JPS6352889A

JPS6352889A - 抗ヘパラン硫酸モノクロ−ン抗体及びこれを用いるヘパラン硫酸の検出方法

Info

Publication number: JPS6352889A
Application number: JP61195298A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Koike; 泰志小池; Masato Kato; 正人加藤; Hiroharu Kimata; 弘治木全; Akira Suzuki; 鈴木　旺
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1986-08-22
Filing date: 1986-08-22
Publication date: 1988-03-07
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: JPH0753756B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の属する技術分野］本発明は、ヘパラン硫酸に対して特異性の高いモノクロ
ーン抗体及びそれを用いるヘパラン硫酸の検出方法に関
するものである。

［従来の技術とその問題点］ヘパラン硫＃（以下ｒＨ５Ｊという、）は、動物のほと
んど全ての種類の細胞の表面に存在しくＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒ７．１０．１４４５（１９７１））　、細胞と
細胞間マトリックスの相互作用にもっとも基本的に関与
するグリコサミノグリカンといわれている。

また、癌化により細胞の接着能が低下し、細胞の移動性
が増加したり、増殖の接着阻害部が喪失するのは、ＨＳ
の変化が関与しているともいわれている。

その他、ＨＳは。

（イ）細胞の核の成分としてＤＮＡ発現め制御に関与す
る（口）神経系における主要プロテオグリカンである（ハ）血管内皮細胞表面の成分としてリボ蛋白リパーゼ
の結合部位となり、脂質代謝に関与する（二）細胞の成
長を制御する（ホ）基底膜の成分として蛋白等の透過性を制御する等の諸機能を有すると考えられている。

このように動物体内に幅広く存在し、多様な機能を備え
たＨＳは、動物及びヒトにとって重要な成分であり、そ
の定性的ないし定量的な、特異性の高い検出は、生物学
及び医学上非常に重要な意義を有する。このような意味
でＨＳのモノクローン抗体は、またとない検出試薬とな
りうるちのである。

プロテオヘパラン硫酸に対する抗体についてはいくつか
の報告［Ｐｒｏｃ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、、　７７、４４
９４（１９８０）；　Ｊ、　（：ｅｌｌ、　ＥｌｉｏＬ
、、　９”ａ、　１７４３（１１１８４）；　Ｊ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、出、　９７Ｂ（１９８５月が
ある。

しかしながら、これらの抗体は、プロテオヘパラン硫酸
のコア蛋白を認識するもので、Ｈ３ｔ！！ｉｊＱ部分を
認識するものではない。

そこで１本発明者らは、Ｈ３糖鎖部分に対し、優れた特
異性を示すモノクローン抗体を得ることを目的として鋭
意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

［発明の構成］本発明は、ＨＳを含有する組織由来のプロテオヘパラン
硫酸を抗原として予め免疫したラットの脾細胞とマウス
のミエローマ細胞との細胞融合により形成されたハイブ
リドーマから産生される抗ＨＳモノクローン抗体、及び
該モノクローン抗体を用いることを特徴とするＨＳの検
出方法に関するものである。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明の目的を達成するための第一段階は、抗体を産生
ずる新規な単クローンハイブリドーマを確立することで
ある。このハイブリドーマを確立する方法の具体的詳細
は実施例で示すが、簡単には次の３工程から成る。

１、免疫２、　細胞融合３、　ハイブリドーマの還択と単りローン化免差本発明において、抗原として用いるプロテオヘパラン硫
酸としては、ＨＳを含有する組織、例えばマウスのＥｎ
ｇｅｌｂｒｅｊｈ−Ｈｏｌｍ−３ｖａｒｍ腫瘍（以下ｒ
ＥＨ５腫瘍」という。）、ウシ肝臓、ブタ肝臓、ウシ肺
臓及びブタ肺臓由来のものであれば、如何なるものでも
よいが、特にＨＳに富んだ組織由来のもの、例えばＥ　
ＨＳ　Ｉｌｉ　Ｌ％組織由来のプロテオヘパラン硫酸を
用いることが好ましい。

