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"proéparation de pénicilline acylase purifiée et d'acide 6-aminopénicillanique"
La présente invention traite d'un nouveau procédé d'iso- lement et de purification de l'enzyme pénicilline acylase à partir de Escherichia Coli HA61 ainsi que de la production d'acide 6-aminopénicillanique par l'intermédiaire de l'hydrolyse enzyma- tique de la benzylpénicilline G.
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Depuis que Rolinson G.N. et consort (Nature 187, 236,
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04. t..
1960) ont démontré que l'hydrolyse enzymatique des Pénicillines G et V donne l'acide 6-aminopénicillanique, beaucoup de micro-orga- nismes se sont révélés posséder cet enzyme qui fragmente les Pénicillines, V ou G. Sous les recommandations de l'Union Interna- tionale de Biochimie pour la nomenclature des enzymes (Ind.
Jour. Biochemistry 2 septembre 1965 Supplément, page 36), l'enzyme qui hydrolyse la Pénicilline V ou G en acide 6-aminopénicillanique (6-APA) et la chaîne latérale correspondante est appelé Pénicilli- ne acylase ( EC 3¯5,1,Il). Borkar et consort (Hindustan Antibiot.
Bull 4, 152, 1962) ont décrit un processus de préparation d'une poudre de E. coli HA61 séchée à l'acétone, cultivée sur un milieu de culture nutritif pendant 36¯heures à 24 C, les cellules étant recueillies par centrifugation. Ils ont obtenu l'acylase en dé- truisant par le son les cellules séchées à l'acétone. Le procédé utilisant les cellules séchées à l'acétone est plus efficace que le procédé de Kulhanek, M. et Tadra, M. (Microbiologica 8, 301
1963) dans lequel les auteurs utilisent les cellules bactériennes qui ont été séparées de leur milieu de croissance et remises en suspension dans l'eau avec des traces de toluène.
La benzylpéni- cilline est ensuite dissoute dans ceci à 0,5 et 1,0% (poids/volume).
Elle est ensuite convertie en 6-APA avec une efficacité totale de 40-64%.
La présente invention est basée sur ce qu'on obtient l'a- cylase à partir des cellules séchées à l'acétone par un nouveau procédé et l'utilisation ultérieure de cet extrait enzymatique di- rectement ou après une nouvelle purification par un nouveau pro- cédé qui sera décrit, pour la conversion de la Pénicilline G en' 6-APA suivant une manière hautement efficace.
Le procédé décrit jusqu'ici pour la conversion microbiologique de la Pénicilline en 6-APA a le désavantage sérieux de ne pas pouvoir utiliser de très , grandes quantités initiales de Pénicilline car le taux de con-
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version de la Pénicilline en 6-APA est lent et limité à cause de' la faible concentration de l'enzyme acylase qui est présent dans les cellules microbiennes. Cette difficulté est entièrement sur- montée par le nouveau procédé décrit ici ou par l'utilisation de l'enzyme acylase purifié ,il est possible de convertir la Pénicil- line G en 6-APA à des taux qui sont de 5 à 20 fois supérieurs à ceux des processus connus jusqu'à présent.
Ceci conduit à une con- centration très élevée en 6-APA par ml du milieu de conversion, ce qui permet au 6-APA de facilement se séparer en cristaux du milieu de conversion lui-même sans aucune opération supplémentaire de purification ou de concentration. La présente invention décrit aussi un procédé dans lequel on utilise des tamis moléculaires, l'enzyme étant séparé du 6-APA et étant réutilisé pour une nouvelle conversion de Pénicilline en 6-APA.
Le procédé sera décrit en deux étages. Le premier compor- tera une description du procédé de purification de l'enzyme acylase, et le second la conversion de Pénicilline en 6-APA et la sépara- tion de l'enzyme du 6-APA pour une réutilisation de l'enzyme pour une nouvelle conversion de Pénicilline en 6-APA et la cristalli- sation du 6-APA qui est obtenu.
Une description générale du procédé sera de la façon suivante :
L'Escherichia coli HA61 est cultivé sur un milieu nutritif contenant un inducteur pour la biosynthèse de la Pénicilline acy- lase. On fait crottre la souche d'Escherichia coli en culture immergée par le procédé décrit dans le @ brevet Indien n 116943.
A la fin du cycle de croissance, les cellules bactériennes sont recueillies par centrifucation et l'enzyme brut est obtenu en (a) faisant sécher les cellules à l'acétone ou en (b) brisant les cellules par oscillation ultrasonique ou par broyage avec de la poudre de verre, du sable ou de la poudre de carborundum. Dans
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-
Le cas des cellules aéchées à l'acétone, l'acylanss est extraite en mettant en suspension les cellules séchées à l'acétone, dans du phosphate ou d'autres tampons à pH 6,0-7,8 à une température allant de -3 à +40*C pendant 2-12 heures. Le débris cellulaire après de tels traitements est séparé de l'extrait enzymatique par des techniques de centrifugation ou de filtration.
L'enzyme brut ainsi préparé est ensuite purifié en trois opérations. Le produit de n'importe quel stade peut être utilisé directement pour la conversion de Pénicille G en 6-APA. Le choix concerne principalement le taux de conversion requis de Pénicilli- ne en 6-APA. La première opération de purification est réalisée par l'addition de quantités calculées d'alcool éthylique ou d'acétone refroidi avec une agitation constante. L'addition con- trôlée d'acétone ou d'alcool éthylique en ce qui concerne la vitesse d'addition et la quantité ajoutéemènent à la précipitation d'une Pénicilline acylase purifiée, en laissant une grande por- tion d'autres protéines présentes dans l'extrait enzymatique brut.
