JPS6368079A - 新規な３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ−ゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規な３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ（以下、３α−）ＴＳＤ）（と略す）及びその
製造法に関する。更に詳細には、至適ｐＨが８．２〜８
．８にあり且つ３α−ヒドロキシステロイドに対し基質
特異性を有する３α−Ｈ３ＤＩ及びノカルジア１ｖＩ１
．生物を培養し、培養物から該３α−Ｈ３ＤＨを製造す
る方法に関する。

近年、臨床検査分野で肝胆道系疾患の検査法として血中
の胆汁酸濃度を測定することが注目され、実用化されて
いる。胆汁酸の測定にはイムノアッセイ法、ガスクロマ
トグラフィー法、薄層クロマトグラフィー法、高速液体
クロマトグラフィー法等があるが、方法によっては特定
の胆汁酸しか測定できなかったり、前処理が煩雑で分離
が不充分なこと、さらには血中濃度を測定するには感度
が低い等の問題点がある。これらを解決する為、総胆汁
酸の測定には３α−Ｈ３ＤＨを用いる簡便で特異性が高
く、感度の良い方法が採用されている。

この酵素法による胆汁酸定量は、日常のルーチン検査法
、マススクリーニング法として優れている。

本発明の３α−Ｈ３ＤＨは、補酵素（ＮＡＤ。

ＮＡＤＰ）の存在下、３α−ヒドロキシステロイドを脱
水素する酵素である。それ故、この反応により生成する
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰ）（の増加を分光光度法や螢光測
定、ホルマザン色素の形成反応、酵素的サイクリング法
により測定すれば生体体液中の胆汁酸が定量できる。

従来の技術 ３α−Ｈ３ＤＨは従来より数多くの報文に記載されてい
る。

動物起源のものとしてはラットの肝、腎臓、来九、前立
腺、ウサギの肝、ヒトの前立腺にその存在が証明されて
いる。

一方、微生物起源のものとしては例えば、Ｔａ１ａｌａ
ｙ、　Ｐらが報告したシュードモナス・テストステロニ
ー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎ
ｉ）由来の３α−ＨＳ　Ｄ　Ｈ（Ｎａｔｕｒｅ、１７３
巻、１１８９頁、　１９５４年、Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｉ、２１８巻、６
７５頁、１９５６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　、　５巻、５１２頁、　１９６２年、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４巻、　１Ｂ２５頁、　１９
６５年）、上島らが報告したシュードモナス・プチダ（
Ｐｓｅｕｄｏｍ。

ｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）及びバチルス・スフエリカス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　）由来の３
α−Ｈ３ＤＨ（八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＋４２巻、　１５７
７頁。

１９７８年、４３巻、　１５２１頁、　１９７９年、特
公昭６Ｏ−２２９１４）、同じくバチルス・スフエリカ
ス由来の３α−Ｈ３ＤＨ（特開昭５４−１７８９４）等
が挙げられる。

しかしながら、Ｔａ１ａｌａｙ、　Ｐらが報告した３α
−Ｈ３ＤＨは至適ｐ■が９．１．金属イオン、ｐ−クロ
ロマーキュリベンゾエートにより活性が著しく阻害され
ること、及び５α−ステロイドと５β−ステロイドの相
対活性の比率が１０＝１であり、本酵素とは大きく性質
を異にする。又、上島らのシュードモナス・プチダ由来
の３α−Ｈ３ＤＨは至適ｐＨが１１．０、金属イオン、
ｐ−クロロマーキュリベンゾエートにより活性阻害がみ
られこれも本発明の３α−Ｈ３ＤＨとは異なる。更に、
バチルス・スフエリカス由来の酵素は至適ｐＨが１０．
０〜１０．５、分子量１６万、安定化に金属イオンを要
求すること、５α−ステロイドと５β−ステロイドとの
相対活性の比率も本酵素と異なる。

このように、従来報告された３α−Ｈ３ＤＴ（と本発明
の酵素とは至適ｐＨ，分子量、阻害剤、基質特異性９等
電点等数多くの理化学的性質に於いて差異が認められる
のである。

特に、従来の３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼは至ＪｐＨが高い為、生体体液中の胆汁酸測定には
不利である。

