JPS63501076A - 蛋白質の工業的分別プロセスにおいて使用可能な、蛋白質及び脂肪酸の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質の工業的分別プロセスにおいて使用可能な、蛋白質及び脂肪酸の分離方法 本発明は、精製及び濃厚蛋白質を得、ることを目的とした蛋白質の工業的分別プ ロセスにおいて使用することのできる、蛋白質及び脂肪酸を分離するための方法 に関する。

蛋白質の分別は、下記の目的のためにいろいろな工業において実施されている１ 操作であるニ ー副産物の価格設定（例えば、と殺場で生じる動物血の処理；乳清及び酪農産業 の副産物の処理）；−治療用製品の製造：、ヒト血漿、の分別；　。

−植物由来の製品の価格設定（えんどう、フィールドビーン、なたね、・・・） 。

これらの用途、そして得られる蛋白質の要求品質の基準の帰結として、いろいろ な分離方法が開発されている。

熱“凝固（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎどによる蛋白質の全面沈殿は、異なる蛋白質 を分別しないけれども、但し、低コストでもって、動物飼料用として一般に意図 される製品の集合体を回収することを可能にする。

限外濾過は、蛋白質をそれらのサイズに従って分離することを可能にする。しか し、この方法は、実質的に、蛋白質溶液を濃縮しかつ精製するために用いられて いる。

まだ工業的に開発の段階にあるところのクロマトグラフィｉ法、では、固体の吸 着剤を使用して、蛋白質の分別をそれらの親和性に従って行うことが可能である 。この有望な技法は、・　経済的り観点から１．吸着剤の°毒（ｐｏｉｓｏｎｉ ｎｇ）″に対する著しい感度を自体立証しなければならない。

最も良く用いられている工業的分別法は、ｐＨ条件、イオン力、沈殿剤の性質及 び濃度の函数として、蛋白質を選択的に沈殿させることに基づいている。血漿蛋 白を得るために世の中で最も広く用いられている方法は、エタノールの使用に′ 基づいている（ＣＯＨＮ法）。この方法には、トライ及びテストを入念に行い得 、そして細菌汚染の危険を制限し得るという利点がある。しかし、この方法は、 エタノールの価格や４℃を下延る冷時で処理を行うことの必要性に原因して、多 額の出費を必要とする。

あるところでは、別の沈殿剤が工業的スケールで試験されている。かかる沈殿剤 は、特に６〜１４個の炭素原子を有する脂肪酸、とりわけカプリル酸であり、周 囲温度で分離が可能でありかつ多数の蛋白質にとっての安定剤であるという利点 を奏する。しかしながら、カプリル酸によって沈殿せしめられた蛋白質の回収は 、この沈殿剤の使用を制限するところの多くの問題をかかえている。沈殿の有効 な再溶解にはかなりの量の塩が必要であり、また、かかる塩は、特定の蛋白質を 変性させ得かつ希釈された蛋白質溶液を導（。従って、大半の用途の場合、追加 の濃縮工程が必要となってくる。

本発明の目的は、温和な条件の下で、すなわち、蛋白質を変化させないで、蛋白 質を回収し、そしてこれらの蛋白質を分別するために用いられた脂肪酸を再循環 させるための方法を提供することにある。

そのために、精製及び濃厚蛋白質を得るために蛋白質の分別に用いられる蛋白質 及び脂肪酸を分離するためのこの方法は、非混和性の液膜を形成する溶液を含浸 した多孔性支持体に脂肪酸を拡散させ、その際、一方では、脂肪酸及び蛋白質の 溶液から構成される被処理充填物を液膜を含浸せる多孔性支持体の一方の側に供 給しかつ、他方では、脂肪酸受理層を多孔性支持体の別の側に供給することを特 徴とする。

支持体付きの液膜を使用した本発明による方法では、低いｐＨ値（ｐＨ４，５〜 ６）であっても蛋白質−カプリル酸沈殿の溶解な促進すること、蛋白質の最終濃 厚溶液を直接に得ること、そして続けて行う再循環の観点から、カプリル酸の全 部あるいは一部を容易に回収することが可能になる。

