JPWO2003033693A1 - 蛍光蛋白質 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、オワンクラゲ以外の生物に由来する新規な蛍光蛋白質を提供することである。本発明によれば、アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質が提供される。（１）分子量は約２７０００；（２）平衡化状態で４量体を形成する；（３）励起極大波長が４９２ｎｍであり、蛍光極大波長は５０５ｎｍである；（４）モル吸光係数は７４１００である；（５）量子収率は０．６２５である；及び（６）ｐＨ５〜１２の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低い：
Description
技術分野
本発明は、改善された特性を有する新規な蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の新規な蛍光蛋白質及びその利用に関する。
背景技術
クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的（ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ）突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはｐＨ感受性を改変したといった様々なＧＦＰ変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をＧＦＰ等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。
最もよく使用されるＧＦＰ変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）が挙げられる。ＹＦＰは、クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ＧＦＰ変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分のＹＦＰのεおよびΦは、それぞれ６０，０００〜１００，０００Ｍ−１ｃｍ−１および０．６〜０．８であり（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，５０９−５４４）、これらの値は、一般的な蛍光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値に匹敵する。従ってＹＦＰの絶対的輝度の改善は、ほぼ限界に達しつつある。
発明の開示
本発明は、オワンクラゲ以外の生物に由来する新規な蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、オワンクラゲ由来の蛍光蛋白質と比較して改善された蛍光特性を有する新規な蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討し、既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列に基づいて好適なプライマーを設計し、蛍光を示すアザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のｃＤＮＡライブラリーから上記プライマーを用いて蛍光蛋白質を増幅してクローニングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られたアザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の蛍光蛋白質の蛍光特性を調べた結果、当該蛍光蛋白質が所望の蛍光特性を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質が提供される。
（１）分子量は約２７０００；
（２）平衡化状態で４量体を形成する；
（３）励起極大波長が４９２ｎｍであり、蛍光極大波長は５０５ｎｍである；
（４）モル吸光係数は７４１００である；
（５）量子収率は０．６２５である；及び
（６）ｐＨ５〜１２の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低い：
本発明の別の態様によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において７６番目のＧｌｎをＡｒｇに、１０６番目のＡｓｎをＡｓｐに、１１８番目のＩｌｅをＴｈｒに、１５０番目のＡｓｐをＧｌｙに、そして１５７番目のＶａｌをＡｓｐに置換したアミノ酸配列を有する、蛍光蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１２３番目のＶａｌをＴｈｒに、１８８番目のＴｙｒをＡｌａに、１９０番目のＰｈｅをＬｙｓに置換したアミノ酸配列を有する、蛍光蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ：
本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質が提供される。好ましくは、他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質であり、さらに好ましくは他の蛋白質は細胞内小器官に特異的な蛋白質である。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の融合蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター、形質転換体、又は融合蛋白質を含む、蛍光試薬キットが提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の蛍光蛋白質
本発明の蛍光蛋白質は、アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）分子量は約２７０００；
（２）平衡化状態で４量体を形成する；
（３）励起極大波長が４９２ｎｍであり、蛍光極大波長は５０５ｎｍである；
（４）モル吸光係数は７４１００である；
（５）量子収率は０．６２５である；及び
（６）ｐＨ５〜１２の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低い：
アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）はサンゴの１種で、群体の外形は半球形で、板状あるいは円柱状になることがある。サンゴ個体は角張った長楕円形で、鋭く尖った多くの隔板が飛び出している。
なお、本書中以下の実施例では、アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を出発材料として上記特性を有する本発明の蛍光蛋白質を単離したが、アザミサンゴ以外の蛍光を発するサンゴから本発明の蛍光蛋白質を取得することができる場合もあり、そのような蛍光蛋白質も本発明の範囲内である。
本発明の蛍光蛋白質の分子量は約２７０００であり、平衡化状態で４量体を形成し、また少量ながら８量体を形成する。４量体の分子量は約１１６ｋＤａであり８量体の分子量は約２０４ｋＤａである。平衡化状態とは、例えば、本発明の蛍光蛋白質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌで平衡化した状態を言う。また、多量体形成の測定は光散乱を測定することにより行う事ができる。微粒子に光を当てると、大部分は同じ光の波長で散乱する。これをレイリー散乱と言い、この散乱光の強度は、微粒子の数及びその大きさの関数になる。この原理を利用して光散乱検出器によって得た値から分子量を導き出す。具体的には、本発明の蛍光蛋白質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌで平衡化し、まず、ゲルろ過により本発明の蛍光蛋白質平衡化溶液を分子量で分ける。続いて多角度光散乱検出器、ＲＩ検出器でそれぞれ散乱光、試料濃度を測定して分子量を値として出す。
本発明の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が４９２ｎｍであり、蛍光極大波長は５０５ｎｍである。モル吸光係数は７４１００であり、量子収率は０．６２５である。これに対してＥＧＦＰ（クロンテック）のモル吸光係数は４４８００であり、量子収率は０．６００である。モル吸光係数は蛍光分子１モルあたりの光子の吸収量を表し、量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発する事が出来るかを表した数値であるため、モル吸光係数、量子収率の値が大きいことは蛍光が強い事を示す。よってＥＧＦＰよりもモル吸光係数、量子収率の値が大きい本発明の蛍光蛋白質は、ＥＧＦＰよりもより強い蛍光を発する。励起および蛍光の極大波長に関してはＥＧＦＰと本発明の蛍光蛋白質との間に大きな差はないが、本発明の蛍光蛋白質の励起、蛍光スペクトルはＥＧＦＰのそれに比べてシャープであるため、他の蛍光分子との組み合わせて行うマルチカラーイメージング等に際して有利と言える。
本発明の蛍光蛋白質は、ｐＨ５〜１２の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低いことを特徴とする。即ち、ｐＨ５〜１２の範囲において蛍光強度のピーク値の変動が少なく、このｐＨ範囲において高い蛍光強度を維持することができる。従来から使用されているＥＧＦＰの場合には、ｐＨ７以下では蛍光強度が低下するため生体内での使用に際して制約があったが、本発明の蛍光蛋白質にはそのような制約がない。