発明が解決しようとする問題点 従来より胆汁酸測定用として実用に供されている酵素、
例えばシュードモナス・テストステロニー由来の３α−
Ｈ３ＤＨは至！ｐＨが９．０以上のところにあり、臨床
検査試薬としては不利な面が多い。即ち、この酵素を用
いる胆汁酸測定キットにおいては、通常ｐＨ７，０〜８
．０前後で酵素反応が行われる為、このｐＨ８，０より
も掛は離れた至適ｐｌ＋を持つ酵素程、測定に充分な量
を使用しなければならないことを意味する。故に、酵素
使用量の増加はコストの面のみならず、多量に使用する
ことによる、往々にして夾雑する酵素及び添加剤の悪影
響を免れ得ないのである。なお且つ、試薬組成中にはβ
−ＮＡＤが含まれており、この物質は溶液のｐＨがアル
カリ側に傾く程不安定で分解し、測定に支障をきたすこ
とになる。これらの問題は、検査データが正しく反映さ
れないことでもある。

又、基質特異性においてもデオキシコール酸よりもアン
ドロステロンに約１０倍も親和性が高く、濃度によって
はその影響は重大である。

そこで、本発明の目的とするところは生体体液中の胆汁
酸の定量に有利な３α−Ｈ３ＤＨ及びその製造法を提供
することにある。

問題点を解決する為の手段 上記の実情により、至適ｐＨが従来のものよりも低く、
且つ５β−ステロイドに作用しゃすい３α−Ｈ３ＤＨの
開発が強く望まれている現状をふまえ、本発明者らはか
かる欠点を補うべく生体体液中の胆汁酸測定用に適した
３α−Ｈ３ＤＨの開発を目的として鋭意検討した。その
結果、研究の過程で意外にもノカルジア属（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａ　ｓｐ、Ｎｏ、Ｃｈ２−１．ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ
、６２１７　）に属する微生物が上記目的に合致した酵
素を産生ずることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。

ここで発見された新規な３α−Ｈ３ＤＨは、至！！ｐ）
Ｉが８．２〜８．８であり前記の胆汁酸測定に伴うｐｕ
の問題点を解決したのみならず、ｐ−クロロマーキュリ
ベンゾエート等のＳＨ試薬、金属イオンによっても影響
を受けず、安定剤も特に必要としないという実用上すこ
ぶる優れた性質を有していたのである。

本発明の酵素を製造する際に用いられる優れた菌株は、
ノカルジア・エスピー　Ｎｏ、Ｃｈ２　１゜Ｆ　Ｅ　Ｒ
Ｍ　　Ｎｏ、　６２１７であり、その菌学的性質は下記
の如くである。

（Ａ）形態的性質 １）細胞の形及び大きさ：培養初期菌糸状に生育し分岐
を生じる。その後、不規則な分断が生じ細胞は桿菌状と
なる。大きさは０．８〜１．０μ×１゜５〜４．０β位
である。気菌糸を形成せず胞子のう胞子も形成しない。

２）ダラム染色性：陽性 ３）抗酸性：陽性 ４）運動性：無 （Ｂ）化学的組成分析 細胞壁中にｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸、アラビノー
ス、ガラクトースが含まれり、Ｌ−ジアミノピメリン酸
、グリシンは含まない。

（Ｃ）各培地における生育状態 ■）肉汁寒天平板培地：３０℃で４日培養後、直径０．
５〜１．０ｍの円形のコロニーを形成する。周辺は金縁
もしくは波状である。表面は平滑で半球状であり、中心
部が凸状に隆起する場合もある。

色調は薄いクリーム色で不透明である。培地中に色素は
出さない。

２）シュークロース硝酸塩寒天培地：生育中程度で集落
の色は白色ないし薄クリーム色である。

水溶性色素は出さない。

３）グルコース、アスパラギン寒天培地：生育中程度で
集落の色はクリーム色である。水溶性色素は出さない。

４）グリセリン、アスパラギン寒天培地：生育中程度で
集落の色は白色ないし薄クリーム色である。水溶性色素
は出さない。

５）スターチ無機塩寒天培地：生育中程度で集落の色は
白色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出さない
。

６）チロシン寒天培地：生育中程度で集落の色は白色な
いし薄クリーム色である。水溶性色素は出さない。

７）栄養寒天培地：生育良好で集落の色はクリーム色で
ある。水溶性色素は出さない。

８）イースト麦芽寒天培地：生育良好で集落の色はクリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。

９）オートミール寒天培地：生育中程度で集落の色は白
色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出さない。

