CN117024297A - 一种从全细胞转化发酵液中分离纯化维生素b5的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法，属于维生素技术领域。本发明所述方法具体为：(1)比表面积不同的聚苯乙烯吸附树脂XAD‑2和XAD‑16的制备与筛选；(2)利用不同浓度的甲醇溶液对饱和树脂进行洗脱，确定洗脱剂；(3)放大试验和确定工艺路线。最终确立的工艺路线为发酵液经酸化离心、聚苯乙烯树脂吸附饱和、洗脱剂洗脱、净化、转化并经适当放大后结果仍好。此法拥有较为集中的洗脱高峰，所得产品纯度达87％以上，回收率可达95％以上。利用HPLC检测所得精品，检测出的产品纯度为96.5％以上。
Description
技术领域
本发明涉及维生素技术领域，尤其涉及一种从全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法。
背景技术
维生素B5，也称为泛酸或烟酰胺，是辅酶A的关键成分之一。它参与能量代谢、合成重要化合物，维持皮肤健康，促进神经传递，支持免疫系统功能。由于人体无法自行合成维生素B5，因此需要从食物中进行提取。但是，某些如消化系统疾病患者、素食者、长期食用精加工食品等这样的人群容易出现维生素B5缺乏的现象，因此，维生素B5的生产工艺也变得越发重要。
目前，维生素B5的制备方法主要有化学合成法和发酵生产法两种。其中，通过化学合成法生产出的维生素B5存在着成本高、副产物多、难以提纯的问题。维生素B5的发酵生产法主要是从抗生素废液中提取，通过假单胞菌、谷氨酸棒杆菌等发酵和采用拥有转基因的E.coli发酵生产得到。全细胞转化发酵液是近些年来兴起的新型分离纯化方法，筛选出的菌种具有生长快、产率高等优点，同时其产生的维生素B5主要形式为D-泛酸。
目前，维生素的分离方法依赖于毛细管电泳和大孔树脂方法。但毛细管电泳对电泳缓冲液的选择和优化要求较高；样品的预处理和进样要求也较为复杂；同时易受到样品中杂质和离子的干扰。中国专利CN107628963B公开了通过大孔吸附树脂吸附分离，依次经过板框过滤、碳柱过滤和钛棒过滤处理获得维生素B5粗品。但是该方法步骤复杂、处理量小，难以工业化。裴立忠、张延梅等人在《维生素B5提取与结晶工艺优化研究》这项科技成果中，利用酶水解工艺，使用D-泛解酸内酯水解酶水解DL-泛解酸内酯，生成D-泛解酸和L-泛解酸内酯水解液。通过分离提取后得到D-泛解酸，其经过内酯化处理，得到D-泛解酸内酯。同时L-泛解酸内酯经甲醇钠回流处理得到D-泛解酸内酯,D-泛解酸内酯通过一系列反应合成D-泛酸钙，在提取分离工艺中，采用了大孔树脂进行一步提取分离，最终得到维生素B5粗品。但是该方法工艺复杂、步骤繁琐，分离得到的维生素B5纯度不高。与大孔树脂相比，聚苯乙烯树脂具有更好的机械强度和化学稳定性，使得它在吸附分离过程中能够高度选择性地、有效地吸附维生素B5，同时排除其他干扰物质，不需要再次进行过滤，从而实现高效的分离纯化。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种从全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法。该方法具有高收率、低成本和环境友好的特点。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明的目的是提供一种从全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法，包括以下步骤：
(1)发酵液的预处理：将全细胞转化发酵液进行固液分离取液相，调整所得液相中固形物的含量为5％-8％，调整PH为酸性，得到预处理后的发酵液；
(2)将步骤(1)所得预处理后的发酵液与聚苯乙烯树脂混合吸附，得到吸附发酵液的饱和树脂；
