JPWO2004076463A1 - 阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
HIV−1はレトロウイルスの一種であり、正常細胞に感染するとウイルスのmRMAを細胞内に送り込み、逆転写酵素によりウイルスのcDNAを生成し、核内の染色体遺伝子に結合させる。細胞が増殖するために遺伝子が転写されると同時に、ウイルスの遺伝子も転写されRNAとなる。
通常RNAはスプライシングを受け、熟成mRNAとして核外に放出されるが、この際HIV−1のRNAはスプライシングされずに核外へ放出されなければならない。このメカニズムで重要になるのがHIV−1のmRNAのRRE(Rev Responsible Element)とRevタンパクとの相互作用である。(RREの塩基配列およびRevタンパクの構造を、それぞれ図1、図2に示すとともに、RREとRevタンパクとの結合により、HIV−1の複製が行われるときの様子を図3に概略的に示す。)
RREとRevタンパクとの結合(相互作用)を阻害すると、HIV−1mRNAはスプライシングを受け短くなるために、ウイルスが増殖できなくなる。したがって、RREとRevタンパクとの結合を阻害する物質には、AIDSの発症を抑える効果があると考えられている。
これまでにも、いくつかの物質が、RREとRevタンパクとの結合を阻害する阻害剤となることが報告されている。このような阻害剤となる物質として、例えば、構造式▲1▼
で表される、天然物である抗生物質のネオマイシンB(Neomycin B)が挙げられる。ネオマイシンBがRREと強く結合することで、RREはRevと結合できなくなる。
RREと結合することが可能な物質の中には人工的に合成されたものもあり、このような物質は、例えば、Luedtke et al.Journal of American Chemical Society,122,980(2000)(以下、「非特許文献1」と称する)やWilson et al.Biochemistry 40,1150(2001)(以下、「非特許文献2」と称する)に開示されている。非特許文献1および2に開示の物質の構造を示せば、それぞれ、構造式▲2▼,▲3▼に示す通りである。
しかしながら、従来の阻害剤として挙げられる物質は、天然物のスクリーニングにより得られたアミノグリコキシドがほとんどである。また、従来の阻害剤となり得る物質は、RREのRevタンパク結合サイトに特異的に結合するように設計された構造を有していないために、非特異的な結合が強く、また阻害活性も十分ではない。
そこで本発明は、十分な阻害活性を有するとともに、RREのRevタンパク結合サイトに強力に結合する阻害剤を提供することを目的とする。
本発明を考案するにあたって、本発明者らは、RRE中のインターナルループにGGミスマッチ塩基対およびGAミスマッチ塩基対があることに着目した。そしてRREのRevタンパク結合サイトに特異的に結合することでRREとRevタンパクとの結合を阻害する、新規な阻害剤を発案した。
具体的には、本発明にかかる阻害剤は、RREとRevタンパクとの結合を阻害する阻害剤であって、一般式(A)
(式中、R,R1は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、Xは、任意の二価基を示し、Yは、一般式(B)
で表される置換基、または一般式(C)
で表される置換基を示す)
で表されるナフチリジン誘導体を含んでいることを特徴としている。また、本発明に係るナフチリジン誘導体は、上記一般式(A)で表されるナフチリジン誘導体である。
上記ナフチリジン誘導体は、1つのナフチリジン部分に加えて、一般式(B)で表されるナフチリジン部分または一般式(C)で表されるアザキノロン部分を少なくとも1つ含むことで、RRE中のインターナルループに存在するGGミスマッチ塩基対に特異的に結合する。これによれば、RREと結合することにより、RREとRevタンパクとの結合を阻害することの可能な阻害剤を提供することができる。
本発明にかかる阻害剤は、RREとRevタンパクとの結合を阻害する阻害剤であって、一般式(1)
(式中、R,R1は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R2は、炭素数1〜20のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるナフチリジンダイマーを含んでいることを特徴としている。
また本発明にかかる阻害剤は、一般式(2)
(式中、R3は、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R4は、炭素数1〜20のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んでいることを特徴としている。
阻害剤がナフチリジンダイマーを含むことで、該阻害剤は、RRE中のインターナルループに存在するGGミスマッチ塩基対に特異的に結合する。また、阻害剤がナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含むことで、該阻害剤は、RRE中のインターナルループに存在するGAミスマッチ塩基対に特異的に結合する。これによれば、阻害剤がRREと結合することにより、RREとRevタンパクとの結合を阻害することの可能な阻害剤を提供することができる。
また本発明にかかる阻害剤は、一般式(3)
(式中、R5〜R7は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示す)
で表されるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んでいることを特徴としている。