（Ｄ）生理的性質 １）生育温度：１５〜４３℃で生育する。１０℃、４５
℃で生育しない。最適温度は３０〜３５℃である。

２）硝酸塩還元性：陽性 ３）カタラーゼ：陽性 ４）オキシダーゼ；陰性 ５）ウレアーゼ：陽性 ６）デンプン加水分解：陰性 ７）ゼラチン液化：陰性 ８）チロシン加水分解：陰性 ９）カゼイン加水分解：陰性 １０）キサンチン加水分解：陰性 １１）ＤＮＡの分解：陰性 １２）リドマスミルク：アルカリ性、ペプトン化、凝固
共にしない。

１３）メラニン様色素の生成：無 １４）エスクリン加水分解：陽性 １５）　Ｔｓｅｅｎ　２０．４０，６０．８０加水分解
：全て陽性１６）ペニシリン耐性試験：耐性 １７）酸素に対する態度：好気性 １８）無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸塩共に
利用する。

１９）　ＮａＣ１生育範囲：０〜６％で生育する。７％
で生育しない。

２０）各種炭素源の同化性（プリドハム、ゴドリープ寒
天培地）；Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、マンノ
ース、グリセリン、トレハロースを同化する。Ｌ−アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、サッカロース、イノジット
、Ｌ−ラムノース、ラフィノース、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−マンニット、マルトース、ソルビットを同化しない
。

２１）各種糖から酸の生成：Ｄ−グルコース、マンノー
ス、Ｄ−フラクトース、トレハロース、グリセリンから
酸を生成する。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ
−ガラクトース、マルトース、サッカロース、ラクトー
ス、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、イノシフト、デ
ンプンから酸を生成しない。

以上の菌学的性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆ　Ｄｅｔｅｒ＋＊１ｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ第８版を参考に検討した結果、細胞壁中にｍ
ｅｓｏ−ジアミノピメリン酸、アラビノース、ガラクト
ースを含み、Ｌ、Ｌ−ジアミノピメリン酸、グリシンが
含まれないこと、好気性で菌糸状によく生育し、後に分
断して桿菌状となること、抗酸性であること、胞子のう
胞子及び気菌糸を着生しないこと等から本菌はＮｏｃａ
ｒｄｉａに属する菌である。本菌は、本発明者らがノカ
ルジア・エスピーＮｏ、Ｃｈ　２−１　（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ　　ｓｐ、Ｎｏ、Ｃｈ　２−１）と命名し、工業技
術院微生物工業技術研究所に菌奇第６２１７号（ＦＥＲ
Ｍ　−Ｐ　Ｎｏ、６２１７　）として既に寄託されてい
る。

本酵素を培養液中に生成蓄積せしめるには、栄養培地に
炭素源としてグルコース、トレハロース等の糖類を、窒
素源としては肉エキス、ペプトン、酵母エキス等の有機
物を用いることができる。

尚、３α−Ｈ３ＤＨの生産にはステロイド類の添加が夕
・要であり、コレステロール、β−シトステ０−ル等を
加えることが好ましい。又、無機物としては、リン酸、
マグネシウム、カリウム等が挙げられるが、培地成分は
上記成分に限定されることなくその他の成分も任意に用
いることができる。

培養は上記成分を含む培地で、２０〜４０℃付近、好気
的条件下で行うことが好ましい。

かくして１５〜４８時間程度で目的物３α−Ｈ３ＤＨの
蓄積量は最大となる。本酵素は菌体内に蓄積する為、次
にこれを抽出精製する。これは種々の公知の方法により
達成され、例えば得られた培養液を一過助剤により濾過
するか、遠心分離により菌体を集めた後菌体を乳鉢、ダ
イノミル、フレンチプレス、超音波等により破砕して菌
体内の３α−Ｈ３ＤＨを抽出せしめる。しかるのち、こ
の抽出液をウルトラフィルトレージョンによる濃縮又は
硫安塩析法、有機溶剤沈澱法、透析法などの方法を駆使
することによって粗酵素液となす。

以上のようにして得た粗酵素は、イオン交換クロマトグ
ラフィーによる吸着及び溶出２分子量の差に基づくゲル
濾過法、疎水結合クロマトグラフイー法、アフイニテイ
クロマトグラフイー法、電気泳動法など一般的な酵素の
精製法を適宜選択、組み合わせて精製される。