L'acylase précipitée est séparée par des tachniques de centrifuga- tion ou de filtration. Ce précipité est ensuite dissous dans un tampon convenable,et il est utilisé pour la conversion de Pénicil- line G en 6-APA ou pris pour l'opération II de purification.
L'opération II de purification consiste à séparer la pénicilline acylase en fonction de son poids moléculaire, de sa dimension et de sa configuration protéinique sur un système de gel agissant comme tamis moléculaire. Des exemples typiques de gels qu'on utilise le plus fréquemment à ce titre, sont les Séphadex G-50, G-75 et G-100. Le gel est gonflé dans un tampon de phosphate ou de tris-HCl (tris hydroxy méthyl amino méthane) à pH 6,0-8,0 et il est versé dans une colonne. Une température constante est aussi maintenue pour la chromatographie sur colonne. Cette tempé- rature est partout de +5. à +35 C.
Les séphades G-50 et G-75 sous ces conditions ont des limites d'exclusion moléculaires respectivement de 30.000 et de 70.000 et la Pénicilline acylase émerge
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de la loDM dans le vo1ui18 vide ou intergranulaire dans un état '?:, '":"":f1,......":i,"''' tvi-...... """""""." - '0 - .. ¯' hautement purifié. Par ce procédé, elle est purifiée des autres substances qui ont un poids moléculaire inférieur à 30.000 et
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7O.OED. Dans le cas du Séphadex 6-100, l'enzyme est élue comme une fraction séparée après le volume vide. Cette solution enzyma- tique hautement purifiée peut être directement utilisée pour la conversion de Pénicilline G en 6-APA ou prise pour l'opération III de purification.
La troisiène opération de purification de l'enzyme
Pénicilline acylase comprend l'utilisation de gels de filtration où la purification est réalisée par tamisage moléculaire et échange ionique. Des exemples typiques de gels qu'on utilise le plus ordi-
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nairement à cet effet sont les DEAE-Séphadex A-25 et A-50. Ces deux gals en plus de fonctionner comme tamis moléculaires sont aussi de pauvres échangeurs anioniques. Les gels sont gonflés dans
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des tassons de phosphate ou de tris-HCl à pH 6,0-1.5 et sont ver- sés dans des colonnes en verre de grandeurs convenables. La Péni- cilline acylase purifiée provenant de l'opération II est ensuite passée à travers cette colonne.
Sous ces conditions de bH et de températures, le gel sépare l'acylase de la plupart des autres protéines et acides nucléiques et une Pénicilline acylase haute- lient poure apparaît dans le volume vide ou intergranulaire de l'éluat. Cet enzyme doit être directement utilisé pour la conver- sion de Pénicilline en 6-APA ou il doit être concentré et gardé à
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une tellpérature allant de -60 à +20oC pendant de longues périodes de temps.
La concentration est effectuée selon une des manières suivantes : CI) séchage à froid ou (2) concentration en utilisant
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#Î - - , .... le Sépîiadex G-25 ou G-5O dans la forme se..-'. ' ;,¯ .....".... - ¯, - ' Btagé#I à conversion enzymatique de la Pénicilline G en 6-APA. (j- .:':';-1i. la présente invention, l'étage II comprend la con- =j- .
J. iversiôldt^3a Pénicilline 6. 6 PA en utilisant 1. 1 enzyme 1?ni.- -.,"" iO='yf y'e'. 1 ¯. cilline acy1ase purifia obtenu tel que décrit précédemment.'- Le ailier de conversion est un milieu extreEacaent simple ,88 cotapo-.. t.<, -+ "'::'l.f ..:- ......,r."'.,.. - ..;,.....'Ü .. ":1 .." ...:..-" "....-".- -
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, -,-'.r-<-- ' -- - sant ordisairesent d'un. tampon de phosphate ou de trîs-IIC1 de , : . '*.<a3.:. .'--<--t.-*- "*'t <.-tA# --- 0,01-0;1K et de pU 6,t3-B.C. Suivant l'activité spécifique de l'en- zyme (l'activité spécifique est définie ici en micro moles de
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6-api converties par l'enzyme par milligramme de protéine ensyma- tique par heure), on prépare de 0,1 à 5 mgr par ml du milieu de ."conversion contenant la protéine enzymatique.
Le sel de sodium ou ,.de potassium de la Pénicilline G d'une activité non inférieure à 1500 unités/mgr est dissous dans le milieu de conversion pour don-
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ner partout de 10.000 à '.100.000 'unités de Pénicilline G par ml. La période d'incubation varie entre une heure et 18 heures et la température d'incubation se situe entre 20 et 45 C. A la fin
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de la période d'imcubation, lorsque la pénicilline G est presque quantitativement convertie en 6-APA, le milieu est refroidi à
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+5"C et un des traitements suivants est réalisé :
(1) la totalité .du milieu de conversion est passée par une colonne Sêphadex G-50
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ou G-75 et équilibrée dans un tampon de tris-IICI ou de phosphate 0,01M et éluée avec le même. L'enzyme seul émerge dans le volume .vide tandis que les substances de poids moléculaire inférieur com-
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tne le 6-APA, l'acide phénylacêtique et les traces de Pénicilline "'"' G sont absorbées sur la colonne et éluées ultérieurement comme 'fraction séparée. L'enzyme acylase dans le volume vide est repris pour une nouvelle conversion de Pénicilline G en 6-APA par addition d'une quantité appropriée de sel de sodium ou de potassium de Pénicilline G et l'incubation à la température adéquate.