免疫動物としては、ラー７トを用いるが、このうち、免
疫グロブリンを産生じない腫瘍細胞株の確立されている
Ｗｉｓｔａｒ系ラットを用いることが好ましい。

通常、免疫は数回に分けて行うが、初回免疫はアジュバ
ントと共に投与することが好ましい。

アジュバントとしては、ミョウバン、結核死菌、核酸、
フロインドアジュバント等が使用される。

縄ぷり東介最終免疫後にリンパ節或は牌臓を摘出し、得られるリン
パ球を細胞融合に供する。一方、細胞融合に使用される
腫瘍細胞株としては、通常、マウスのＢＡＬＢ／ｃ由来
（７）　Ｐ　３Ｎ　Ｓ　−１／１−Ａｇ４−１、ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ（Ｐ３　Ｕｌ）、Ｐ３　　Ｘ６３
−Ａｇ３　６５３、ＳＰ２１０−Ａｇ１４等を用いる。

ハイブリドーマの巽　と屯クローン化ハイブリドーマの増殖の盛んな細胞Ｊｅ　ｆＪ上清を種
々の分析法（例えばＲＩＡ　、プラーク法、凝集反応、
ＥＬ　ＩＳＡ等）で目的の抗体産生ハイブリドーマを選
択する。ハイブリドーマを得たならクローニングを行う
。クローニングの方法としてはＦＡＣ５（Ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｔ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔ
ｅｒ）を用いたり、５ｏｆｔ　Ａｇａｒを用いてコロニ
ーを拾い一部げる方法の他に、一般によく用いられる限
界希釈法等がある。クローニングはコロニーが一つのハ
イブリドーマから形成されるような細胞濃度で行う。

限界希釈法では９６ウエルブレー１・の１ウエルあたり
細胞が１個以下になるように行う。どの方法を用いても
クローニングは２回繰返し行い、単一クローンとする。

！Ｌ、、！ｉＳモノクローン″−一の辛Ｊ゛クローンを
確立したなら抗体は大址にｉｎ　ｖｉｔｒ。

で培養するか、或はｉｎ　ｖｉｖｏで培養するかによっ
て産生されるａ　ｉｎ　ｖｉｔｒａで産生された抗体は
他の抗体の混入はないが抗体価は低い。ｉｎ　ｖｉｖｏ
で産生された抗体は宿主が若干混じるが、抗体価はｉｎ
　ｖｉｔｒｏに比し非常に高い。どちらの方法で抗体を
産生させるかは目的による。

上記方法により、抗ＨＳモノクローン抗体が得られる。

旦】」工夾律抗ＨＳモノクローン抗体を用いて４．１Ｆ異的にＨＳを
検出するためには、常法に従って酵素抗体法、蛍光抗体
法、重金属抗体法、ビオチン−アビジンシステム、ペル
オキシダーゼ−抗ベルオ午シダーゼ法等によって行われ
る。

［発明の効果］本発明によれば、ＨＳの多糖類のみを認識するモノクロ
ーン抗体を提供でき、これを用いることによりＨＳを特
異的に検出することができる。

［発明の実施例］以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

実施例１（１）プロテオヘバランイ“　の・製ＥＨ８ｌ１１１′ｊ瘍をマウスに移植して増殖させ、こ
れを摘出した。この腫瘍より、Ｊ、　ｉｌｌ、　１ａｓ
ｓｅｌｌ　　らの方法（Ｐｒａｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７、４４９４（１９８
０））に従ってプロテオヘパラン硫酸を精製し、採取し
た。

（２）底生立λ讃（１）で得たプロテオヘパラン硫酸の一部をジチオスレ
イトールで還元処理した。処理したもの及び未処理のも
のを等間合わせて２８０−　ｇのプロテオヘパラン硫酸
をフロイント完全アジュバントとともにＳ　ｌ　ｃ　Ｗ
ｉｓｔａｒ系ラットの腹腔内と背中皮下に注射して感作
した。次いで、２遇間毎に計５回ブースター注射をした
。この時、還元処理及び未処理のプロテオヘパラン硫酸
の等量からなる１２０　、ｇのプロテオヘパラン硫酸を
フロインド不完全アジュバントとともに投かした。感作
後、ＥＬ　ｒｓＡ法により抗体価をチェックしたところ
、３万以上であったので、ラットを殺し牌臓を摘出し、
常法により浮遊脾細胞を得た。こうして得た細胞１０に
対し、マウスのミエローマＮ５−１．ＩＩ胞１の割合で
、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。