(3)对吸附发酵液的饱和树脂进行动态洗脱：以盐酸溶液对所述吸附发酵液的饱和树脂以动态流动的方式进行洗脱，再用甲醇的水溶液进行洗脱，得到维生素B5。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述全细胞转化发酵液为大肠杆菌全细胞转化发酵液、谷氨酸棒杆菌全细胞转化发酵液、乳酸菌全细胞转化发酵液和双歧杆菌全细胞转化发酵液中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述固液分离的方式为离心；所述离心的条件为：10000g-12000g离心至少10min。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述预处理后的发酵液的pH值为4.5-6。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述预处理后的发酵液与聚苯乙烯树脂的质量比为1：1-1：3，所述吸附的时间为≤20min。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述聚苯乙烯树脂的比表面积为40m2/g-45m2/g。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述聚苯乙烯树脂通过以下方法制备得到：
在惰性氛围和搅拌的条件下，将油相与水相混合，加热反应，过筛，得到所述聚苯乙烯树脂；所述油相与水相的质量比为1：1-2：1。
所述水相为明胶和氯化钠的水溶液；所述油相由二乙烯苯、苯乙烯、极性单体马来酸酐、过氧化二苯甲酰和致孔剂等比例混合组成。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述动态流动的方式为：进液流速为5mL/min-10mL/min，洗脱流速为10mL/min-15mL/min。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述盐酸溶液与聚苯乙烯树脂的体积比为：5：1-8：1。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述盐酸溶液的浓度为1.5mol/L-2.5mol/L。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述甲醇的水溶液中甲醇的浓度为80％-85％。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述甲醇的水溶液与聚苯乙烯树脂的体积比为3：1-5：1。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提供了一种从全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法。所述方法对比表面积不同的聚苯乙烯吸附树脂进行了制备与筛选；对洗脱剂进行了筛选；采用放大试验确定工艺路线。最终确立的工艺路线为发酵液经酸化离心、聚苯乙烯树脂吸附饱和、洗脱剂洗脱、净化、转化并经适当放大后结果仍好。此法拥有较为集中的洗脱高峰，所得产品纯度达87％以上，回收率可达95％以上。利用HPLC检测所得精品，检测出的产品纯度为96.5％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1聚苯乙烯吸附树脂的制备及筛选。
聚苯乙烯吸附树脂的制备：在45g水中加入0.225g明胶作分散剂，并加入质量分数为5％的氯化钠以防止极性单体在水中聚合；油相由二乙烯苯、苯乙烯以及极性单体马来酸酐等比例混合以及质量分数为1％过氧化二苯甲酰和致孔剂(甲苯、二甲苯)组成。在搅拌的同时将油相倒入水相中，通氮气5min以除去溶液中的氧气，控制搅拌转速为220r/min，在353K下反应6h再升温至363K反应4h，过滤，用热水洗去明胶，冷却得乳白色树脂颗粒。将树脂颗粒在索氏抽提器中抽提8h，除去致孔剂后真空干燥，经24目和60目过筛后就能得到聚苯乙烯吸附树脂，本实施例根据粒径和孔隙的不同，分别制备得到对比表面积为40m2/g的XAD-2和比表面积为45m2/g的XAD-16这2种聚苯乙烯吸附树脂。
