CN117089535A - 一种羟甲基转移酶的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羟甲基转移酶的生产方法，包括以下步骤：摇瓶菌种；高压灭菌，采用LB培养基的摇瓶接种，培养周期10～16h；发酵罐培养；向罐内通空气，开冷水进行降温，待罐温冷却后开始接种；接种前对周围环境进行消毒，在火焰保护下迅速将抗性、摇瓶种液、乳糖倒入罐内，上好接种帽，立即通入空气培养；羟化酶酶活的测定：经过均质机、离心机、去上清液、Ni2+柱、纯化酶液等工序后用SDS‑PAGE电泳检测羟化酶的纯度；含酶全细胞的包埋：将发酵液用陶瓷膜过滤，离心弃去上清液获得酶源，将酶源加入生理盐水制成菌悬液，加入包埋液中搅拌，将混合均匀的包埋液缓慢滴入到固定化釜中成型；通过上述技术方案，可以有效解决背景技术中的问题。
Description
技术领域
本发明涉及酶合成技术领域，特别涉及一种羟甲基转移酶的生产方法。
背景技术
羟甲基转移酶是一种催化5，10-亚甲基四氢叶酸与羟甲基受体反应的酶。如酶EC2.1.2.1、EC2.1.2.7、EC2.1.2.8(酶的国际系统命名)分别催化甘氨酸、D-丙氨酸、脱氧胞苷酸羟甲基化，形成丝氨酸、2-甲基丝氨酸、5-羟甲基脱氧胞苷酸和四氢叶酸；生物催化转化法可以替代传统的化学提取工艺，得到高纯度的L-羟脯氨酸产品，可以实现规模化生产；
为提高生产L-羟脯氨酸产品中使用的羟甲基转移酶的制备量，需要对羟甲基转移酶生产工艺及培养物作一定的优化。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种羟甲基转移酶的生产方法，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种羟甲基转移酶的生产方法，包括以下步骤：
S1、摇瓶菌种；高压灭菌，采用LB培养基的摇瓶接种，培养周期10～16h；
S2、发酵罐培养；向罐内通空气，开冷水进行降温，待罐温冷却后开始接种；接种前对周围环境进行消毒，在火焰保护下迅速将抗性、摇瓶种液、乳糖倒入罐内，上好接种帽，立即通入空气培养；
S3、羟化酶酶活的测定：经过均质机、离心机、去上清液、Ni2+柱、纯化酶液等工序后用SDS-PAGE电泳检测羟化酶的纯度；
S4、含酶全细胞的包埋：将发酵液用陶瓷膜过滤，离心弃去上清液获得酶源，将酶源加入生理盐水制成菌悬液，加入包埋液中搅拌，将混合均匀的包埋液缓慢滴入到固定化釜中成型，固定化釜静置获得固定酶源，用抽滤器抽滤、去离子水洗得到固定化细胞。
其中，培养基的配方为：葡萄糖2％；酵母浸粉0.5％；硫酸铵0.5％；磷酸二氢钾0.1％；氯化钠0.2％硫酸镁0.02％；硫酸亚铁0.01％；pH6.8～7.2；
其中，异丙基-B-D-半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，将种子液接种于发酵培养基中，摇菌，向培养瓶中分别加入诱导剂乳糖；
其中，诱导剂乳糖的诱导时间为5h～13h；
其中，胁迫优化菌种上罐的温度为45°～60°。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：通过优化培养基增加了菌体量增加了酶的含量，由原来的1％增加到2％；在中试罐上通过优化空气流量在1：0.5～1：1.5，调节搅拌转速200～600转/分，综合调控溶氧在10％～40％，分阶段控制氧气的浓度，在线流加氨水控制pH，补加培养基，流加70％葡萄糖，补加抗性、异丙基-B-D-半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂等多项措施综合使用，提高菌体密度，使菌量由2％提高到5％，最高可达6％。