La fraction de 6-APA est soit concentrée deux à dix fois sous vide à
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une tetepSrat'ore non supérieure d 3i C et ensuite le 6-APA est re- cristallisé ,soit directement reprise pour la cristallisation de 6--ARA. Ceci dépend du titre ou de la concentration en 6-APA de
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l'éluat? (H) la :fraction de 6-APA est reprise directement pour la cristallisation de 6-APA dans le cas où la concentration en 6-
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RPA est suffinawimt élevée pour obtenir une cristallisation satis- .
Ëaisante et e-a l'enzyae acylase ne doit pas être récupéré pour une --.-,':s ....... ' '
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1\0." .. , .hconversion ultérieure de Pénicilline G en 6-APA; ou bien (III) '.'-< %,;, - 111: ...."4. ......... "'r"-"':. ..'- "':"'t,.,:';. Ç....'-\T.....H¯-Y"'1. :,""",\"".-.... :3.> '/.-':-'"<.K on concentre sous vide deux à dix fois à une température de distillation non supérieure à 35 C et le 6-APA se sépare ensuite en cristaux
Le procédé de cristallisation du 6-APA se fait générale- ment de la façon suivante : solution contenant le 6-APA est .d'abord refroidie à +5 C et, tout en agitant, on ajoute de l'acide organique ou minéral concentré très lentement pour obtenir un pH de 4,3. A ce moment, le 6-APA se sépare en cristaux .
Les cristaux sont séparés par filtration et ils sont lavés avec de l'eau acidulée à pH de 4,3 suivi par de l'acétone refroidi . Les cristaux de 6-APA sont ensuite séchés. Les cristaux qui ont une pureté de 92 à 95% à ce stade, sont repris pour la recristallisation si on désire un legré de plus grande pureté pour le 6-APA. La recristallisation est @lisée en dissolvant les cristaux de 6-APA d'abord dans une quan-
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tité minimum d'eau avec du 39'aOH ou du bicarbonate de sodium et ensuite en ajustant à pH 4,3 avec de l'acide organique ou minéral concentré , le 6-APA se séparant alors en cristaux. Les cristaux ront récupérés ,tel que décrit ci-dessus. L'activité des cris- ;aux à ce stade est située entre 2680 et 2740 unités/mgr.
Les taux de conversion en 6-APA , les titres et les acti- dtés des cristaux sont déterminés par le processus au paradimé- bylamino benzaldéhyde et par l'iodométrie.
L'invention est illustrée par les exemples suivants mais cas lle n'est en aucun/limitée à ceux-ci.
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(lL7iiC.6lCI 1 ¯g
On prépare une solution nutritive qui a la composition vivante :5,0 gr de peptone, 1,5 gr d'extrait de levure, 1,5 gr 'extrait de boeuf, 3,58 gr de NaCl, 1,0 gr de glucose, 1 gr de
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2B.P04 ,1,32 gr de KH2P04' 1,0 gr d'acide phénylacétique et de 'eau distillée pour faire 1 litre. est
La stérilisation/réalisée dans un autoclave pendant 30 à
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40 tes à une pression de 15 livres . Le pa du milieu avant . ¯ ', .,. - :; ,,¯ 1-çi;-Ldrîlisation est ajusté à 6,0-7,4 avec de l'alcali. Pour la préparation d'un inoculum de germes, ---- une suspension de cellules bactériennes qu'on a mise à croître pendant une nuit dans une culture couchée nutritive sur agar est inoculée dans 100 ml
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du milieu ci-dessus contenant z6 d'acide pbénylacétîque dans un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml maintenu sur un dispositif d'agitation pendant 18 à 20 heures à 22-32"C. 5%de ceci sont inoculés dans 100 ml du milieu ci-dessus dans un flac,.-on de 500 ml.
Les flacons de fermen-- à secousses 7 talion sont gardés sur un dispositif d'agitation/pendant 18-30 heure à 22-32 C. Après la fin de la fermentation, le bouillon provenant des différents flacons est mis en commun et les cellules bactériennes sont séparées r centrifugation dans des centrifugeu- ses sharples. Les cellules sont enlevées et remises en suspension dans de l'eau distillée pour donner une pâte mince. La pâte est ensuite ajoutée avec une agitation constante à 10 volumes d'acé-
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tone refroidi (-5* à -200C). Le mélange st ensuite' laissé au re- pos à la température ci-dessus pendant environ une heure et il est ensuite filtré à la trompe.
Les cellules bactériennes sont ensuite lavées successivement avec de 1''acétone refroidi et avec un mélange d'acétone/ éther (1/1). Le gâteau de bactéries est enlevée il est séché à l'air et est finalement séché sous vide pendant la nuit pour enlever les dernières traces de, solvants.