实施例2从大肠杆菌(Escherichia coli)全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5。
本实施例提供了一种从大肠杆菌(Escherichia coli)全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法，包括以下步骤：
(1)发酵液预处理：通过管式离心机固液分离去除大肠杆菌发酵液中的杂质和沉淀物，从而方便后续提取和精制。将NaNO2和冰醋酸依次加入到发酵液中，再向其中添加消泡剂，在煮沸时长达到30min后将其快速冷却到室温。
(2)发酵液分离：将步骤(1)处理后得到的发酵液装入离心管中，12000g，室温条件下离心10min后弃去沉淀，留上清备用。
(3)聚苯乙烯吸附树脂的制备与筛选：将步骤(2)所得发酵液的上清液分别与两种不同表面积的聚苯乙烯树脂混合吸附，得到吸附发酵液的饱和树脂。对比表面积为40m2/g的XAD-2和比表面积为45m2/g的XAD-16这2种聚苯乙烯吸附树脂进行了初次筛选，将用聚苯乙烯树脂吸附发酵液5min时与吸附10min时的吸附量占发酵液VB5总量的百分比值进行对比。由结果可知，XAD-2对VB5的吸附量较高，相比XAD-16对VB591.8％的吸附量，XAD-2对VB5的吸附量可达92.2％。对拥有较高吸附量数据的聚苯乙烯树脂进行了复筛，用这些树脂吸附发酵液长达10min，结果与初次筛选的相符。对XAD-2和XAD-16这2种树脂进行饱和吸附实验。结果表明，XAD-2和XAD-16的饱和吸附量较为接近。但通过树脂饱和曲线可知，在20min时，XAD-2比XAD-16提前达到饱和状态，而XAD-16在28min时才能达到饱和状态。在工业生产上可以有效缩短生产周期，故XAD-2比XAD-16更加合适。因此，比表面积较大的XAD-2是备选树脂中最适合用于VB5分离纯化的树脂。
(4)对饱和树脂进行静态洗脱：将吸附发酵液的饱和树脂置于三角瓶中，使用蒸馏水充分洗涤，把多余水除去；向其中添加2mol/L的HCl作为洗脱剂使之振摇10min后，间隔5min取一次样，每次取样0.5mL，之后再加入0.5mL2 mol/L的HCl继续洗脱。这一过程中，要保持体系的总体积不发生改变。用HPLC检测得到的样品，结果显示样品纯度为88.7％，这表明还需对样品进行进一步的动态洗脱。
(5)洗脱剂的选择：根据VB5的溶解性，对不同浓度的甲醇-水和乙醇-水两种洗脱体系进行比较和筛选。分别用浓度为25％、50％、65％的甲醇水溶液和浓度为25％、50％、65％的乙醇水溶液对吸附饱和的树脂XAD-2进行洗脱。洗脱结果表示，在甲醇水溶液的浓度提高后，VB5的洗脱量也明显得到提高，这对于VB5洗脱很有利；但在乙醇水溶液浓度提高后，VB5的洗脱量反而出现下降现象，这对于VB5洗脱不利。且由HPLC结果可知，将乙醇作为洗脱剂会使得大量杂质被洗脱出来，从而大大降低洗脱效果。
(6)对吸附有发酵液的饱和树脂进行动态洗脱：先使用2mol/L的HCl溶液对筛选出的XAD-2饱和树脂以动态流动的方式进行洗脱，洗脱之后再重复利用。将进液流速控制在5mL/min，洗脱流速设为10mL/min。采用5倍树脂体积的HCl溶液洗脱饱和树脂，之后分别用浓度为60％和80％的甲醇和乙醇水溶液对吸附饱和的树脂进行动态洗脱，结果显示用浓度不同的乙醇作为洗脱剂，都出现了较低的洗脱回收率。而用60％甲醇水溶液来洗脱，会出现拖尾的洗脱曲线，且洗脱高峰不集中。用80％的甲醇水溶液洗脱，出现的洗脱峰集中，回收率较高。因此，80％的甲醇是较适合的洗脱剂，且通过HPLC检测的纯度可达96.5％。
(7)放大试验：对设计的路线进行了适当放大，先后分别用2mol/L的HCl和80％甲醇水溶液作为洗脱剂，对5mL和10mL吸附饱和的树脂进行动态洗脱。分别放大2倍和4倍后，洗脱曲线与放大前的结果相符。结果显示洗脱高峰集中，洗脱浓度可达12.3mg/g。
