JPS6361147A - 分析方法 - Google Patents

分析方法

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JPS6361147A
JPS6361147A JP61205604A JP20560486A JPS6361147A JP S6361147 A JPS6361147 A JP S6361147A JP 61205604 A JP61205604 A JP 61205604A JP 20560486 A JP20560486 A JP 20560486A JP S6361147 A JPS6361147 A JP S6361147A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 し利用分野] 本発明は比色分析等光学的変化を利用して流体中の特定
成分を定1分析する方法に関する。特に、そのような分
析における所要時間の短縮に関する。
[従来技術の欠点] 液体中に存在する特定の物質を検出するなめに、検出対
象となる物質と適当な試薬との反応により生ずる発色、
変色等の光学的変化を利用する方法は、極めて一般的な
方法であり、比色分析と呼ばれている。湿式法では、被
検物質と反応して発色等の光学的変化を生ずる試薬は、
試料液に添加される。これに対し最近発達した乾式法で
は、試薬を含有する分析要素に液体試料を点滴し、被検
物質と試薬の反応により生ずる発色等を測定する。
このような乾式分析要素として例えば、特公昭53−2
1677号や特開昭55−164356号に開示された
ものがある。
試料液に試薬を添加するか、乾式分析要素に試料液を点
着すると、試薬と被検成分が反応し、色素の形成等が生
ずる0例えば、特開昭55−164356号に記載され
た乾式分析要素に血液または血漿を点着すると、分析要
素中の試薬と検体中のグルコースが反応し、色素、例え
ば赤色の色素が形成される。乾式分析要素の光学濃度は
生成した色素の量に対応するから、一定時間後に反射光
学濃度を測定し、予め求めておいた検1線からグルコー
ス濃度、いわゆる血糖値に換算する。湿式法では、液の
透過濃度が測定される。
従来は、反応速度を測度として酵素などの活性を測定す
る反応速度法による分析の場合を除くと、試料液の点着
または試薬の添加から一定時間後に光学濃度測定を行う
のみであった。被検成分の濃度(例えば血糖値)が、比
較的低い場合にはすでに反応が終了しているので、この
時間まで待つ必要はなく、時間の不経済である0分析法
作に要する時間が短縮された乾式分析法では、なおさら
である、しかし被検成分の濃度が高い場合には、反応時
間が短いと検量線の勾配が小さく、分析値の変動係数が
大となり、十分な分析精度が得られないことが多い。
[解決すべき技術課題] 本発明は、液体中の特定物質の濃度を比色分析笠で測定
する方法において、分析精度を損なうことなく、分析に
要する時間を必要最小限度に短縮することを目的とする
[課題解決の手段] 本発明においては、 (1)光学濃度を反応開始後適当な時間間隔で複数回測
定することにより、光学濃度の変化な追跡し、 (2)各測定時点における光学濃度の値から更に反応を
継続するかどうか判断し、 (3)分析精度の上で更に反応を継続する必要がないと
判断した場合は、その反応時間に対応する検量線を選択
し、 (4)反応を継続する必要があると判断した場合は更に
反応を1!続し。
(5)精度の上から必要最小限度の反応時間で分析を終
了する ことを特徴とする。
本発明は種々の発色反応に基づく比色分析、特に一体化
乾式分析要素を用いた比色分析に適用できる1例えば以
下に列挙するような発色反応に基づく比色分析に適用で
きる。
(1)被検物質(アナライトともいわれる)との反応に
より直接または間接に生成した過酸化水素を検出する種
々の発色反応0例えば、 ペルオキシダーゼその他の過酸化物触媒活性物質の存在
下においてフェナジン類(1−フェニル−2,3−ジメ
チル−4−アミノピラゾリン−5−オン、1−(2,4
,6−ドリクロロフエニルー2.3−ジメチル−4−ア
ミノピラゾリン−5−オン等)とフェノール類(フェノ