本発明の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するアミノ酸配列：
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
上記（ｂ）で言う「蛍光特性」とは任意の蛍光特性を意味し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の蛍光強度、励起波長、蛍光波長又はｐＨ感受性などの蛍光特性と同等の蛍光特性でもよいし、又は異なる蛍光特性であってもよい。
上記変異を有する蛍光蛋白質の一例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において７６番目のＧｌｎをＡｒｇに、１０６番目のＡｓｎをＡｓｐに、１１８番目のＩｌｅをＴｈｒに、１５０番目のＡｓｐをＧｌｙに、そして１５７番目のＶａｌをＡｓｐに置換したアミノ酸配列を有する、蛍光蛋白質が挙げられる。この蛍光蛋白質は、３８０ｎｍと４８４ｎｍに励起のピークを持ち、いずれの励起によっても蛍光スペクトルは５０１ｎｍにピークを示す。メジャーな励起のピークが３８０ｎｍであり、ストークスシフトは１２０ｎｍと非常に大きな値となっている。マイナーな４８４ｎｍの励起のピークはｐＨ６からｐＨ１０に向かって値が増加するが、３８０ｎｍの励起のピーク値は変化しない。そのため、３８０ｎｍと４８４ｎｍの励起光による蛍光値の比を測ることにより、ｐＨを測定することがｉｎ ｖｉｔｒｏ又は細胞内において可能である。従来のオワンクラゲ由来のＧＦＰの改変体にも２つの励起ピークの増減でｐＨ測定ができるものが存在するが（ｐＨｌｕｏｒｉｎ）、ＡＧ−ｐＨと違って片方のピークが一定値を取るものではない。従って、この蛍光蛋白質は、３８０ｎｍのピークを励起することによりｐＨに左右されることなく蛍光測定を行うことができる。
上記変異を有する蛍光蛋白質の別の一例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１２３番目のＶａｌをＴｈｒに、１８８番目のＴｙｒをＡｌａに、１９０番目のＰｈｅをＬｙｓに置換したアミノ酸配列を有する、蛍光蛋白質が挙げられる。この蛋白質は単量体で存在する。光散乱測定により分子量を確認した結果、３４ｋＤａであった。この単量体蛍光蛋白質は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質と同じ蛍光極大５０５ｎｍ、励起極大４９２ｎｍを示す。
本発明の蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列並びに配列番号２に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて上記したような各種の公知の蛍光蛋白質のｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの一部の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製したＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
（２）本発明のＤＮＡ
本発明によれば、本発明の蛍光蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ：
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のＤＮＡは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造することもできる。本発明のＤＮＡ又はその断片の作製方法については、本明細書中上述した通りである。
また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、並びにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）に記載されている。
（３）本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮ アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＢＡＮ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルス ＶＡ ＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（４）本発明の形質転換体
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行なえばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（５）本発明の蛍光蛋白質及びそれを含む融合蛍光蛋白質の利用
本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることにより、融合蛍光蛋白質を構築することができる。
本発明の融合蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列及び配列番号２に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、本発明の蛍光蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを構築するのに必要なＤＮＡ断片を作製することができる。また同様に、融合すべき蛋白質をコードするＤＮＡ断片も入手する。
次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛍光蛋白質を産生することができる。
本発明の蛍光蛋白質は、特に、標識としての利用価値が高い。即ち、本発明の蛍光蛋白質を被検アミノ酸配列との融合蛋白質として精製し、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、該融合蛋白質の分布を経時的に観察すれば、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検出することが可能である。
本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質（被検アミノ酸配列）の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが発現可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。
また、本発明の蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーター活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモーターの下流に、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光蛋白質の蛍光を検出することにより、被検プロモーターの活性を測定することが可能である。被検プロモーターとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。
上記被検アミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモーター活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「ｐＮＥＯ」（Ｐ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ａｎｄ Ｐ．Ｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．ＭＯｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７）、「ｐＣＡＧＧＳ」（Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，ａｎｄ Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ．Ｇｅｎｅ １０８，１９３−２００（１９９１））、「ｐＲｃ／ＣＭＶ」（インビトロゲン社製）、「ｐＣＤＭ８」（インビトロゲン社製）などが、酵母用ベクターでは、「ｐＲＳ３０３」，「ｐＲＳ３０４」，「ｐＲＳ３０５」，「ｐＲＳ３０６」，「ｐＲＳ３１３」，「ｐＲＳ３１４」，「ｐＲＳ３１５」，［ｐＲＳ３１６］（Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ ａｎｄ Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２：１９−２７）、「ｐＲＳ４２３」，「ｐＲＳ４２４」，「ｐＲＳ４２５」，「ｐＲＳ４２６」（Ｔ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｍ．Ｄａｎｔｅ，Ｊ．Ｈ．Ｓｈｅｒｏ，ａｎｄ Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９９２）Ｇｅｎｅ １１０：１１９−１２２）などが好適に用いられる。
