡＢＣＦ２遺伝子はそれぞれＢＡＣクローン、ＲＰ１１−３０４Ｌ１９、ＲＰ１１−２１２Ｂ１、ＲＰ１１−８０３Ｊ６、ＲＰ１１−６０６Ｐ１、ＲＰ４−６１３Ａ２、ＲＰ１１−７０４Ｂ８、ＲＰ１１−５１６Ｆ７、ＲＰ１１−１２４Ｄ１５、ＲＰ１１−７２９Ｉ１０、ＲＰ１１−２７２Ｐ３、ＲＰ５−９１９Ｊ２２、ＲＰ１１−５４３Ｈ９及びＲＰ４−５４８Ｄ１９に含まれている。ＢＣＬ２ファミリーに属するＢＣＬ２Ｌ２遺伝子、ＭＣＬ１遺伝子及びＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子はそれぞれＢＡＣクローン、ＲＰ１１−１２４Ｄ２、ＲＰ１１−２４３Ｇ２２及びＲＰ１１−３３７Ｂ１１に含まれる。これらのＢＡＣＤＮＡを４塩基認識酵素ＲｓａＩで消化した後アダプターを加えてライゲーションを行った。その後、アダプターの配列をプライマーに用いてＰＣＲを行い、遺伝子増幅を行った（この増幅工程を無尽蔵化と言う）。コントロールＤＮＡとして、上記以外の５種類のＢＡＣＤＮＡ（ＲＰ１１−９８Ａ２０、ＲＰ１１−２５２Ｏ１１、ＲＰ１１−３５７Ｇ３、ＲＰ１１−１９６Ｆ４及びＲＰ１１−７３６Ａ８）を無尽蔵化して調製した。
無尽蔵化したＤＮＡをインクジェット式プリンターを用いてアミノ化オリゴヌクレオチド固定化アレイ用スライドグラスにＴｒｉｐｌｉｃａｔｅにスポットすることによりＤＮＡ定着基盤を作成した。
健常者組織に由来するＤＮＡをＣｙ５で標識し、癌患者より摘出した癌組織に由来するＤＮＡをＣｙ３で標識する。その混液をＤＮＡ定着基盤上でハイブリダイゼーションを行い、そのアレイをスキャンし、Ｃｙ３のシグナルとＣｙ５のシグナルを標準化した後Ｃｙ３／Ｃｙ５の強度比を求める。その比が２であればＤＮＡ定着基盤にプリントした遺伝子を含むゲノムの領域が癌組織で２倍に増幅、その比が４であれば４倍に増幅していることを示す。

ヒトＡＢＣトランスポーター系遺伝子、ＢＣＬ２ファミリー遺伝子またはＤＮＡ合成関連遺伝子群は、制癌剤耐性に密接に関連している。従って、本発明により、癌細胞の染色体上でのこれらの遺伝子領域の増幅及び欠失を調べることにより、癌細胞の制癌剤耐性を判定することが可能である。その結果、癌患者の患部の細胞が制癌剤耐性かどうか容易に診断することが可能である。これは患者個人に適切な化学療法即ちオーダーメイド医療を可能にし、制癌剤耐性能獲得に基づく奏効率の極めて低い化学療法を避けることが可能であり、かつ、患者のＱｕａｌｉｔｙｏｆＬｉｆｅの無用な低下を防ぐことができる。

