KR100863440B1

KR100863440B1 - 위암의 전이 또는 전염 진단용 키트 및 판단 방법

Info

Publication number: KR100863440B1
Application number: KR1020070012717A
Authority: KR
Inventors: 강종호; 양송주; 강현웅; 이승희; 곽미선; 서정선; 신명주; 오은희
Original assignee: 주식회사 마크로젠
Priority date: 2007-02-07
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2008-10-16
Also published as: KR20080073900A

Abstract

본 발명은 위암의 전이, 또는 전염 여부 또는 조직학적 유형을 판단할 수 있는 마커; 위암 환자로부터 분리한 시료, 상기와 같은 위암 전이 진단용 마커 및 상기 마커에서의 DNA 복제수 이상을 측정할 수 있는 측정 수단을 포함하는 위암 전이, 전염 또는 조직학적 유형 진단용 키트; 및 상기 마커에서의 DNA 복제수 이상을 측정하여 사용하여 환자의 위암 전이 여부, 전염 여부 또는 조직학적 유형을 판단하는 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명은 위암의 림프절 전이, 간 전이 및 복막 전염 여부 및 조직학적 유형을 용이하게 판단할 수 있어, 위암 환자의 효과적인 맞춤 치료에 매우 유용하다.

Description

위암의 전이 또는 전염 진단용 키트 및 판단 방법{KIT AND METHOD FOR DETRMINING METASTASIS OR DISSEMINATION OF GASTRIC CANCER}

도 1은 83개의 산발 위선암 세포에서의 각 클론/유전자에 대한 DNA 복제수 이상 (DNA copy number aberrations; DCNAs)의 전체적인 빈도를 보여주는 것이다.

도 2는 림프절 전이가 일어난 종양과 그렇지 않은 종양에서의 DNA 복제수 이상의 빈도(DCNAs)를 각각의 BAC 클론에 대하여 측정하여 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 3은 복막 전염이 일어난 종양과 그렇지 않은 종양에서의 DNA 복제수 이상의 빈도를 각각의 BAC 클론에 대하여 측정하여 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 간 전이가 일어난 종양과 그렇지 않은 종양에서의 DNA 복제수 이상의 빈도를 각각의 BAC 클론에 대하여 측정하여 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 장형 위선암 및 확산형 위선암에서의 DNA 복제수 이상의 빈도를 각각의 BAC 클론에 대하여 측정하여 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 6은 본 발명의 실시예에서 수행된 aCGH 방법을 개략적으로 보여주는 모식도이다.

본 발명은 위암의 전이, 또는 전염 여부 또는 조직학적 유형을 판단할 수 있는 마커; 위암 환자로부터 분리한 시료, 상기와 같은 위암 전이 진단용 마커 및 상기 마커에서의 DNA 복제수 이상을 측정할 수 있는 측정 수단을 포함하는 위암 전이, 전염 또는 조직학적 유형 진단용 키트; 및 상기 마커에서의 DNA 복제수 이상을 측정하여 사용하여 환자의 위암 전이 여부, 전염 여부 또는 조직학적 유형을 판단하는 진단 방법에 관한 것이다.

위선암 (Gastric adenocarcinoma)은 전세계적으로 가장 흔한 암 중 하나로, 암 관련 사망에 있어서 두 번째로 많은 사망 원인이 되는 질병이다. 이에 대하여 많은 진단 및 치료 기술이 개발되고 있지만, 여전이 많은 위암 환자들이 이로 인하여 사망에 이르고 있다. 위암은 생물학적, 형태학적 및 유전학적 견지에서 다양한 유형의 질병을 포함한다. 개개인의 암환자를 효과적으로 치료하기 위하여, 개인별 맞춤 의학의 제시가 필요하며, 이러한 맞춤 의학을 수행하기 위해서, 위암을 생물학적 특성을 기준으로 유형화하는 것이 필요하다.

종양 세포의 전염 (dissemination)과 전이 (metastasis)는 모두 악성 종양의 대표적인 특징이며, 일반적으로, 환자의 예후를 판단하는 인자가 된다. 암 치료 계획이 전이의 존재 여부에 따라 달라질 수 있기 때문에, 치료 양태의 결정에 있어서 림프절 상태 (nodal status)를 평가하여야 한다. 그러나, 림프절 상태를 평가 하는 것은 상당히 어렵고 분자생물학적인 진단이 불가능한 상태이기 때문에, 위암 치료 전에 림프절 전이 및 간 전이를 포함하는 생물학적 특성을 통상적인 방법으로 평가하는 것은 매우 곤란하다. 현재까지, 생물학적 특성이 상이한 위암을 정확하게 구분 및 진단할 수 있는 기술이 개발되지 못하고 있다.

따라서 위암 치료 전에 림프절 전이 또는 간 전이 등과 같은 위암의 생물학적 상태를 판단하여 환자 개인의 상태에 맞춘 정확하고 효과적인 치료를 제공하기 위하여, 이러한 위암의 생물학적 상태를 평가할 수 있는 마커와 이를 이용하는 종양 진단 기술의 개발이 시급한 상황이다.

상기의 요구에 부응하기 위하여, 본 발명은 위암의 전이, 또는 전염 여부 또는 조직학적 유형을 판단할 수 있는 마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 환자로부터 분리한 시료, 상기와 같은 위암 전이 진단용 마커 및 상기 마커에서의 DNA 복제수 이상을 측정할 수 있는 측정 수단을 포함하는 위암 전이, 전염 또는 조직학적 유형 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커에서의 DNA 복제수 이상을 측정하여 사용하여 환자의 위암 전이 여부, 전염 여부 또는 조직학적 유형을 판단하는 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 위암의 전이, 또는 전염 여부 또는 조직학적 유형을 판단할 수 있 는 마커; 위암 환자로부터 분리한 시료, 상기와 같은 위암 전이 진단용 마커 및 상기 마커에서의 DNA 복제수 이상을 측정할 수 있는 측정 수단을 포함하는 위암 전이, 전염 또는 조직학적 유형 진단용 키트; 및 상기 마커에서의 DNA 복제수 이상을 측정하여 사용하여 환자의 위암 전이 여부, 전염 여부 또는 조직학적 유형을 판단하는 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명은 위암의 림프절 전이, 간 전이 및 복막 전염 여부 등의 생물학적 특성 및 조직학적 유형을 용이하게 판단할 수 있어, 위암 환자의 효과적인 맞춤 치료에 매우 유용하다.

위암의 생물학적 특성은 일차적으로 암세포의 근원적인 유전적 변형에 따라 달라진다. 타 기관으로의 전이 (metastasis) 또는 전염 (dissemination)이 일어난 위암과 그렇지 않은 위암은 생물학적 특성이 상이하기 때문에, 효과적인 치료를 위해서는 암의 전이 또는 전염 여부와 전이된 기관을 정확하게 찾아내는 것이 환자 개개인에 최적화된 맞춤 치료에 있어서 매우 중요하다. 이에, 본 발명은 위암의 생물학적 특성과 더 나아가 조직학적 유형을 판별하여 보다 효과적인 위암 치료가 가능하도록 하는 기술을 제공한다.

본 발명자들은 전이 (특히, 림프절 또는 간으로의 전이) 또는 복막 전염이 일어난 위암과 그렇지 않은 위암을 구별할 수 있도록 하는 마커와 위암의 조직학적 유형을 분류할 수 있는 마커를 발견하였으며, 이를 이용하여 aCGH 데이터의 정량 및 정성 분석을 수행함으로써 종양의 전이 또는 전염 여부 또는 조직학적 유형의 판단 기술을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

우선, 본 발명은 위암의 전이 또는 전염 여부 또는 조직학적 유형을 진단할 수 있는 위암 전이 또는 전염 또는 조직학적 유형 진단용 마커를 제공한다.

본 발명에 따른 마커는 아래의 표 1에 기재된 바와 같은 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12, 1p34.2, 1q44-qter, 6q23.3, 7q31.1, 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12, 12q24.13, 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2의 20개의 유전자 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 위암의 림프절 전이 여부, 간 전이 여부, 복막 전염 여부 또는 조직학적 유형의 판단을 위한 것일 수 있다:

[표 1]

(MacArray^TM Karyo1400 Gene list: ver.060628_1, NCBI build 36)

이 중에서, 위암의 림프절 전이 여부의 판단에 사용되는 마커는 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12 및 1p34.2의 6 개의 유전자 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, 위암의 간 전이 여부의 판단에 사용되는 마커는 인간 게놈 염색체 부위 1q44-qter, 5q13.2, 6q23.3 및 7q31.1의 4 개의 유전자 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, 위암의 복막 전염 여부 판단에 사용되는 마커는 인간 게놈 염색체 부위 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12 및 12q24.13의 4 개의 유전자 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이고, 위암의 조직학적 유형 판단, 즉 장형 (intestine-type)인지 확산형 (diffusion-type)인지의 판단에 사용되는 마커는 인간 게놈 염색체 부위 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2의 7 개의 유전자 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 것이다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은

위암 환자로부터 얻은 시료;

인간 게놈 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12, 1p34.2, 1q44-qter, 6q23.3, 7q31.1, 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12, 12q24.13, 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2와 혼성화하는 하나 이상의 BAC (bacterial artificial chromosome) 클론; 및

상기 시료와 혼성화된 BAC 클론의 DNA 복제수 이상의 빈도를 측정할 수 있는 측정 수단을 포함하는, 위암의 전이 여부, 전염 여부 또는 조직학적 유형 진단용 키트를 제공한다.

상기 진단용 키트는 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12 및 1p34.2와 혼성화하는 6 개의 BAC 클론으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 BAC 클론을 포함하여 위암의 림프절 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 여부 진단용 키트일 수 있다.