本発明による方法によって得られる溶液は、澄んでおりかつ蛋白質が変性せしめ られていない。９０％よりも高率の蛋白質収量を得ることができる。

本発明の１実施態様は、以下、非限定の実施例を使用して、本発明による方法を 実施する液膜装置の断面図である添付の図面を参照しながら、説明する。

図面の簡単な説明 図面は本発明に従う方法を実施する装置を示すが、２つの画室１及び２を持つモ ジュールで構成され、画室１及び２は非混和性液膜と呼ばれる溶液を含浸した多 孔性支持体３で分離され、処理することが望まれる充填物６と、受理層と呼ばれ る相４とを有する。充填物６は例えばほぼ水性の溶液中のカプリル酸と蛋白質の 沈殿物の懸濁液から成る。受理層４は液膜を通って拡散したカプリン酸を集める ことを意図するものである。受理層はカプリン酸が著しく可溶であるか（例えば 塩基性水溶液）、あるいはこの酸が適当な錯化剤で強く錯化されうるか、あるい は不溶性塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、・・・） の形で沈殿されうろことが好ましいであろう。さらに、カプリル酸は受理層の蒸 発か濾過のいずれかあるいはその他の公知の分離手段によって受理層に容易に回 収されなければならない。

モジュールを去る溶液は、一方は、画室２を去ってカプリル酸を回収する装置に 向かうカプリル酸に冨む溶液５であり、もう一方は、画室ｌを去る可溶化された 蛋白質に冨む溶液７多孔性支持体３は下記の特性を有さなければならない。

・高い孔密度（好ましくは７５％よりも大）・小さい孔径（好ましくは１ミクロ ンより小）・最小膜厚（２００ミクロンより小） ・例えばポリテトラフルオロエチレン、ポリフルオロビニリデン、有機液膜のた めの疎水性重合体、ポリカーボネート、セルロース、あるいは親水性液膜の場合 にはその他の親水性重合体のような、液膜によって趨潤可能である少なくとも１ 種の材料によってできていること・最小表面積であること。

本発明による方法は、蛋白質が沈殿した正にその媒質中に、すなわち、ｐＨおよ び塩分の変化なしで、蛋白質を再溶解することを許容する利点がある。この方法 は脂肪酸の再循環と、従って、分別コストのかなりの低減を許容する。さらに、 この方法は自動化が容易である。

本発明による方法を実施するいくつかの限定的でない例を以下に説明として記載 する。

■工 多孔性支持体はポリテトラフルオロエチレン膜（孔径０．５ミクロン、膜厚１０ ０ミクロン）である。用いたモジュールの交換表面は７ｄである。

液膜は医療用の流動パラフィン（２０℃での粘度１４ｃＰ、屈折率１．４５７　 、引火点１６０℃）で構成される。受理相は０．４Ｎソーダ溶液９ＱｃｒＡから なる。

被処理充填物は家庭用磨砕機で５秒間磨砕したヒトアルブミンとカプリル酸の沈 殿物３ｇからなる。この沈殿物の重量組成はほぼ下記の通りである。

・アルブミン　３３％ ・カプリル酸　３３％ ・水分　３３％ この沈殿物をｐＨ４，９０の０．０６Ｍ酢酸ナトリウム溶液８７ｃｆｆｌ中の懸 濁液として保持する。２つの画室ｌ及び２の相を機械的に攪拌する。温度を２０ ℃に保持する。

下記第１表は２つの画室ｌ及び２中の濃度の変化を示し、５５ｇ／ｒｒｒ−ｈｒ に等しい蛋白質の生成物流を計算することが可能である。

抽出するカプリル酸の収率は６時間後に約６０％である。

第一１−表 倒」− この例では、多孔性支持体はフン化ポリビニレン膜（孔径０．２２ミクロン、膜 厚１００　ミクロン）である。この膜はそれぞれ１００　ミクロンに近い膜厚で 良好な機械的特性を与える非常に多孔性の親水性支持体２枚で挾持されている。