また、使用可能な細胞の種類も特に限定されず、各種の動物細胞、例えば、Ｌ細胞、ＢａｌｂＣ−３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＲＫ（ｎｏｒｍａｌ ｒａｔ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」などの酵母細胞や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などを使用することができる。ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法などの常法により行うことができる。
上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質（蛋白質Ｘとする）とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を可視化して分析することができる。
例えば、蛋白質Ｘとして細胞内オルガネラに特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソームなどの分布や動きを観察できる。
また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。
本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡（カールツァイス社 アキシオフォト フィルターセット ０９）や画像解析装置（ＡＴＴＯ デジタルイメージアナライザー）などを用いて行うことが可能である。
顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。
フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。本発明の蛍光蛋白質の場合は、励起光４７０〜４９０ｎｍ、蛍光５００〜５６０ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。
また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却ＣＣＤカメラを使用する。冷却ＣＣＤカメラは、ＣＣＤを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
（６）本発明のキット
本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも１種以上を含むことを特徴とする、細胞内成分の局在の分析及び／又は生理活性物質の分析のためのキットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。
蛍光蛋白質又はＤＮＡなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例
実施例１：珊瑚からの新規蛍光蛋白遺伝子（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）の単離
（１）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
蛍光を放つ珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料にはアザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を用いた。アザミサンゴをハンマーで砕き、砕いたサンゴ８ｇに”ＴＲＩｚｏｌ”（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を１５ｍｌ加えて攪拌し、１５００×ｇで１０分間遠心した。上清にクロロホルム３ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、３分間静置した。７５００×ｇで１５分間遠心した。上清にイソプロパノール７．５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、１０分間静置した。１７０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て７０％エタノールを６ｍｌ加えて１７０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て沈殿をＤＥＰＣ水２００μｌで溶解した。ＤＥＰＣ水で溶解したｔｏｔａｌ ＲＮＡを１００倍に希釈してＯ．Ｄ．２６０とＯ．Ｄ．２８０の値を測定してＲＮＡ濃度を測った。３００μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。
（２）Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ３μｇを使用し、Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成キット”Ｒｅａｄｙ Ｔｏ Ｇｏ”（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりｃＤＮＡ（３３μｌ）を合成した。
（３）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＰＣＲ
合成したＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ（３３μｌ）のうち３μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。
プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。使用プライマーの配列を以下に記載する。
（ここで、ＲはＡ又はＧを示し、ＹはＣ又はＴを示し、ＶはＡ、Ｃ又はＧを示し、ＤはＡ、Ｇ又はＴを示す。）
以下のＰＣＲ反応液組成を使用した。
テンプレート（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ） ３μｌ
Ｘ１０ ｔａｑ バッファー ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μｌ
１００μＭ ｐｒｉｍｅｒ１ １μｌ
１００μＭ ｐｒｉｍｅｒ２ １μｌ
ミリＱ ３５μｌ
ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ） １μｌ
以下のＰＣＲ反応条件を使用した。
９４℃で１分（ＰＡＤ）
９４℃で３０秒（変性）
５２℃で３０秒（アニーリング）
７２℃で１分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行い、アニーリング温度を１サイクルごとに０．３℃下げた。即ち、３０サイクル時の温度は４３℃となる。
７２℃で７分（最後の伸長）
４℃（保持）
一回目のＰＣＲ反応で得られた増幅産物１μｌをテンプレートとして、もう一度同じ条件でＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動で予想された大きさの３５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。
（４）サブクローニング及び塩基配列の決定
精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのＤＮＡ塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法による遺伝子全長のクローニングを行った。
（５）５’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の５’側の塩基配列を決定するために５’−ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて、５’−ＲＡＣＥ法を行った。鋳型として（１）で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを３μｇ使用した。
ｄＣ−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡの一回目の増幅には、
のプライマーを用いた（ここで、Ｉはイノシンを示す）。
二回目の増幅には、
のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された３００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（６）３’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の３’側部分は、（４）の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴｄＴプライマーのＰＣＲで得た。鋳型として（２）で調製したｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを３μｌ使用した。作成したプライマーは、５’−ＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＴＴ−３’（ｐｒｉｍｅｒ３）（配列番号９）である。
以下のＰＣＲ反応液組成を使用した。
テンプレート（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ） ３μｌ
Ｘ１０ ｔａｑ バッファー ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μｌ
２０μＭ ｐｒｉｍｅｒ３ １μｌ
１０μＭ ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒ １μｌ
ミリＱ ３５μｌ
ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ） １μｌ