このようにして得られた、本発明の３α−Ｈ３ＤＲの理
化学的性質は次のとうりである。

０作用 補酵素（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ）の存在下、ステロイドの３
α位水酸基を脱水素し、３−ケトステロイドを生成させ
る。

■基質特異性 デオキシコール酸、リトコール酸によく作用する。５α
−ステロイドと５β−ステロイドに対する反応性は等し
い。結果を第１表に示す。

（以下　余白） 第１表 ■至適ｐＨ 至適ｐＨはｐＨ８，２〜８．８である。

結果を第１図に示す。

■安定ｐＨ 安定ｐＨ範囲は４０℃、１５分処理で、ｐＨ６，０〜１
０．０である。結果を第２図に示す。

■至適温度及び熱安定性 至適温度が５５〜６０℃であり、ｐ　Ｈ８，５，２０分
処理では４０℃まで１００％の残存活性があり、５０℃
に保存しても６０％の活性を示す。結果を第３図及び第
４図に示す。

■阻害、活性及び安定化 ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、モノヨード酢酸等
のＳＨ試薬により殆ど阻害されない。又、ＲＤＴＡ、２
価の金属イオンも活性に影響を与えない。結果を第２表
に示す。

（以下　余白） 第２表 性を１００として算出した。

■Ｋｍ値 コール酸１．４Ｘ　１０−４　Ｍ　　、デオキシコール
酸１．７Ｘ　１０−５　Ｍ、タウロコール酸７．１Ｘ　
１０−５　Ｍ。

β−ＮＡＤ　７．４ｘｌＯ−５Ｍである。

■分子量 セファデックスＧ−１００（登録商標、ファルマシア社
１１）を用いたゲル濾過法により測定した結果、分子量
約５８．０００である。

■等電点 アンホラインによるショ糖濃度勾配電気泳動により測定
した結果、等電点ｐＴ　４．４である。

［相］精製方法 培養液の菌体破砕液を、４０％硫安塩折する。この沈澱
をリン酸緩衝液に熔解し透析した後、Ｉ）Ｅ牝セファロ
ース（登録商標、ファルマシア社製）カラムに通液し吸
着せしめ、食塩で溶出する。活性画分を限外濾過した後
、リン酸緩衝液で平衡化したアミノへキシルセファロー
ス（登録商標、ファルマシア社製）カラムに通液し吸着
せしめ、食塩で溶出する。更に、限外濾過により濃縮し
た活性画分をセファデックスＧ−１００（登録商標、フ
ァルマシア社製）でゲル濾過を行い、次いで脱塩濃縮し
て本酵素を得る。

■活性測定法 コール酸ナトリウム（半井化学製）溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｅ）　０．５　ｉｆ、β−ＮＡＤ　（オリエンタル酵母
製）溶液（３０ｍｇ／＋ｍ）　０．１−１０．１　Ｍ　
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）　２．８−を石英セル
にとり、これに酵素液０．０２艷を添加し３７℃で反応
させ、３４００ｍに於ける吸光度増加を測定する。

１単位とは１分間に１マイクロモルのＮ　Ａ　Ｄ　Ｉ（
を生成する酵素量を示す。

以上のように本発明の３α−ＨＳ　Ｄ　Ｈハ、シュ−ド
モナス・テストステロニー、シュードモナス・プチダ及
びバチルス・スフエリカス由来の３α−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼと多くの点で異なっている。こ
れらの比較を第３表に示す。

（以下　余白） 第３表 由来 酵素■　シュードモナス・ブチグー由来酵素■　バチル
ス・スフエリカ由来 第３表から明らかなように、本酵素は至適ｐＨが他の酵
素と比較して低いこと、ＳＨ試薬や金属イオンの影響を
全く受けず非常に安定であること、デオキシコール酸と
アンドロステロンの活性比は１：１であることなどから
、本発明の３α−Ｈ３ＤＨは従来のいずれの酵素とも性
質を異にしており、新規なものと断定できる。