(8)HPLC检测发酵液、中间体和流出液中VB5含量：选用Agilent高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为汉邦C18 ODS柱；流动相：70％甲醇水溶液；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：375nm；进样量：10μL。通过检测结果，发现流出液中VB5含量高，可达87％；回收率达95％。
实施例3从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5。
本实施例提供一种从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法，具体包括以下步骤：
(1)发酵液预处理：取谷氨酸棒杆菌发酵液于11000r/min离心5min，取上层菌液，弃去菌体沉淀。用蒸馏水稀释10倍后，调节PH至5.5-6以备后用。
(2)聚苯乙烯吸附树脂的制备：将步骤(1)所得发酵液的上清液分别与两种聚苯乙烯树脂混合吸附，得到吸附发酵液的饱和树脂。对比表面积为40m2/g的XAD-2和比表面积为45m2/g的XAD-16这2种聚苯乙烯吸附树脂进行了初次筛选，将用树脂吸附发酵液5min时与吸附10min时的吸附量占发酵液VB5总量的百分比值进行对比。由结果可知，XAD-2对VB5的吸附量较高，相比XAD-16对VB591.8％的吸附量，XAD-2对VB5的吸附量可达92.2％。对拥有较高吸附量数据的聚苯乙烯树脂进行了复筛，用这些树脂吸附发酵液长达10min，结果与初次筛选的相符。对XAD-2和XAD-16这2种树脂进行饱和吸附实验。结果表明，XAD-2和XAD-16的饱和吸附量较为接近。但通过树脂饱和曲线可知，在20min时，XAD-2比XAD-16提前达到饱和状态，而XAD-16在28min时才能达到饱和状态，在工业生产上可以有效缩短生产周期，故XAD-2比XAD-16更加合适。因此，比表面积较大的XAD-2是备选树脂中最适合用于VB5分离纯化的树脂。
(3)对饱和树脂进行静态洗脱：向其中添加2mol/L的HCl作为洗脱剂使之振摇10min后，间隔5min取一次样，每次取样0.5mL，之后再加入0.5mL2 mol/L的HCl继续洗脱。这一过程中，要保持体系的总体积不发生改变。用HPLC检测得到的样品，结果显示样品纯度为88.7％，这表明还需对样品进行进一步的动态洗脱。
(4)洗脱剂的选择：根据VB5的溶解性，对不同浓度的甲醇-水和乙醇-水两种洗脱体系进行比较和筛选。分别用浓度为25％、50％、65％的甲醇水溶液和乙醇水溶液对吸附饱和的树脂XAD-2进行洗脱。洗脱结果表示，在甲醇水溶液的浓度提高后，VB5的洗脱量也明显得到提高，这对于VB5洗脱很有利；但在乙醇水溶液浓度提高后，VB5的洗脱量反而出现下降现象，这对于VB5洗脱不利。由HPLC结果可知，将乙醇作为洗脱剂会使得大量杂质被洗脱出来，从而大大降低洗脱效果。
(5)对吸附有发酵液的饱和树脂进行动态洗脱：先使用2mol/L的HCl溶液对筛选出的XAD-2饱和树脂以动态流动的方式进行洗脱，洗脱之后再重复利用。将进液流速控制在5mL/min，洗脱流速设为10mL/min。采用5倍树脂体积的HCl溶液洗脱饱和树脂可使洗脱率达到90％以上。之后用80％的甲醇水溶液洗脱，出现的洗脱峰集中，回收率较高。因此，80％的甲醇是较适合的洗脱剂，且通过HPLC检测的纯度可达97.3％。
(6)放大试验：对设计的路线进行了适当放大，先后分别用2mol/L的HCl和80％甲醇水溶液作为洗脱剂，对5mL和10mL吸附饱和的树脂进行动态洗脱。分别放大2倍和4倍后，洗脱曲线与放大前的结果相符。结果显示洗脱高峰集中，洗脱浓度可达14.5mg/g以上。
(7)HPLC检测发酵液、中间体和流出液中VB5含量：选用Agilent高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为汉邦C18 ODS柱；流动相：70％甲醇水溶液；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：375nm；进样量：10μL。通过检测结果，发现流出液中VB5含量高，可达89％；回收率达96.2％。