또한, 상기 진단용 키트는 인간 게놈 염색체 부위 1q44-qter, 5q13.2, 6q23.3 및 7q31.1와 혼성화하는 4 개의 BAC 클론으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 BAC 클론을 포함하여 위암의 간 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 위암의 간 전이 여부 진단용 키트일 수 있다.

또한, 상기 진단용 키트는 인간 게놈 염색체 부위 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12 및 12q24.13와 혼성화하는 4 개의 BAC 클론으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 BAC 클론을 포함하여 위암의 복막 전염 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 위암의 복막 전염 여부 진단용 키트일 수 있다.

또한, 상기 진단용 키트는 인간 게놈 염색체 부위 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2와 혼성화하는 7 개의 BAC 클론으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 BAC 클론을 포함하여, 위암의 조직학적 유형을 장형 (intestinal-type) 위암 또는 확산형 (diffusion-type) 위암으로 분류하는 것을 특징으로 하는 위암의 조직학적 유형 진단용 키트일 수 있다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 위암 환자로부터 얻은 시료를 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12, 1p34.2, 1q44-qter, 6q23.3, 7q31.1, 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12, 12q24.13, 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2 와 혼성화하는 하나 이상의 BAC 클론과 혼성화시키고; 상기 시료와 BAC 클론과의 혼성체의 DNA 복제수 이상의 빈도를 측정하는 단계를 포함하는, 위암의 전이 여부, 전염 여부 또는 조직학적 유형의 진단 방법을 제공한다.

상기 진단 방법은 시료와 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12 및 1p34.2와 혼성화하는 6 개의 BAC 클론으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 BAC 클론과 혼성화시켜 DNA 복제수 이상의 빈도를 측정함으로써 위암의 림프절 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 여부 진단 방법일 수 있다.

또한, 상기 진단 방법은 시료를 인간 게놈 염색체 부위 1q44-qter, 5q13.2, 6q23.3 및 7q31.1와 혼성화하는 4 개의 BAC 클론으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 BAC 클론과 혼성화시켜 DNA 복제수 이상의 빈도를 측정함으로써 위암의 간 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 위암의 간 전이 여부 진단 방법일 수 있다.

또한, 상기 진단 방법은 시료와 인간 게놈 염색체 부위 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12 및 12q24.13와 혼성화하는 4 개의 BAC 클론으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 BAC 클론과 혼성화시켜 DNA 복제수 이상의 빈도를 측정함으로써 위암의 복막 전염 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 위암의 복막 전염 여부 진단 방법일 수 있다.

또한, 상기 진단 방법은 시료와 인간 게놈 염색체 부위 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2와 혼성화하는 7 개의 BAC 클론으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 BAC 클론과 혼성화시켜 DNA 복제수 이상의 빈도를 측정함으로써 위암의 조직학적 유형을 장형 (intestinal-type) 위암 또는 확산형 (diffusion-type) 위암으로 분류하는 것을 특징으로 하는 위암의 조직학적 유형 진단 방법일 수 있다.

본 발명에 의하면, 개개의 위암 세포의 생물학적 특성과 조직학적 특성을 질병의 진단과 동시에 조사할 수 있게 된다. 각 종양에 대한 전이 또는 전염 등의 생물학적 상태를 평가하는 것은 최소 침습술 (minimal invasive surgery)에 의하여 환자의 고통을 최소화 시키고 환자 개인의 상태에 맞는 효과적인 맞춤 치료를 제공하는데 매우 중요하다. 본 발명에서는 aCGH에 의하여 측정된 DNA 복제수 이상에 기초하여 위암의 생물학적 상태, 즉, 림프절 전이, 간 전이 및/또는 복막 전염 여부를 정확하게 판단하여, 이러한 전이 및/또는 전염이 일어난 위암과 그렇지 않은 위암을 정확하게 구별할 수 있다. 현재까지, DNA 복제수 이상과 위암의 림프절 전이, 간 전이 및 복막 전염과의 상관 관계에 대하여 보고된 바가 없다.

이를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다:

본 발명에 있어서, 시료와 혼성화된 상기 마커의 DNA 복제수 이상 (DNA copy number aberrations; DCNAs)은 통상적으로 사용 가능한 모든 방법으로 측정 가능하다. 본 발명의 바람직한 구체 예에 있어서 어레이 기반의 비교 유전자 혼성화 (cDNA, Oligonucleotide 또는 BAC clone Array-based comparative genomic hybridization; aCGH) 분석법을 사용하여 DNA 복제수 이상을 분석할 수 있다.

2세대 비교 유전자 혼성화법 (comparative genomic hybridization; CGH) 중 하나인 aCGH 분석법은 통상적인 CGH법과 비교하여 해상도가 매우 우수하며, DNA 복제수 이상을 1회 수행으로 고해상도의 locus-by-locus 측정을 가능하게 하는 방법이다. 위선암을 포함하는 악성 종양들은 많은 비특이적 유전자 이상을 동반하기 때문에, 전이 및 복막 전염과 같은 생물학적 특성과 관련된 유전자 이상을 동정하는 것은 쉽지 않다. 본 발명에서는, aCGH 분석법을 사용하여, 복제수 이상을 갖는 유전자들과 종양의 생물학적 특성 간의 관련성을 입증함으로써 동정이 용이하지 아니하던 종양의 전이 및 복막 전염과 같은 생물학적 특성과 관련된 유전자 이상을 동정하였으며, 이를 통하여 종양의 생물학적 특성과 조직학적 유형을 판단할 수 있는 기반을 마련한 것이다. 현재까지 알려진 바에 따르면, aCGH 데이터 분석법을 사용하여 전이 또는 전염이 일어난 위암 세포와 그렇지 않은 위암 세포를 구별하는 기술에 대해서는 보고된 바가 없다.

CGH는 전체 게놈을 분석하여 염색체 상의 특정 부위의 증폭과 결실을 측정하는데 널리 이용되는 기술로서, 최근에는 DNA microarray 기술이 접목되어 대용량 분석을 칩으로 가능하도록 한 것이 aCGH이다. aCGH를 이용하여 시료에서의 염색체 이상을 측정할 수 있으며, 이러한 시도는 amplicons 내에서 질병의 중요한 요인인 유전자의 발견을 촉진할 뿐 아니라, 이미 알려진 유전자 발현 데이터와의 비교를 통해 질병의 분자 진단 및 치료에 많은 발전을 가져올 수 있다. aCGH 분석에 의하여 염색체 이상의 변화를 분석프로그램을 이용하여 직접 표현할 수 있으며, 복제수가 증가한 유전자와 감소한 유전자를 쉽게 구분할 수 있다.

본 발명에서는 위암의 림프절 전이 또는 간 전이 또는 복막 전염과 같은 생물학적 특성 및 조직학적 특성과 관련된 유전자 이상의 존재 여부를 판단하기 위한 마커를 동정하기 위하여, 83개의 위선암 (gastric adenocarcinomas) 세포에 대하여 3 알고리즘 분류인 C4.5 (Weak classifiers trees J48; www.cs.wailato.ac.nz/ml/weka/)에 의한 aCGH 데이터 분석을 수행하여 각 클론에서의 DNA 복제수 이상을 측정하였다. 본 명세서 전반 걸쳐서, 위선암은 모든 종류의 위암의 특징을 대표하는 것으로 기재되어 있으며, 위선암과 관련하여 기재된 내용은 특별한 언급이 없는 한 다른 종류의 위암에도 적용되는 것으로 한다.

상기 aCGH 분석은 평균 해상도가 2.3 Mb인 1,440개의 박테리아 인공 염색체 (bacterial artificial chromosome, BAC; 한국특허공개 제10-2006-0018049호의 표 2 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다)를 어레이 상에 고정시켜 수행하였다. 그 결과, 염색체 부위 20q13, 8q21-q24, 및 7p12-14 등과 혼성화된 BAC 클론에서 DNA 복제수의 증가 빈도가 높은 것으로 검출되고, 염색체 부위 4q34-q35, 5q, 14q32, 17p11-13, 21q22, 및 22q11 등과 혼성화된 BAC 클론과, Y 염색체에서는 DNA 복제수 감소 빈도가 높은 것으로 검출되었다. 3 알고리즘 분류인 C4.5에 의한 aCGH 데이터의 정성 및 정량분석에 의하여, 림프절 또는 간 전이 또는 복막 전염이 일어난 암과 그렇지 않은 암을 100% 정확도 (resolution rate)로 구별할 수 있다.

상기 aCGH는 치료 시작 전에 각 환자에게 위암의 림프절 전이, 간 전이 및 복막 전염에 관한 유용한 정보를 제공하여, 효과적인 맞춤 치료를 실현할 수 있다.

예컨대, 림프절 전이가 일어난 위암과 그렇지 않은 위암은 각각 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12 및 1p34.2과 혼성화된 6 개의 BAC 클론의 복제수 상태에 의하여 구별된다 (도 2 참조). 상기 클론은 염색체 부위와 혼성화하는 것으로 생각되는 후보 유전자들을 포함하며, 이들이 위암의 림프절 전이와 관련이 있을 것으로 생각된다. 또한, 간 전이가 일어난 위암과 그렇지 않은 위암은 각각 염색체 부위 1q44-qter, 5q13.2, 6q23.3 및 7q31.1과 혼성화된 4 개의 BAC 클론의 복제수 상태에 의하여 구별된다 (도 4 참조). 상기 클론은 염색체 부위와 혼성화하는 것으로 생각되는 후보 유전자들을 포함하며, 이들이 위암의 간 전이와 관련이 있을 것으로 생각된다. 또한, 위암의 복막 전염 여부는 각각 염색체 부위 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12 및 12q24.13과 혼성화된 4 개의 BAC 클론의 복제수 상태에 의하여 평가할 수 있다 (도 3 참조). 상기 클론은 염색체 부위와 혼성화하는 것으로 생각되는 후보 유전자들을 포함하며, 이들이 위암의 복막 전염과 관련이 있을 것으로 생각된다.