附图说明
图1为本发明一种羟甲基转移酶的生产方法的工艺流程示意图；
图2诱导剂乳糖的浓度对表达量的影响；
图3诱导时间对表达量的影响；
图4表面活性剂种类及浓度优化；
图5顺式-L-羟基脯氨酸和L-脯氨酸标品；
图6反式-L-羟基脯氨酸、顺式-L-羟基脯氨酸和L-脯氨酸标品；
图7酶催化转化反应液；
图8不同批次固定化羟化酶催化L-脯氨酸的转化率与残余酶活；
图9不同批次包埋细胞催化L-脯氨酸的转化率与残余酶活；
图10不同底物浓度的转化率。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
如图1所示的一种羟甲基转移酶的生产方法，包括以下步骤：
S1、摇瓶菌种；高压灭菌，采用LB培养基的摇瓶接种，培养周期10～16h；
S2、发酵罐培养；向罐内通空气，开冷水进行降温，待罐温冷却后开始接种；接种前对周围环境进行消毒，在火焰保护下迅速将抗性、摇瓶种液、乳糖倒入罐内，上好接种帽，立即通入空气培养；
S3、羟化酶酶活的测定：经过均质机、离心机、去上清液、Ni2+柱、纯化酶液等工序后用SDS-PAGE电泳检测羟化酶的纯度；
S4、含酶全细胞的包埋：将发酵液用陶瓷膜过滤，离心弃去上清液获得酶源，将酶源加入生理盐水制成菌悬液，加入包埋液中搅拌，将混合均匀的包埋液缓慢滴入到固定化釜中成型，固定化釜静置获得固定酶源，用抽滤器抽滤、去离子水洗得到固定化细胞。
具体工艺流程如下：
A：摇瓶菌种培养基配置；摇瓶菌种培养基采用LB培养基，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠7g和水搅拌溶解，定溶到1000ml，分装到9cm双碟、50ml、500ml摇瓶。装量15ml、20ml、100ml，高压灭菌锅灭菌。温度120～121℃灭菌20分钟。备用。
B：接种；从-80℃冰箱拿出甘油管，在双碟上划线，培养箱培养，挑取单菌落接入20ml摇瓶培养，从50ml吸取5ml到500ml摇瓶培养两瓶，长好后接入发酵罐培养；
培养温度：28～30℃；
培养周期10～16h。
培养过程中，取样检查菌丝形态、pH值、透光率。
C：羟化酶的发酵制备；在30L发酵罐中加入葡萄糖1.4kg，酵母浸粉0.7kg，氯化钠1.05kg和水搅拌均匀，定溶到16L，上好罐盖。控制温度120～122℃，灭菌20～30分钟。向罐内通空气，开冷水进行降温，待罐温冷却后开始接种。接种前对周围环境进行消毒，在火焰保护下迅速将抗性、摇瓶种液、乳糖倒入罐内，上好接种帽，立即通入空气培养。
罐温：25～29℃；
流量：接种后空气流量按照周期分阶段控制在10L/min*m3发酵液以上，培养周期45～48h。
培养过程中，取无菌样和生化样检查菌丝形态、pH值、透光率，移种2小时前，镜检判断是否染菌，移种前取样测定pH、透光率。
在此发酵过程中，流加氨水pH保持在6.8～7.0，流加70％葡萄糖，用消泡剂消除泡沫得到培养好的酶原。离心过滤收集固体菌体物，用于固定化酶的制备，过滤的废液直接进入到污水处理装置。
D：羟化酶酶活的测定；取发酵液10ml于12000r/min离心5min，弃上清液，收集菌体，将菌体重悬于1mlpH7.5、20mmol/LTris-HCl中用超声波破碎仪破碎菌体，破碎功率200W，破碎时间10min(超声波5s，间隔10s)，12000r/min离心5min，收集上清液，即为粗酶液。