实施例4从乳酸菌(Lactic acidbacteria)全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5。
本实施例提供一种从乳酸菌(Lactic acidbacteria)全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法，具体包括以下步骤：
(1)发酵液配制及预处理：在1L去离子水中加入10g蛋白胨、20g酵母提取物、20g白砂糖、5g乙酸钠、2g磷酸二氢钾和柠檬酸钠、洋葱提取物、0.2g硫酸镁后，将PH调节至6.5，在发酵罐中以121℃温度灭菌半小时。将乳酸菌接种到灭菌冷却的溶液后，在37℃±1℃恒温发酵，至PH下降到4.5。将NaNO2和冰醋酸依次加入到发酵液中，再向其中添加消泡剂，在煮沸时长达到30min后将其快速冷却到室温。
(2)发酵液分离：将步骤(1)处理后的发酵液装入离心管中，12000g，室温条件下离心10min后弃去沉淀，留上清备用。
(3)聚苯乙烯吸附树脂的制备与筛选：将步骤(2)所得发酵液的上清液分别与两种聚苯乙烯树脂混合吸附，得到吸附发酵液的饱和树脂。对比表面积为40m2/g的XAD-2和比表面积为45m2/g的XAD-16这2种聚苯乙烯吸附树脂进行了初次筛选，将用树脂吸附发酵液5min时与吸附10min时的吸附量占发酵液VB5总量的百分比值进行对比。由结果可知，XAD-2对VB5的吸附量较高，相比XAD-16对VB591.8％的吸附量，XAD-2对VB5的吸附量可达92.2％。。对拥有较高吸附量数据的聚苯乙烯树脂进行了复筛，用这些树脂吸附发酵液长达10min，结果与初次筛选的相符。对XAD-2和XAD-16这2种树脂进行饱和吸附实验。结果表明，XAD-2和XAD-16的饱和吸附量较为接近。但通过树脂饱和曲线可知，在20min时，XAD-2比XAD-16提前达到饱和状态，而XAD-16在28min时才能达到饱和状态，在工业生产上可以有效缩短生产周期，故XAD-2比XAD-16更加合适。因此，比表面积较大的XAD-2是备选树脂中最适合用于VB5分离纯化的树脂。
(4)对饱和树脂进行静态洗脱：
向其中添加2mol/L的HCl作为洗脱剂使之振摇10min后，间隔5min取一次样，每次取样0.5mL，之后再加入0.5mL2 mol/L的HCl继续洗脱。这一过程中，要保持体系的总体积不发生改变。用HPLC检测得到的样品，结果显示样品纯度为88.7％，这表明还需对样品进行进一步的动态洗脱。
(5)洗脱剂的选择：根据VB5的溶解性，对不同浓度的甲醇-水和乙醇-水两种洗脱体系进行比较和筛选。分别用浓度为25％、50％、65％的甲醇水溶液和乙醇水溶液对吸附饱和的树脂XAD-2进行洗脱。洗脱结果表示，在甲醇水溶液的浓度提高后，VB5的洗脱量也明显得到提高，这对于VB5洗脱很有利；但在乙醇水溶液浓度提高后，VB5的洗脱量反而出现下降现象，这对于VB5洗脱不利。由HPLC结果可知，将乙醇作为洗脱剂会使得大量杂质被洗脱出来，从而大大降低洗脱效果。
(6)对吸附有发酵液的饱和树脂进行动态洗脱：先使用2mol/L的HCl溶液对筛选出的XAD-2饱和树脂以动态流动的方式进行洗脱，洗脱之后再重复利用。将进液流速控制在5mL/min，洗脱流速设为10mL/min。采用5倍树脂体积的HCl溶液洗脱饱和树脂可使洗脱率达到90％以上。之后分别用高浓度的甲醇和乙醇水溶液对吸附饱和的树脂进行动态洗脱，结果显示用浓度不同的乙醇作为洗脱剂，都出现了较低的洗脱回收率。而用60％甲醇水溶液来洗脱，会出现拖尾的洗脱曲线，且洗脱高峰不集中。用80％的甲醇水溶液洗脱，出现的洗脱峰集中，回收率较高。因此，80％的甲醇是较适合的洗脱剂，且通过HPLC检测的纯度可达98.1％。
(7)放大试验：对设计的路线进行了适当放大，先后分别用2mol/L的HCl和80％甲醇水溶液作为洗脱剂，，对5mL和10mL吸附饱和的树脂进行动态洗脱。分别放大2倍和4倍后，洗脱曲线与放大前的结果相符。结果显示洗脱高峰集中，洗脱浓度可达15.6mg/g以上。
