JPS6365312B2

JPS6365312B2 -

Info

Publication number: JPS6365312B2
Application number: JP6691379A
Authority: JP
Priority date: 1979-05-31
Filing date: 1979-05-31
Publication date: 1988-12-15
Also published as: JPS55159800A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はリボフラビン含有醗酵ブロスからのリ
ボフラビンの回収方法に関するものである。

本発明の出発物質はリボフラビン含有醗酵ブロ
スである。醗酵ブロスからのリボフラビンの調製
は知られている。すなわち、醗酵ブロスを用いる
リボフラビンの調製は、米国特許第2387023号
（1945年10月16日発行）、第2445128号（1948年７
月13日発行）、第2483855号（1949年10月４日発
行）及び第2571896号（1951年10月16日発行）に
記載され、従来公知の技術である。簡単に云えば
栄養培地を滅菌し、リボフラビンを生産すること
ができる微生物を接種するのである。具体例を示
せば、以下の２種の方法によりリボフラビン醗酵
ブロスは調製される。

500mlフラスコにグルコース４ｇ、コーンス
テイープリカー（corn steep liquor）0.5ｇ
（乾燥重量）及びペプトン０〜2.0ｇを加える。
水を全量100mlになるようにフラスコに加える。
水酸化ナトリウムを用いて、PHを6.5に調節す
る。フラスコは15lb／in²ゲージ圧（1.1Kg／cm²）
で30分間蒸気滅菌される。後、冷却され、活性
培養物アシビアゴシピー（Ashbya gossypii）
が加えられる（１容量％）。次いでフラスコは
揺動器で揺動させながら29℃で８日間培養され
リボフラビンが精製される。

500mlフラスコにグルコース４ｇ及びコーン
ステイープリカー0.5ｇ（乾燥重量）が加えら
れる。酸加水分解されたタンケージ
（tankage）0.25〜0.75ｇが加えられる。（酸加
水分解は2N塩酸50ml中タンケージ10ｇを121℃
で30分オートクレーブ処理により行なわれる。）
PHが6.5に調節され、全量が100mlになるように
水が加えられる。15lb／in²ゲージ圧（1.1Kg／
cm²）で30分間滅菌した後、フラスコは冷却され
活性培養物アシビアゴシピーが加えられる（１
容量％）。29℃で８日間揺動させながら培養さ
れリボフラビンを生成させる。醗酵収量がほぼ
最大になつた時、或は最大になりつつある時、
ブロスを約50℃から約65℃の温度に約15分ない
し約45分間、好ましくは約25分ないし約35分間
加熱し、リボフラビンの回収を始める。この加
熱は細胞を溶解し、ブロスの粘度を減少させる
のに役立つので、ひき続いての回収及び精製段
階での効率を高める。45分間を越える加熱はブ
ロスの粘度を減少させるよりもむしろ増加させ
るので好ましくない。

次いでこのブロスを冷却し、予め決めた量の水
で稀釈する。水の量はブロス中に懸濁している固
型物を溶かすには不十分であるが、ブロス中に予
め溶解している固型物を稀釈し、結晶状リボフラ
ビンより軽い比重を有する固型の懸濁粒子の分離
を高めることによつて遠心による分離を至適にす
るのに十分であるように選ぶ。典型的には、添加
する水の量は醗酵ブロスの液量の約25ないし約
100容量％であり、好ましくは醗酵ブロスの約1/3
ないし約1/2の液量である。

加熱中に蛋白分解酵素が存在していてもよい
し、加熱後に加えてもよい。この酵素で数時間、
一般には約１時間ないし約５時間、好ましくは約
３時間ないし約４時間蛋白様物質を分解させる。
酵素処理の間、PHは酵素の働きが最大になるよう
な水準、一般には約6.0から約9.0のPH、に調節す
る。

次いでブロスを冷却し、もしアルカリ性ならば
PHが7.0になるように調節する。

酵素処理した、或は未処理の稀釈したブロスを
次に遠心によつてスラツジにする。

次いでこのスラツジを予め定めた量の水に再懸
濁する。使用する水の量は再懸濁したスラツジ中
の懸濁した固型物を溶かすには不十分であるが結
晶状リボフラビンの比重よりも軽い固型粒子の分
離を至適にするのに十分であるように選ぶ。典型
的には、この水の量はスラツジの容量の約１ない
し約３倍の容量であり、好ましくはスラツジの容
量の２倍の容量である。固型物の量でいえば、再
懸濁したスラツジは約15ないし約30重量％の固型
物を含有する。

次いでこの再懸濁したスラツジを遠心分離し
て、そのままで動物飼料追加物として使用し得る
遠心分離物をつくる。

本発明の実施に適した酵素の例としてビー・ズ
ブチリス（B.Subtilis）プロテアーゼ、ビー・リ
グニノホルミス（B.ligninoformis）プロテアー
ゼ及びビー・アミロフアシエンス（B.
amylofaciens）プロテアーゼ等のアルカリ性プ
ロテアーゼ、又は中性ビー・ズブチリス（B.
Subtilis）プロテアーゼ等の中性プロテアーゼが
あげられる。そのような酵素は市販されており、
例えば適当なアルカリ性プロテアーゼ酵素として
ロームアンドハース社のロジーム（Rhozyme）
Ｐ−62、適当な中性プロテアーゼ酵素としてエン
ザイムデベロプメント社のエンゼコバクテリ
アルプロテアーゼがあげられる。