又、本酵素は前記の精製方法により胆汁酸測定で問題と
なる夾雑酵素、例えば３β、７α、１２α。

１７α−ステロイドデヒドロゲナーゼ等を除去すること
が可能であり、酵素使用量が少量であることと相まって
３α−ステロイドのみを特異的に定量することができる
。

次に、本発明の３α−Ｈ３ＤＲの実施例及び試験例を示
すが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

実施例Ｉ Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ、Ｎｏ、Ｃｈ　２−１　　（Ｆ
ＥＲＭ　−Ｐ　Ｎｏ、６２１７　）をグルコース５ｇ／
ｊ！、肉エキス５ｇ／Ｃ酵母エキス０．２ｇ／４及び少
量の消泡剤よりなる培地（ｐ　Ｈ７，２）　２００　ｙ
ｎＲを入れた５００−容の坂ロフラスコに麹菌し、３０
℃で２４時間振盪培養した。この種培養液ヲコレステロ
ール５　ｇ／７！、グルコース２ｇ／１２．肉エキス５
　ｇ／Ｌ　　リン酸水素カリウム５　ｇ／Ｉ１．硫酸マ
グネシウム０．２ｇ／１．及び消泡剤０．５ｇ／ｊ２の
組成より成る培地（ｐＨ７，２）　２０βを入れた３０
７！容ジヤーフアメンターに植菌し、３０℃で通気攪拌
しながら４０時間培養した。培養液を遠心分離し、得ら
れた菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁
しガラスピーズにより菌体を破砕した。これを１０００
ｐ、ｐ、、、で１０分間遠心分離し清澄な菌体抽出液を
得た。次に、硫酸アンモニウムを４０％飽和になるよう
に加え酵素を沈澱せしめ、この沈澱を遠心分離で集め２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）１００−に溶解した
。更に、セロファンチューブで上記と同様の緩衝液にて
１５時間透析し、粗酵素液を得た。

この粗酵素液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で
平衡化したＤＥＡＥセファロース（登録商標、ファルマ
シア社製）１００−を充填したカラムに通液し、酵素を
吸着せしめた。洗浄後、上記緩衝液中の食塩濃度を連続
的に上昇せしめる溶出法（食塩濃度θ〜０．５　Ｍ）に
よりクロマトグラフィーを行い活性画分を得た。活性画
分は限外濾過膜により脱塩・濃縮した。この濃縮液を２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したアミノ
へキシルセファロース（登録商標、ファルマシア社製）
　５０ｒｎＰ、を充填したカラムに通し、吸着した酵素
は０．１Ｍ食塩を含む同緩衝液で洗浄後、食塩濃度をＯ
〜０．４Ｍに連続的に上昇させる溶出方法により精製し
た。更に、この活性画分を限外濾過法により濃縮した後
、０．２Ｍ食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｌ＋８
．０　）で平衡化したセファデックスＧ−１００（登録
商標。

ファルマシア社製）２．２　Ｘ９０■でゲル濾過を行っ
た。再び限外濾過により脱塩・濃縮した後、７．５％ア
クリルアミド（ｐＨ８，９）によるスラブ電気泳動を行
ったところ、本精製により得られた３α−Ｉ（ＳＤＲは
単一なバンドを示した。

実施例２ 実施例１で得られた培養ろ液に、ＤＢＡＩ！セルロース
（セルバ社製）を適量加え、１時間攪拌した後ろ紙で濾
過した。　ＤＥＡＲセルロースに吸着した３α−Ｈ３Ｄ
Ｈは０．３Ｍ食塩水で溶出せしめた後、この液をオクチ
ルアガロースカラム（５０ｍｌ！容量）定容量し、吸着
させた。洗浄後、１％コール酸ナトリウムを含む１Ｍ食
塩水にて溶出し、溶出液はウルトラフィルトレージョン
法により脱塩、濃縮した。更に、セファデックスＧ−２
５（登録商標、ファルマシア社製）により脱塩した。こ
の精製法により得られた３α−Ｈ３ＤＲは、電気泳動で
単一なバンドを示した。

試験例１ 実施例１で得られた３α−Ｈ３ＤＨを用い胆汁酸の定量
を行った。

β−ＮＡＤ　（オリエンタル酵母製）　　４ｐ　　ｍｏ
ｌｅ　。

トリトンＸ−１００（片山化学製）　１．５　ｍｇ、　
３　ｃｘ　−ＨＳ　Ｄ　ＨＯ，２単位を含む０．１Ｍ）
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）　　３−に、種々の濃度
のコール酸ナトリウム（半井化学製）溶液を０．１−加
え、３７℃で１０分間反応後、３４０ｎｍにおける吸光
度を測定した。