次いで、ハイブリドーマとミエローマ細胞とを分けるた
めにＨＡＴ　ｊ２地で２四間ｊ８五し、残存ミエローマ
細胞を死滅させた。

（３）クローニング常法に従いクローニングを行い、得られたクローンの産
生ずる抗体についてＥＬｉＳＡ法に従いスクリーニング
を行った。この時、抗原のプロテオヘパラン硫酸と反応
するが、ヘパリチナーゼで処理したプロテオヘパラン硫
酸とは反応しないクローンを選択して行き、２種のクロ
ーンを得、それぞれＨＫ−１４４及びＨＫ−２４９と名
付けた。これら２種のクローン細胞の増殖を行って抗体
を集めた（以下、ＨＫ−１４４由来のモノクローン抗体
をｒＨＫ−１４４抗体Ｊ、ＨＫ−２４９由来のモノクロ
ーン抗体をｒＨＫ−２４９抗体」という、）。

両抗体は、マイルス・ラボラトリーズ・インコーホレー
テッド（以下「マイルス社」という、）のモノクローナ
ルタイピングキットを用いて分析し、クラスエｇＭと同
定された。

実施例２実施例１で得られたＨＫ−１４４抗体及びＨＫ−２４９
抗体を用いてその性質を調べた。尚、これらの性質は、
　　Ｅｌ、ＩＳＡ法［Ａ、　Ｂ、　Ｂ、、工。

３９９　（１９８１）］　及びＥＬＩＳＡ−阻害実験に
よっ阻害対した。

（１）抗体価のＪｌｌｌ定ＥＨ５腫瘍由来のプロテオヘパラン１ｉｔ酸をＶｏｌｌ
ｅｒ’ｓ緩衝液で蛋白濃度ｌ弘ｇ／ｍｌに溶解した抗原
溶液ｔ　ｏ　ｏ　ｇｘをＥＬ　ＩＳＡ用マイクロタイタ
ープレート　（９６穴、ポリビニル製）の各ウェルに加
え、４℃で２〜３日静置して抗原をコートした。プレー
トをＰＢＳ（リン酸緩衝化塩溶液）〜０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０溶液で３回洗？’Ｊｌ後、各ハイブリドーマ培
養上清（３倍希釈を繰り返した）（ＲＰＭＩ　　１６４
０培地、１０％ＦＣＳ）を加え、室温で１〜２時間反応
させた。ＰＢＳ〜Ｔｗｅｅｎ　２０溶液で３回洗浄後、
ペルオキシダーゼを結合した抗ラット（Ｉ　ｇＧ＋Ｉ　
ｇＭ）のウサギイムノグロブリンＣＤＡＫＯ社）／ＰＢ
Ｓ〜Ｔｗｅｅｎ　２０溶液１００ｇＭ／ウェルに加え、
１時間室温で反応させた。

Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ２０溶液にて４回洗浄後、オ
ルトフェニレンジアミン−過酸化水素水溶液［オルトフ
ェニレンジアミン１０　ｍｇ７１　ｍｌメタノール。

３０％過酸化水素水溶液１０ル見、蒸留水１００１コ　
１５０ルｌを加え、発色させ、３Ｍ硫酸５０μ父で反応
停止後、４８０ｎｍの吸光度を測定した。

こうしてＨＫ−１４４、ＨＫ−２４９抗体液の抗体価を
測定した。その結果を第１図に示す。

両抗体ともに約７００倍以上の抗体価が認められた。

（２）プロテオヘパラン硫酸に対する酵素消化の影響（Ａ）へパリチナーゼ（ヘパラン硫酎分解酵素）ＥＨ３
ｉ′ｌＪ瘍由来のプロテオヘパラン硫酸（蛋白質１　ｇ
　ｇ／ｍ１．ウロン酸０　、５　ｇ　ｇ／ｍｌ）溶液１
００ｇＭ／つｘ　ルテ’：１−ト後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔ
ｗｅｅｎ２０溶液で３回洗浄した。ヘパリチナーゼ０．
２ｍ工Ｕ／ウェルにより３７℃で３０分加温消化後、　
　ＰＢ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ２０溶液にて２回洗節し、酵
素除去後、各抗体１００一文／ウェルを加え、反応した
。対照としてプロテオヘパラン硫酸のコア蛋白部分を認
識するモノクローン抗体ＨＫ−１０＝２を用いて対比し
た。その結果を第２図に示す。第２図において、（−）
はヘパリチナーゼ未処理の場合の結果を表わし、（＋）
はヘパリチナーゼ処理を行った場合の結果を表わす。