Les cellules bactériennes séchées à l'acétone/éther sont
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remises en suspension dans un tampon phosphate O,lM à pH de 6.0- 7,5 dans la proportion de 1/10 à 1/20. La suspension homogène des u-Yesst-prégarée dans un mélangeur du type Waring et elle est laissée au repos pendant 2-12 heures à une température allant de
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-211 & +400C. La suspension est centrifugée à 12.000 tours par mi- nute pour enlever le débris cellulaire. Le liquide surnageant donne une activité spécifique d'environ 5 à 8 micro moles/heure/ mgr de protéine . Le liquide surnageant est ensuite traité avec
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0,5 ;volume d'acétone refroidi à una température de -5 à -20 C pour faire précipiter les protéines inactives. Celles-ci sont séparées par centrifugation.
La concentration de l'acétone est élevée à 1,5 volume d'acétone refroidi. Le précipité contenant la Pénicilline acylase active est enlevée par centrifugation à 2500 tours par minute et il est dissous dans l'eau et dialysé pour enlever les traces d'acétone. L'activité spécifique de l'enzyme est d'environ 8 à 12 micro moles/heure/mgr de protéine.
A un milieu de conversion contenant 0,5-5,0 mgr/ml de la fraction
HCl / enzymatique dialysée dans (0,01-0,1M)du tampon tris/ou phosphate, on ajoute de la benzyl Pénicilline de sodium ou de potassium de manière à ce qu'il contienne 10.000 à 100.000 unités/ml. Le mé- lange est incubé à 37 -46 C pendant 1 à 18 heures, moment où la plus grande quantité de Pénicilline est convertie en 6-APA. A la fin de la période d'incubation, le pH du mélange est ajusté à
5,0.
La turbidité qui apparait à ce stade est enlevée par centri- fugation et le surnageant clair est refroidi et le pH est ramené à 4,3 avec des acides organiques ou minéraux. L'acide 6-aminopé- nicillanique se sépare en cristaux lors d'une période de repos / de 6 à 8 heures à 0 C, Les cristauxdacide 6-aminopénicillanique sont filtrés, lavés à l'eau froide, à l'acétone et séchés pendant
Lorsqu' la nuit sous vide sur du gel de silice./ on utilise des concentra- tions très basses en Pénicilline G, le titre du 6-APA est par conséquent très bas et une concentrationaqueuse sous vide de 2 à 10 fois amène le-titre-de 6-APA à un niveau qui facilite la cris- tallisation ,
telle que détaillée ci-dessus.
EXEMPLE 2
Les extraits enzymatiques bruts sont passés par une colonne de Séphadex G-50 avec un volume de lit de 100 ml. La colonne est équilibrée avec du tampon tris-HCl ou PO4 0,01-0,lM. La Pénicilli- ne acylase émerge dans le volume vide sur élution avec le même tampon. L'enzyme à ce stade a une activité spécifique d'environ
14-16 micro moles/heure/mgr de protéine.
Au bouillon enzymatique
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contenant enviror0,5-5,0 mgr/ml de protéine, on ajoute de la pé- nicilline G de manière à ce qu'il contienne 10.000 à 100.000 unités/ml et on incube à pH 6,0-7.5 et à 35-45 C pendant 1-10 heures.Ala fin de la période d'incubation, le pH est ajusté à 4,3 et l'acide 6-aminopénicillanique est récupéré uivant le pro- cessus décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE
A la place d'une colonne de Séphadex G-50 comme dans l'exem- ple 2 une colonne de Séphadex G-75 avec un volume de lit de 100 ml peut être utilisée pour purifier l'enzyme. On obtient l'acide 6-aminopénicillanique en utilisant de l'enzyme purifié par Sé- phadex G-75, tel que décrit dans l'exemple 2
EXEMPLE 4
A la place d'une colonne de Séphadex G-50 comme dans 1' exemple 2, une colonne de g-100 peut être utilisée pour purifier l'enzyme. L'enzyme est retenu sur la colonne et est élue immédia- tement après le volume vide.
On obtient l'acide 6-amiunopénicilla- nique en utilisant l'enzyme purifié, tel que décrit dans les exemples 1 et 2.
EXEMPLE 5
La solution enzymatique fractionnée à l'acétone obtenue , comme décrit dans l'exemple l.est passée par une colonne de sé- phadex G-50 ,comme décrit dans l'exemple 2. L'enzyme est à nou- veau purifié - pour donner l'activité spécifique de 34 micro moles/ heure/ mgr de protéine. La solution enzymatique ainsi obtenue est incubée pour obtenir l'acide 6-aminopénicillanique, comme décrit dans l'exemple 2.
EXEMPLE 6
A la place du Séphadex G-5O utilisé dans l'exemple 5 pour la purification de l'enzyme à partir de la solution enzymatique fractionnée à l'acétone, on utilise du Séphadex G-75, et l'acide 6-aminopénicillanique est isolé par le processsus tel que décrit dans l'exemple 1.
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EXEMPI± J ""1. ' ', ' ' ; ¯ " l ' " "'5
A la place du Séphadex G-50 utilisé dans l'exemple 5 pour la purification de l'enzyme à partir de la solution enzymatique
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fractionnée à l'acétone, on utilise du G-100,et l'acide 6-aminopénicillanique est isolé par le processus décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 8
Les fractions enzymatiques purifiées aux Séphadex G-50, Séphades G-75 et Séphadex G-100 sont passées par une colonne de
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DFAE Sépnadex A-25 et élu6es avec du tampon phosphate t3,0iM-0,3.1i à pH 6,5-7,5. L'activité enzymatique est considérée comme étant présenta dans le volume vide. La purification atteinte à ce stade est de 10 à 15 fois avec une activité spécifique d'environ 65-85 micro moles/heure/mgr de protéine. L'acide 6-aminopénicillanique est obtenu en utilisant cet enzyme purifié suivant le processus décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 9
A la place de la colonne DEAE Séphadex A-25, on utilise une colonne de DEAE Séphadex A-50 pour la purification de la pé- nicilline acylase, comme décrit dans l'exemple 8. L'acide 6-amino-
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péniciULanique en utilisant l'enzyme purifié au DEAE Sêpbadex A-5fl est obtenu tel que décrit dans l'exemple*!.