(8)HPLC检测发酵液、中间体和流出液中VB5含量：选用Agilent高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为汉邦C18 ODS柱；流动相：70％甲醇水溶液；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：375nm；进样量：10μL。通过检测结果，发现流出液中VB5含量高，可达90.1％；回收率达95.7％。
实施例5从双歧杆菌(Bifidobacterium)全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法
本实施例提供一种从双歧杆菌(Bifidobacterium)全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法，具体包括以下步骤：
(1)发酵液配制及预处理：以0.5％葡萄糖、2％白砂糖、<1％的番茄汁、1％牛肉汤的比例在发酵罐中配制双歧杆菌培养液，将培养液的起始pH控制在6.5～7.0。将配制好的培养液在灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为115℃、20min在接种箱内将5％有活性的双歧杆菌种子液转入培养液中，整个操作过程需处于无菌环境。发酵温度为37℃，发酵2天。因为得到的双歧杆菌发酵液中含有部分沉淀，所以用G型正压过滤器过滤掉双歧杆菌发酵液中含有的杂质及沉淀物。
(2)发酵液分离：将步骤(1)预处理后的发酵液装入离心管中，12000g，室温条件下离心10min后弃去沉淀，留上清备用。
(3)聚苯乙烯吸附树脂的制备与筛选：将步骤(2)所得发酵液的上清液分别与两种聚苯乙烯树脂混合吸附，得到吸附发酵液的饱和树脂。对比表面积为40m2/g的XAD-2和比表面积为45m2/g的XAD-16这2种聚苯乙烯吸附树脂进行了初次筛选，将用树脂吸附发酵液5min时与吸附10min时的吸附量占发酵液VB5总量的百分比值进行对比。由结果可知，XAD-2对VB5的吸附量较高，相比XAD-16对VB591.8％的吸附量，XAD-2对VB5的吸附量可达92.2％。对拥有较高吸附量数据的聚苯乙烯树脂进行了复筛，用这些树脂吸附发酵液长达10min，结果与初次筛选的相符。对XAD-2和XAD-16这2种树脂进行饱和吸附实验。结果表明，XAD-2和XAD-16的饱和吸附量较为接近。但通过树脂饱和曲线可知，在20min时，XAD-2比XAD-16提前达到饱和状态，而XAD-16在28min时才能达到饱和状态，在工业生产上可以有效缩短生产周期，故XAD-2比XAD-16更加合适。因此，比表面积较大的XAD-2是备选树脂中最适合用于VB5分离纯化的树脂。
(4)对饱和树脂进行静态洗脱：
向其中添加2mol/L的HCl作为洗脱剂使之振摇10min后，间隔5min取一次样，每次取样0.5mL，之后再加入0.5mL2 mol/L的HCl继续洗脱。这一过程中，要保持体系的总体积不发生改变。用HPLC检测得到的样品，结果显示样品纯度为88.7％，这表明还需对样品进行进一步的动态洗脱。
(5)洗脱剂的选择：根据VB5的溶解性，对不同浓度的甲醇-水和乙醇-水两种洗脱体系进行比较和筛选。分别用浓度为25％、50％、65％的甲醇水溶液和乙醇水溶液对吸附饱和的树脂XAD-2进行洗脱。洗脱结果表示，在甲醇水溶液的浓度提高后，VB5的洗脱量也明显得到提高，这对于VB5洗脱很有利；但在乙醇水溶液浓度提高后，VB5的洗脱量反而出现下降现象，这对于VB5洗脱不利。由HPLC结果可知，将乙醇作为洗脱剂会使得大量杂质被洗脱出来，从而大大降低洗脱效果。