Claims

被験癌細胞における、ＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＢ６遺伝子、ＡＢＣＢ８遺伝子、ＡＢＣＢ１０遺伝子、ＡＢＣＣ４遺伝子、ＡＢＣＣ９遺伝子、ＡＢＣＤ３遺伝子、ＡＢＣＤ４遺伝子、ＡＢＣＥ１遺伝子、ＡＢＣＦ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ２Ｌ１０、ＢＣＬ２Ｌ１、および、ＢＣＬ２Ａ１からなる群のＡＢＣトランスポーター系遺伝子またはＢＣＬ２ファミリー遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子の増幅を検出することにより、当該被験癌細胞における制癌剤に対する薬剤耐性の獲得を検出する、検出方法。
ＡＢＣＡ３遺伝子の増幅がエトポシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＢ６遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＢ８遺伝子の増幅がシスプラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＢ１０遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＣ４遺伝子の増幅がシスプラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＣ９遺伝子の増幅がエトポシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＤ３遺伝子の増幅がエトポシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＤ４遺伝子の増幅がアドリアマイシンに対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＥ１遺伝子の増幅がカンプトテシン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＡＢＣＦ２遺伝子の増幅がシスプラチン類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子の増幅がカントプテシン類、シスプラチン類、エトポキシド類またはシトシンアラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子の増幅が、カントプテシン類、シスプラチン類またはシトシンアラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標であり、ＢＣＬ２Ｌ１遺伝子の増幅が、カントプテシン類、シスプラチン類、エトポシド類またはシトシンアラビノシド類に対する薬剤耐性獲得の指標である、請求項１記載の検出方法。
検出方法を、ＣＧＨ法、フローサイトメトリー法、ＥＬＩＳＡ法、ＤＮＡチップ法、または、定量ＰＣＲ法により行う、請求項１または２の検出方法。
検出方法をＣＧＨ法またはＤＮＡチップ法により行う、請求項１または２記載の検出方法。
ＣＧＨ法またはＤＮＡチップ法に用いる基盤が、ＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＢ６遺伝子、ＡＢＣＢ８遺伝子、ＡＢＣＢ１０遺伝子、ＡＢＣＣ４遺伝子、ＡＢＣＣ９遺伝子、ＡＢＣＤ３遺伝子、ＡＢＣＤ４遺伝子、ＡＢＣＥ１遺伝子、ＡＢＣＦ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ１遺伝子、および、ＢＣＬ２Ａ１遺伝子からなる群のＡＢＣトランスポーター系遺伝子またはＢＣＬ２ファミリー遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を含有するＤＮＡの定着基盤である、請求項４記載の検出方法。
上記ＤＮＡの定着基盤が、さらに、ＡＢＣＢ１遺伝子、ＡＢＣＣ１遺伝子、ＡＢＣＢ１１遺伝子、ＢＣＬ２遺伝子、ＭＣＬ１遺伝子、ＢＣＬＸＬ遺伝子、ＤＣＫ１遺伝子、ＴＯＰ１遺伝子、および、ＴＯＰ２Ａ遺伝子からなる群のＡＢＣトランスポーター系遺伝子、ＢＣＬ２ファミリー遺伝子またはＤＮＡ合成関連遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を含有するＤＮＡ定着基盤である、請求項５記載の検出方法。
それぞれ異なる蛍光色素で標識した対照ＤＮＡと薬剤耐性の獲得を検出する対象となる被験癌細胞のＤＮＡを、上記ＤＮＡ定着基盤上において同時に接触させてハイブリダイズを行うことにより得られる蛍光色を指標として、被験ＤＮＡの特定領域の増幅または欠失を定量的に検出する、請求項４〜６のいずれかに記載の薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法。
上記ＤＮＡ定着基盤に定着されるＤＮＡと被験ＤＮＡと対照ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡである、請求項７記載の薬剤耐性獲得癌細胞の検出方法。
ＡＢＣＡ３遺伝子、ＡＢＣＢ６遺伝子、ＡＢＣＢ８遺伝子、ＡＢＣＢ１０遺伝子、ＡＢＣＣ４遺伝子、ＡＢＣＣ９遺伝子、ＡＢＣＤ３遺伝子、ＡＢＣＤ４遺伝子、ＡＢＣＥ１遺伝子、ＡＢＣＦ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ２遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ１０遺伝子、ＢＣＬ２Ｌ１遺伝子、および、ＢＣＬ２Ａ１遺伝子からなる群のＡＢＣトランスポーター系遺伝子またはＢＣＬ２ファミリー遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を含有するＤＮＡが定着している、ＤＮＡの定着基盤。
さらに、ＡＢＣＢ１遺伝子、ＡＢＣＣ１遺伝子、ＡＢＣＢ１１遺伝子、ＢＣＬ２遺伝子、ＭＣＬ１遺伝子、ＢＣＬＸＬ遺伝子、ＤＣＫ１遺伝子、ＴＯＰ１遺伝子、および、ＴＯＰ２Ａ遺伝子からなる群のＡＢＣトランスポーター系遺伝子、ＢＣＬ２ファミリー遺伝子またはＤＮＡ合成関連遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子を含有する複数種類のＤＮＡが定着している、請求項８記載のＤＮＡの定着基盤。
基盤に定着させる複数種類のＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または、合成オリゴヌクレオチドである、請求項９または１０記載のＤＮＡの定着基盤。
複数種類のＤＮＡがゲノムＤＮＡであり、かつ、当該ゲノムＤＮＡが、ＢＡＣＤＮＡ、ＹＡＣＤＮＡ、または、ＰＡＣＤＮＡの遺伝子増幅産物である、請求項１１記載のＤＮＡの定着基盤。