본 발명에 따르면, 이와 같은 전이 또는 전염과 같은 위암의 생물학적 상태 이외에도, 장형 위암 (intestinal-type gastric cancers)과 확산형 위암 (diffuse-type gastric cancers)과 같은 조직학적 유형 역시 이러한 방법으로 구별 가능하다. 상기와 같은 위암의 조직학적 유형 판단은 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2와 혼성화된 7 개의 BAC 클론의 복제수 상태에 의하여 평가할 수 있다 (도 5 참조). 상기 클론은 염색체 부위와 혼성화하는 것으로 생각되는 후보 유전자들을 포함하며, 이들이 위암의 조직학적 유형 결정에 관련이 있을 것으로 생각된다. 본 발명에서는, 장형 위암에서의 복제수 이상 평균이 확산형 위암에서보다 높은 것으로 나타났으며, 상기 7 개의 BAC 클론에서의 복제수 이상을 측정함으로써 이들 두 유형을 구별할 수 있음이 밝혀졌다. 이는 상기 두 가지 조직학적 유형이 형태학적뿐만 아니라 유전학적으로도 상이함을 보여주는 것이다.

상기 마커와 이와 혼성화하는 것으로 보이는 후보 유전자와 여기서 조사되는 DNA 복제수 이상 빈도를 아래의 표 2에 정리하였다.

[표 2]

N.I.: not identified

상기 표 2에서, 정상 샘플에 대한 시험 샘플의 DNA 복제수 비율의 log2 값 (DNA 복제수의 log2 값: 아래의 정의 참조)이 0.25보다 큰 경우에는 DNA 복제수가 증가한 것으로 하고, -0.25 보다 작은 경우에는 DNA 복제수가 감소한 것으로 하여, 상기의 결과를 얻었다.

상기 표 2에서 알 수 있는 같이, 본 발명은 위암의 전이 및/또는 전염 여부를 매우 정확하게 판단할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 클론들 중에서, 림프절 전이와 간 전이가 모두 일어나지 않은 위암에서 복제수 감소를 보이는 염색체 부위 5q13.2를 제외하고는, 림프절 전이, 간 전이 및 복막 전염이 일어난 위암 세포는 DNA의 복제수 이상에 있어서 유의적인 연관성을 보이지 않는 것으로 나타났다. 이는 위암 전이의 표적 기관에 따라서 전이의 유전적 메커니즘이 상이함을 보여주는 것이라 할 수 있다 (표 6-1, 6-2 및 6-3 참조). 상기 클론들 중 림프절 전이 및 간 전이가 일어난 위암 세포와 복막 전염이 일어난 위암 세포에 공통적인 것은 없다. 이는 종양의 전이(metastasis)와 전염(dissemination)의 유전학적 메커니즘이 서로 상이하다는 것을 의미하는 것이다. 상기와 같이 위암의 림프절 전이, 간 전이 및 복막 전염과 연관 있는 것으로 선별된 BAC 클론을 통하여 이와 혼성화하는 후보 유전자를 제시할 수 있으며, 상기 유전자들이 각각 위암의 림프절 전이, 간 전이 및 복막 전염에 관여한다고 예상할 수 있다.

본 발명의 구체 예에 있어서, 분류 트리 알고리즘 (classification tree algorithm)을 사용하여 임상병리학적 특성을 나타내는 aCGH 데이터를 조사하여, BAC 클론의 DNA 복제수 이상과, 위암의 림프절 전이, 간 전이 및 복막 전염간의 관계를 조사할 수 있다. 이를 위하여 aCGH 데이터 분석에 C4.5 분류 트리 알고리즘을 적용할 수 있으며, 이에 의하여 림프절 전이 또는 간 전이가 발생한 위암 세포와 그렇지 않은 위암세포의 설명이 가능할 수 있다. 이와 같은 결과에 따르면, 림 프절 전이가 일어난 위암 세포와 그렇지 않은 위암세포는, 도 2에 나타난 바와 같은 순서도에 따라서 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 1p34.2, 14q32.2, 및 3q13.12(Fig. 2의 순서)와 혼성화하는 6 개의 BAC 클론의 DNA 복제수 이상 정도를 순서대로 평가함으로써, 100%의 정확성으로 구별할 수 있다.

상기 6 개 BAC 클론과 혼성화하는 후보 유전자는 상기의 표 2에 나타낸 바와 같다. 염색체 부위 5q13.2와 혼성화하는 BAC 클론에 있어서, 23개의 림프절 전이 음성 위암세포 중 44%에서 DNA 복제수 감소가 탐지되는 반면, 60개의 림프절 전이 양성 위암세포 중에서는 8%에서만이 BAC 클론의 DNA 복제수 감소가 나타났다. 또한, 염색체 부위 13q31.1와 혼성화하는 BAC 클론에 있어서, 림프절 전이 음성 위암세포 중 30%에서 DNA 복제수 증가가 탐지된 반면, 림프절 전이 양성 위암세포 중에서는 13%에서 DNA 복제수 증가가 나타난다 (표 2 참조).

또한, 간 전이가 일어난 위암세포와 그렇지 않은 위암세포는 염색체 부위 1q44-qter, 5q13.2, 6q23.3 및 7q31.1과 혼성화하는 4 개의 BAC 클론에서의 DNA 복제수 이상을 조사함으로써 100%의 정확성으로 구별할 수 있다 (도 4 참조). 대략적으로, 염색체 부위 1q44-qter 및 5q13.2와 혼성화하는 BAC 클론에서 DNA 복제수 감소가 나타난 경우 위암세포에서는 간암 전이가 발견되지 않는다. 이들 BAC 클론과 혼성화하는 후보 유전자는 상기의 표 2에 나타낸 바와 같다. 염색체 부위 1q44-qter와 혼성화하는 BAC 클론에 있어서, 간 전이 양성 위암세포 중 57%에서 DNA 복제수 증가가 탐지되는 반면, 간 전이 음성 위암세포 중에서는 6%에서만이 BAC 클론의 DNA 복제수 증가가 나타났다. 또한, 염색체 부위 5q13.2와 혼성화하는 BAC 클론에 있어서는, 림프절 전이 음성 위암세포 중 19%에서 DNA 복제수 감소가 탐지된 반면, 간 전이 양성 위암세포 중에서는 DNA 복제수 감소가 전혀 나타나지 않는다 (표 2 참조).

특히, 염색체 부위 5q13.2와 혼성화하는 BAC 클론에서의 DNA 복제수 감소 빈도는 림프절 전이와 간 전이가 모두 일어나지 않은 위암세포에서 높게 나타난다. 이를 제외하고는 림프절 전이와 간 전이가 일어난 위암세포는 각각 별개의 마커에 의하여 탐지된다.

상기와 같은 분류 트리 알고리즘을 사용하는 aCGH 데이터 분석에 의하여 위암의 림프절 전이 및 간 전이뿐만 아니라 위암의 복막 전염 여부도 평가할 수 있다 (도 3 참조). 염색체 부위 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12 및 12q24.13와 혼성화하는 4 개의 BAC 클론에서의 DNA 복제수 이상을 조사함으로써 100%에 가까운 정확성으로 복막 전염이 일어난 위암세포와 그렇지 않은 것을 구별할 수 있다 (표 2 참조).

또한, 위암 세포는 조직학적 유형에 따라서 장형 (intestinal-type) 및 확산형 (diffuse-type)의 두 그룹으로 나뉘어진다 (도 5 참조). 인간 게놈 염색체 부위 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2와 혼성화하는 7 개의 BAC 클론에서의 DNA 복제수 이상을 조사함으로써, 100%의 정확성으로 상기 두 유형을 구별할 수 있다 (표 2 참조).

상기의 내용에 비추어 본 발명에 따른 진단용 키트 및 진단 방법은 다음과 같은 판단 기준 및 판단 단계에 의하여 위암의 림프절 전이, 간 전이, 복막 전염 및 조직학적 유형을 진단할 수 있다.

본 발명의 구체예에 있어서, DNA 복제수의 log2 값을 기준으로 DNA 복제수 이상 여부를 판단할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 'DNA 복제수의 log2 값'은 각 염색체 부위에서의 정상 샘플의 DNA 복제수에 대한 시험 샘플의 DNA 복제수 비율 (시험 샘플의 DNA 복제수/정상 샘플의 DNA 복제수)을 log2 값으로 변환시킨 것을 의미하며, 보다 구체적으로, 다음의 정의를 따른다:

DNA 복제수의 log2 값

= log2 (시험 샘플에서의 형광 신호* 중간값/정상 샘플에서의 형광 신호** 중간값)

상기 식 중,

*은 시험 샘플에서의 DNA 복제수를 탐지할 수 있도록 사용된 형광 물질의 신호 정도로서, 상기 사용된 형광 물질은 DNA 검출에 사용 가능한 모든 형광물질일 수 있으며 (예컨대, Cy3 등), 신호 정도는 사용된 형광 물질의 신호 탐지에 통상적으로 사용되는 방법으로 측정된 값이고;

**는 정상 샘플에서의 DNA 복제수를 탐지할 수 있도록 사용된 형광 물질의 신호 정도로서, 상기 사용된 형광 물질은 DNA 검출에 사용 가능한 모든 형광물질 중에서 상기 시험 샘플에 사용된 것과 상이한 것일 수 있으며 (예컨대, Cy5 등), 신호 정도는 사용된 형광 물질의 신호 탐지에 통상적으로 사용되는 방법으로 측정된 값이다.