一般式(3)に示すように、トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドは、2つのナフチリジンおよびアザキノロンを含んでいる。したがって、このトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んでなる阻害剤とすれば、RRE中のインターナルループに存在するGGミスマッチ塩基対およびGAミスマッチ塩基対への特異的な結合が同時に行なわれる。これによれば、RREとRevタンパクとの結合をより効果的に阻害することの可能な阻害剤を提供することができる。
本発明にかかる、トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んでなる阻害剤は、例えば、ナフチリジンダイマーと、アザキノロンハイブリッドとをリンカーで結合することで得られる。本発明にかかる阻害剤は、このリンカーの構造を適宜調整することで得られる、一般式(4)
(式中、R8〜R10は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R11,R12は、それぞれ、炭素数1〜20のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドの誘導体を含む構成とすることもできる。このようなリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドの誘導体を含む阻害剤としても、RREとRevタンパクとの結合を効果的に阻害することができる。
本発明にかかるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドの誘導体を含む阻害剤は、例えば、ナフチリジンダイマー、あるいは、ナフチリジン−アザキノロンハイブリットと、一般式(D)
(式中、RAは、炭素数1〜13のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるジアルデヒドとの反応により、アルデヒドを中間体として合成する工程を経て得られる。なお、ここで、RAで示されるアルキレン基は、特に、炭素数1〜3のアルキレン基である。このときのアルデヒドは、具体的には、一般式(5)
(式中、R13,R14は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R15,R16は、それぞれ、炭素数1〜18のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示し、R17は、炭素数1〜14のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキレン基を示す)で表されるナフチリジンダイマー含有アルデヒド、あるいは一般式(6)
(式中、R18は、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R19,R20は、それぞれ、炭素数1〜18のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示し、R21は、炭素数1〜14のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるナフチリジン−アザキノロンハイブリッド含有アルデヒドであることを特徴としている。ここで、R17およびR21で示されるアルキレン基は、特に、炭素数1〜4のアルキレン基である。
また本発明では、上記ナフチリジンダイマー、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッド、トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドまたはその誘導体を含む化合物群から選ばれる、少なくとも1種の化合物を含んでなる組成物から構成されている基盤を提供する。
このような基盤を用いて、例えばチップ、キュベット、プレート等の器具を構成すれば、これらの器具に、培養液中や血水に含まれるRREの検出機能を持たせることができる。
また、本発明に係るバイオセンサは、本発明に係るナフチリジン誘導体を、チップ、キュベット、プレート等の担体に固定化してなるものである。
上記バイオセンサによれば、培養液中や血水に含まれるRREを検出でき、HIV−1ウイルスによる感染等を検出できる。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって充分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
図2は、Revタンパクの構造を示す図である。
図3は、RREとRevタンパクとの結合により、HIV−1の複製が行われるときの様子を概略的に示す図である。
図4は、ナフチリジンダイマーおよびナフチリジン−アザキノロンハイブリッドをリンカー結合するときの様子を概略的に示す図である。
図5は、阻害剤としてのナフチリジンダイマーが、RRE中のインターナルループにあるGGミスマッチ塩基対に結合しているときの様子を示す図である。
図6は、阻害剤としてのナフチリジン−アザキノロンハイブリッドが、RRE中のインターナルループにあるGAミスマッチ塩基対に結合しているときの様子を示す図である。
図7は、実施例2において、ナフチリジンダイマーおよびRREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示す図である。
図8は、実施例2において、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッドおよびRREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示す図である。
図9は、実施例2において、第1キノリン含有化合物およびRREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示す図である。