装置は０．７Ｍのひだ付きの膜を含む゛円筒状カートリッジの形である。液膜は 流動パラフィンからなる。受理相はマグネシア５９．２ｇ／ＩＩ　、　ｐ）１１ ０．２、体積２９４ｄのマグネシア乳である。被処理充填物は０．０６Ｎ＃酸ナ トリウム、グルコース１．２　ｇ／Ｉｔ　、　ｐＨ４，ｓの溶液５７５ｄ中に懸 濁した、家庭用磨砕機で磨砕したアルブミンの沈殿物である。温度は２０℃に保 持する。

下記第２表は、５９％のアルブミンが６．５時間後に溶解すること、および受理 相へのアルブミンの損失はないことを示す。遊離のカプリル酸は不溶性のマグネ シウム塩の形で沈殿するので受理相には殆んど見られない。

第−又一人 多孔性支持体は膜厚約３０ミクロン、孔径１ミクロンのポリカーボネートによる 親水性膜である。液膜は流動パラフィンである。受理相は０．０６Ｎソーダ溶液 （９０ｃＪ）である。画室１は０．０６Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４，９） を含む。

５分後、このタイプの支持体の油性相の付着の乏しさと液膜の非密封性を反映し て２相間のｐ）ｌが等しくなる。沈殿物の溶解は見られない。

■土 支持体３は４ｄの疎“水性ポリカーボネートのひだ付膜（孔径０．２２ミクロン 、膜厚３０ミクロン）を２枚の多孔性支持体間に挾持したものである。装置は円 筒状カートリッジを成す。

受理相は０．０６Ｍの酢酸ナトリウム溶液で、そのｐ）Ｉはソーダを加えて９． ５に近く保持する。画室１中の被処理相は、ｐＨを６に調整し、カプリル酸とア ルブミンの沈殿物５４ｇを加えた０、０６Ｍの酢酸ナトリウム溶液である。温度 は２０℃である。

下記第３表は２つの画室中の濃度の上昇を示す。画室２中のアルブミンの漏れは 実質的に見られない。膜として働く有機液体中にかなりの濃度のカプリル酸が見 られる。

最初に次の内容を示す。すなわち、実験条件下では、０．０６Ｍ酢酸ナトリウム 溶液（ｐＨ４，９）　５０　ｇに、アルブミンおよびカプリル酸の沈殿物２ｇを 溶解することはできない。この目的に対し、沈殿物を酢酸ナトリウム溶液中で２ 時間激しく分散する。この処理後、可溶性アルブミンの濃縮は検出できず、一方 ガプリル酸は１５ミリモル／１に近い平衡濃度に達した。

次いで、この充填物を液膜−受理相系と接触状態に置き次いで充填物（画室１） 内の濃縮物並びに受理相（画室２）内での濃縮物を展開する。

この例において、多孔質支持体は高密度ポリエチレン支持体に支持させた９ｎｒ のポリテトラフルオロエチレン膜である。

孔の直径は０．５ミクロンであり、厚みは約１２５ミクロンである。支持体は、 式Ｃ６Ｆ１３　Ｃ２Ｈ４０Ｈを有するフッ化脂肪アルコールから構成される有機 相０．２　ｇで含浸されている。被処理充填物６は、５０ｇの酢酸ナトリウム緩 衝液（０，０６モル／Ｉｔ　、ｐＨ５，９７）中懸濁状態にある、充填された沈 殿物（４５％の血漿アルブミン；３１％のカプリル酸；２４％の水）から成る。