우선, 본 발명에 따른 위암의 림프절 전이 여부 판단에 있어서, 염색체 부위 5q13.2와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 감소 빈도의 감소; 염색체 부위 13q31.1와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증가 빈도의 감소; 염색체 부위 1p22.3와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증감 빈도의 증가; 염색체 부위 14q32.2와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증감 빈도의 증가; 염색체 부위 3q13.12와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증가 빈도의 증가 및 DNA 복제수 감소 빈도의 감소; 및 염색체 부위 1p34.2와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증가 빈도의 증가 및 DNA 복제수 감소 빈도의 감소 중에서 한 가지 이상이 관찰되면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단할 수 있다.

상기 위암의 림프절 전이 여부 판단은 다음과 같은 판단 기준 중 한 가지 이상을 적용하는 것일 수 있다:

염색체 부위 5q13.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.349보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단;

염색체 부위 13q31.1에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.37보다 크면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단;

염색체 부위 1p22.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.042보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단;

염색체 부위 1p34.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.004보다 크면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단;

염색체 부위 14q32.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.01보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단; 및

염색체 부위 3q13.12에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.06 보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단.

가장 바람직한 예에 있어서, 본 발명의 위암의 림프절 전이 여부의 판단은 상기 판단 기준을 모두 순차적으로 적용하여 다음과 같은 판단 과정을 수행하는 것일 수 있다.

1-1) 염색체 부위 5q13.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.349보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단;

1-2) 상기 단계 1-1)에서 염색체 부위 5q13.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.349보다 큰 경우, 염색체 부위 13q31.1에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.37보다 크면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단;

1-3) 상기 단계 1-2)에서 염색체 부위 13q31.1에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.37보다 작거나 같은 경우, 염색체 부위 1p22.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.042보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단;

1-4) 상기 단계 1-3)에서 염색체 부위 1p22.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.042보다 큰 경우, 염색체 부위 1p34.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.004보다 크면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단;

1-5) 상기 단계 1-4)에서 염색체 부위 1p34.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.004보다 작거나 같은 경우, 염색체 부위 14q32.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.01보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이 가 없는 것으로 판단;

1-6) 상기 단계 1-5)에서 염색체 부위 14q32.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.01보다 큰 경우, 염색체 부위 3q13.12에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.06보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단하고, -0.06보다 크면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단.

상기 단계를 다음과 같은 알고리즘 1로 나타낼 수 있다:

[알고리즘 1] 위암의 림프절 전이 여부 판단 알고리즘

또한, 본 발명에 따른 위암의 간 전이 여부 판단은 염색체 부위 1q44-qter와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증가 빈도의 증가 및 DNA 복제수 감소 빈도의 감소; 염색체 부위 5q13.2와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증감 빈도의 감소; 염색체 부위 6q23.3와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증감 빈도의 감소; 및 염색체 부위 7q31.1와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증가의 증가 및 DNA 복제수 감소 빈도의 감소 중에서 한 가지 이상의 현상이 관찰되면 위암의 간 전이가 있는 것으로 판단할 수 있다.

상기 위암의 간 전이 여부의 판단은 다음의 판단 기준 중 한 가지 이상을 적 용하는 것일 수 있다:

염색체 부위 6q23.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.041보다 크면 간 전이가 있는 것으로 판단하고, -0.041보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단;

염색체 부위 5q13.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.126보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단; 및

염색체 부위 7q31.1에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.022보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단하고, 0.022보다 크면 간 전이가 있는 것으로 판단.

가장 바람직한 예에 있어서, 상기 위암의 간 전이 여부 판단은 상기의 판단 기준을 모두 적용하여, 다음의 판단 단계를 순차적으로 수행하는 것일 수 있다:

2-1) 염색체 부위 1q44-qter에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.33보다 큰 경우, 염색체 부위 6q23.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값을 측정하여 상기 값이 -0.041보다 크면 간 전이가 있는 것으로 판단하고, -0.041보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단;

2-2) 상기 단계 2-1)에서 염색체 부위 1q44-qter에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.33보다 작거나 같은 경우, 염색체 부위 5q13.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.126보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단;

2-3) 상기 단계 2-2)에서 염색체 부위 5q13.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복 제수의 log2 값이 0.126보다 큰 경우, 염색체 부위 7q31.1에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.022보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단하고, 0.022보다 크면 간 전이가 있는 것으로 판단.

상기 단계를 다음과 같은 알고리즘 2로 나타낼 수 있다:

[알고리즘 2] 위암의 간 전이 여부 판단 알고리즘

또한, 본 발명에 따른 위암의 복막 전염 여부의 판단은 염색체 부위 4q13.3와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증가 빈도의 증가 및 DNA 복제수 감소 빈도의 감소; 염색체 부위 4q32.2와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증감 빈도의 감소; 염색체 부위 13q12.12와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증감 빈도의 감소; 및 염색체 부위 12q24.13와 혼성화하는 BAC 클론의 DNA 복제수 증가의 증가 빈도의 증가 중에서 하나 이상의 현상이 관찰되면 위암의 복막 전염이 있는 것으로 판단할 수 있다.

상기 위암의 복막 전염 판단은 다음의 판단 기준 중 한 가지 이상을 적용하는 것일 수 있다:

염색체 부위 4q13.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.114보 다 크면 복막 전염이 있는 것으로 판단;

염색체 부위 4q32.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.559보다 작거나 같으면 복막 전염이 있는 것으로 판단;

염색체 부위 13q12.12에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.025보다 크면 복막 전염이 없는 것으로 판단; 및

염색체 부위 12q24.13에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.011보다 크면 복막 전염이 있는 것으로 판단.

가장 바람직한 예에 있어서, 상기 위암의 복막 전염 판단은 상기의 판단 기준을 모두 적용하여 다음의 판단 단계를 순차적으로 적용하는 것일 수 있다:

3-1) 염색체 부위 4q13.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.114보다 크면 복막 전염이 있는 것으로 판단;

3-2) 상기 단계 3-1)에서 염색체 부위 4q13.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.114보다 작거나 같은 경우, 염색체 부위 4q32.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.559보다 작거나 같으면 복막 전염이 있는 것으로 판단;

3-3) 상기 단계 3-2)에서 염색체 부위 4q32.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.559보다 큰 경우, 염색체 부위 13q12.12에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.025보다 크면 복막 전염이 없는 것으로 판단;

3-4) 상기 단계 3-3)에서 염색체 부위 13q12.12에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.025보다 작거나 같은 경우, 염색체 부위 12q24.13에 해당하 는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.011보다 크면 복막 전염이 있는 것으로 판단하고, -0.011보다 작거나 같으면 복막 전염이 없는 것으로 판단.

상기 단계를 다음과 같은 알고리즘 3으로 나타낼 수 있다:

[알고리즘 3] 위암의 복막 전염 여부 판단 알고리즘

또한, 본 발명에 따른 위암의 장형 또는 확산형으로의 분류는 다음의 판단 기준 중 한 가지 이상을 적용하여 수행하는 것일 수 있다:

염색체 부위 8p23.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.203보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

염색체 부위 5q33.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.334보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

염색체 부위 2p16.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.085보다 크면 장형 위암으로 판단;

염색체 부위 16p13.13에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.213보다 크면 장형 위암으로 판단.

염색체 부위 7p13에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.207보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

염색체 부위 1p31.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.104보다 크면 확산형 위암으로 판단; 및

염색체 부위 2p11.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.042보다 작거나 같으면 확산형 위암으로 판단.

가장 바람직한 예에 있어서, 상기 위암의 장형 또는 확산형 분류는 상기의 판단 기준을 모두 적용하여 다음과 같은 판단 단계를 순차적으로 적용하는 것일 수 있다:

4-1) 염색체 부위 8p23.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.203보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

4-2) 상기 단계 4-1)에서 염색체 부위 8p23.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.203보다 큰 경우, 염색체 부위 5q33.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.334보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

4-3) 상기 단계 4-2)에서 염색체 부위 5q33.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.334보다 큰 경우, 염색체 부위 2p16.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.085보다 크면 장형 위암으로 판단;

4-4) 상기 단계 4-3)에서 염색체 부위 2p16.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.085보다 작거나 같은 경우, 염색체 부위 16p13.13에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.213보다 크면 장형 위암으로 판단.

4-5) 상기 단계 4-4)에서 염색체 부위 16p13.13에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.213보다 작거나 같은 경우, 염색체 부위 7p13에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.207보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

4-6) 상기 단계 4-5)에서 염색체 부위 7p13에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.207보다 큰 경우, 염색체 부위 1p31.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.104보다 크면 확산형 위암으로 판단;

4-7) 상기 단계 4-6)에서 염색체 부위 1p31.3에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.104보다 작거나 같은 경우, 염색체 부위 2p11.2에 해당하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.042보다 작거나 같으면 확산형 위암으로 판단하고, -0.042보다 큰 경우 장형 위암으로 판단.

상기 단계를 다음과 같은 알고리즘 4로 나타낼 수 있다:

[알고리즘 4] 위암의 조직학적 유형 판단 알고리즘

이하, 본 발명을 다음의 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하겠지만, 본 발 명이 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 조직 표본과 시료 제작

연속 수술로 제거된 83개 위선암 세포를 준비하였으며, 이들 중 10개는 초기암 단계이고, 73개는 진행암 단계이었다. 상기 위선암 세포는 각각 62명의 남성 위선암 환자 및 21명의 여성 위선암 환자로부터 분리된 것이며, 상기 83명의 환자의 연령 분포는 44 내지 89세이며 평균 연령은 70세이었다. 상기 환자들은 모두 암에 관련된 가족력이 없었으며, 모든 종양은 산발적인 것이었다. 상기 환자들에 대한 임상병리학적 데이터를 하기의 표 3에 나타내었다.