E.coliBL21/pET-M-3C表达的重组蛋白带有6-His标签，采用Ni2+亲合层析柱纯化。用pH7.8的20mmol/L磷酸盐缓冲溶液平衡Ni2+柱，上样体积为3ml，用pH7.8的10mmol/L咪唑溶液6～9ml洗涤，去除杂蛋白，再用pH7.8的200mmol/L咪唑溶液洗脱，得到纯化酶液，收集流出液一般3ml左右冷藏备用。收集液经冷冻干燥后得到羟化酶冻干粉。
冻干粉加入缓冲液溶解后可用SDS-PAGE电泳检测羟化酶的纯度。含量的测定方法，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白，用紫外分光光度计在595nm下测定比色值(OD595)，根据比色结果制作羟化酶含量标准曲线。
同样蛋白浓度下，对羟化酶进行转化活性测定，反应液中加入80mMMES缓冲液，4mM-脯氨酸，8mM2-酮戊二酸，2mM硫酸亚铁，4mM抗坏血酸，35℃反应10min。转化液经衍生化反应于HPLC一并检测分析。
固定化细胞菌采用同样方法进行酶活性检测。
结果显示，在SDS-PAGE电泳中31kDa处呈现出单一清晰条带，纯化蛋白含量约为0.147mg/mL。1g湿菌体酶活性在22.0U/g，1mg纯蛋白酶活在1.63U/mg，计算出1g重组大肠杆菌湿细胞大概可得到13.5mg的纯酶。转化40mML-脯氨酸的转化率可达到98％。
含酶细胞提取及固定化
E：含酶全细胞的包埋(固定化)；将发酵液用陶瓷膜过滤收集菌体1.1kg，离心弃去上清液，获得酶源。将酶源加入0.9％的生理盐水，制成含菌量80％的菌悬液1.4L。
加入7L融化好的包埋液中，搅拌20～30分钟。包埋液含5％的海藻酸钠和2％的聚乙烯醇，将混合均匀的包埋液缓慢滴入到固定化釜中成型。
固定化釜中含有等体积0.1M的CaCl2溶液，静置3～4小时，固定酶源完成。用抽滤器抽滤、去离子水洗得到固定化细胞。
其中培养基、诱导剂优化实验如下：
(1)基础培养基的优化
在小试阶段酶源诱导培养基用LB培养基，由于酵母粉和蛋白胨营养成分复杂而且贵重，工业化用量较大，原材料质量即使同一公司产品质量也很难稳定，会造成生产不稳定。改用价格较低成分单一的葡萄糖做碳源，硫酸铵做氮源，加入少量酵母粉，磷酸二氢钾等微量元素通过正交试验确定了培养基的各种营养成分和配比：
A.优化氮源
以酵母膏、蛋白胨和硫酸铵；作为氮源，采用Lg(33)正交表进行试验。
表1
B.优化无机盐
实验选择了K2HPO4、KH2PO4、Mg2SO4、FeSO4四种无机盐，进行了以Lg(34)正交表设计实验。
表2
通过正交试验，确定了培养基的最优配方为：葡萄糖2％；酵母浸粉0.5％；硫酸铵0.5％；磷酸二氢钾0.1％；氯化钠0.2％硫酸镁0.02％；硫酸亚铁0.01％；pH6.8～7.2
通过优化培养基增加了菌体量增加了酶的含量由原来的1％增加到2％增加了一倍。
(2)胁迫优化菌种上罐
基因工程菌扩培上罐，质粒丢失导致发酵失败是工程菌放大的一个共同的难题，为了解决这一难题利用温度胁迫实验解决。利用正交试验方法Lg(34)。
表3温度胁迫正交试验表
通过很多实验找到了适合胁迫的菌体浓度和温度和处理时间，使得基因工程菌中试实验成功实现。
(3)菌体培养及诱导工艺条件优化
在中试罐上通过优化空气流量在1：0.5～1：1.5，调节搅拌转速200～600转/分，综合调控溶氧在10％～40％，分阶段控制氧气的浓度，在线流加氨水控制pH，补加培养基，流加70％葡萄糖，补加抗性等多项措施综合使用，提高菌体密。使菌量量由2％提高到5％，最高可达6％。
A.诱导剂的优化