第４表に示すように、良好な結果が得られた。

第４表 β−ＮＡＤ　（オリエンタル酵母製）４μ　ｍｏｌｅ。

トリトンＸ−１００（片山化学製）　１．５１ｎＬ　３
α−ＨＳ　Ｄ　ＨＯ，２単位、ニトロテトラゾリウムブ
ルー（同位化学製＞　０．０５ｍｇ、ジアホラーゼ（天
野製薬製）３単位を含む０．１Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ１８゜５）３−に、種々の濃度のコール酸ナトリウム
（半井化学製）ｉ９液を０．１−加え、３７℃で１０分
間反応後、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。

第５表に示すように、良好な結果が得られた。

第５表 ３α−Ｈ３ＤＲ（液状品及び凍結乾燥粉末（活性３単位
／ｍｇ））の経時的安定性を、４℃の条件で行った。

第６表に、液状品の各ｐＨに於ける安定性及び凍結乾燥
粉末の安定性を相対活性（％）で示す。

表から明らかなように、３α−Ｈ３ＤＲは長期間にわた
り活性を保持していることが判る。

（以下　余白） 第６表 発明の効果 本発明の３α−Ｈ３ＤＨは、従来の酵素に比べ至Ｗ！Ｌ
ｐＨが低い為、使用する酵素の微量化に伴うコストの大
幅な減少をうろことができる他、キット中“に存在する
補酵素（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ）の安定な条件下で胆汁酸を
測定することができる。

更に、ＳＨ試薬、金属イオンの影響を全く受けず且つ安
定性が高い為、試薬保存性に優れるなどの利点を併せも
つ酵素として生体体液中の胆汁酸の定量に有利に応用す
ることができ、正確な検査データを提供することが可能
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の３α−Ｈ３ＤＨのｐＨと活性の関係
を示す図である。 第２図は、本発明の３α−Ｈ３ＤＨのｐＨと安定性の関
係を示す図である。 第３図は、本発明の３α−Ｈ３ＤＲの反応温度と活性の
関係を示す図である。 第４図は、本発明の３α−Ｈ３ＤＲの温度と安定性の関
係を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有する３α−ヒドロキシステロ
   イドデヒドロゲナーゼ。 （１）作用 補酵素（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ）の存在下、ステロイドの３
   α位水酸基を脱水素し、３−ケトステロイドを生成させ
   る。 （２）基質特異性 デオキシコール酸、リトコール酸によく作用する。 （３）至適ｐＨ 至適ｐＨはｐＨ８．２〜８．８である。 （４）安定ｐＨ 安定ｐＨ範囲は４０℃、１５分処理で、ｐＨ６．０〜１
   ０．０である。 （５）至適温度及び熱安定性 至適温度が５５〜６０℃であり、ｐＨ８．５、２０分処
   理では４０℃まで１００％の残存活性があり、５０℃に
   保存しても６０％の活性を示す。 （６）Ｋｍ値 コール酸１．４×１０＾−＾４Ｍ、デオキシコール酸１
   ．７×１０＾−＾５Ｍ、タウロコール酸７．１×１０＾
   −＾５Ｍ、β−ＮＡＤ７．４×１０＾−＾５Ｍである。 （７）分子量 セファデックスＧ−１００（登録商標、フアルマシア社
   製）を用いたゲル濾過法により測定した結果、分子量約
   ５８，０００である。 （８）等電点 アンホラインによるショ糖濃度勾配電気泳動により測定
   した結果、等電点ｐＩ４．４である。 ２、ノカルジア属に属する３α−ヒドロキシステロイド
   デヒドロゲナーゼ生産菌を培養し、培養物中に３α−ヒ
   ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを生成蓄積せしめ
   、該培養物からこれを採取することを特徴とする３α−
   ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの製造法。 ３、ノカルジア属に属する菌株がノカルジア・エスピー
   Ｎｏ．Ｃｈ２−１（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ．Ｎｏ．Ｃ
   ｈ２−１）ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ．６２１７である特許請
   求の範囲第２項記載の３α−ヒドロキシステロイドデヒ
   ドロゲナーゼの製造法。