EXEMPLE 10
Le mélange réactionnel obtenu en incubant n'importe laquelle ,-des fractions de Pénicilline acylase des exemples 1 à 9 avec de la
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Pénicilline G à pH de t"or?,5 et à une température de 35-h5 C pendant 2 à 18 heures est passé par une colonne de Sêphadex aG-50 avec jun volume de lit de 100 ml. La colonne est précédemment équilibrée avec du tampon phosphate 0)1-6,1 M. L'enzyme Pénicilline acylase est élue avec le même tampon , il apparaît dans le volume vide et Ullacîde --aci.nopénicillanique retenu sur la colonne est élue avec le même tampon à un stade ultérieur.
L'acide 6-aminopénicillanî- que se sépare ensuite en cristaux directement ou par évaporation de
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1"iuat pression réduiteo tel que décrit dans l'exemple 1.' j-¯,: ài->¯i,,, ,¯ ,, , .y"ç 3k w,. tr ...F.< ...- L'acylase apparaissant dans lt'ro3.uae vide est ensuite réutilisée pour la conversion de Pénicilline G en 6-APA comme dans l'exemple 1. Les Séphadex 6-50, 6-75, 6-100 et le DEAE Séphadex A-50 sont fabriqués par Pharmacia Fine Chemicale Uppsala, Suède.
REVENDICATIONS
1. Un procédé pour la production de Pénicilline acylase, un enzyme capable d'hydrolyser la benzyl pénicilline à partir des
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cellules léchées à l'acétone de micro-organisjae Eécherichia coli ayant la culture n* HA61 capable de produire l'enzytae Pénicilline en acylase lorsque cultivé/aérobie sous des conditions immer- gées dans une solution nutritive aqueuse contenant des sels inorga- niques, des composés azotés, des substances favorisant la croissan- ce et des hydrates de carbone.
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"preparation of purified penicillin acylase and 6-aminopenicillanic acid"
The present invention relates to a novel process for the isolation and purification of the enzyme penicillin acylase from Escherichia Coli HA61 as well as the production of 6-aminopenicillanic acid via enzymatic hydrolysis. benzylpenicillin tick G.
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Since Rolinson G.N. et al. (Nature 187, 236,
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1960) demonstrated that the enzymatic hydrolysis of Penicillins G and V gives 6-aminopenicillanic acid, many microorganisms have been shown to possess this enzyme which fragments Penicillins, V or G. Under the recommendations of the International Union of Biochemistry for the nomenclature of enzymes (Ind.
Day. Biochemistry September 2, 1965 Supplement, page 36), the enzyme which hydrolyzes Penicillin V or G to 6-aminopenicillanic acid (6-APA) and the corresponding side chain is called Penicillin acylase (EC 3¯5,1, Il ). Borkar et al (Hindustan Antibiot.
Bull 4, 152, 1962) described a process for preparing a powder of E. coli HA61 dried with acetone, cultured on a nutrient culture medium for 36 ½ hours at 24 ° C., the cells being collected by centrifugation. They obtained acylase by destroying acetone-dried cells with bran. The method using the acetone-dried cells is more efficient than the method of Kulhanek, M. and Tadra, M. (Microbiologica 8, 301
1963) in which the authors use bacterial cells which have been separated from their growth medium and resuspended in water with traces of toluene.
The benzylpenicillin is then dissolved in this at 0.5 and 1.0% (w / v).
It is then converted to 6-APA with a total efficiency of 40-64%.
The present invention is based on the fact that a-cylase is obtained from the cells dried with acetone by a new method and the subsequent use of this enzymatic extract directly or after further purification by a new method. - Assigned which will be described, for the conversion of Penicillin G to '6-APA in a highly efficient manner.
The process described heretofore for the microbiological conversion of penicillin to 6-APA has the serious disadvantage of not being able to use very, large initial amounts of penicillin because the level of con-
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Penicillin's version of 6-APA is slow and limited due to the low concentration of the enzyme acylase which is present in microbial cells. This difficulty is entirely overcome by the new method described herein or by the use of the purified acylase enzyme, it is possible to convert Penicillin G to 6-APA at levels which are 5 to 20 times higher. to those of the processes known so far.
This results in a very high concentration of 6-APA per ml of the conversion medium, which allows the 6-APA to easily crystallize from the conversion medium itself without any further purification or concentration. The present invention also describes a method in which molecular sieves are used, the enzyme being separated from 6-APA and reused for further conversion of penicillin to 6-APA.
The process will be described in two stages. The first will include a description of the process for purifying the acylase enzyme, and the second will include the conversion of Penicillin to 6-APA and the separation of the enzyme from 6-APA for reuse of the enzyme for further processing. further conversion of Penicillin to 6-APA and crystallization of the resulting 6-APA.