异丙基-B-D-半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，但IPTG成本高并污染环境，工艺控制条件苛刻，不适于工业生产。我们在长期中试工作的基础上，摸索了以乳糖代替IPTG诱导重组蛋白的发酵工艺。与IPTG不同的是，乳糖在其中既是碳源又是诱导剂，乳糖诱导在葡萄糖消耗完后开始，这一非常重要的调控机制使得葡萄糖的流加工工艺得以实，通过努力基本能用乳糖完全代替IPTG，并达到相当好的效果。
B.诱导剂乳糖的浓度对表达量的影响
将种子液按1％的比例接种于发酵培养基中，28℃140rpm摇菌约2小时A600在0.6～0.8时，向培养瓶中分别加入诱导剂乳糖至终浓度为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％，诱导培养9h，离心收集菌体，按质量体积比1g：100mL(菌体量：转化液)比例向菌体中加入转化液含有200mML-脯氨酸、200mMα-酮戊二酸、6mM硫酸亚铁、6mML－抗坏血酸、80mMpH6.5MES缓冲液及1％SDS，每组实验三个平行实验，做转化进行液相色谱分析分析。实验结果，诱导剂浓度在0.6％～1.2％之间时对其转化率影响不大，成本原则考虑，诱导剂浓度确定为0.8％。
C.诱导剂乳糖的加入时间对表达量的影响
在摇瓶培养时，普遍认为在低菌体浓度下诱导比较合适，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于蛋白表达。
将种子液按1％的比例接种于发酵培养基中，从接种后0h、2h、4h6h、8h、10h、加入诱导剂乳糖8g/L、诱导培养9h，离心收集菌体，按质量体积比1g：100mL(菌体量：转化液)比例向菌体中加入转化液含有200mML-脯氨酸、200mMα-酮戊二酸、6mM硫酸亚铁、6mML－抗坏血酸、80mMpH6.5MES缓冲液及1％SDS，每组实验三个平行实验，做转化进行液相色谱分析分析。实验结果显示乳糖在接种0～10h后加入对转化率影响不大，对OD值没有了0.6～0.8之间的要求，降低了工艺难度，所以采用接种后直接加入乳糖。
D.乳糖诱导时间对表达量的影响
将种子液按1％的比例接种于发酵培养基中，加入诱导剂乳糖至终浓度为8g/L诱导培养，诱导5、7h、9h、11h、13h、15h、离心收集菌体，按质量体积比1g：100mL(菌体量：转化液)比例向菌体中加入转化液含有200mML-脯氨酸、200mMα-酮戊二酸、6mM硫酸亚铁、6mML－抗坏血酸、80mMpH6.5MES缓冲液及1％SDS，每组实验三个平行实验，做OD值测定，做转化进行液相色谱分析。
实验结果分析从5～9小时OD值一直升高，转化率一直升高，11～13小时OD值，开始下降，转化率略有下降变化不明显。所以乳糖的诱导时间确定在11小时，11小时后30分检测一次OD，OD值下降就停止诱导。
2、表面活性剂种类及浓度优化
表面活性剂小试试验一直采用SDS，但用中试罐转化时，由于装料系数加大，直接通入空气，开搅拌，泡沫非常大造成很严重的逃液，加入消泡剂又削弱了SDS的破壁作用，加入没有起泡作用的CCTC用来破壁，进行梯度试验
将种子液按1％的比例接种于发酵培养基中，加入诱导剂乳糖至终浓度为8g/L诱导培养，诱导20h、离心收集菌体，按质量体积比1g：100mL(菌体量：转化液)比例向菌体中加入转化液含有200mML-脯氨酸、200mMα-酮戊二酸、6mM硫酸亚铁、6mML－抗坏血酸、80mMpH6.5MES缓冲液和CCTC分别选择20、24、28；32、37mg/L的终浓度每组三个平行实验做转化进行液相色谱分析。实验结果20、24mg/L的浓度转化率没有影响，37mg/L转化率有降低，考虑生产成本和生产稳定采用25mg/L的浓度实验。
关于采用上述方法制造的羟甲基转移酶在L-羟脯氨酸的生产中的应用：