(6)对吸附有发酵液的饱和树脂进行动态洗脱：先使用2mol/L的HCl溶液对筛选出的XAD-2饱和树脂以动态流动的方式进行洗脱，洗脱之后再重复利用。将进液流速控制在5mL/min，洗脱流速设为10mL/min。采用5倍树脂体积的HCl溶液洗脱饱和树脂可使洗脱率达到90％以上。之后分别用高浓度的甲醇和乙醇水溶液对吸附饱和的树脂进行动态洗脱，结果显示用浓度不同的乙醇作为洗脱剂，都出现了较低的洗脱回收率。而用60％甲醇水溶液来洗脱，会出现拖尾的洗脱曲线，且洗脱高峰不集中。用80％的甲醇水溶液洗脱，出现的洗脱峰集中，回收率较高。因此，80％的甲醇是较适合的洗脱剂，且通过HPLC检测的纯度可达97.3％。
(7)放大试验：对设计的路线进行了适当放大，先后分别用2mol/L的HCl和80％甲醇水溶液作为洗脱剂，对5mL和10mL吸附饱和的树脂进行动态洗脱。分别放大2倍和4倍后，洗脱曲线与放大前的结果相符。结果显示洗脱高峰集中，洗脱浓度可达14.2mg/g以上。
(8)HPLC检测发酵液、中间体和流出液中VB5含量：选用Agilent高效液相色谱仪进行检测，色谱柱为汉邦C18 ODS柱；流动相：70％甲醇水溶液；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：375nm；进样量：10μL。通过检测结果，发现流出液中VB5含量高，可达91.2％；回收率达96.4％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种从全细胞转化发酵液中分离纯化维生素B5的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发酵液的预处理：将全细胞转化发酵液进行固液分离取液相，调整所得液相中固形物的含量为5％-8％，调整PH为酸性，得到预处理后的发酵液；
(2)将步骤(1)所得预处理后的发酵液与聚苯乙烯树脂混合吸附，得到吸附发酵液的饱和树脂；
(3)对吸附发酵液的饱和树脂进行动态洗脱：以盐酸溶液对所述吸附发酵液的饱和树脂以动态流动的方式进行洗脱，再用甲醇的水溶液进行洗脱，得到维生素B5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述全细胞转化发酵液为大肠杆菌全细胞转化发酵液、谷氨酸棒杆菌全细胞转化发酵液、乳酸菌全细胞转化发酵液和双歧杆菌全细胞转化发酵液中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固液分离的方式为离心；所述离心的条件为：10000g-12000g离心至少10min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述预处理后的发酵液与聚苯乙烯树脂的质量比为1：1-1：3，所述吸附的时间为≤20min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚苯乙烯树脂的比表面积为40m2/g-45m2/g。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚苯乙烯树脂通过以下方法制备得到：
在惰性氛围和搅拌的条件下，将油相与水相混合，加热反应，过筛，得到所述聚苯乙烯树脂；所述油相与水相的质量比为1：1-2：1。
所述水相为明胶和氯化钠的水溶液；所述油相由二乙烯苯、苯乙烯、极性单体马来酸酐、过氧化二苯甲酰和致孔剂等比例混合组成。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述动态流动的方式为：进液流速为5mL/min-10mL/min，洗脱流速为10mL/min-15mL/min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述盐酸溶液与聚苯乙烯树脂的体积比为：5：1-8：1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述甲醇的水溶液中甲醇的浓度为80％-85％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述甲醇的水溶液与聚苯乙烯树脂的体积比为3：1-5：1。
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