ール、α−ナフトール、1.7−シヒドロキシナフタレ
ン等)とのカップリング反応、 ペルオキシダーゼ等の存在下においてベンジジン型色原
体、例えばベンジジン、0−トルイジン、0−ジアニシ
ジン、テトラメチルベンジジンの、変色反応(f9#え
ば、USP2,981,606号の記載参照)、 イミダゾール核を有するロイコ色素、例えば2.4.5
−トリアリールイミダゾール、2.4−ジアリール−5
−アルキルイミダゾール等からの色素生成反応。
(2)NADとN A D H、またはNADPとNA
D P Hの間の酸化還元反応に共役する電子伝達剤を
介してのテトラゾリウム塩からのホルマザン色素形成反
応0例えば、特開昭59−88097号に記載されたテ
トラゾリウム塩からの色素形成反応。
(3)芳香族ジアゾニウム塩とビリルビンの結きによる
アゾビリルビンの生成反応1例えばUSP2.854,
317号、同3,880,588号、特開昭59−14
5965号の記載参照。
(4)バニルマンデル酸とジアゾニウム塩、例えばp−
ニトロベンゼンジアゾニウムとによるアゾ色素の形成反
応。
(5)クレアチニンとピクリン酸塩からの色素形成反応
(いわゆるヤッフェ法)。
(6)酵素活性下での自己顕色性基質からの色素解茫0
例えば USP4,233,403号に記載のあるp−二トロフ
ェノール置換オリゴ糖から、パラニトロフェノールを生
成する加水分解反応、 γ−グルタミルバラニトロアニリド、リン酸バラニトロ
フェノール等から、パラニトロフェノールを生成する加
水分解反応。
(7)1性環境でナフチルアミン類、例えばN−(1−
ナフチル)−N’ −ジエチルエチレンジアミンと0−
フタルアルデヒドと尿素との反応、例えば特開昭55−
69038号、特開昭58−117457号に記載のあ
る反応。
(8)金属イオン、例えばカルシウムイオンと、キレー
ト剤、例えば3.3′−ビス[(ジ(カルボキシメチル
)アミン)メチル] −0−クレゾールフタレインとの
間のキレート色素形成反応。
(9)酸塩基指示薬のpI−1による変色0例えば、フ
ェノールスルフオフタレイン、ブロムクレゾールグリー
ン、ブロムクレゾールパープル等の変色。
(10)酸塩基指示薬の蛋白質による変色0例えば、ア
ンモニア、尿素等の分析に利用されるブロムクレゾール
グリーン、ブロムクレゾールパープル、テトラブロモフ
ェノールブルー等のアルブミンによる変色。
(11)総蛋白の定量に利用される、アルカリ環境にお
けるビウレット試薬の呈色。
色素の形成または変色(吸収波長変化)のみならず、色
素の退色や有色物質の減少を測定する場合にも、本発明
が適用できる0例えば、N A D HまたはNADP
Hの減少を測定するグルコースの分析や、フェリシアン
化物の減少を測定するグルコースの分析である。
短波長電磁波、例えば紫外縁、放射線の励起により生ず
る蛍光を測定する場合にも、本発明が適用できる。また
化学発光、生物発光などの発光を測定する場合にも、本
発明が適用できる6例えば、過酸化水素の作用によるル
ミノールの発光等。
[発明の効果] 本発明は、液体中の特定物質の濃度を比色分析等で測定
する方法において、分析精度を損なうことなく、分析に
要する時間を必要最小限度に短縮することができる。
試料液の点着または試薬の添加から一定時間後に光学濃
度測定を行う従来の終点法分析に比し、本発明では、被
検成分の濃度(例えば血vN値)が比鮫的低い場合には
反応が比較的短時間に終了しているのでそれ以上待つこ
となく分析を終了し、分析時間の経済を図ることができ
る。乾式分析法のように分析操作に要する時間が短縮さ
れた分析法では特にその長所を活用することができる。
一方、被検成分の濃度が高い場合には、反応時間が短い
と検量線の勾配が小さく、分析値の変動係数が大となり
、十分な分析精度が得られないことがあるので、このよ
うな場合には必要な反応時間を取ることにより、分析精
度を高く保つことができる。曳式分析要素を用いた分析
法では、上の傾向が多く見られるので、これは重要であ
る。
本発明では、分析時間の単なる短縮だけでなく、試料液
中の被検成分濃度に応じて、分析精度の上で必要な最小
限の反応時間を選ぶので、分析精度を損なうことなく所
要時間の合理的な短縮が達成できる。