以下の実施例は、本発明を例示するものである
がその実施例だけに制限するものではない。別記
しない限り温度はすべて摂氏で表示してある。

実施例１１リツトルのリボフラビン醗酵ブロスを醗酵完
了後30分間60゜に加熱する。

次いでこのブロスを25℃に冷却し、蒸留水で
1.4リツトルに稀釈する。稀釈したブロスを遠心
分離し、遠心分離物を２倍量の水に再懸濁し、再
び遠心分離する。得られた遠心分離物の純度は未
処理の乾燥醗酵ブロスの３倍であり、それ以上処
理することなく動物飼料追加物として使用できる
だけの十分な純度を有する。

実施例２１リツトルのリボフラビン醗酵ブロスを醗酵完
了後60゜に加熱し、次いで3.65カゼイン単位活性
を有するビー・ズブチリス（B.Subtilis）アルカ
リ性プロテアーゼ0.068ｇアリクオート
（aliquot）を加え、３時間反応させる。１カゼイ
ン単位は、270ｇのアゾカゼインを１時間、40゜、
PH8.0で可溶化する１ｇの酵素の能力として定義
される。加熱後このブロスを25゜に冷却し、PH7.0
に中和し、蒸溜水で1.4リツトルに稀釈する。稀
釈したブロスを遠心分離し、遠心分離物を２倍容
の水に再懸濁し、再び遠心分離する。得られた遠
心分離物の純度は実施例１のものより20％改善さ
れている。

実施例３リボフラビン醗酵ブロスの試料を実施例２と全
く同様に処理する。

但しビー・ズブチリス（B.Subtilis）アルカリ
性プロテアーゼの代りに0.48ｇの3.0アンソン単
位活性のビー・リグニノホルミス（B.
ligninoformis）アルカリ性プロテアーゼを使用
する。１アンソン単位は１ｇの酵素より10分間、
25゜；PH10.1で消化されるヘモグロビンのグラム
数（トリクロロ酢酸を添加しても沈澱しないも
の）として定義される。酵素処理したスラツジの
純度は酵素処理しないスラツジよりも27％改善さ
れている。酵素処理したスラツジは、未処理の乾
燥醗酵ブロスよりも3.4倍純粋である。醗酵ブロ
スの酵素処理は、醗酵容器中で加熱滅菌処理と同
時に行うことも可能であり、その場合同じ結果が
得られる。

実施例４ 553mlの殺菌したリボフラビン醗酵ブロスに10
mlのビー・ズブチリス（B.Subtilis）（ナシヨナ
ルコレクシヨンタイプカルチヤー第3610号）
栄養ブロスシードカルチヤーを接種する。37゜
で48時間醗酵を続けさせる。醗酵中に懸濁固型物
は72％減少する。このビー・ズブチリス（B.
Subtilis）醗酵ブロスを加熱し、水で750mlにう
すめ遠心分離する。遠心分離物を200mlの水に懸
濁し、再び遠心分離する。この遠心分離物はビ
ー・ズブチリス（B.Subtilis）醗酵処理しないコ
ントロールよりも、更に53％純粋であり、乾燥醗
酵ブロスよりも4.4倍純粋である。

実施例５遠心分離する前に再懸濁した遠心分離物をPH
8.0にし、60゜に加熱することを除き実施例１と同
じ操作を繰り返す。3.65カゼイン単位の活性をす
る0.049ｇのビー・ズブチリス（B.Subtilis）アル
カリ性プロテアーゼ酵素を加え、３時間反応させ
る。このスラリーを冷却し、中和し、遠心分離す
る。遠心分離物は醗酵処理を受けないコントロー
ル試料よりも純度が41％高くなつている。同一醗
酵バツチの同じブロスに行つた均等の醗酵処理で
はコントロールに比較して純度が20％増加してい
るに過ぎなかつた。

Claims

【特許請求の範囲】１リボフラビンの醗酵収量がほぼ最大になつた
時に約15分ないし約45分間、約50℃から約65℃に
醗酵ブロスを加熱し、この醗酵ブロス中に懸濁し
ている固型物を溶解させるには不十分であるが、
予め溶解している固型物を稀釈し、結晶状リボフ
ラビンより軽い比重を有する固型の懸濁粒子の遠
心による分離を可能にすることによつて分離を最
適化するのに十分な量の水を醗酵ブロスに加え、この加えた量の水を含有する醗酵ブロスを遠心
してスラツジをつくり、懸濁した固型物を溶かす
のには不十分であるが、結晶状リボフラビンより
軽い比重を有する固型の粒子の分離を最適化する
のに十分な量の水にこのスラツジを再懸濁し、この再懸濁したスラツジを遠心分離して、その
ままで動物飼料追加物として使用し得る精製され
たリボフラビン含有の遠心分離物を得る、ことから成るリボフラビン含有醗酵ブロスからの
精製リボフラビンの回収方法。２醗酵ブロスに加える水の量が、醗酵ブロスの
最初の液量の約25容量％から約100容量％である
特許請求の範囲第１項記載の方法。３醗酵ブロスに加える水の液量が、醗酵ブロス
の最初の液量の約1/3ないし約1/2である特許請求
の範囲第１項記載の方法。４スラツジを再懸濁するのに用いる水の液量
が、スラツジの容量の約１ないし約３倍である特
許請求の範囲第１項記載の方法。５醗酵ブロスを遠心分離してスラツジにする前
に、リボフラビンには影響しないが、蛋白様物質
を可溶化するか、或は蛋白様物質を遠心によつて
分離ができるように比重の減少した物質に変える
のに有効な蛋白分解酵素によつて処理する特許請
求の範囲第１項記載の方法。６再懸濁したスラツジを遠心する前に蛋白分解
酵素によつて処理する特許請求の範囲第１項記載
の方法。