以下のＰＣＲ反応条件を使用した。
９４℃で１分（ＰＡＤ）
９４℃で３０秒（変性）
５５℃で３０秒（アニーリング）
７２℃で１分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃で７分（最後の伸長）
４℃（保持）
アガロースゲル電気泳動で、増幅された８５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（７）大腸菌での蛋白発現
得られた全長の塩基配列より、蛋白のＮ末端、Ｃ末端に相当する部分でプライマーを作製し、（２）で調製したＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。全塩基配列および全アミノ酸配列を配列表の配列番号１及び配列番号２に記載する。使用したプライマーを以下に示す。
以下のＰＣＲ反応液組成を使用した。
テンプレート（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ） ３μｌ
Ｘ１０ ｐｙｒｏｂｅｓｔ バッファー ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μｌ
２０μＭ ｐｒｉｍｅｒ４ １μｌ
２０μＭ ｐｒｉｍｅｒ５ １μｌ
ミリＱ ３５μｌ
ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）１μｌ
以下のＰＣＲ反応条件を使用した。
９４℃で１分（ＰＡＤ）
９４℃で３０秒（変性）
５５℃で３０秒（アニーリング）
７２℃で１分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃で７分（最後の伸長）
４℃（保持）
アガロースゲルの電気泳動で、増幅された７００ｂｐのバンドを切り出し、精製してｐＥＴ２８ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローニングして、大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解析した。
（８）蛍光特性の解析
蛍光蛋白２０μＭ（分子量２７０２６．５２）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液を用いて、吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピーク（４９２ｎｍ）の値よりモル吸光係数を計算した。４５０ｎｍの吸収が０．００３となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈し、４５０ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと５４０ｎｍの蛍光による励起スペクトルを測定した。ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を同様に４５０ｎｍの吸収が０．００３となるようにして蛍光スペクトルを測定し、ＥＧＦＰの量子収率を０．６として今回クローニングされた蛍光蛋白の量子収率を求めた。
結果を表１及び図１に示す。
（９）ｐＨ感受性の測定
４５０ｎｍの吸収が０．００３となるように蛍光蛋白を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５で希釈し、４５０ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと５４０ｎｍの蛍光による励起スペクトルを測定した。ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）も同様にｐＨ７．５における４５０ｎｍの吸収が０．００３となるようにして蛍光スペクトルを測定し対照とした。各ｐＨの緩衝液は次の通り、
ｐＨ４、４．５、５ ： 酢酸バッファー
ｐＨ５．５、６．５、１１ ： リン酸バッファー
ｐＨ６ ： ＭＥＳバッファー
ｐＨ７ ： ＭＯＰＳバッファー
ｐＨ８ ： ＨＥＰＥＳバッファー
ｐＨ９、１０ ： グリシンバッファー
ｐＨ１２．５ ： 水酸化塩化物バッファー
測定結果は図２に示す。
（１０）多量体形成の測定
蛍光蛋白を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌで平衡化して、光散乱による多量体形成の測定を昭光通商株式会社に依頼した。測定の結果、この蛍光蛋白は四量体（１１６Ｋ）および、わずかながら八量体（２０４Ｋ）を形成することが確認された。
光散乱の測定結果は、図３に示す。
実施例２：ｐＨ感受性変異体（ＡＧ−ｐＨ）の作成
Ａｚａｍｉ−ＧｒｅｅｎはｐＨ感受性を持たず、ｐＨ５．５からｐＨ１２．５で安定なグリーンの蛍光を放つ。しかし、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎの７６番目のグルタミンをアルギニンに、１０６番目のアスパラギンをアスパラギン酸に、１１８番目のイソロイシンをトレオニンに、１５０番目のアスパラギン酸をグリシンに、１５７番目のバリンをアスパラギン酸に置き換えることでｐＨ感受性を獲得した。この改変蛍光蛋白質をＡＧ−ｐＨとした。
ＡＧ−ｐＨは、３８０ｎｍと４８４ｎｍに励起のピークを持つ。いずれの励起によっても蛍光スペクトルは５０１ｎｍにピークを示す。メジャーな励起のピークが３８０ｎｍであり、ストークスシフトは１２０ｎｍと非常に大きな値となっている。マイナーな４８４ｎｍの励起のピークはｐＨ６からｐＨ１０に向かって値が増加するが、３８０ｎｍの励起のピーク値は変化しない。そのため、３８０ｎｍと４８４ｎｍの励起光による蛍光値の比を測ることにより、ｐＨを測定することがｉｎ ｖｉｔｒｏ又は細胞内において可能である。従来のオワンクラゲ由来のＧＦＰの改変体にも２つの励起ピークの増減でｐＨ測定ができるものが存在するが（ｐＨｌｕｏｒｉｎ）、ＡＧ−ｐＨと違って片方のピークが一定値を取るものではない。したがって、この改変蛍光蛋白質は３８０ｎｍのピークを励起することによりｐＨに左右される事なく蛍光測定を行う事も出来る（図４、５、６、７、８及び９）。
実施例３：単量体化変異体（ｍＡＧ）の作成
Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎはホモの四量体を形成するが、１２３番目のバリンをトレオニンに、１８８番目のチロシンをアラニンに、１９０番目のフェニルアラニンをリジンに置き換えることによって、単量体に留まる変異体を取得した。光散乱測定により分子量の確認をした（３４ｋＤａ）。この改変単量体蛍光蛋白質をｍＡＧとした。ｍＡＧは野生型Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎと同じ蛍光極大５０５ｎｍ、励起極大４９２ｎｍを示す（図１０及び１１）。
産業上の利用の可能性
本発明により、クラゲ以外の生物に由来する新規な蛍光蛋白質が提供されることになった。本発明の蛍光蛋白質は、所望の蛍光特性を有し、またｐＨ感受性が低いことから、分子生物学的分析において有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のサンゴ由来の蛍光蛋白質（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）とＥＧＦＰの蛍光特性を解析した結果を示す。
図２は、本発明のサンゴ由来の蛍光蛋白質（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）とＥＧＦＰの蛍光強度のｐＨ感受性を示す。
図３は、本発明のサンゴ由来の蛍光蛋白質を用いて光散乱による多量体形成を測定した結果を示す。
図４は、ｐＨ感受性変異体ＡＧ−ｐＨの蛍光及び励起スペクトル（ｐＨ８．０）を示す。
図５は、ｐＨ６からｐＨ９における励起スペクトルを示す。
図６は、３８０ｎｍで励起、４８０ｎｍで励起したときの蛍光値（５２０ｎｍ）のｐＨによる変動を示す。
図７は、４８０ｎｍで励起、３８０ｎｍで励起したときの蛍光値（５２０ｎｍ）の比を示す。
図８は、ＨｅＬａ細胞でＡＧ−ｐＨを発現し、３８０ｎｍと４８０ｎｍで交互に励起したときの細胞内蛍光値のｐＨによる変動を示す。
ＨｅＬａ Ｓ３トランスフェクション後５０時間；減光９０％；露光各１００ｍｓ；１５秒間隔測定；
Ｅｘ ３８０ＨＴ１５，４８０ＤＦ１０ Ｅｍ ５１０ＡＬＰ ＤＭ ５０５ＤＲＬＰ
レンズ４０倍 Ｕａｐｏ／３４０ ＮＡ１．３５
図９は、ＨｅＬａ細胞でＡＧ−ｐＨを発現し、３８０ｎｍと４８０ｎｍで交互に励起したときの細胞内蛍光値の比を示す。
図１０は、ｍＡＧの蛍光スペクトル及び励起スペクトルを示す。
図１１は、光散乱測定結果を示す。
本発明は、改善された特性を有する新規な蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の新規な蛍光蛋白質及びその利用に関する。
背景技術
クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的（ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ）突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはｐＨ感受性を改変したといった様々なＧＦＰ変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をＧＦＰ等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。