将固定好的细胞按质量和转化液的体积比1kg：360L加入转化反应釜内，进行酶催化转化。
转化液配制：1400L转化液含L-脯氨酸47.46kg；a-酮戊二酸33.81kg；七水合硫酸亚铁2.338kg；维生素C0.742kg。
过程控制：维持pH6.5～6.7、温度28～30℃下，搅拌140rpm反应，检测L-脯氨酸转化率，流加转化液，40～48h左右，流加到1400L，补加固定化细胞到30kg。L-羟脯氨酸浓度达到37～40g/L，反应结束后进行离心固液分离，获得含羟脯氨酸的转化反应液。反应结束后打入转化液贮罐。
分离、纯化工序
在转化液储罐内开启搅拌加硫酸调节pH值为3.0～3.1；加热至95℃以上，并保温1～2小时；冷却，离心，测pH值3.5～3.6；收集上清液
炭脱工序
采用活性炭吸附技术，去除色素、杂蛋白及其它微量杂质。
利用泵将清液打入装好活性炭的一次脱色釜中，其中炭量为2.5％～3％，搅拌，升温至60～65℃，脱色2h后抽滤，除炭，滤液收集到滤液储罐
提纯、浓缩、结晶、离心
将上步脱色液经浓缩闪蒸器减压浓缩5～6倍，过程中产生蒸汽经浓缩冷凝器冷却后收集到接收水罐中。打入浓缩釜，加入等体积的乙醇，产生絮状蛋白产生，离心收集清液。
将上步浓缩液打入二次浓缩釜，减压浓缩，过程中产生蒸汽经二次浓缩冷凝器冷却后收集到接收罐中。
将上步到达终点的二次浓缩液放入结晶釜中，加入乙醇，夹套通入冷盐水降温结晶。结晶原液放入结晶离心机进行固液分离，得到L-羟脯氨酸粗品，母液收集到结晶母液储罐中。
精制、干燥工序
将L-羟脯氨酸粗品在二次脱色釜中升温到70℃溶解，加入活性炭脱色，经过滤除炭。滤液经二次浓缩釜减压浓缩，过程中产生蒸汽经二次浓缩冷凝器冷却后收集到接收罐中。
浓缩液到达浓缩终点后放入重结晶釜中降温结晶，后经重结晶离心机离心，得L-羟脯氨酸湿品。
将L-羟脯氨酸湿品经双锥真空干燥，得到L-羟脯氨酸产品。
产品鉴定及达到的技术指标
(1)产品标准制定及指标
L-羟脯氨酸产品指标
产品经检测，符合企业标准要求。经用户使用，符合药品生产的要求。
(2)L-羟脯氨酸光学异构体的确认
如下面的HPLC谱图所示，图5为顺式-4-羟基-L-脯氨酸与L-脯氨酸标品，图6为反式-4-羟基-L-脯氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸及L-脯氨酸标品，图7为样品反应液。
从L-脯氨酸转化反应液中可以看到，仅有反式-L-羟脯氨酸生成，酶的催化转化选择性专一。
酶的固定化试验
(1)粗酶液制备：发酵液于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞1g用5mL水重悬，高压均质，破胞得到粗酶液。将粗酶液用冷冻干燥机冻干，即为冻干粗酶粉。
(2)酶的固定化方法一：将1.5％(w/v)海藻酸钠与所得粗酶液混合，在37℃水浴中溶化；充分混匀后，加入1％(v/v)戊二醛，放入摇床摇30min，并于4℃冰箱中静置3h得到混合液。然后将混合液逐滴注入2％(w/v)的氯化钙溶液中，形成凝胶小球；过滤，用0.9％(w/v)氯化钠溶液洗涤两遍，得到固定羟化酶。
(3)酶的固定化方法二：同样用上述细胞处理的方法得到羟化酶粗酶液。将大孔树脂D201GF用去离子水清洗3次，用4％NaOH浸泡4h后去离子水清洗至中性，再用4％HCl浸泡4h后转为Cl型，然后用去离子水清洗至中性，最后用2倍体积以上去离子水浸泡备用。取处理好的大孔离子交换树脂用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬，加入戊二醛溶液至终浓度为0.1％—0.3％，轻轻振动1—5h，然后用去离子水将多余的戊二醛洗掉；按1：5-1：10质量比将交联后的大孔离子交换树脂悬浮于羟化酶粗酶液中，0-16℃固定5—15h，用去离子水洗涤以去除游离酶，即得到固定化的羟化酶。