A general description of the process will be as follows:
Escherichia coli HA61 is cultivated on a nutrient medium containing an inducer for the biosynthesis of penicillin acylase. The strain of Escherichia coli is grown in submerged culture by the method described in Indian Patent No. 116943.
At the end of the growth cycle, the bacterial cells are collected by centrifugalization and the crude enzyme is obtained by (a) drying the cells with acetone or by (b) breaking the cells by ultrasonic oscillation or by grinding with glass powder, sand or carborundum powder. In
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-
In the case of cells dried with acetone, the acylanss are extracted by suspending the cells dried with acetone, in phosphate or other buffers at pH 6.0-7.8 at a temperature ranging from - 3 at + 40 * C for 2-12 hours. Cellular debris after such treatments is separated from the enzymatic extract by centrifugation or filtration techniques.
The crude enzyme thus prepared is then purified in three operations. The product of any stage can be used directly for the conversion of Penicillus G to 6-APA. The choice mainly concerns the required conversion rate of Penicillin to 6-APA. The first purification step is carried out by adding calculated amounts of ethyl alcohol or cooled acetone with constant agitation. The controlled addition of acetone or ethyl alcohol with regard to the rate of addition and the amount added results in the precipitation of a purified penicillin acylase, leaving a large portion of other proteins present in it. the crude enzyme extract.
The precipitated acylase is separated by centrifugation or filtration techniques. This precipitate is then dissolved in a suitable buffer, and it is used for the conversion of Penicillin G to 6-APA or taken for purification step II.
The purification step II consists in separating the penicillin acylase according to its molecular weight, its size and its protein configuration on a gel system acting as a molecular sieve. Typical examples of gels which are most frequently used for this purpose are Sephadex G-50, G-75 and G-100. The gel is swelled in a phosphate or tris-HCl (tris hydroxy methyl amino methane) buffer at pH 6.0-8.0 and poured into a column. A constant temperature is also maintained for column chromatography. This temperature is +5 everywhere. at +35 C.
Sephads G-50 and G-75 under these conditions have molecular exclusion limits of 30,000 and 70,000, respectively, and Penicillin acylase emerges.
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of the loDM in the empty or intergranular vo1ui18 in a state '?:,' ":" ": f1, ......": i, "'' 'tvi -......" "" " "" "." - '0 - .. ¯' highly purified. By this method, it is purified from other substances which have a molecular weight of less than 30,000 and
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7O.OED. In the case of Sephadex 6-100, the enzyme is eluted as a separate fraction after the void volume. This highly purified enzymatic solution can be used directly for the conversion of Penicillin G to 6-APA or taken for purification step III.
The third operation of purification of the enzyme
Penicillin acylase involves the use of filter gels where purification is achieved by molecular sieving and ion exchange. Typical examples of the most commonly used gels
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nally for this purpose are DEAE-Sephadex A-25 and A-50. These two gals in addition to functioning as molecular sieves are also poor anion exchangers. The gels are swollen in
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tampons of phosphate or tris-HCl at pH 6.0-1.5 and are poured into glass columns of suitable sizes. The purified penicillin acylase from step II is then passed through this column.
Under these bH and temperature conditions, the gel separates the acylase from most other proteins and nucleic acids and a high-binding penicillin acylase appears in the void or intergranular volume of the eluate. This enzyme must be used directly for the conversion of Penicillin to 6-APA or it must be concentrated and kept at
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such a temperature ranging from -60 to + 20oC for long periods of time.
Concentration is carried out in one of the following ways: CI) cold drying or (2) concentration using
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# Î - -, .... the Sepiadex G-25 or G-5O in the form se ..- '. ';, ¯ ..... ".... - ¯, -' Btagé # I enzymatically converting Penicillin G to 6-APA. (J-.: ':'; - 1i. The present invention, stage II includes the con- = j-.
J. iversiôldt ^ 3a Penicillin 6. 6 PA using 1.11 enzyme 1? Ni.- -., "" IO = 'yf y'e'. 1 ¯. cillin acylase purifia obtained as described previously. '- The conversion wing is a simple extreEacaent medium, 88 cotapo- .. t. <, - + "' :: 'lf ..: - ......, r . "'., .. - ..;, .....' Ü ..": 1 .. "...: ..-" "....-" .- -
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, -, - '. r - <-' - - ordinary health of a. phosphate or tris-IIC1 buffer:. '*. <a3.:. .'-- <- t .- * - "* 't <.- tA # --- 0.01-0; 1K and pU 6, t3-BC Depending on the specific activity of the enzyme (the specific activity is defined here in micro moles of
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6-api converted by the enzyme per milligram of enzyme protein per hour), 0.1 to 5 mg per ml of the conversion medium containing the enzyme protein is prepared.
The sodium or potassium salt of Penicillin G with an activity of not less than 1500 units / mgr is dissolved in the conversion medium to give
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anywhere from 10,000 to 100,000 units of Penicillin G per ml. The incubation period varies between one hour and 18 hours and the incubation temperature is between 20 and 45 C. At the end
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of the incubation period, when penicillin G is almost quantitatively converted to 6-APA, the medium is cooled to
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+5 "C and one of the following treatments is performed:
(1) all of the conversion medium has passed through a Sephadex G-50 column
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or G-75 and equilibrated in tris-IICI or 0.01M phosphate buffer and eluted with the same. The enzyme alone emerges in the empty volume while the lower molecular weight substances com-
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All 6-APA, phenylacetic acid and traces of Penicillin "" "G are taken up on the column and subsequently eluted as a separate fraction. The acylase enzyme in the void volume is taken up for further conversion of Penicillin G to 6-APA by addition of an appropriate amount of sodium or potassium salt of Penicillin G and incubation at the correct temperature.