[표 3]

시험 대상 위선암 세포 총 개수		83 개
환자의 평균 연령 (연령 분포)		70세 (44 내지 89세)
	위선암의 조직학적 유형
	장형		확산형
개수	41 개		42 개
평균 연령	72 세		68 세
성별 (여성/남성)	9/32		12/30
림프절 전이	26		34
간 전이	3		3
양성 전염	7		12
초기암/진행암	6/35		4/38

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 조직학적으로, 41개의 종양세포는 장형 위암으로 분류되었고, 나머지 42개의 종양세포는 확산형 위암으로 분류되었다 [로렌 분류(Lauren classification)]. 상기 환자 중 60명은 림프절 전이가 일어난 상태이며 6명은 간 전이가 일어난 상태였다. 또한, 19명의 환자에서는 복막 전염이 있어난 상태였다.

얻어진 조직 표본을 사용시까지 -80 ℃에서 보관하였다. aCGH시에 정상 조 직에 의한 오염을 감소시키기 위하여 현미 해부 기술(microdissection)을 사용하여 관찰하였다 [Hashimoto, Y., Oga, A., Okami, K., Imate, Y., Yamashita, Y., and Sasaki, K. Relationship between cytogenetic aberrations by CGH coupled with tissue microdissection and DNA ploidy by laser scanning cytometry in head and neck squamous cell carcinoma. Cytometry 2000; 40: 161-166]. DNA 추출키트(SepaGene, Sankojunyaku Co., Ltd, Tokyo, Japan)를 사용하여 제조자 사용 설명서에 따라서 상기 현미 해부된 종양 조직 표본으로부터 고분자량 게놈 DNA를 추출하였다. 대조군으로서, Promega (Madison, WI)으로부터 제공받은 DNA를 reference로 사용하였다.

실시예 2: DNA 복제수 이상의 측정

2.1. 측정 방법: Array CGH ( aCGH )

본 실시예에서의 DNA 복제수 이상은 aCGH 분석법에 의하여 측정하였다. aCGH 분석법은 다음과 같이 수행하였다:

MacArray™ Karyo 1440 (Macrogen Inc., Seoul, Korea)를 사용하여 제조자 사용 설명서에 따라서 aCGH 실험을 수행하였다. 상기 aCGH에 사용된 어레이 [㈜마크로젠]는 평균 간격 2.3 Mb으로 인간의 전체 게놈을 포함하도록 슬라이드 기판에 인간 BAC 클론을 고정시켜 놓은 것이며, 356개의 암 관련 유전자를 포함하는 1,440개의 인간 BAC 클론이 고정된 것을 사용하였다 (한국특허공개 제10-2006-0018049호의 표 2 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다). 상기 실시예 1에서 준비된 시료 (test)와 gender matched reference의 게놈 DNA (reference) 각각 500 ng를 랜덤 프라이밍법(random priming method)으로 형광 염료 Cy3 (test sample)와 Cy5 (reference sample)로 각각 표지하였다. 상기 표지된 DNAs를 Cot-1 DNA (50 μg, Gibco BRL, Gaithersburg, MD)와 혼합하고, 습윤 챔버에서 37℃에서 2일 동안 상기 어레이 슬라이드와 혼성화시켰다. 상기 어레이 슬라이드를 표 4와 같은 세척 버퍼용액으로 세척하고 완전히 건조시켰다.

[표 4]

Making of Washing Solutions and Ethanol Series
Components	Washing Solution				Ethanol Series
Components	1	2	3	4	70%	85%	100%
20xSSC	20 mL	20 mL	-	25 mL	-	-	-
Distilled Water	80 mL	180 mL	100 mL	225 mL	60 mL	30 mL	-
Formamide	100 mL	-	-	-	-	-	-
2xPhosphate Buffer	-	-	100 mL	-	-	-	-
20% SDS	-	1 mL	-	-	-	-	-
Nonidet P40	-	-	200 ㎕	-	-	-	-
Ethanol	-	-	-	-	140 mL	170 mL	250 mL
Total Volume	200 mL	200 mL	200 mL	250 mL	200 mL	200 mL	250 mL

건조된 어레이 슬라이드를 Gene Pix 4000A scanner (Axon Instruments, Burlingame, CA)를 사용하여 스캐닝하였다. 상기에서 얻어진 형광 이미지를 상기 어레이 분석에 최적화된 MAC Viewer™ software (Macrogen Inc.)를 사용하여 분석하였다 [Ohguri T, Hisaoka M, Kawauchi S, Sasaki K, Aoki T, Kanemitsu S, Matsuyama A, Korogi Y, Hashimoto H. Cytogenetic analysis of myxoid liposarcoma and myxofibrosarcoma by array-based comparative genomic hybridization. J Clin Pathol. 2006 June 2]. 자동 격자기능을 사용하여 형광 스팟 위치를 결정하고 수동으로 조정하였다. CGH 비율을 모두 log₂ 값으로 환산하였다. 모든 스팟의 형광 세기 비율을 염색체상에서의 클론 간 거리에 대하여 플로팅 하였다. 각각의 BAC 클론 중에서 평균 비율이 "0"과 통계학적으로 유의미한 정도의 큰 편차를 갖는 것은 비정상적인 것으로 간주하였다 (±log₂ 0.25).

상기의 시험 과정을 도 6에 개략적으로 나타내었다.

2.2. 전체적인 DNA 복제수 이상의 빈도

상기 실시예 1에서 얻어진 83개의 산발성 위선암 시료에서의 각 클론당 전반적인 DNA 복제수 이상의 빈도를 상기 실시예 2.1과 같이 측정하여, 얻어진 결과를 도 1과 아래의 표 5-1 및 5-2에 나타내었다.

도 1은 모든 위선암 세포에서 다수의 BAC 클론의 DNA 복제수 이상을 검출하여 얻은 결과를 보여주는 것이다. 도 1의 윗부분 선 (녹색)은 DNA 복제수의 상대적 증가를 보이는 클론의 빈도를 보여주는 것이고, 아랫부분 선 (적색)은 DNA 복제수의 상대적 감소를 보이는 클론의 빈도를 보여주는 것이다. 그래프의 수평축 (x축)은 염색체 수 (클론 수)를 나타내는 것이고, 수직축 (y축)은 각 클론에서의 DNA 복제수 이상 빈도를 나타내는 것이다. DNA 복제수 이상을 갖는 BAC 클론의 수는 각 종양마다 다르지만, 대체적으로 각 종양 세포당 15%의 클론이 DNA 복제수 이상을 갖는 것으로 나타났다.

표 5-1은 위선암 세포에서 DNA 복제수 증가 빈도가 높게 (빈도 >30%) 나타난 염색체 부위와 이와 혼성화하는 후보 유전자를 나타낸 것이고, 표 5-2는 위선암 세포에서 DNA 복제수 감소 빈도가 높게 (빈도 >25%) 나타난 염색체 부위와 이와 혼성화하는 후보 유전자를 나타낸 것이다.

[표 5-1]

Chromosomal region	Candidate gene	Frequency
20q12	N.I.	0.433
20q13.2	BCAS1	0.432
8q24.21	DDEF1	0.427
8q24.3	TG	0.427
20q12	C20orf100	0.407
20q12-q13	TOP1	0.402
20q13.2	PCK1, ZBP1, TMEPAI	0.398
20q13.31	C20orf174,	0.391
20q12	MAFB,	0.391
20q12.3	C20orf94, JAG1	0.387
8q24.3	NDRG1	0.386
20q13.2	DOK5	0.385
8q24.1	EXT1	0.376
20q13.13	N.I.	0.371
8q24.1	WISP1*	0.366
7p12.2	GRB10	0.360
20q13.2	DOK5	0.360
8q21.12	N.I.	0.356
8q21-q24	NBS1	0.349
8q24.13	SRRM1L	0.348
8q23.1	RSPO2	0.342
7p14.3	PDE1C	0.337
8q23.3	N.I.	0.333
20p12.3	PLCB4	0.330
20q13.33-qter	N.I.	0.329
8q24.1	NOV	0.329
20p12.1	RPL7AL3, SNRPB2, OTOR	0.326
8q22.3	N.I.	0.326
20p11.23	PCSK2, BFSP1, RPS27AP2	0.326
7p21.3	C1GALT1	0.323
7p13	CCM2, TBRG4, RAMP3	0.322
20p11.23	C20orf74	0.322
20p11.21	ACSS1, VSX1	0.321
20q13.1	PTPN1	0.315
8q12-q13	IL7	0.315
20q12*	PTPRT	0.314
20q12*	PTPRT	0.312
8q24.23	N.I.	0.311
8q24.11	SAMD12	0.306
7p11.2	EGFR	0.305
7p15.3	OSBPL3	0.303

N.I.: not identified

[표 5-2]