受理相４（８０ｇ）はグリシンの０．２モル溶液であり、このｐＨはソーダによ り９に調節されている。これは当初３ｇ／ｌのグルコースを含有する。

第４表は二相内の濃縮物の展開を示す。

導入したカプリル酸の４５％が、５時間後に受理相中に見出される。一方、アル ブミンの２４％が画室１に溶解していた。

受理相に達するカプリル酸流は、６４ｇ／ｈｒ−ｒｒｒに等しい。

時間の遅れの後、アルブミンを実験条件の下０．１８ｇ／ｈｒ、に近い速度で溶 解する。

肛 実験モジュール、支持体３、被処理充填物および受理相は、例５で記載したもの と同じである。

液膜は、「トリデカノール」、１３個の炭素を有する分枝アルコールの混合物０ ．１４ｇにより構成される。

得られた結果を下記の第５表に示す。

芽ユ」Ｌ−表 実験モジュール、支持体、充填物および用いた受理相は、例５で述べたものであ る。液膜は、０．１４ｇのシリコーン油から構成される。

第６表は、濃縮の経時的展開を示す。

第６表 ２７％のカプリル酸を受理相から回収する。

１４％のアルブミンは、これらの条件下５時間後区画１内で可溶化した形態で存 する。

■ 実験モジュール、支持体、充填物、および受理相は、例５で記載したものである 。

液膜は、式ＣＩＦＩ？　Ｃ２Ｈ４を有するフン化アルカン０．１７ｇにより構成 される。

測定した濃縮物を下記の第７表に示す。最初の酸の３３％が受理相に見出される が、わずか２％のアルブミンが画室１で溶解しておりこの画室ではまた先の例に 対するよりもより高濃度の酸の蓄積が認められ得る。

実験モジュールは、多孔質支持体３を含有し、これは孔径０．０２ミクロンを有 しかつ厚さ約４００　ミクロンのポリテトラフルオロエチレン膜である。液膜は 、液体パラフィンにより構成されている。受理相は、ｐＨを９に調節した０、２ モルグリシン溶液（３７０ｇ　）である。

充填物は、０．０６モルの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４，９７）１０１　ｇに分 散したカプリル酸および血漿トランスフェリンの沈殿物により構成される。２０ 時間後、沈殿物は完全に溶解（１００％溶解）し、充填物内のトランフェリン濃 度は、１０．７　ｇ　／　Ｉｔである。

手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＦＲ８６１００２５４ ２、発明の名称 蛋白質の工業的分別プロセスにおいて使用可能な、蛋白質及び脂肪酸の分離方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 昭和６２年１０月２７日（発送日） ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定１；Ｊる書面の［特許出願人の代表者 」の欄 （２）委任状 （３）明細書の翻訳文 （４）請求の範囲の翻訳文 （５）法人証明書 ７、補正の内容 （１）（２）（５）　別紙の通り （３）明細書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（４）請求の範囲の翻訳文の浄 書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の ５第１項の規定による書面　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 、（３）明細書の翻訳文　１通 （４）請求の範囲の翻訳文　１通 （５）法人証明書及びその翻訳文　各１通ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　’ｈＦ−ＺＮＴＥ λＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　ＱＮ！？ｆｆＥＲＮＡＴＩＯ ＮＡｒ、ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＦＲ８６１００２５４（Ｓ Ａ　１３９３４）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．精製及び濃厚蛋白質を得ることを目的とした蛋白質の工業的分別プロセスに おいて使用可能な、蛋白質及び脂肪酸を分離するための方法であって、非混和性 の液膜を形成する溶液を含浸した多孔性支持体（３）を通して脂肪酸を拡散させ 、また、一方では、脂肪酸及び蛋白質の溶液から構成される被処理充填物（６） を液膜を含浸せる多孔性支持体（３）の片側（１）に供給し、かつ、他方では、 脂肪酸受理相（４）を多孔性支持体（３）の別の側（２）に供給することを特徴 とする蛋白質及び脂肪酸の分離方法。
2. ２．脂肪酸が、著しく可溶であるか、さもなければ錯化剤によって強く錯化せし められ得るか、さもなければ不溶性塩の形で沈殿せしめられ得る受理相（４）を 使用することを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．多孔性支持体（３）が、好ましくは７５％よりも大である高い細孔密度、好 ましくは１ミクロンよりも小である小さな径、そして好ましくは２００ミクロン よりも小さな最小膜厚を有することを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の方 法。
4. ４．多孔性支持体（３）が、液膜によって湿潤可能である材料、例えばポリテト ラフルオロエチレン、ポリフルオロビニリデソ、有機液膜のための疎水性重合体 、ポリカーボネート、セルロース、あるいは親水性液膜の場合に任意のその他の 親水性重合体からできていることを特徴とする、請求の範囲第２項に記載の方法 。
5. ５．カプリル酸を脂肪酸として使用することを特徴とする、請求の範囲第２項に 記載の方法。