The fraction of 6-APA is either concentrated two to ten times under vacuum at
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no higher tetepSratore of 3i C and then 6-APA is recrystallized, or directly taken up for crystallization of 6-ARA. This depends on the titre or the concentration of 6-APA of
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the elected official? (H) the: fraction of 6-APA is taken directly for crystallization of 6-APA in the case where the concentration of 6-
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RPA is high enough to achieve satis- factory crystallization.
Ease and e-a enzyme acylase should not be recovered for a --.-, ': s .......' '
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1 \ 0. ".., .h subsequent conversion of Penicillin G to 6-APA; or (III) '.'- <%,;, - 111: ...." 4. ......... "'r" - "' :. ..'-" ': "' t,.,: ';. Ç ....'- \ T ..... H ¯-Y "'1. :, "" ", \" ".-....: 3.> '/.-':-'"<.K is concentrated under vacuum two to ten times at a distillation temperature not higher than 35 C and 6-APA then separates into crystals
The crystallization process of 6-APA is generally carried out as follows: solution containing 6-APA is first cooled to +5 C and, while stirring, concentrated organic or inorganic acid is added. very slowly to obtain a pH of 4.3. At this time, 6-APA separates into crystals.
The crystals are separated by filtration and they are washed with acidulated water to pH 4.3 followed by cooled acetone. The 6-APA crystals are then dried. The crystals which have a purity of 92 to 95% at this stage are taken up for recrystallization if a higher degree of purity is desired for 6-APA. Recrystallization is carried out by dissolving the crystals of 6-APA first in an amount.
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minimum amount of water with 39'aOH or sodium bicarbonate and then adjusting to pH 4.3 with concentrated organic or inorganic acid, the 6-APA then separating into crystals. The crystals will be recovered, as described above. Crisis activity at this stage is between 2680 and 2740 units / mgr.
The rates of conversion to 6-APA, the titers and the activities of the crystals are determined by the paradimebylamino benzaldehyde process and by iodometry.
The invention is illustrated by the following examples but it is not in any way / limited thereto.
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(lL7iiC.6lCI 1 ¯g
A nutrient solution is prepared which has the living composition: 5.0 g of peptone, 1.5 g of yeast extract, 1.5 g of beef extract, 3.58 g of NaCl, 1.0 g of glucose , 1 gr of
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2B.P04, 1.32 gr of KH2PO4 '1.0 gr of phenylacetic acid and of distilled water to make 1 liter. East
Sterilization / carried out in an autoclave for 30 to
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", -'- << '..---. *. -,.
40 tons at a pressure of 15 pounds. The middle front pa. ¯ ',.,. -:; ,, ¯ 1-çi; -Ldrillization is adjusted to 6.0-7.4 with alkali. For the preparation of a germ inoculum, ---- a suspension of bacterial cells which has been grown overnight in a nutrient coated culture on agar is inoculated into 100 ml
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of the above medium containing z6 of pbenylacetic acid in a 500 ml Erlenmeyer flask kept on a shaker for 18 to 20 hours at 22-32 ° C. 5% of this is inoculated into 100 ml of the medium above in a vial, .- on of 500 ml.
The 7 talion shaking fermen vials are kept on a shaking device / for 18-30 hours at 22-32 C. After the fermentation is complete, the broth from the different vials is pooled and the cells bacteria are separated by centrifugation in sharples centrifuges. The cells are removed and resuspended in distilled water to give a thin paste. The paste is then added with constant stirring to 10 volumes of ac-
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tone cooled (-5 * to -200C). The mixture is then allowed to stand at the above temperature for about an hour and is then filtered with suction.
The bacterial cells are then washed successively with cooled acetone and with a mixture of acetone / ether (1/1). The bacteria cake is removed it is air dried and is finally vacuum dried overnight to remove the last traces of solvents.
Acetone / ether dried bacterial cells are
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resuspended in 0.1M phosphate buffer at pH 6.0-7.5 in the proportion of 1/10 to 1/20. The homogeneous suspension of u-Yesst-prégarée in a mixer of the Waring type and it is left to stand for 2-12 hours at a temperature ranging from
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-211 & + 400C. The suspension is centrifuged at 12,000 rpm to remove cell debris. The supernatant liquid gives a specific activity of about 5 to 8 micro moles / hour / mgr of protein. The supernatant liquid is then treated with
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0.5 volume of acetone cooled to -5 to -20 C to precipitate inactive proteins. These are separated by centrifugation.
The concentration of acetone is raised to 1.5 volumes of cooled acetone. The precipitate containing the active penicillin acylase is removed by centrifugation at 2500 revolutions per minute and it is dissolved in water and dialyzed to remove traces of acetone. The specific activity of the enzyme is approximately 8 to 12 micro moles / hour / mgr of protein.
To a conversion medium containing 0.5-5.0 mgr / ml of the fraction
HCl / enzymatic dialyzed in (0.01-0.1M) tris / or phosphate buffer, sodium or potassium benzyl penicillin is added so that it contains 10,000 to 100,000 units / ml. The mixture is incubated at 37 -46 ° C for 1 to 18 hours, at which time most of the penicillin is converted to 6-APA. At the end of the incubation period, the pH of the mixture is adjusted to
5.0.