(4)酶的固定化方法三：同样用上述细胞处理的方法得到羟化酶粗酶液。将大孔树脂D301R用50-60℃热水反复清洗，用3-5％的盐酸浸泡24—48h，水洗至中性，再用3-5％的NaOH浸泡24—48h，水洗至中性，用pH7.5的磷酸缓冲液平衡，用之前再用去离子水冲洗。将壳聚糖溶解在质量分数为10％～15％的醋酸溶液中，得到壳聚糖饱和溶液。将其滴入装有D301R大孔树脂的三口瓶中，负压吸附3—5h，壳聚糖吸附在树脂的内外表面。减压过滤分离载体，用蒸馏水洗至中性，再加入5-8％的戊二醛处理，水洗至中性，真空干燥。将一定量的羟化酶溶于pH4.5磷酸缓冲溶液中，加入一定量制备的大孔树脂壳聚糖膜载体，0-20℃放置5—10h，干燥的固定化羟化酶。(5)固定化方法酶活性测定：
不同方法制备的1g固定化酶，加入终浓度为5g/L的L-脯氨酸的反应体系中，35℃磁力搅拌下反应20min。取反应液衍生后用HPLC检测产物峰面积，根据峰面积计算出产物浓度，计算酶活力，如表4所示。
表4游离酶与不同固定化酶的酶活力
(6)固定化酶的使用频次
在100mL反应缓冲液中加入20g不同方法制备的固定化羟化酶，加入终浓度为200mM的L-脯氨酸，35℃磁力搅拌下反应。反应24h后停止反应，用HPLC测定转化率。反应结束后用纱布进行过滤，滤渣用10mL80％(v/v)的乙醇洗涤三次，过滤，滤渣回收即得固定化酶，测定残余活性并用于下一批次反应。(如表5所示)。
表5不同批次固定化酶催化L-脯氨酸的转化率
由结果看出，固定化酶使用次数还有待提高。
含酶的全细胞固定化试验
(1)全细胞的包埋：发酵液于12000r/min离心5min，弃上清，收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞1g用5mL水重悬，得到菌悬液。
用Bradford法测菌悬液含量为400mg/g。将5％(w/v)海藻酸钠与2％(w/v)聚乙烯醇混合溶化；充分混匀后，加入菌悬液，放入摇床摇30min，并于4℃冰箱中静置3h得到混合液。然后将混合液逐滴注入2％(w/v)的氯化钙溶液中，形成凝胶小球；过滤，用0.9％(w/v)氯化钠溶液洗涤两遍，得到包埋好的固定化细胞。
(2)包埋细胞活性测定：
1g制备的包埋好酶，加入终浓度为200mM的L-脯氨酸的反应体系中，30℃磁力搅拌下反应20min。取反应液衍生后用HPLC检测产物峰面积，根据峰面积计算出产物浓度，计算酶活力，如表6所示。
表6游离酶与固定化酶及包埋细胞的酶活力
通过上表实验看出游离酶活性最高，固定化酶、包埋细胞活性相差不大。
(3)对固定化菌体细胞的使用频次研究
在100mL反应缓冲液中加入20g固定化羟化酶、20g包埋细胞，加入终浓度为200mM的L-脯氨酸，30℃磁力搅拌下反应。反应过程中用HPLC测定转化率至99％或反应24小时后停止反应。反应结束后用纱布进行过滤，滤渣用10mL80％(v/v)的乙醇洗涤三次，过滤，滤渣回收即得固定化酶，测定残余活性并用于下一批次反应。
如图8、图9所示，发现固定化羟化酶重复使用五次后转化率降到71％以下。固定化细胞转化率重复使用五次后仍在92％以上。制备包埋细胞酶活损失少、分离简单、重复利用次数多，反应条件温和，操作简便。选择固定化体细胞使用
(4)固定化的细胞在反应体系中对L-脯氨酸底物浓度的转化研究。
取固定化的细胞1g加入100ml转化液中，反应24小时。转化液中L-脯氨酸的浓度分别为(5、10、20、40、60g/L)，反应结束后，测定L-脯氨酸的转化率。