図10は、実施例2において、第2キノリン含有化合物およびRREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示す図である。
図11は、実施例2において、ナフチリジン単独およびRREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示す図である。
図12は、実施例2において、アザキノロン単独およびRREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示す図である。
図13は、実施例2において、キノロン単独およびRREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示す図である。
図14は、実施例3において、RREのみ、RREにナフチリジンダイマーを添加した場合、RREにナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを添加した場合それぞれにおけるCDスペクトルを示す図である。
図15は、実施例3において、RRE−negのみ、RRE−negにナフチリジンダイマーを添加した場合、RRE−negにナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを添加した場合それぞれにおけるCDスペクトルを示す図である。
図16は、実施例3におけるRRE−negの塩基配列を示す図である。
図17は、実施例4において、SPRセンサーチップ上に固定したナフチリジンダイマーに対する、RRE,RRE−neg、TAR、シングルストランドRNAそれぞれの結合を調べるときの様子を概略的に示す図である。
図18は、実施例4において、SPRのセンサーチップ上に固定したナフチリジンダイマーに対する、RRE、RRE−neg、TAR、およびシングルストランドRNAそれぞれの結合の強さを示す図である。
図19は、実施例4におけるTARの塩基配列を示す図である。
図20は、実施例4におけるシングルストランドRNAの塩基配列を示す図である。
図21は、実施例5において、種々の濃度のRRE存在下でのナフチリジンダイマーのUV吸収スペクトルを示す図である。
図22は、実施例5において、図21の332nmにおける吸収強度から計算したRREに結合しているナフチリジンダイマーの加えた全ナフチリジンダイマーに対する割合を示す図である。
図23は、実施例6にかかる、フルオロセインを用いて蛍光標識したRev−F1が、RREと複合体を形成する様子を概略的に示す図である。
図24は、実施例6におけるRev−F1の構成を示す図である。
図25は、実施例6において、種々の濃度のRRE存在下に対する、Rev−F1のアニソトロピーの変化を示す図である。
図26は、実施例7において、阻害剤として、ナフチリジンダイマー、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッド、ネオマイシンBを用いた場合の、それぞれの阻害剤の濃度に対するアニソトロピーを示す図である。
図27は、実施例8において、RREのみ、RREにナフチリジンダイマーを添加した場合、RREにトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを添加した場合、およびRREにトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを添加した場合それぞれにおけるRREのCDスペクトルの変化を示す図である。
図28は、実施例8において、阻害剤として、ナフチリジンダイマー、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッド、ネオマイシンB、およびトリアザキノロンハイブリッドを用い、それぞれにおけるアニソトロピーの測定結果を示す図である。
本実施の形態にかかるナフチリジンダイマーは、特に限定されるものではない。したがって、このナフチリジンダイマーを、従来公知の種々の方法によって合成することができる。例えば、1,8−ナフチリジン誘導体を用い、これをリンカーにより結合させることで、一般式(1)で表されるナフチリジンダイマーを得ることができる。
なお、上記1,8−ナフチリジン誘導体は、例えば、2−アミノ−1,8−ナフチリジンまたは2−アミノ−7−メチル−1,8−ナフチリジンをN−保護−4−アミノ酪酸の反応性誘導体、例えば酸塩化物を反応させて、2位のアミノ基をアシル化した後、アミノ基を保護基を脱保護することで得ればよい。
本実施形態にかかる阻害剤は、一般式(1)で表されるナフチリジンダイマーの一方のナフチリジンが、アザキノロンとなった、上記一般式(2)で表される、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んでいる構成とすることもできる。
本実施の形態にかかるナフチリジン−アザキノロンハイブリッドは、特に限定されるものではない。したがって、このナフチリジン−アザキノロンハイブリッドは、従来公知の種々の方法によって合成すればよいものとする。
また、本実施の形態にかかる阻害剤は、上記一般式(3)で表されるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んで構成されていてもよい。
上記トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドは、例えば、図4に示すように、ナフチリジンダイマーおよびナフチリジン−アザキノロンハイブリッドをリンカーで結合することで得ればよい。このときのリンカーは特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜設定すればよいものとする。また、本実施の形態にかかる阻害剤は、このリンカーの構造を適宜調整することで、上記一般式(4)で表されるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドの誘導体を含む構成としてもよい。
トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドは、例えば、トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを、ナフチリジンダイマーと、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒドとを反応させることによって、上記一般式(5)で表されるナフチリジンダイマー含有アルデヒドを中間体として合成し、このナフチリジンダイマー含有アルデヒドと、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッドとを反応させることによって得ることができる。
あるいは、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッドと、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒドとを反応させることで、上記一般式(6)で表されるナフチリジン−アザキノロンハイブリッド含有アルデヒドを中間体として合成し、このナフチリジン−アザキノロンハイブリッド含有アルデヒドと、ナフチリジンダイマーとを反応させることによって、トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを得ることもできる。
このように、本実施の形態にかかる阻害剤は、ナフチリジンダイマーおよび/またはナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んでいる。したがって、この阻害剤は、RRE中のインターナルループに存在するGGミスマッチ塩基対および/またはRRE中のインターナルループに存在するGAミスマッチ塩基対に特異的に結合する。
図5に、本実施の形態にかかる阻害剤としてのナフチリジンダイマーが、RRE中のインターナルループにあるGGミスマッチ塩基対に結合しているときの様子を示す。また図6に、本実施の形態にかかる阻害剤としてのナフチリジン−アザキノロンハイブリッドが、RRE中のインターナルループにあるGAミスマッチ塩基対に結合しているときの様子を示す。
本実施の形態において、阻害剤がナフチリジンダイマーを含んで構成されているときには、RRE100ナノモル濃度(nM)とRevタンパク100ナノモル濃度(nM)の結合に対して、該阻害剤を、1.2マイクロモル濃度(μM)〜12マイクロモル濃度(μM)の範囲内で用いることが好ましい。
また阻害剤がナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んで構成されているときには、RRE100ナノモル濃度(nM)とRevタンパク100ナノモル濃度(nM)の結合に対して、該阻害剤を、2マイクロモル濃度(μM)〜20マイクロモル濃度(μM)の範囲内で用いることが好ましい。
また阻害剤がトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッド、または、トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドの誘導体を含んで構成されているときには、RRE100ナノモル濃度(nM)とRevタンパク100ナノモル濃度(nM)の結合に対して、該阻害剤を、200ナノモル濃度(nM)〜2マイクロモル濃度(μM)の範囲内で用いることが好ましい。
本実施の形態にかかる阻害剤は、RREと特異的に結合するために、ゲノムRNAの細胞質の輸送を抑えることができる。したがって本実施の形態にかかる阻害剤を、ウイルスの複製を阻害する抗HIV−1薬として用いることができる。
本実施の形態にかかる、ナフチリジンダイマー、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッド、トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドまたはその誘導体を含む化合物群から選ばれる、少なくとも1種の化合物を含んでなる組成物から、例えば基盤(担体)を構成してもよい。このような基盤を用いて例えばチップ、キュベット、およびプレート等の器具を構成すれば、これらの器具に、培養液中や血水に含まれるRREの検出機能を持たせることができる。
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
(i)ナフチリジンダイマー(73mg)のメタノール溶液に酢酸数滴を加えpH5とした。この溶液にグルタルアルデヒド(360mg)を加え、続いて水素化シアノホウ素ナトリウム(3.6mg)を加え室温で10分反応させた。
反応混合物を水−クロロホルムで分配し、有機層を乾燥後濃縮した。粗生成物を、分取TLCを使って精製し、ナフチリジンダイマー含有アルデヒドを得た(27.0mg)。
得られたナフチリジンダイマー含有アルデヒドをNMRで測定したところ、以下に示す結果が得られた。
1HNMR(CDCl3,400MHz)δ=10.29(br,2H),9.65(br,1H),8.32(d,2H,J=8.8Hz),7.93(d,2H,J=9.2Hz),7.83(d,2H,J=8.0Hz),7.14(d,2H,J=8.4Hz),2.98(m,4H),2.80(br,4H),2.69(s,6H),2.65(m,4H),1.64(m,4H);
13CNMR(CDCl3,100MHz)δ=202.6,171.8,162.7,154.3,153.6,138.5,136.2,121.17,118.2,114.6,53.7,49.6,43.5,34.8,25.7,25.4,19.9.