ＨＫ−１４４抗体、ＨＫ−２４９抗体はへパリチナーゼ
処理を行ったプロテオヘパラン硫酸に結合性を示さない
ことがら、糖鎖認識抗体であることがわかる。

（Ｂ）プロナーゼ（蛋白分解酵素）プロテオヘパラン硫酸１１００ＡＬを水２００μ文に溶
解し、プロナーゼ（１０ｍｇ７’ｍｌ　　ＩＭトリス−
塩酸緩衝液　ｐＨ７、４）を４８牌文加え、５０℃で２
４時間反応させた。反応液を５分間ｉｏｏ’ｃで加熱し
て酵素を失活させた後、エタノール沈殿して上清を除去
し乾燥させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２０溶液１ｏｏＪＬ
文に溶解した。対照として失活させたプロナーゼをプロ
テオヘパラン硫酸に加え、ただちに、エタノール沈殿し
たものを用いた。これらの溶液を段階希釈してＨＫ−１
４４及びＨＫ−２４９各抗体に対する阻害実験を行った
結果、プロテオヘパラン硫酸をプロナーゼ消化してもそ
の阻害活性はほとんど変化しないことがわかった（結果
省略）。このことは両抗体とも糖鎖を認識することを支
持する結果である。

（３）ＨＫ−１４４抗体及びＨＫ−２４９抗体の特異性本発明のモノクローン抗体の各種糖に対する反応特異性
を調べるために、ＥＬＩＳＡ法による阻害実験を行った
。

各ウェルにＥＨ５ＩｌｔｌＬＧ由来のプロテオヘパラン
硫酸（蛋白質１ルｇ／ｍｌ）溶液１００μ旦でコート後
、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回洗浄した。

）ＩＫ−１４４、ＨＫ　−２４９抗体液は４卸ｄ／ウエ
ルずつ使用した。該抗体の反応特異性を調べるだめの各
種グリコサミノグリカンは、各グリコサミノグリカンｌ
ｆｆ１ｇ／ｆｆ１ｌの原液を開始腋とし、段階的焉釈液
を調製し、各種、各濃度のグリコサミノグリカン溶液８
０ｐ、Ｑと各抗体液とを同時にプロテオヘパラン硫酸で
コートしたウェルに添加し、室温で１〜２時間抗原抗体
結合を行わせた。

Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄後、ペルオキ
シダーゼを結合した抗うッ）　（Ｉ　ｇＧ＋Ｉ　ｇＭ）
のウサギイムノグロブリン／　Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅ
ｒ＋２０溶液を１００ル文／ウェルずつ加え、室温で１
時間反応させた。未反応物を洗７’ｌ＋　Ｌ、オルトフ
ェニレンシアミン−過酸化水素水溶液１５０　ｇｕを加
え、反応により生じた色調を４８０ｎｖ５の吸光度をＡ
ｌＩ３定することにより調べた。

各グリコサミノグリカンの添加量に対応する吸光度をプ
ロットし、阻害剤無添加時の吸光度の乃僅に対応する添
加量を５０％阻害量（Ｉ　Ｃ５ｏ）とした。その結果を
第１表に示す。第１表において、記号〉は、少なくとも
、この量までは阻害が起こらないことを示している。

第１表第１表から、本発明のモノクローン抗体は、ＨＳ以外の
グリコサミノグリカンとは反応せず、ＨＫ−１４４抗体
の方が各種動物由来のＨＳと反応する広い特異性を有し
、ＨＫ−２４９抗体はマウスＥ）（Ｓ腫瘍由来のＨＳに
のみ反応する狭い特異性を右することがわかる。

以上の結果より、本発明の抗ＨＳモノクローン抗体は、
ＨＳの多＄ｌ！ｉ鎖のみを特異的に認識するので、種々
の疾患、特に悪性腫瘍の診断に有用、かつ簡便な方法を
提供するといえる。

（４）ＨＫ−１４４抗体及びＨＫ−２４９抗体の特異性（ＨＳの化学修飾による反応性の検Ｊ・］）（Ａ）−Ｎ
Ｈ２基のアセチル化ＥＨＳ腫瘍由来のＨＳ５０８Ｌｇを水８０ｐＱに溶解し
、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液２０μ文及び５％（ｗ／マ）
無水酢酸水溶液２０用文を加えて攪拌後、室温で１０分
間静置した。エタノール沈１のを２回繰返した後、屹燥
した。