表7
结果分析：由此方法制作的固定化细胞转化L-脯氨酸40g/L时L-脯氨酸转化率稍有下降，转化率为95％。L-脯氨酸50g/L时转化率降低到72.89％。考虑到羟脯氨酸和脯氨酸提取分离比较困难，故此选择其最优L-脯氨酸转化浓度为40g/L。
转化反应工艺条件优化
(1)在小试阶段菌体培养和诱导都在摇床，在中试罐上通过调节空气流量，搅拌转速的共同作用来优化溶氧量，在线控制pH，优化转化工艺300MM底物48小时转化95％以上.周期缩短了24h。
(2)转化反应流加工工艺的实施和优化
底物α-酮戊二酸的存在使反应体系的pH很低，反应过程中α-酮戊二酸的消耗又会使反应体系pH升得很高。利用中试罐转化，可以在线调节pH，原来反应体系有2.558％的MES和大约7％～9％的Tris来稳定体系的pH，采用底物L-脯氨酸和α-酮戊二酸的流加来调节体系的pH，去掉MES和Tris，大大降低了体系的离子浓度，降低了体系的渗透压，加快了反应速度，底物总浓度48h提高到300MM，L-羟脯氨酸浓度达到37～40g/L，转化率达到95％以上。
L-羟脯氨酸提取
(1)转化液预处理
转化结束后抽滤收集清液，用浓硫酸调pH3.0～3.2，加热到95℃以上，离心除去除杂蛋白收集上清液，一次减压浓缩5-6倍，活性炭脱色，加入等体积乙醇二次除蛋白，二次减压蒸发浓缩，加入乙醇结晶，干燥，成品
(2)液相色谱外标法检测含量：98.0％以上为合格品。
总之，通过优化诱导工艺和转化体系使体系产酶量由原来1％提高到5％，底物浓度由原来的200MM提高到300MM，转化率95％以上，分离纯化得到合格产品。
显然，上述实施例仅仅是为清楚的说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (5)
1.一种羟甲基转移酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、摇瓶菌种；高压灭菌，采用LB培养基的摇瓶接种，培养周期10～16h；
S2、发酵罐培养；向罐内通空气，开冷水进行降温，待罐温冷却后开始接种；接种前对周围环境进行消毒，在火焰保护下迅速将抗性、摇瓶种液、乳糖倒入罐内，上好接种帽，立即通入空气培养；
S3、羟化酶酶活的测定：经过均质机、离心机、去上清液、Ni2+柱、纯化酶液等工序后用SDS-PAGE电泳检测羟化酶的纯度；
S4、含酶全细胞的包埋：将发酵液用陶瓷膜过滤，离心弃去上清液获得酶源，将酶源加入生理盐水制成菌悬液，加入包埋液中搅拌，将混合均匀的包埋液缓慢滴入到固定化釜中成型，固定化釜静置获得固定酶源，用抽滤器抽滤、去离子水洗得到固定化细胞。
2.根据权利要求1所述的一种羟甲基转移酶的生产方法，其特征在于，所述培养基的配方为：葡萄糖2％；酵母浸粉0.5％；硫酸铵0.5％；磷酸二氢钾0.1％；氯化钠0.2％硫酸镁0.02％；硫酸亚铁0.01％；pH6.8～7.2。
3.根据权利要求2所述的一种羟甲基转移酶的生产方法，其特征在于，所述异丙基-B-D-半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，将种子液接种于发酵培养基中，摇菌，向培养瓶中分别加入诱导剂乳糖。
4.根据权利要求3所述的一种羟甲基转移酶的生产方法，其特征在于，所述诱导剂乳糖的诱导时间为5h～13h。
5.根据权利要求4所述的一种羟甲基转移酶的生产方法，其特征在于，所述胁迫优化菌种上罐的温度为45°～60°。
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