最もよく使用されるＧＦＰ変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）が挙げられる。ＹＦＰは、クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ＧＦＰ変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分のＹＦＰのεおよびΦは、それぞれ６０，０００〜１００，０００Ｍ−１ｃｍ−１および０．６〜０．８であり（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，５０９−５４４）、これらの値は、一般的な蛍光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値に匹敵する。従ってＹＦＰの絶対的輝度の改善は、ほぼ限界に達しつつある。
発明の開示
本発明は、オワンクラゲ以外の生物に由来する新規な蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、オワンクラゲ由来の蛍光蛋白質と比較して改善された蛍光特性を有する新規な蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討し、既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列に基づいて好適なプライマーを設計し、蛍光を示すアザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のｃＤＮＡライブラリーから上記プライマーを用いて蛍光蛋白質を増幅してクローニングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られたアザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の蛍光蛋白質の蛍光特性を調べた結果、当該蛍光蛋白質が所望の蛍光特性を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質が提供される。
（１）分子量は約２７０００；
（２）平衡化状態で４量体を形成する；
（３）励起極大波長が４９２ｎｍであり、蛍光極大波長は５０５ｎｍである；
（４）モル吸光係数は７４１００である；
（５）量子収率は０．６２５である；及び
（６）ｐＨ５〜１２の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低い：
本発明の別の態様によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において７６番目のＧｌｎをＡｒｇに、１０６番目のＡｓｎをＡｓｐに、１１８番目のＩｌｅをＴｈｒに、１５０番目のＡｓｐをＧｌｙに、そして１５７番目のＶａｌをＡｓｐに置換したアミノ酸配列を有する、蛍光蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１２３番目のＶａｌをＴｈｒに、１８８番目のＴｙｒをＡｌａに、１９０番目のＰｈｅをＬｙｓに置換したアミノ酸配列を有する、蛍光蛋白質が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ：
本発明のさらに別の態様によれば、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質が提供される。好ましくは、他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質であり、さらに好ましくは他の蛋白質は細胞内小器官に特異的な蛋白質である。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の融合蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、上記した本発明の蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター、形質転換体、又は融合蛋白質を含む、蛍光試薬キットが提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の蛍光蛋白質
本発明の蛍光蛋白質は、アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）分子量は約２７０００；
（２）平衡化状態で４量体を形成する；
（３）励起極大波長が４９２ｎｍであり、蛍光極大波長は５０５ｎｍである；
（４）モル吸光係数は７４１００である；
（５）量子収率は０．６２５である；及び
（６）ｐＨ５〜１２の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低い：
アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）はサンゴの１種で、群体の外形は半球形で、板状あるいは円柱状になることがある。サンゴ個体は角張った長楕円形で、鋭く尖った多くの隔板が飛び出している。
なお、本書中以下の実施例では、アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を出発材料として上記特性を有する本発明の蛍光蛋白質を単離したが、アザミサンゴ以外の蛍光を発するサンゴから本発明の蛍光蛋白質を取得することができる場合もあり、そのような蛍光蛋白質も本発明の範囲内である。
本発明の蛍光蛋白質の分子量は約２７０００であり、平衡化状態で４量体を形成し、また少量ながら８量体を形成する。４量体の分子量は約１１６ｋＤａであり８量体の分子量は約２０４ｋＤａである。平衡化状態とは、例えば、本発明の蛍光蛋白質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌで平衡化した状態を言う。また、多量体形成の測定は光散乱を測定することにより行う事ができる。微粒子に光を当てると、大部分は同じ光の波長で散乱する。これをレイリー散乱と言い、この散乱光の強度は、微粒子の数及びその大きさの関数になる。この原理を利用して光散乱検出器によって得た値から分子量を導き出す。具体的には、本発明の蛍光蛋白質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌで平衡化し、まず、ゲルろ過により本発明の蛍光蛋白質平衡化溶液を分子量で分ける。続いて多角度光散乱検出器、ＲＩ検出器でそれぞれ散乱光、試料濃度を測定して分子量を値として出す。
本発明の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が４９２ｎｍであり、蛍光極大波長は５０５ｎｍである。モル吸光係数は７４１００であり、量子収率は０．６２５である。これに対してＥＧＦＰ（クロンテック）のモル吸光係数は４４８００であり、量子収率は０．６００である。モル吸光係数は蛍光分子１モルあたりの光子の吸収量を表し、量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発する事が出来るかを表した数値であるため、モル吸光係数、量子収率の値が大きいことは蛍光が強い事を示す。よってＥＧＦＰよりもモル吸光係数、量子収率の値が大きい本発明の蛍光蛋白質は、ＥＧＦＰよりもより強い蛍光を発する。励起および蛍光の極大波長に関してはＥＧＦＰと本発明の蛍光蛋白質との間に大きな差はないが、本発明の蛍光蛋白質の励起、蛍光スペクトルはＥＧＦＰのそれに比べてシャープであるため、他の蛍光分子との組み合わせて行うマルチカラーイメージング等に際して有利と言える。
本発明の蛍光蛋白質は、ｐＨ５〜１２の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低いことを特徴とする。即ち、ｐＨ５〜１２の範囲において蛍光強度のピーク値の変動が少なく、このｐＨ範囲において高い蛍光強度を維持することができる。従来から使用されているＥＧＦＰの場合には、ｐＨ７以下では蛍光強度が低下するため生体内での使用に際して制約があったが、本発明の蛍光蛋白質にはそのような制約がない。
本発明の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するアミノ酸配列：
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
上記（ｂ）で言う「蛍光特性」とは任意の蛍光特性を意味し、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の蛍光強度、励起波長、蛍光波長又はｐＨ感受性などの蛍光特性と同等の蛍光特性でもよいし、又は異なる蛍光特性であってもよい。
上記変異を有する蛍光蛋白質の一例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において７６番目のＧｌｎをＡｒｇに、１０６番目のＡｓｎをＡｓｐに、１１８番目のＩｌｅをＴｈｒに、１５０番目のＡｓｐをＧｌｙに、そして１５７番目のＶａｌをＡｓｐに置換したアミノ酸配列を有する、蛍光蛋白質が挙げられる。この蛍光蛋白質は、３８０ｎｍと４８４ｎｍに励起のピークを持ち、いずれの励起によっても蛍光スペクトルは５０１ｎｍにピークを示す。メジャーな励起のピークが３８０ｎｍであり、ストークスシフトは１２０ｎｍと非常に大きな値となっている。マイナーな４８４ｎｍの励起のピークはｐＨ６からｐＨ１０に向かって値が増加するが、３８０ｎｍの励起のピーク値は変化しない。そのため、３８０ｎｍと４８４ｎｍの励起光による蛍光値の比を測ることにより、ｐＨを測定することがｉｎ ｖｉｔｒｏ又は細胞内において可能である。従来のオワンクラゲ由来のＧＦＰの改変体にも２つの励起ピークの増減でｐＨ測定ができるものが存在するが（ｐＨｌｕｏｒｉｎ）、ＡＧ−ｐＨと違って片方のピークが一定値を取るものではない。従って、この蛍光蛋白質は、３８０ｎｍのピークを励起することによりｐＨに左右されることなく蛍光測定を行うことができる。