The turbidity which appears at this stage is removed by centrifugation and the clear supernatant is cooled and the pH is brought back to 4.3 with organic or mineral acids. 6-Aminopenicillanic acid separates into crystals upon standing / 6-8 hours at 0 C. 6-Aminopenicillanic acid crystals are filtered, washed with cold water, acetone and dried. while
When overnight under vacuum over silica gel / very low concentrations of Penicillin G are used, the titer of 6-APA is therefore very low and a 2- to 10-fold aqueous concentration in vacuo gives the titer. -from 6-APA to a level which facilitates crystallization,
as detailed above.
EXAMPLE 2
The crude enzymatic extracts are passed through a Sephadex G-50 column with a bed volume of 100 ml. The column is equilibrated with 0.01-0.1M tris-HCl or PO4 buffer. Penicillin acylase emerges in the void volume on elution with the same buffer. The enzyme at this stage has a specific activity of about
14-16 micro moles / hour / mgr of protein.
Enzymatic broth
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containing enviror0.5-5.0 mgr / ml of protein, penicillin G is added so that it contains 10,000 to 100,000 units / ml and incubated at pH 6.0-7.5 and at 35- 45 C for 1-10 hours. At the end of the incubation period, the pH is adjusted to 4.3 and 6-aminopenicillanic acid is recovered following the process described in Example 1.
EXAMPLE
Instead of a Sephadex G-50 column as in Example 2 a Sephadex G-75 column with a bed volume of 100 ml can be used to purify the enzyme. 6-Aminopenicillanic acid is obtained using the enzyme purified by Sephadex G-75, as described in Example 2.
EXAMPLE 4
Instead of a Sephadex G-50 column as in Example 2, a g-100 column can be used to purify the enzyme. The enzyme is retained on the column and elutes immediately after the void volume.
6-Amiunopenicillinic acid is obtained using the purified enzyme as described in Examples 1 and 2.
EXAMPLE 5
The acetone fractionated enzyme solution obtained, as described in Example 1, is passed through a Sephadex G-50 column, as described in Example 2. The enzyme is further purified - for give the specific activity of 34 micro moles / hour / mgr of protein. The enzymatic solution thus obtained is incubated to obtain 6-aminopenicillanic acid, as described in Example 2.
EXAMPLE 6
Instead of Sephadex G-5O used in Example 5 for the purification of the enzyme from the enzyme solution fractionated with acetone, Sephadex G-75 is used, and 6-aminopenicillanic acid is isolated. by the process as described in Example 1.
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EXEMPI ± J "" 1. '', ''; ¯ "the" "'5
Instead of Sephadex G-50 used in Example 5 for the purification of the enzyme from the enzymatic solution
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Fractionated with acetone, G-100 is used, and 6-aminopenicillanic acid is isolated by the procedure described in Example 1.
EXAMPLE 8
The enzymatic fractions purified with Sephadex G-50, Sephades G-75 and Sephadex G-100 are passed through a column of
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DFAE Sepnadex A-25 and eluted with t3.0iM-0.3.1i phosphate buffer at pH 6.5-7.5. The enzymatic activity is considered to be present in the void volume. The purification achieved at this stage is 10 to 15 times with a specific activity of about 65-85 micro moles / hour / mgr of protein. 6-Aminopenicillanic acid is obtained using this purified enzyme following the procedure described in Example 1.
EXAMPLE 9
Instead of the DEAE Sephadex A-25 column, a DEAE Sephadex A-50 column is used for the purification of penicillin acylase, as described in Example 8. 6-amino acid.
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peniciULanic using the DEAE purified enzyme Sêpbadex A-5fl is obtained as described in example * !.
EXAMPLE 10
The reaction mixture obtained by incubating any of the penicillin acylase fractions of Examples 1 to 9 with
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Penicillin G at pH t "or?, 5 and at a temperature of 35-h5 C for 2 to 18 hours is passed through a column of Sephadex aG-50 with a bed volume of 100 ml. The column is previously equilibrated with phosphate buffer 0) 1-6.1 M. The enzyme Penicillin acylase is eluted with the same buffer, it appears in the empty volume and ullacid - aci.nopenicillanic acid retained on the column is eluted with the same buffer at a stage ulterior.
The 6-aminopenicillanic acid then separates into crystals directly or by evaporation of
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1 "iuat reduced pressure as described in Example 1." j-¯ ,: ài-> ¯i ,,,, ¯ ,,, .y "ç 3k w ,. tr ... F. <...- The acylase appearing in empty lt'ro3.uae is then reused for the conversion of Penicillin G into 6-APA as in Example 1. Sephadex 6-50, 6- 75, 6-100 and DEAE Sephadex A-50 are manufactured by Pharmacia Fine Chemicale Uppsala, Sweden.
CLAIMS
1. A process for the production of Penicillin acylase, an enzyme capable of hydrolyzing benzyl penicillin from
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Acetone-licked cells of the microorganism Echerichia coli having the culture n * HA61 capable of producing the enzyme Penicillin in acylase when cultured / aerobic under conditions immersed in an aqueous nutrient solution containing inorganic salts, nitrogen compounds, growth promoting substances and carbohydrates.