Chromosomal region	Candidate gene	Frequency
4q35.2	FAT	0.372
1p36.33 pter	MORN1	0.363
4q34.1	N.I.	0.363
4q12-13	MAC25	0.346
22q11.2	GST T1	0.337
5q21.2	N.I.	0.333
14q32.33 qter	N.I.	0.330
14q32.33	IGHVIII-25-1, IGHV2-26	0.329
4q35.2	N.I.	0.319
14q32.33	IGHV3-22, IGHVII-22-1	0.316
21q22.3	KIAA0179, PDXK, CSTB	0.308
21q22.12	KCNE1, DSCR1	0.307
17p13.1	ALOX12P2	0.304
5q35	NPM1	0.302
21q11.2	STCH,	0.301
17p13.3	ABR	0.295
4p16.3 pter	WHSC1, WHSC2	0.293
21q22.3	AIRE, PFKL, TRPM2	0.293
9p21.2	N.I.	0.288
19p13.3 pter	EDG6, NCLN, BRUNOL5	0.287
4p16.3	WHSC1	0.284
4q33	N.I.	0.284
21q22.3	SMT3A/UBE2G2	0.280
21q22.3	PRDM15, C21orf25	0.275
4q24	ADH6, ADH1A	0.270
21q22.3	DIP2A,	0.269
4q34.3	N.I.	0.267
21q22.3	UBE2G2, SUMO3, PTTG1IP	0.267
4p16	CTBP1	0.267
4q32.3	N.I.	0.264
4q22.3	N.I.	0.262
4p15.1	N.I.	0.261
5q33.2	TIMD4,	0.259
21q22.3	COL18A1, SLC19A1	0.258
4q35.1	TLR3	0.256
4q33	N.I.	0.256
21q22.3	ETS2 / E2	0.256
21q22.3	PTTG1IP, ITGB2	0.256
5q13.2	N.I.	0.253

(Information on Y chromosome is excluded from this list)

N.I.: not identified

상기의 표 5-1 및 5-2에 나타낸 바와 같이, 염색체 부위 7p12-14, 8q21-q24 및 20q12-13에서는 DNA 복제수 증가 빈도가 높게 나타났고 (표 5-1), 염색체 부위 1p36, 4q34-q35, 5q, 14q32, 22q11, 21q22, 및 Y 염색체에서는 DNA 복제수 감소 빈 도가 높은 것으로 나타났다 (표 5-2).

2.3. 위암세포의 생물학적 특성 및 조직학적 유형에 따른 DNA 복제수 이상의 빈도

상기 실시예 2.1에서 얻어진 평균 DNA 복제수 이상 수를 생물학적 상태와 조직학적 유형에 따라서 분류하여 아래의 표 6에 나타내었다.

[표 6]

	DNA 복제수 이상
	증가	감소
Node metastasis
Positive (n=60)	107±71	126±95
Negative (n=23)	102±66	139±93

Liver metastasis*
Positive (n=6)	254±77	149±04
Negative (n=77)	103±67	128±93

Peritoneal dissemination
Positive (n=19)	114±73	142±90
Negative (n=64)	103±69	126±96

Histological type**
Intestinal-type (n=41)	122±70	164±02
Diffuse-type (n=42)	90±66	97±72

*: 간 전이가 일어난 위암세포와 간 전이가 일어나지 않은 위암세포 간의 평균 DNA 복제수 증가에 있어서의 유의미한 차이를 나타냄 (P<0.00001)

**: 장형 위암세포와 확산형 위암세포 간의 평균 DNA 복제수 증가 및 감소에 있어서의 유의미한 차이를 나타냄 (각각 P<0.05, 및 P<0.001)

상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, DNA 복제수 이상의 수는 각 위암세포마다 다르며, 동일한 카테고리에 속하는 위암세포에서도 상이하다는 것을 알 수 있다. DNA 복제수가 증가 및 감소가 나타난 BAC 클론의 평균 개수는 림프절 전이가 일어난 위암세포와 그렇지 않은 세포 간 (도 2 참조), 및 복막 전염이 일어난 위암세포와 그렇지 않은 세포 간 (도 3 참조)에서 유의미한 차이를 보이지 않았다. 또한 DNA 복제수 감소가 나타난 BAC 클론의 평균 개수는 간 전이가 일어난 위암세포와 그렇지 않은 위암세포 간에서 유의미한 차이를 보이지 않는 반면 (도 4 참조), DNA 복제수 증가가 나타난 BAC의 평균 개수는 상기 두 그룹간 큰 차이를 보였다 (p<0.00001). 한편, 장형 위암세포와 확산형 위암세포 간 (도 5 참조), 에는 DNA 복제수 증가 및 감소가 나타난 BAC 클론의 평균 개수에 있어서 유의미한 차이가 관찰되었다 (각각 p<0.05 및 p<0.001).

상기 실시예 2.1에서 얻어진 결과를 기초로, 림프절 전이가 일어난 위암 세포와 그렇지 않은 위암 세포에서의 DNA 복제수 이상 빈도의 차이를 나타내는 BAC 클론을 아래의 표 7-1에 나타내었다 (p<0.01).

[표 7-1]

N.I.: not identified 양성 (N=60), 음성(N=23)

상기 실시예 2.1에서 얻어진 결과를 기초로, 간 전이가 일어난 위암 세포와 그렇지 않은 위암 세포 간 DNA 복제수 이상 빈도의 차이를 나타내는 BAC 클론을 아래의 표 7-2에 나타내었다 (p<0.01).

[표 7-2]

N.I.: not identified 양성 (N=6), 음성(N=77)

상기 실시예 2.1에서 얻어진 결과를 기초로, 복막 전염이 일어난 위암 세포 와 그렇지 않은 위암 세포 간 DNA 복제수 이상 빈도의 차이를 나타내는 BAC 클론을 아래의 표 7-3에 나타내었다 (p<0.01).

[표 7-3]

양성 (N=19), 음성(N=64)

상기 표 7-3에 나타낸 바와 같은 복막 전염 여부에 따라서 DNA 복제수 이상 빈도 차이를 나타내는 클론들은 표 7-1 및 7-2에 나타낸 바와 같은 림프절 전이와 간 전이가 일어난 위암세포와 상이하고 공통된 클론은 없었다.

상기 실시예 2.1에서 얻어진 결과를 기초로, 장형 위선암 세포와 확산형 위선암 세포 간 DNA 복제수 이상 빈도의 차이를 나타내는 BAC 클론을 아래의 표 7-4에 나타내었다 (p<0.01).

[표 7-4]

N.I.: not identified 확산형 (N=41), 장형(N=42)

림프절 전이, 간 전이 및 복막 전염이 일어난 위암 세포에 공통적인 DNA 복 제수 이상은 발견되지 않았다.

실시예 3: DNA 복제수 이상의 측정 결과에 따른 위암세포의 분류

3.1. 통계학적 분석

상기 실시예 2에서 얻어진 aCGH 데이터를 C4.5 디시전 트리 (decision tree, DT) 알고리즘 (Weak classifiers trees J48; http://www.cs.waikato.ac.nz/ml/weka/)을 사용하여 분석하여, 결절 전이된 위암 세포와 그렇지 않은 것, 간 전이된 위암 세포와 그렇지 않은 것, 및 복막 전염된 위암 세포와 그렇지 않은 것을 각각 구별하였다. x²-테스트 또는 Fisher's exact test를 사용하여 각 그룹간의 각각의 BAC 클론의 DNA 복제수 이상 빈도를 비교하였다. Student t-test를 사용하여 각 그룹 간 평균 복제수의 차이를 비교하였다. P-value가 0.05보다 작은 경우 유의미한 차이를 갖는 것으로 간주하였다.

3.2. DNA 복제수 이상의 빈도에 따른 림프절 전이 여부의 판단

상기 실시예 2.1에서 얻은 결과를 림프절 전이가 일어난 위암세포와 그렇지 않은 위암세포에서 비교하여 도 2에 나타내었다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 림프절 전이가 일어난 위암세포와 림프절 전이가 일어나지 않은 위암세포는, 히스토그램의 전반적인 패턴은 서로 유사하였지만, 각 BAC 클론에서의 DNA 복제수 이상의 빈도에 있어서는 서로 차이가 있는 것으로 나타났다. 도 2 중 윗부분 선 (녹색)은 DNA 복제수가 상대적으로 증가한 클론의 빈도수를 보여준 것이고, 아랫부분 선 (적색)은 DNA 복제수가 상대적으로 감소 한 클론의 빈도를 보여주는 것이다. 그래프의 수평축 (x축)은 염색체 수 (클론 수)를 나타내는 것이고, 수직축 (y축)은 각 클론에서의 DNA 복제수 이상 빈도를 나타내는 것이다. 위의 히스토그램은 림프절 전이가 일어나지 않은 위암세포의 결과이고, 아래 히스토그램은 림프절 전이가 일어난 위암 세포의 결과이다.

도 2의 아래 부분의 순서도에 나타난 수치는 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 1p34.2, 14q32.2 및 3q13.12 각각에서의 DNA 복제수의 log2 값으로, log2 [시험 샘플(test sample)의 Cy3 신호 중간값/정상 샘플(reference sample)의 Cy5 중간값]을 의미하고, 상기 신호값은 상기 실시예 2.1의 방법으로 측정된 것이다.

도 2의 아래쪽에 나타낸 순서도와 같이, 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 1p34.2, 14q32.2 및 3q13.12에 위치하는 6 개의 BAC 클론에서의 DNA 복제수 변화 정도를 차례로 검사하면 림프절 전이가 일어난 위암세포와 그렇지 않은 위암세포를 완전하게 구별할 수 있다. 예컨대, 5q13.2부터 시작하여, 여기에서의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.346보다 작거나 같은 종양 세포는 림프절 전이를 나타내지 않은 것으로 분류하고, 나머지는 차례로 13q31.1, 1p22.3, 1p34.2, 14q32.2 및 3q13.12의 DNA 복제수의 log2 값의 비교를 통하여 기재된 수치보다 높고 낮음을 평가하여 림프절 전이가 있는 종양세포와 전이가 없는 세포 중 어느 하나로 분류한다 (도 2 아래 순서도 참조).