[実施例] く化学分析スライドの作製〉 下記のようにして、グルコース乾式化学分析スライドを
作製した。
ゼラチン下塗りがされている厚さ180ミクロンのポリ
エチレンテレフタレート平滑フィルムの上に下記オ■成
の試薬層塗布液を、乾燥厚さが15ミクロンになるよう
に塗布し乾燥した。
ゼラチン            20gペルオキシダ
ーゼ      2500IUグルコースオキシダーゼ
   100OI01.7−シヒドロキシナフタレン 
 0.5g4−アミノアンチピリン      0.5
gポリオキシエチレン ノニルフェノール       0.2g水     
             200m1その上に下記組
成の光遮蔽層塗布液を乾燥厚さが7ミクロンになるよう
に、塗布、乾燥した。
ゼラチン            10g二酸化チタン
         100g水           
       500m1光遮蔽層の上に下記組成の接
着層を乾燥膜厚が2μmになるよう塗布、乾燥した。
ゼラチン            4gポリオキシエチ
レン ノニルフェノール       0.1g水     
            200mN接着層を30g/
m2の割合の水で湿らせた後、綿ブロード織物を軽く圧
着し、乾燥させた。
上記のように作製されたグルコース分析フィルムを、1
5X15mmに切り、24X28mmのプラスチック製
マウントに収納した。
く比色分析操作〉 上記のように作製されたグルコース分析スライドを、第
1図に示す分析装置のスライド挿入位置2に装填し、試
料液1oμ!をマイクロとベットで点着した後、直ちに
スライド送りレバー4を測光位置3まで押して、インキ
ュベータ7内にスライドを送り込む。
分析装置内に設けられたタイマーにより、スライドの送
り込みから2分後に、インへ一ユベータの下方に設けら
れた測光窓を通して、スライド内の化学分析フィルムの
支持体側からの反射光学濃度を、光学濃度測定ヘッド(
プローブ)12の光源と測光部14、参照先の測光部1
5によって測定した。光源には透過極大波長500nm
のフィルターを光路に挿入した。
本発明における代表的な工程を示すフローチャートを、
本実施例の場合について第2図に示す。
点着から2分後に測定した光学濃度の値が0゜400よ
り小のときには、反応を打ち切ってスライドとインキュ
ベータからトレイ23に排出させる一方、反応時間2分
での用意された検量線を用いて、グルコース濃度を算出
する。検量線は演算装置内の記憶装置に記憶されている
ものが、演算制御装置からの指令信号により泗択されて
演算装置の演算部にインプットされ、演算に用いられる
2分後の光学濃度が0.400以上であるときには、3
分後までインキュベータ内でスライド上の反応を継続さ
せて、光学濃度を測定する。
3分後の光学濃度が0.600より小のときには、反応
を打ち切ってスライドをインキュベータから排出させる
一方、反応時間3分での用意された検Jl線を用いて、
グルコース濃度を算出する。
3分後の光学濃度が0.600以上であるときには、さ
らに4分後までインキュベータ内でスライド上の反応を
継続させて、4分後に光学濃度を測定する。
4分後の光学濃度が0.700より小のときには、反応
を打ち切ってスライドをインキュベータから排出させる
一方、反応時間4分での用意された検量線を用いて、グ
ルコース濃度を算出する。
4分後の光学濃度が0.700以上であるときには、さ
らに5分後までインキュベータ内でスライド上の反応を
継続させて、5分後に光学濃度を測定する。
5分後の光学濃度が0.850より小のときには、反応
を打ち切ってスライドをインキュベータから排出させる
一方、反応時間5分での用意された検量線を用いて、グ
ルコース濃度を算出する。
5分後の光学濃度が0.850以上であるときには、さ
らに6分後までインキュベータ内でスライド上の反応を
継続させて、6分後に光学濃度を測定する。測定終了後
のスライドは排出される。
本実施例における以上の論理処理フローチャートを第3
図に示した。
く検量線の作製〉 各反応時間に対する検量線は、分析に先立ち以下のよう
にして作成した。
前記のグルコース分析スライドに、0,50゜100.