(ii)ナフチリジンダイマー含有アルデヒド(22.3mg)のメタノール溶液に酢酸数滴を加えpH5とした。この溶液にナフチリジンアザキノロン(29.6mg)を加え、続いて水素化シアノホウ素ナトリウム(3.6mg)を加え室温で15分反応させた。
反応混合物を水−クロロホルムで分配し、有機層を乾燥後濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使って精製し、トリナフチリジンアザキノロンを得た(10.0mg)。
上述した合成反応を式Aに示す。
得られたトリナフチリジンアザキノロンをNMRで測定したところ、以下に示す結果が得られた。
1HNMR(CD3OD,400MHz)δ=8.11(br,1H),8.10(d,2H,J=8.8Hz),8.01(d,2H,J=8.4Hz),7.99(d,1H,J=8.0Hz),7.87(d,2H,J=8.4Hz),7.85(d,2H,J=8.4Hz),7.63(d,1H,J=8.0Jz,7.57(d,1H,J=9.6Hz),7.24(d,1H,J=8.4Hz),7.18(d,2H,J=8.4Hz),6.97(d,1H,J=7.6Hz),6.38(d,1H,J=9.6Hz),4.39(s,2H),2.98(br,8H),2.72(10H),2.62(s,3H),2.61(s,6H),2.60(2H),1.70(m,4H),1.47(m,2H);
13CNMR(CD3OD,100MHz)δ=173.7,172.6.164.5,163.0,162.7,160.0,153.9,153.83,153.78,153.7,148.5,139.7,138.9,138.6,137.4,137.2,136.7,121.6,121.3,121.2,118.5,118.4,116.1,114.4,114.3,113.3,54.05,53.8,50.3,49.6,49.4,48.7,44.6,33.9,25.9,24.9,23.9,23.8
図7は、ナフチリジンダイマーおよびRREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示している。図7中、実線で示すのがRREのみ、破線で示すのがナフチリジンダイマーおよびRRE混合物の吸収からナフチリジンフリーの吸収を差し引いたスペクトルとなっている。
図8は、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッドおよびRREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示している。図8中、実線で示すのがRREのみ、破線で示すのがナフチリジン−アザキノロンハイブリッドおよびRRE混合物の吸収からナフチリジン−アザキノロンハイブリッドフリーの吸収を差し引いたスペクトルとなっている。
図9は、構造式(7)
で表されるように、ナフチリジンダイマーの一方のナフチリジンをグアニンと水素結合できないキノリンに変えてなる第1キノリン含有化合物、および、RREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示している。図9中、実線で示すのがRREのみ、破線で示すのが第1キノリン含有化合物フリーの吸収を差し引いたスペクトルとなっている。
図10は、構造式(8)
で表されるように、ナフチリジンダイマーの一方のナフチリジンをグアニンと水素結合できないキノリンに変えてなる第2キノリン含有化合物、および、RREを混合させたときのUV吸収スペクトルを示している。図10中、実線で示すのがRREのみ、破線で示すのが第2キノリン含有化合物フリーの吸収を差し引いたスペクトルとなっている。
本実施例では、RREの吸収のない300nm〜400nmを比較した。
図7〜図10から、GGミスマッチを認識するナフチリジンダイマーや、GAミスマッチを認識するナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを用いた場合には、UV吸収スペクトルに大きな変化が確認された。しかしながら、一方のナフチリジン環をグアニンと水素結合できないキノリンに変えた第1および第2キノリン含有化合物では顕著な変化はなかった。
また、構造式(9)
で表されるナフチリジン単独、構造式(10)
で表されるアザキノロン単独、および、構造式(11)
で表されるキノロン単独それぞれと、RREとを混合させたときでは、300nm〜400nmではほとんど変化が見られなかった。ナフチリジン単独、アザキノロン単独、およびキノロン単独と、RREとをそれぞれ混合させたときのUV吸収スペクトルを、それぞれ、図11〜図13に示す。
以上の結果から、RREに結合するためにはナフチリジンが2つあるナフチリジンダイマー、あるいは、ナフチリジンダイマーの一方のナフチリジンをアザキノロンに変えたナフチリジン−アザキノロンハイブリッドであることが必要であり、それぞれの構成分子単独では、RREと結合しないことがわかった。
図14中、実線はRREのみ、破線はRREにナフチリジンダイマーを添加した場合、一点破線はRREにナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを添加した場合のスペクトルをそれぞれ示している。
図14に示すように、RREにナフチリジンダイマーを添加すると、スペクトル全体に大きな変化がみられた。また、RREにナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを添加した場合でも300nm以降にスペクトルの変化が見られた。
また、ドラッグの結合によるRRE−negのCDスペクトルの変化を調べた。その結果を図15に示す。なお、RRE−negとは、RREのGGミスマッチとGAミスマッチからなるインターナルループをなくしたものであり、図16に示す塩基配列を有するものである。
図14および図15に示す結果から、ナフチリジンダイマー、および、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッドは、RREのインターナルループに特異的に結合することがわかった。