이러한 방법으로 83개의 위선암 세포를 분류한 결과 83 개 모두에서 표 2의 원래 유형과 동일한 결과를 얻었으며 (정확도 100%), 오분류는 없었다 (0%). 순서도 상의 괄호 안의 수치는 상기 요건을 만족시키는 위암세포 수를 나타낸다.

leaves 수 (출발 클론을 포함하는 분지점 수): 7,

tree 크기 (총 분지 수): 13

3.3. DNA 복제수 이상의 빈도에 따른 복막 전염 여부 판단

상기 실시예 2.1에서 얻은 결과를 복막 전염이 일어난 위암세포와 그렇지 않은 위암세포에서 비교하여 도 3에 나타내었다.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 복막 전염이 일어난 위암세포와 복막 전염이 일어나지 않은 위암세포는, 히스토그램의 전반적인 패턴은 외관상 서로 유사해 보였지만, 각 BAC 클론에서의 DNA 복제수 이상의 빈도에 있어서는 서로 차이가 있는 것으로 나타났다. 도 3 중 윗부분 선 (녹색)은 DNA 복제수가 상대적으로 증가한 클론의 빈도수를 보여준 것이고, 아랫부분 선 (적색)은 DNA 복제수가 상대적으로 감소한 클론의 빈도를 보여주는 것이다. 그래프의 수평축 (x축)은 염색체 수 (클론 수)를 나타내는 것이고, 수직축 (y축)은 각 클론에서의 DNA 복제수 이상 빈도를 나타내는 것이다. 위의 히스토그램은 복막 전염이 일어나지 않은 위암세포의 결과이고, 아래 히스토그램은 복막 전염이 일어난 위암 세포의 결과이다.

도 3의 아래 부분의 순서도에 나타난 수치는 염색체 부위 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12 및 12q24.13 각각에서의 DNA 복제수의 log2 값으로, log2 [시험 샘플(test sample)의 Cy3 신호 중간값/정상 샘플(reference sample)의 Cy5 중간값]을 의미하고, 상기 신호값은 상기 실시예 2.1의 방법으로 측정된 것이다.

도 3의 아래쪽에 나타낸 순서도와 같이, 염색체 부위 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12 및 12q24.13에 위치하는 4 개의 BAC 클론에서의 DNA 복제수 변화 정도를 차례로 검사하면 복막 전염이 일어난 위암세포와 그렇지 않은 위암세포를 완전하게 구별할 수 있다. 예컨대, 4q13.3부터 시작하여, 여기에서의 복제수의 log2 값이 0.114 보다 큰 종양 세포는 림프절 전이를 나타내지 않은 것으로 분류하고, 나머지는 차례로 4q32.2, 13q12.12 및 12q24.13의 log2 값의 비교를 통하여 기재된 수치보다 높고 낮음을 평가하여 복막 전염이 있는 종양세포와 전염이 없는 세포 중 어느 하나로 분류한다 (도 3 아래 순서도 참조). 이러한 방법으로 83개의 위선암 세포를 분류한 결과 82 개에서 표 2의 원래 유형과 동일한 결과를 얻었으며 (정확성 98.8%), 하나의 위음성 반응에 의한 오분류가 있었다 (1.2%). 순서도 상의 괄호 안의 수치는 상기 요건을 만족시키는 위암세포 수를 나타낸다. (leaves 수: 5, tree 크기: 9)

3.4. DNA 복제수 이상의 빈도에 따른 간 전이 여부 판단

상기 실시예 2.1에서 얻은 결과를 간 전이가 일어난 위암세포와 그렇지 않은 위암세포에서 비교하여 도 4에 나타내었다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 간 전이가 일어난 위암세포와 간 전이가 일어나지 않은 위암세포는 각 BAC 클론에서의 DNA 복제수 이상의 빈도에 있어서 서로 차이가 있는 것으로 나타났다. 도 4 중 윗부분 선 (녹색)은 DNA 복제수가 상대적으로 증가한 클론의 빈도수를 보여준 것이고, 아랫부분 선 (적색)은 DNA 복제수가 상대적으로 감소한 클론의 빈도를 보여주는 것이다. 그래프의 수평축 (x축)은 염색체 수 (클론 수)를 나타내는 것이고, 수직축 (y축)은 각 클론에서의 DNA 복제수 이상 빈도를 나타내는 것이다. 위의 히스토그램은 간 전이가 일어나지 않은 위암 세포의 결과이고, 아래 히스토그램은 간 전이가 일어난 위암 세포의 결과이다.

도 4의 아래 부분의 순서도에 나타난 수치는 염색체 부위 1q44-qter, 5q13.2, 7q31.1 및 6q23.3 각각에서의 DNA 복제수의 log2 값으로, log2 [시험 샘플(test sample)의 Cy3 신호 중간값/정상 샘플(reference sample)의 Cy5 중간값]을 의미하고, 상기 신호값은 상기 실시예 2.1의 방법으로 측정된 것이다.

도 4의 아래쪽에 나타낸 순서도와 같이, 염색체 부위 1q44-qter, 5q13.2, 7q31.1 및 6q23.3에 위치하는 4 개의 BAC 클론에서의 DNA 복제수 변화 정도를 차례로 검사하면 간 전이가 일어난 위암세포와 그렇지 않은 위암세포를 완전하게 구별할 수 있다. 예컨대, 1q44-qter부터 시작하여, 여기에서의 복제수의 log2 값이 -0.33보다 큰 경우와 작거나 같은 경우로 나누어 도 4 아래 순서도에 나타난 단계를 수행하여 간 전이가 있는 종양세포와 전이가 없는 세포 중 어느 하나로 분류한다. 이러한 방법으로 83개의 위선암 세포를 분류한 결과 83 개 모두에서 표 2의 원래 유형과 동일한 결과를 얻었으며 (정확도 100%), 오분류는 없었다 (0%). 순서도 상의 괄호 안의 수치는 상기 요건을 만족시키는 위암세포 수를 나타낸다. (leaves 수: 5, tree 크기: 9)

3.5. DNA 복제수 이상의 빈도에 따른 조직학적 유형의 분류

상기 실시예 2.1에서 얻은 결과를 장형 위선암세포와 확산형 위선암세포에서 비교하여 도 5에 나타내었다.

도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 장형 위선암세포와 확산형 위선암세포는 각 BAC 클론에서의 DNA 복제수 이상의 빈도에 있어서 서로 차이가 있는 것으로 나타났 다. 도 5 중 윗부분 선 (녹색)은 DNA 복제수가 상대적으로 증가한 클론의 빈도수를 보여준 것이고, 아랫부분 선 (적색)은 DNA 복제수가 상대적으로 감소한 클론의 빈도를 보여주는 것이다. 그래프의 수평축 (x축)은 염색체 수 (클론 수)를 나타내는 것이고, 수직축 (y축)은 각 클론에서의 DNA 복제수 이상 빈도를 나타내는 것이다. 위의 히스토그램은 장형 위암 세포의 결과이고, 아래 히스토그램은 확산형 위암 세포의 결과이다.

도 5의 아래 부분의 순서도에 나타난 수치는 염색체 부위 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2 각각에서의 DNA 복제수의 log2 값으로, log2 [시험 샘플(test sample)의 Cy3 신호 중간값/정상 샘플(reference sample)의 Cy5 중간값]을 의미하고, 상기 신호값은 상기 실시예 2.1의 방법으로 측정된 것이다.

도 5의 아래쪽에 나타낸 순서도와 같이, 염색체 부위 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2에 위치하는 7 개의 BAC 클론에서의 DNA 복제수 변화 정도를 차례로 검사하면 장형 위선암세포와 확산형 위선암세포를 완전하게 구별할 수 있다. 예컨대, 8p23.3부터 시작하여, 여기에서의 복제수의 log2 값이 -0.203보다 작거나 같은 경우 장형 위암 세포로 분류하고, 나머지는 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2의 log2 값의 비교를 통하여 기재된 수치보다 높고 낮음을 평가하여 장형 위암세포와 확산형 위암세포 중 어느 하나로 분류한다 (도 5 아래 순서도 참조). 이러한 방법으로 83개의 위선암 세포를 분류한 결과 83 개 모두에서 표 2의 원래 유형과 동일한 결과를 얻었으며 (정확도 100%), 오분류는 없었다 (0%). 순서도 상의 괄호 안의 수치는 상기 요건을 만족시키는 위암세포 수를 나타낸다. (leaves 수: 8, tree 크기: 15)

본 발명에 따르면, 위암의 림프절 전이, 간 전이 및 복막 전염 여부 및 조직학적 유형을 용이하게 판단할 수 있어, 위암 환자의 효과적인 맞춤 치료에 매우 유용하다.