150,200,250,300,350゜400.4
50,500,550,600mg/dlのグルコース
をそれぞれ含む管理血清(市販管理血清およびそれに所
要量のグルコースを加えたもの)を、マイクロとベット
を用いて点着し、1゜2.3,4,5.6分後の反射光
学濃度を測定した。
各グルコース濃度における反応時間と反射光学濃度の関
係は、第4図に示すごとくであった。このグラフをもと
に、反応時間2.3,4,5.6分における検X線(グ
ルコース金型対光学濃度)を求めた、各反応時間に対す
る検量線は第5図に示すごとくであった。
【図面の簡単な説明】
第1図は実施例に用いた分析装置の断面図と電気回路の
模式図である。 第2図は工程フローチャートの代表例、第3図は実施例
の論理処理フローチャートである。 第4図は実施例における反応時間と反射光学濃度の関1
系を示すグラフ、第5図は実施例における検量線を示す
グラフである。 第1図、第2図で各記号の示す意義は下記の通りである
。 1 スライド挿入レバーの、スライド排出位置を示す 2 スライド挿入レバーの、液点着位置を示す 3 スライド挿入レバーの、測光位置を示す4スライド
挿入レバー 5 スライド挿入レバー(平面図) 6 スライド送り部 7 上部保温部材 8 化学分析スライド    16 ランプ9 黒板 
         17 増幅器10 白板     
    18 増幅器11 下部保温部材   1つ 
切り換え器12 測光ヘッド    2OA/D変換器
13 レンズ      21 コンピュータ14 受
光素子     22 ベース15 受光素子(9照光
) 23 スライド排出トレー 出願人     富士写真フィルム株式会社手続補正書
(方式)4・ 1、事件の表示    昭和61年特願第λorto4
A号2、発明の名称   分析方法 3、補正をする者 事件との関係       特許出願人連絡先 〒10
6東京都港区西麻布2丁目26番30号補正命令の日付
  昭和47年17月27日(発送日) 補正の対象  図 面 補正の内容 窮/、3、φ区別紙の通シ。 手続補正書 1、事件の表示    昭和67年特願第−20j60
4′号2、発明の名称  分析方法 3、補正をする者 事件との関係       特許出願人性 所  神奈
川県南足柄市中沼210番地4、補正の対象  図 面 5、補正の内容 第3図を別紙の通り補正する。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 液体中の特定物質の濃度または活性を、化学反応を介し
    て生ずる光学的変化を検出して測定する分析方法におい
    て、光学濃度または発光強度を反応開始後適当な時間間
    隔で複数回測定することにより、光学濃度の変化を追跡
    し、各測定時点における光学濃度の値から更に反応を継
    続するかどうか判断し、分析精度の上から反応を継続す
    る必要がないと判断した場合はその反応時間に対応する
    検量線を選択し、反応を継続する必要があると判断した
    場合は更に反応を継続して、分析精度の上から最小限度
    の反応時間で分析を終了することを特徴とする分析方法
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