図18に示すように、RREを用いた場合には、大きなSPRシグナルが得られ、ナフチリジンダイマーとRREが強く結合していることがわかった。しかしながら、その他のRNAではほとんどレスポンスがなかった。特に、TARRNAにはRRE同様、インターナルループがあるにもかかわらず、全く結合しなかった。
この結果より、ナフチリジンダイマーはRREのインターナルループの塩基配列を認識していることがわかった。
RREの濃度の増加に伴い、ナフチリジンダイマーのUV吸収が減少し、等吸収点を通って、複合体のUV吸収が増加していくのが確認された。
このことから、ナフチリジンダイマーはRREの二本鎖にインターカレートしていること、ナフチリジンダイマーと、ナフチリジンダイマーで複合体を形成していることがわかった。
偏光度すなわちアニソトロピーは、分子量の増大とともに大きくなる。図23に示すように、フルオロセインを用いて蛍光標識したRevペプチド(以下、「Rev−F1」と略す)が、RREと複合体を形成すると分子量の増大に伴い、アニソトロピーが大きくなる。なお、Rev−F1の構成は、図24に示すとおりである。
種々の濃度のRRE存在下、Rev−F1のアニソトロピーを測定したところ、図25に示すバインディングカーブが得られ、複合体の形成が確認された。
また、得られた結合曲線を解析することにより、RevとRREの解離定数が16nMであることがわかった。
図26から、ネオマイシンBに比べ、ナフチリジンダイマーや、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッドのほうが低い濃度でアニソトロピーの減少が確認された。このことから、ネオマイシンBより、ナフチリジンダイマーや、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッドのほうがRev−RRE複合体形成の阻害能が高いことがわかった。
また、複合体形成阻害のIC50値は、ネオマイシンが4マイクロモル、ナフチリジンダイマーが1.2マイクロモル、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッドが2マイクロモルであった。
また図28に、阻害剤として、ナフチリジンダイマー、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッド、ネオマイシンB、およびトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを用い、それぞれにおけるアニソトロピーの測定を行った結果を示す。(図28中、アニソトロピー値が大きいほうから順に、RREにネオマイシンBを加えた場合、RREにナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを加えた場合、RREにナフチリジンダイマーを加えた場合、RREにトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを加えた場合の解離曲線を示し、横軸は阻害剤の濃度を示している。)これらの結果より、トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んでなる阻害剤は、ネオマイシンBの約20倍の活性を持つことがわかった。
本発明にかかる阻害剤は、以上のように、RREとRevタンパクとの結合を阻害する阻害剤であって、一般式(1)で表されるナフチリジンダイマーを含んでいる構成である。
また本発明にかかる阻害剤は、以上のように、一般式(2)で表されるナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んでいる構成である。
また本発明にかかる阻害剤は、以上のように、一般式(3)で表されるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んでいる構成である。
また本発明にかかる阻害剤は、以上のように、一般式(4)で表されるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドの誘導体を含む構成である。
それゆえ、阻害剤がRRE中のインターナルループに存在するGGミスマッチ塩基対および/またはGAに特異的に結合することにより、RREとRevタンパクとの結合を阻害することの可能な阻害剤を提供することができるという効果を奏する。
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなされた具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求事項との範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
Claims (16)
- RREとRevタンパクとの結合を阻害する阻害剤であって、一般式(A)
(式中、R,R1は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、Xは、任意の二価基を示し、Yは、一般式(B)
で表される置換基、または一般式(C)
で表される置換基を示す)
で表されるナフチリジン誘導体を含んでいる阻害剤。 - 請求の範囲第1項に記載の阻害剤であって、上記ナフチリジン誘導体が、一般式(1)
(式中、R,R1は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R2は、炭素数1〜20のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるナフチリジンダイマーである阻害剤。 - 請求の範囲第1項に記載の阻害剤であって、上記ナフチリジン誘導体が、一般式(2)