Claims

아래의 표 1에 기재된 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12, 1p34.2, 1q44-qter, 6q23.3, 7q31.1, 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12, 12q24.13, 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2로 이루어진 군에서 선택된 염색체 단편을 갖는 1종 이상의 BAC 클론; 및

DNA 어레이

를 포함하는, 위암의 전이 여부 또는 전염 여부 또는 조직학적 유형 진단용 키트:

[표 1]
제1항에 있어서, 상기 염색체 단편은 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12 및 1p34.2의 6 개의 염색체 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것이고, 위암의 림프절 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 키트.
제1항에 있어서, 상기 염색체 단편은 인간 게놈 염색체 부위 1q44-qter, 5q13.2, 6q23.3 및 7q31.1의 4 개의 염색체 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것이고, 위암의 간 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 키트.
제1항에 있어서, 상기 염색체 단편은 인간 게놈 염색체 부위 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12 및 12q24.13의 4 개의 염색체 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것이고, 위암의 복막 전염 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 키트.
제1항에 있어서, 상기 염색체 단편은 인간 게놈 염색체 부위 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2의 7 개의 유전자 단편으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것이고, 위암의 조직학적 유형을 판단하는 것을 특징으로 하는 키트.
위암 환자로부터 얻은 시료에 대하여,

아래의 표 1에 기재된 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12, 1p34.2, 1q44-qter, 6q23.3, 7q31.1, 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12, 12q24.13, 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2로 이루어진 군에서 선택된 염색체 단편을 포함하는 1종 이상의 BAC 클론의 DNA 복제수 이상을 측정하는 단계를 포함하고,

아래의 식과 같은 DNA 복제수의 log2 값이 0.25보다 큰 경우에는 DNA 복제수가 증가된 것으로 판단하고, DNA 복제수의 log2 값이 -0.25보다 작은 경우에는 DNA 복제수가 감소된 것으로 판단하는,

위암의 전이 여부 또는 전염 여부 또는 조직학적 유형을 판단하는 방법:

[식]

DNA 복제수의 log2 값 = log2 (시료의 DNA 복제수/정상 DNA 복제수)

[표 1]
제6항에 있어서, 상기 염색체 단편이 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2, 13q31.1, 1p22.3, 14q32.2, 3q13.12 및 1p34.2로 이루어진 군 중에서 한 가지 이상 선택된 것이고, 위암의 림프절 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제7항에 있어서, 다음의 판단 기준 중 한 가지 이상을 적용하는 것을 특징으로 하는, 방법:

인간 게놈 염색체 부위 5q13.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.349보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 13q31.1의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.37보다 크면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 1p22.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.042보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 1p34.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.004보다 크면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 14q32.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.01보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단; 및

인간 게놈 염색체 부위 3q13.12의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.06보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단,

상기 판단 기준 중, 상기 DNA 복제수의 log2 값은 log2 (시료의 DNA 복제수/정상 DNA 복제수)로 한다.
제9항에 있어서, 다음의 판단 단계를 순차적으로 적용하여 위암의 림프절 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는, 방법:

1-1) 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.349보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단;

1-2) 상기 단계 1-1)에서 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.349보다 큰 경우, 인간 게놈 염색체 부위 13q31.1의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.37보다 크면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단;

1-3) 상기 단계 1-2)에서 인간 게놈 염색체 부위 13q31.1의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.37보다 작거나 같은 경우, 인간 게놈 염색체 부위 1p22.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.042보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단;

1-4) 상기 단계 1-3)에서 인간 게놈 염색체 부위 1p22.3의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.042보다 큰 경우, 인간 게놈 염색체 부위 1p34.2의 DNA 복제수의 log2 값이 0.004보다 크면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단;

1-5) 상기 단계 1-4)에서 인간 게놈 염색체 부위 1p34.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.004보다 작거나 같은 경우, 인간 게놈 염색체 부위 14q32.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.01보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단; 및

1-6) 상기 단계 1-5)에서 인간 게놈 염색체 부위 14q32.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.01보다 큰 경우, 인간 게놈 염색체 부위 3q13.12의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.06보다 작거나 같으면 위암의 림프절 전이가 없는 것으로 판단하고, -0.06보다 크면 위암의 림프절 전이가 있는 것으로 판단.
제6항에 있어서, 상기 염색체 단편이 인간 게놈 염색체 부위 1q44-qter, 5q13.2, 6q23.3 및 7q31.1로 이루어진 군 중에서 한 가지 이상 선택된 것이고, 위암의 간 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제11항에 있어서, 다음의 판단 기준 중 한 가지 이상을 적용하여 위암의 간 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 방법:

인간 게놈 염색체 부위 6q23.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.041보다 크면 간 전이가 있는 것으로 판단하고, -0.041보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 5q13.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.126보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단; 및

인간 게놈 염색체 부위 7q31.1의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.022보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단하고, 0.022보다 크면 간 전이가 있는 것으로 판단,

상기 판단 기준 중, 상기 DNA 복제수의 log2 값은 log2 (시료의 DNA 복제수/정상 DNA 복제수)로 한다.
제13항에 있어서, 다음의 판단 단계를 순차적으로 적용하여 위암의 간 전이 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 방법:

2-1) 인간 게놈 염색체 부위 1q44-qter의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.33보다 큰 경우, 염색체 부위 6q23.3의 DNA 복제수의 log2 값을 측정하여 상기 값이 -0.041보다 크면 간 전이가 있는 것으로 판단하고, -0.041보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단;

2-2) 상기 단계 2-1)에서 인간 게놈 염색체 부위 1q44-qter의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.33보다 작거나 같은 경우, 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.126보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단; 및

2-3) 상기 단계 2-2)에서 인간 게놈 염색체 부위 5q13.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.126보다 큰 경우, 인간 게놈 염색체 부위 7q31.1의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.022보다 작거나 같으면 간 전이가 없는 것으로 판단하고, 0.022보다 크면 간 전이가 있는 것으로 판단.
제6항에 있어서, 상기 염색체 단편이 인간 게놈 염색체 부위 4q13.3, 4q32.2, 13q12.12 및 12q24.13으로 이루어진 군 중에서 한 가지 이상 선택된 것이고, 위암의 복막 전염 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제15항에 있어서, 다음의 판단 기준 중 한 가지 이상을 적용하여 위암의 복막 전염 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 방법:

인간 게놈 염색체 부위 4q13.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.114보다 크면 복막 전염이 있는 것으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 4q32.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.559보다 작거나 같으면 복막 전염이 있는 것으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 13q12.12의 DNA 복제수의 log2 값이 0.025보다 크면 복막 전염이 없는 것으로 판단; 및

인간 게놈 염색체 부위 12q24.13의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.011보다 크면 복막 전염이 있는 것으로 판단,

상기 판단 기준 중, 상기 DNA 복제수의 log2 값은 log2 (시료의 DNA 복제수/정상 DNA 복제수)로 한다.
제17항에 있어서, 다음의 판단 순서에 의하여 위암의 복막 전염 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 방법:

3-1) 인간 게놈 염색체 부위 4q13.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.114보다 크면 복막 전염이 있는 것으로 판단;

3-2) 상기 단계 3-1)에서 인간 게놈 염색체 부위 4q13.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.114보다 작거나 같은 경우, 인간 게놈 염색체 부위 4q32.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.559보다 작거나 같으면 복막 전염이 있는 것으로 판단;

3-3) 상기 단계 3-2)에서 인간 게놈 염색체 부위 4q32.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.559보다 큰 경우, 인간 게놈 염색체 부위 13q12.12의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.025보다 크면 복막 전염이 없는 것으로 판단; 및

3-4) 상기 단계 3-3)에서 인간 게놈 염색체 부위 13q12.12의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.025보다 작거나 같은 경우, 인간 게놈 염색체 부위 12q24.13의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.011보다 크면 복막 전염이 있는 것으로 판단하고, -0.011보다 작거나 같으면 복막 전염이 없는 것으로 판단.
제6항에 있어서, 상기 염색체 단편이 인간 게놈 염색체 부위 8p23.3, 5q33.3, 2p16.3, 16p13.13, 7p13, 1p31.3 및 2p11.2로 이루어진 군 중에서 한 가지 이상 선택된 것이고, 위암의 조직학적 유형을 장형 (intestinal-type) 위암 또는 확산형 (diffusion-type) 위암으로 분류하는 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 다음의 판단 기준 중 한 가지 이상을 적용하여 장형 (intestinal-type) 위암 또는 확산형 (diffusion-type) 위암으로 분류하는 것을 특징으로 하는 방법:

인간 게놈 염색체 부위 8p23.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.203보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 5q33.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.334보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 2p16.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.085보다 크면 장형 위암으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 16p13.13의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.213보다 크면 장형 위암으로 판단.

인간 게놈 염색체 부위 7p13의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.207보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

인간 게놈 염색체 부위 1p31.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.104보다 크면 확산형 위암으로 판단; 및

인간 게놈 염색체 부위 2p11.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.042보다 작거나 같으면 확산형 위암으로 판단,

상기 판단 기준 중, 상기 DNA 복제수의 log2 값은 log2 (시료의 DNA 복제수/정상 DNA 복제수)로 한다.
제20항에 있어서, 다음의 판단 순서에 의하여 위암의 복막 전염 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 방법:

4-1) 인간 게놈 염색체 부위 8p23.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.203보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

4-2) 상기 단계 4-1)에서 인간 게놈 염색체 부위 8p23.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.203보다 큰 경우, 인간 게놈 염색체 부위 5q33.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.334보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

4-3) 상기 단계 4-2)에서 인간 게놈 염색체 부위 5q33.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.334보다 큰 경우, 인간 게놈 염색체 부위 2p16.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.085보다 크면 장형 위암으로 판단;

4-4) 상기 단계 4-3)에서 인간 게놈 염색체 부위 2p16.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.085보다 작거나 같은 경우, 인간 게놈 염색체 부위 16p13.13의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.213보다 크면 장형 위암으로 판단;

4-5) 상기 단계 4-4)에서 인간 게놈 염색체 부위 16p13.13의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 0.213보다 작거나 같은 경우, 인간 게놈 염색체 부위 7p13의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.207보다 작거나 같으면 장형 위암으로 판단;

4-6) 상기 단계 4-5)에서 인간 게놈 염색체 부위 7p13의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.207보다 큰 경우, 인간 게놈 염색체 부위 1p31.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.104보다 크면 확산형 위암으로 판단; 및

4-7) 상기 단계 4-6)에서 인간 게놈 염색체 부위 1p31.3의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.104보다 작거나 같은 경우, 인간 게놈 염색체 부위 2p11.2의 염색체 단편을 포함하는 BAC 클론의 DNA 복제수의 log2 값이 -0.042보다 작거나 같으면 확산형 위암으로 판단하고, -0.042보다 큰 경우 장형 위암으로 판단.