（Ｂ）Ｎ−３ｏ３．、Ｉ、Ｑの脱硫醇化長沢らの方法［
Ｃａｒｂｏｈ２ｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４８
．８７（１９７Ｂ）］に従って、Ｎ−５ｏ、基の脱硫Ｍ
化を行った。

Ｅ　ＨＳ　Ｉ１４瘍由来のヘパラン硫酸５０．ｇを水８
０ｇ１に溶解し、Ｄｏｗｅｘ　５０Ｗ（Ｈ”　）で処理
し、Ｈ＋型とし、ピリジンで中和してピリジン塩とした
。乾燥後、水５％を含むジメチルスルホ午シト１００ｔ
ｌに溶解し、５０℃で９０分間反応させ、０．２Ｎ　　
ＮａＯＨ水溶液で中和した。エタノール沈殿を２回繰返
した後、乾燥した。

（Ｃ）対照ＥＭＳ腫瘍由来のＨＳを水８０　ＪＬｌに溶解し。

対照とした。

前記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）で調製した各試料に本発
明のモノクローン抗体液２００−文を加え、予めＥＨ３
腫瘍由来のプロテオヘパラン硫酸でコートしたウェルに
加え、ＥＬ　ＩＳＡ法にて阻害実験を行った。その結果
を＠３図に示す。

ＨＫ−１４４抗体の場合、ＨＳの化学修飾により特異性
の変化はみられなかった。一方、ＨＫ−２４９抗体の場
合、アセチル化による変化はみられなかったが、Ｎ−５
ｏ、基の脱硫酸化により抗体に対する阻害活性が消失し
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗体価の測定結果を示す図である。第２図は、ヘパリチナーゼ消化が本発明のモノクローン
抗体の反応性に与える影響についての試験結果を示す図
である。第３図は、ＨＳの化学修飾が本発明のモノクロ
ーン抗体の反応性に与える影響についての試験結果を示
す図である。第１図第２図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヘパラン硫酸を含有する組織由来のプロテオヘパ
ラン硫酸を抗原として予め免疫したラットの脾細胞とマ
ウスのミエローマ細胞との細胞融合により形成されたハ
イブリドーマから産生される抗ヘパラン硫酸モノクロー
ン抗体。
（２）ヘパラン硫酸を含有する組織がマウスのＥｎｇｅ
ｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍組織である特
許請求の範囲第１項記載のモノクローン抗体。
（３）マウスのＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−ＨＯＩｍ−Ｓｗ
ａｒｍ腫瘍組織由来のヘパラン硫酸と結合する特許請求
の範囲第２項記載のモノクローン抗体。
（４）マウスの肺臓及び腎臓並びにウシの肺臓の正常組
織由来のヘパラン硫酸と結合する特許請求の範囲第３項
記載のモノクローン抗体。
（５）マウスの肺臓及び腎臓並びにウシの肺臓の正常組
織由来のヘパラン硫酸と結合しない特許請求の範囲第３
項記載のモノクローン抗体。
（６）ヘパラン硫酸を含有する組織由来のプロテオヘパ
ラン硫酸を抗原として予め免疫したラットの脾細胞とマ
ウスのミエローマ細胞との細胞融合により形成されたハ
イブリドーマから産生される抗ヘパラン硫酸モノクロー
ン抗体を用いることを特徴とするヘパラン硫酸の検出方
法。
（７）ヘパラン硫酸を含有する組織がマウスのＥｎｇｅ
ｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−ｓｗａｒｍ腫瘍組織である特
許請求の範囲第６項記載の検出方法。
（８）抗ヘパラン硫酸モノクローン抗体がマウスのＥｎ
ｇｅｌｂｒｅｔｈ−ＨＯＩｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍組織由来
のヘパラン硫酸と結合する特許請求の範囲第７項記載の
検出方法。
（９）抗ヘパラン硫酸モノクローン抗体がマウスの肺臓
及び腎臓並びにウシの肺臓の正常組織由来のヘパラン硫
酸と結合する特許請求の範囲第８項記載の検出方法。
（１０）抗ヘパラン硫酸モノクローン抗体がマウスの肺
臓及び腎臓並びにウシの肺臓の正常組織由来のヘパラン
硫酸と結合しない特許請求の範囲第８項記載の検出方法
。