上記変異を有する蛍光蛋白質の別の一例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１２３番目のＶａｌをＴｈｒに、１８８番目のＴｙｒをＡｌａに、１９０番目のＰｈｅをＬｙｓに置換したアミノ酸配列を有する、蛍光蛋白質が挙げられる。この蛋白質は単量体で存在する。光散乱測定により分子量を確認した結果、３４ｋＤａであった。この単量体蛍光蛋白質は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質と同じ蛍光極大５０５ｎｍ、励起極大４９２ｎｍを示す。
本発明の蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列並びに配列番号２に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いて上記したような各種の公知の蛍光蛋白質のｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの一部の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製したＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
（２）本発明のＤＮＡ
本発明によれば、本発明の蛍光蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ：
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの更なる具体例としては、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のＤＮＡは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造することもできる。本発明のＤＮＡ又はその断片の作製方法については、本明細書中上述した通りである。
また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、並びにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）に記載されている。
（３）本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮ アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＢＡＮ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルス ＶＡ ＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（４）本発明の形質転換体
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行なえばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（５）本発明の蛍光蛋白質及びそれを含む融合蛍光蛋白質の利用
本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることにより、融合蛍光蛋白質を構築することができる。
本発明の融合蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列及び配列番号２に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、本発明の蛍光蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを構築するのに必要なＤＮＡ断片を作製することができる。また同様に、融合すべき蛋白質をコードするＤＮＡ断片も入手する。
次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛍光蛋白質を産生することができる。
本発明の蛍光蛋白質は、特に、標識としての利用価値が高い。即ち、本発明の蛍光蛋白質を被検アミノ酸配列との融合蛋白質として精製し、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、該融合蛋白質の分布を経時的に観察すれば、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検出することが可能である。
本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質（被検アミノ酸配列）の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが発現可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。
また、本発明の蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーター活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモーターの下流に、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光蛋白質の蛍光を検出することにより、被検プロモーターの活性を測定することが可能である。被検プロモーターとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。
上記被検アミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモーター活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「ｐＮＥＯ」（Ｐ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ａｎｄ Ｐ．Ｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．ＭＯｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７）、「ｐＣＡＧＧＳ」（Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，ａｎｄ Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ．Ｇｅｎｅ １０８，１９３−２００（１９９１））、「ｐＲｃ／ＣＭＶ」（インビトロゲン社製）、「ｐＣＤＭ８」（インビトロゲン社製）などが、酵母用ベクターでは、「ｐＲＳ３０３」，「ｐＲＳ３０４」，「ｐＲＳ３０５」，「ｐＲＳ３０６」，「ｐＲＳ３１３」，「ｐＲＳ３１４」，「ｐＲＳ３１５」，［ｐＲＳ３１６］（Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ ａｎｄ Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２：１９−２７）、「ｐＲＳ４２３」，「ｐＲＳ４２４」，「ｐＲＳ４２５」，「ｐＲＳ４２６」（Ｔ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｍ．Ｄａｎｔｅ，Ｊ．Ｈ．Ｓｈｅｒｏ，ａｎｄ Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９９２）Ｇｅｎｅ １１０：１１９−１２２）などが好適に用いられる。
また、使用可能な細胞の種類も特に限定されず、各種の動物細胞、例えば、Ｌ細胞、ＢａｌｂＣ−３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＲＫ（ｎｏｒｍａｌ ｒａｔ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」などの酵母細胞や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などを使用することができる。ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法などの常法により行うことができる。
上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質（蛋白質Ｘとする）とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を可視化して分析することができる。
例えば、蛋白質Ｘとして細胞内オルガネラに特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソームなどの分布や動きを観察できる。
また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。
本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡（カールツァイス社 アキシオフォト フィルターセット ０９）や画像解析装置（ＡＴＴＯ デジタルイメージアナライザー）などを用いて行うことが可能である。
顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。
フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。本発明の蛍光蛋白質の場合は、励起光４７０〜４９０ｎｍ、蛍光５００〜５６０ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。
また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却ＣＣＤカメラを使用する。冷却ＣＣＤカメラは、ＣＣＤを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
（６）本発明のキット
本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも１種以上を含むことを特徴とする、細胞内成分の局在の分析及び／又は生理活性物質の分析のためのキットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。
蛍光蛋白質又はＤＮＡなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例
実施例１：珊瑚からの新規蛍光蛋白遺伝子（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）の単離
（１）ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
蛍光を放つ珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料にはアザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を用いた。アザミサンゴをハンマーで砕き、砕いたサンゴ８ｇに”ＴＲＩｚｏｌ”（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を１５ｍｌ加えて攪拌し、１５００×ｇで１０分間遠心した。上清にクロロホルム３ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、３分間静置した。７５００×ｇで１５分間遠心した。上清にイソプロパノール７．５ｍｌを加え、１５秒間攪拌した後、１０分間静置した。１７０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て７０％エタノールを６ｍｌ加えて１７０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て沈殿をＤＥＰＣ水２００μｌで溶解した。ＤＥＰＣ水で溶解したｔｏｔａｌ ＲＮＡを１００倍に希釈してＯ．Ｄ．２６０とＯ．Ｄ．２８０の値を測定してＲＮＡ濃度を測った。３００μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。
（２）Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ３μｇを使用し、Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成キット”Ｒｅａｄｙ Ｔｏ Ｇｏ”（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりｃＤＮＡ（３３μｌ）を合成した。
（３）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＰＣＲ
合成したＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ（３３μｌ）のうち３μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。
プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。使用プライマーの配列を以下に記載する。
以下のＰＣＲ反応液組成を使用した。
テンプレート（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ） ３μｌ
Ｘ１０ ｔａｑ バッファー ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μｌ
１００μＭ ｐｒｉｍｅｒ１ １μｌ
１００μＭ ｐｒｉｍｅｒ２ １μｌ
ミリＱ ３５μｌ
ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ） １μｌ
以下のＰＣＲ反応条件を使用した。
９４℃で１分（ＰＡＤ）
９４℃で３０秒（変性）
５２℃で３０秒（アニーリング）
７２℃で１分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行い、アニーリング温度を１サイクルごとに０．３℃下げた。即ち、３０サイクル時の温度は４３℃となる。
７２℃で７分（最後の伸長）
４℃（保持）
一回目のＰＣＲ反応で得られた増幅産物１μｌをテンプレートとして、もう一度同じ条件でＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動で予想された大きさの３５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。
（４）サブクローニング及び塩基配列の決定
精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのＤＮＡ塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法による遺伝子全長のクローニングを行った。
（５）５’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の５’側の塩基配列を決定するために５’−ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて、５’−ＲＡＣＥ法を行った。鋳型として（１）で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを３μｇ使用した。
ｄＣ−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡの一回目の増幅には、
二回目の増幅には、
アガロースゲル電気泳動で、増幅された３００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（６）３’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の３’側部分は、（４）の塩基配列決定で得られた情報を基に作製したプライマーとオリゴｄＴプライマーのＰＣＲで得た。鋳型として（２）で調製したｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを３μｌ使用した。作成したプライマーは、５’−ＡＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＴＴＴＴ−３’（ｐｒｉｍｅｒ３）（配列番号９）である。
以下のＰＣＲ反応液組成を使用した。
テンプレート（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ） ３μｌ
Ｘ１０ ｔａｑ バッファー ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μｌ
２０μＭ ｐｒｉｍｅｒ３ １μｌ
１０μＭ ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｐｒｉｍｅｒ １μｌ
ミリＱ ３５μｌ
ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ） １μｌ
以下のＰＣＲ反応条件を使用した。
９４℃で１分（ＰＡＤ）
９４℃で３０秒（変性）
５５℃で３０秒（アニーリング）
７２℃で１分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃で７分（最後の伸長）
４℃（保持）
アガロースゲル電気泳動で、増幅された８５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（７）大腸菌での蛋白発現
得られた全長の塩基配列より、蛋白のＮ末端、Ｃ末端に相当する部分でプライマーを作製し、（２）で調製したＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。全塩基配列および全アミノ酸配列を配列表の配列番号１及び配列番号２に記載する。使用したプライマーを以下に示す。
テンプレート（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ） ３μｌ
Ｘ１０ ｐｙｒｏｂｅｓｔ バッファー ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４μｌ
２０μＭ ｐｒｉｍｅｒ４ １μｌ
２０μＭ ｐｒｉｍｅｒ５ １μｌ
ミリＱ ３５μｌ
ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）１μｌ
以下のＰＣＲ反応条件を使用した。
９４℃で１分（ＰＡＤ）
９４℃で３０秒（変性）
５５℃で３０秒（アニーリング）
７２℃で１分（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃で７分（最後の伸長）
４℃（保持）
アガロースゲルの電気泳動で、増幅された７００ｂｐのバンドを切り出し、精製してｐＥＴ２８ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローニングして、大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解析した。