(式中、R3は、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R4は、炭素数1〜20のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるナフチリジン−アザキノロンハイブリッドである阻害剤。 - 請求の範囲第1項に記載の阻害剤であって、上記ナフチリジン誘導体が、一般式(3)
(式中、R5〜R7は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示す)
で表されるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドを含んでいる阻害剤。 - 請求の範囲第1項に記載の阻害剤であって、上記ナフチリジン誘導体が、一般式(4)
(式中、R8〜R10は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R11,R12は、それぞれ、炭素数1〜20のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドの誘導体を含む阻害剤。 - RREとRevタンパクとの結合を阻害する阻害剤であって、一般式(A)
(式中、R,R1は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、Xは、任意の二価基を示し、Yは、一般式(B)
で表される置換基、または一般式(C)
で表される置換基を示す)
で表されるナフチリジン誘導体。 - 請求の範囲第6項に記載のナフチリジン誘導体であって、一般式(5)
(式中、R13,R14は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R15,R16は、それぞれ、炭素数1〜18のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示し、R17は、炭素数1〜14のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるナフチリジンダイマー含有アルデヒドであるナフチリジン誘導体。 - 請求の範囲第6項に記載のナフチリジン誘導体であって、一般式(6)
(式中、R18は、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R19,R20は、それぞれ、炭素数1〜18のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示し、R21は、炭素数1〜14のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるナフチリジン−アザキノロンハイブリッド含有アルデヒド。 - 請求の範囲第6項に記載のナフチリジン誘導体であって、一般式(1)
(式中、R,R1は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R2は、炭素数1〜20のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるナフチリジンダイマーであるナフチリジン誘導体。 - 請求の範囲第6項に記載のナフチリジン誘導体であって、一般式(2)
(式中、R3は、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R4は、炭素数1〜20のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるナフチリジン−アザキノロンハイブリッドであるナフチリジン誘導体。 - 請求の範囲第6項に記載のナフチリジン誘導体であって、一般式(3)
(式中、R5〜R7は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示す)
で表されるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドであるナフチリジン誘導体。 - 請求の範囲第6項に記載のナフチリジン誘導体であって、一般式(4)
(式中、R8〜R10は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、R11,R12は、それぞれ、炭素数1〜20のアルキレン基であって該アルキレン基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子、硫黄原子、窒素原子、またはカルボニル基で置換されていてもよいアルキレン基を示す)
で表されるトリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドの誘導体であるナフチリジン誘導体。 - ナフチリジンダイマー、ナフチリジン−アザキノロンハイブリッド、トリナフチリジン−アザキノロンハイブリッドまたはその誘導体を含む化合物群から選ばれる、少なくとも1種の化合物を含んでなる組成物から構成されている基盤。
- RREを検出するためのバイオセンサであって、一般式(A)
(式中、R,R1は、それぞれ、水素原子、炭素数1〜15のアルキル基であって該アルキル基中の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルキル基、炭素数1〜15のアルコキシ基であって該アルコキシ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいアルコキシ基、または、炭素数1〜15のモノもしくはジアルキルアミノ基であって該アルキルアミノ基の1個またはそれ以上の炭素原子が酸素原子または窒素原子で置換されていてもよいモノもしくはジアルキルアミノ基を示し、Xは、任意の二価基を示し、Yは、一般式(B)
で表される置換基、または一般式(C)
で表される置換基を示す)
で表されるナフチリジン誘導体を担体に固定化してなるバイオセンサ。
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