（８）蛍光特性の解析
蛍光蛋白２０μＭ（分子量２７０２６．５２）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液を用いて、吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピーク（４９２ｎｍ）の値よりモル吸光係数を計算した。４５０ｎｍの吸収が０．００３となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈し、４５０ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと５４０ｎｍの蛍光による励起スペクトルを測定した。ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を同様に４５０ｎｍの吸収が０．００３となるようにして蛍光スペクトルを測定し、ＥＧＦＰの量子収率を０．６として今回クローニングされた蛍光蛋白の量子収率を求めた。
結果を表１及び図１に示す。
４５０ｎｍの吸収が０．００３となるように蛍光蛋白を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５で希釈し、４５０ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルと５４０ｎｍの蛍光による励起スペクトルを測定した。ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）も同様にｐＨ７．５における４５０ｎｍの吸収が０．００３となるようにして蛍光スペクトルを測定し対照とした。各ｐＨの緩衝液は次の通り、
ｐＨ４、４．５、５ ： 酢酸バッファー
ｐＨ５．５、６．５、１１ ： リン酸バッファー
ｐＨ６ ： ＭＥＳバッファー
ｐＨ７ ： ＭＯＰＳバッファー
ｐＨ８ ： ＨＥＰＥＳバッファー
ｐＨ９、１０ ： グリシンバッファー
ｐＨ１２．５ ： 水酸化塩化物バッファー
測定結果は図２に示す。
（１０）多量体形成の測定
蛍光蛋白を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌで平衡化して、光散乱による多量体形成の測定を昭光通商株式会社に依頼した。測定の結果、この蛍光蛋白は四量体（１１６Ｋ）および、わずかながら八量体（２０４Ｋ）を形成することが確認された。
光散乱の測定結果は、図３に示す。
実施例２：ｐＨ感受性変異体（ＡＧ−ｐＨ）の作成
Ａｚａｍｉ−ＧｒｅｅｎはｐＨ感受性を持たず、ｐＨ５．５からｐＨ１２．５で安定なグリーンの蛍光を放つ。しかし、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎの７６番目のグルタミンをアルギニンに、１０６番目のアスパラギンをアスパラギン酸に、１１８番目のイソロイシンをトレオニンに、１５０番目のアスパラギン酸をグリシンに、１５７番目のバリンをアスパラギン酸に置き換えることでｐＨ感受性を獲得した。この改変蛍光蛋白質をＡＧ−ｐＨとした。
ＡＧ−ｐＨは、３８０ｎｍと４８４ｎｍに励起のピークを持つ。いずれの励起によっても蛍光スペクトルは５０１ｎｍにピークを示す。メジャーな励起のピークが３８０ｎｍであり、ストークスシフトは１２０ｎｍと非常に大きな値となっている。マイナーな４８４ｎｍの励起のピークはｐＨ６からｐＨ１０に向かって値が増加するが、３８０ｎｍの励起のピーク値は変化しない。そのため、３８０ｎｍと４８４ｎｍの励起光による蛍光値の比を測ることにより、ｐＨを測定することがｉｎ ｖｉｔｒｏ又は細胞内において可能である。従来のオワンクラゲ由来のＧＦＰの改変体にも２つの励起ピークの増減でｐＨ測定ができるものが存在するが（ｐＨｌｕｏｒｉｎ）、ＡＧ−ｐＨと違って片方のピークが一定値を取るものではない。したがって、この改変蛍光蛋白質は３８０ｎｍのピークを励起することによりｐＨに左右される事なく蛍光測定を行う事も出来る（図４、５、６、７、８及び９）。
実施例３：単量体化変異体（ｍＡＧ）の作成
Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎはホモの四量体を形成するが、１２３番目のバリンをトレオニンに、１８８番目のチロシンをアラニンに、１９０番目のフェニルアラニンをリジンに置き換えることによって、単量体に留まる変異体を取得した。光散乱測定により分子量の確認をした（３４ｋＤａ）。この改変単量体蛍光蛋白質をｍＡＧとした。ｍＡＧは野生型Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎと同じ蛍光極大５０５ｎｍ、励起極大４９２ｎｍを示す（図１０及び１１）。
産業上の利用の可能性
本発明により、クラゲ以外の生物に由来する新規な蛍光蛋白質が提供されることになった。本発明の蛍光蛋白質は、所望の蛍光特性を有し、またｐＨ感受性が低いことから、分子生物学的分析において有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のサンゴ由来の蛍光蛋白質（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）とＥＧＦＰの蛍光特性を解析した結果を示す。
図２は、本発明のサンゴ由来の蛍光蛋白質（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ）とＥＧＦＰの蛍光強度のｐＨ感受性を示す。
図３は、本発明のサンゴ由来の蛍光蛋白質を用いて光散乱による多量体形成を測定した結果を示す。
図４は、ｐＨ感受性変異体ＡＧ−ｐＨの蛍光及び励起スペクトル（ｐＨ８．０）を示す。
図５は、ｐＨ６からｐＨ９における励起スペクトルを示す。
図６は、３８０ｎｍで励起、４８０ｎｍで励起したときの蛍光値（５２０ｎｍ）のｐＨによる変動を示す。
図７は、４８０ｎｍで励起、３８０ｎｍで励起したときの蛍光値（５２０ｎｍ）の比を示す。
図８は、ＨｅＬａ細胞でＡＧ−ｐＨを発現し、３８０ｎｍと４８０ｎｍで交互に励起したときの細胞内蛍光値のｐＨによる変動を示す。
ＨｅＬａ Ｓ３トランスフェクション後５０時間；減光９０％；露光各１００ｍｓ；１５秒間隔測定；
Ｅｘ ３８０ＨＴ１５，４８０ＤＦ１０ Ｅｍ ５１０ＡＬＰ ＤＭ ５０５ＤＲＬＰ
レンズ４０倍 Ｕａｐｏ／３４０ ＮＡ１．３５
図９は、ＨｅＬａ細胞でＡＧ−ｐＨを発現し、３８０ｎｍと４８０ｎｍで交互に励起したときの細胞内蛍光値の比を示す。
図１０は、ｍＡＧの蛍光スペクトル及び励起スペクトルを示す。
図１１は、光散乱測定結果を示す。
Claims (14)
- アザミサンゴ（Ｇａｌａｘｅａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質。
（１）分子量は約２７０００；
（２）平衡化状態で４量体を形成する；
（３）励起極大波長が４９２ｎｍであり、蛍光極大波長は５０５ｎｍである；
（４）モル吸光係数は７４１００である；
（５）量子収率は０．６２５である；及び
（６）ｐＨ５〜１２の範囲において蛍光特性のｐＨ感受性が低い： - 以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するアミノ酸配列： - 配列番号１に記載のアミノ酸配列において７６番目のＧｌｎをＡｒｇに、１０６番目のＡｓｎをＡｓｐに、１１８番目のＩｌｅをＴｈｒに、１５０番目のＡｓｐをＧｌｙに、そして１５７番目のＶａｌをＡｓｐに置換したアミノ酸配列を有する、蛍光蛋白質。
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列において１２３番目のＶａｌをＴｈｒに、１８８番目のＴｙｒをＡｌａに、１９０番目のＰｈｅをＬｙｓに置換したアミノ酸配列を有する、蛍光蛋白質。
- 請求項１から４の何れかに記載の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ。
- 以下の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ： - 以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光特性を有する蛋白質をコードする塩基配列： - 請求項５から７の何れかに記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
- 請求項５から７の何れかに記載のＤＮＡ又は請求項８に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
- 請求項１から４の何れかに記載の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質。
- 他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質である、請求項１０に記載の融合蛋白質。
- 他の蛋白質が細胞内小器官に特異的な蛋白質である、請求項１０又は１１に記載の融合蛋白質。
- 請求項１０から１２の何れかに記載の融合蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法。
- 請求項１から４の何れかに記載の蛍光蛋白質、請求項５から７の何れかに記載のＤＮＡ、請求項８に記載の組み換えベクター、請求項９に記載の形質転換体、又は請求項１０から１２の何れかに記載の融合蛋白質を含む、蛍光試薬キット。
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