DK168692B1 - Peritonealt dialysat, samt terapeutisk præparat til anvendelse som osmotisk aktivt middel - Google Patents

Description

i DK 168692 B1

Den foreliggende opfindelse angår et peritonealt dialysat samt et terapeutisk præparat til anvendelse som osmotisk aktivt middel.

Den normale funktion hos pattedyrs nyrer indbefatter en sådan 5 aktivitet, som opretholdelse af en konstant syre-base-balance og elektrolytbalance, fjernelse af overskydende væsker og fjernelse af uønskede produkter af legemets metabolisme fra blodet. Hos et individ med nyresygdom på slutstadiet kan denne funktion hos nyren være reduceret til så lavt som 5% eller 10 mindre af det normale niveau. Når nyrefunktionen er faldet til dette punkt, må der anvendes kunstige midler til erstatning for nyrens aktivitet, hvis livet skal opretholdes. Dette udføres klinisk ved anvendelse af dialyse. En af de mest almindelige metoder til opnåelse af dette er hæmodialyse, hvor pati-15 entens blod føres gennem en kunstig nyredialysemaskine. I denne maskine virker en syntetisk ikke-permeabel membran som en kunstig nyre, med hvilken patientens blod bringes i kontakt på den ene side, mens der på membranens modsatte side er en dialysevæske eller dialysat, hvis sammensætning er således, at de 20 uønskede produkter i patientens blod naturligt vil passere tværs gennem membranen ved diffusion ind i væsken. Derved renses blodet i det væsentlige på samme måde som nyren ville have gjort det, og blodet føres tilbage til patientens legeme. Denne dialysemetode kræver, at patienten er fysisk forbundet med 25 maskinen i adskillige timer, ofte flere gange om ugen. Skønt denne metode er effektiv, giver den af indlysende grunde et antal ulemper.

Nogle af de ulemper, der er forbundet med hæmodialyse, som kræver ekstrakorporeal behandling af blod, overvindes ved an-30 vendelse af metoder, som anvender patientens egen bughinde (peritoneum) som den nødvendige semipermeable membran. Bughinden er den membranagtige foring af det legemshulrum, der indeholder et stort antal blodkar og kapillarer, og som således er i stand til at virke som en naturlig semipermeabel membran.

35 Dialyseopløsning indføres i peritonealhulrummet med et kateter DK 168692 B1 2 i bugvæggen. En passende opholdstid for dialysatet gør det muligt for dette at udveksle opløste materialer mellem dialysatet og blodet, og fjernelse af væske opnås ved at tilvejebringe en passende osmotisk gradient fra blodet til dialysatet for 5 at muliggøre vandoverstrømning fra blodet. Således føres den korrekte syre-base-balance, elektrolytbalance og væskebalance tilbage til blodet, og dialyseopløsningen udtages simpelthen fra legemshulrummet gennem kateteret. Selv om der eksisterer mere end én type peritoneal dialyse, er den teknik, der er 10 kendt som kontinuerlig, ambulatorisk peritoneal dialyse (CAPD), særligt begunstiget, da den ikke kræver, at patienten forbliver bundet til apparaturet, mens udbytningen af opløste stoffer og væske gennemføres. Den eneste nødvendige fastsiddende periode er under infusion og dræning af dialyseopløsnin-15 gen.

Et af de mest vanskelige træk ved peritoneal dialyse, og stadig et af de vigtigste, er at finde et passende osmotisk middel til indføjelse i dialysatet, hvormed der kunne opnås den nødvendige osmotiske gradient. Med osmotisk aktivt middel, som 20 anvendt i nærværende beskrivelse og krav, menes et stof, der er til stede i dialyseopløsningen og som er i stand til at opretholde den osmotiske gradient, der er nødvendig til at forårsage transport af vand og giftige stoffer tværs gennem bughinden ind i dialyseopløsningen. Det pågældende middel skal 25 opfylde mindst to kritiske kriterier. For det første må det i større eller mindre omfang være biologisk inaktivt, dvs. ugiftigt og alligevel metaboliserbart, og for det andet må det fortrinsvis ikke passere hurtigt gennem bughinden ind i blodet; dette ville muliggøre opretholdelse af den maksimale ul-30 trafiltreringsgradient og ville også hindre toksicitet eller akkumulering af uønskede stoffer i blodet. Fravær af toksicitet er særligt vigtig, da næsten ethvert stof, der anbringes i bughinden, til sidst vil finde sin vej ind i kredsløbet, hvad enten det bliver ved en langsom lymfatisk dræning eller ved 35 dialyse igennem bughindemembranen. Hidtil har intet kendt stof fuldstændigt tilfredsstillet disse behov, selv om et antal 3 DK 168692 B1 forskellige materialer har været anvendt med varierende succes. Det middel, som for tiden har opnået den mest udstrakte accept, er glucose. Glucose har fordelen ved at være ugiftig og er også let metaboliserbar, hvis det indtræder i blodet.

5 Hovedproblemet med dets anvendelse er imidlertid, at det let optages i blodet fra dialysatet. Selv om ethvert stof, som nævnt ovenfor, til sidst vil finde sin vej ind i kredsløbet, passerer glucose bughinden så hurtigt, at den osmotiske gradient nedbrydes inden for 2-3 timers infusion. Dette kan endog 10 forårsage omvending af ultrafiltreringsretningen, hvilket forårsager det uønskede resultat, at vand genabsorberes fra dialysatet mod afslutningen af den tid, der tillades for udbytning eller udveksling. Desuden kan den mængde glucose, der indtages, repræsentere en stor andel af patientens energiind-15 tagelse, idet den muligvis er så høj som 12-35%. Mens dette ikke på signifikant måde påvirker en ikke-diabetisk patient, kan det være en alvorlig metabolistisk byrde for en patient, hvis glucosetolerance allerede er svækket. Denne yderligere belastning kan være inddraget i hyperglycæmi og obesitet, 20 hvilket er iagttaget hos et antal CAPD-patienter. Diabetiske patienter lider af den yderligere ulempe og risiko, at de må tilsætte insulin til det peritoneale dialysat for at nedsætte risikoen for hypoglycæmina som følge af tilsat glucosebelast-ning.

25 Anvendelse af glucose giver også problemer ved fremstillingen af dialysatet. Sterilisation af dialysatet gennemføres typisk ved opvarmning, hvilket ved en fysiologisk pH-værdi vil få glucose til at karamellisere. For at kompensere for dette, indstilles dialysatets pH-værdi sædvanligvis til inden for 30 området fra 5,0-5,5. Denne lave pH-værdi, der ligger så langt under det, der er normalt for legemet, kan være ansvarlig for den smerte, der opleves af nogle patienter ved indstrømning, og kunne forårsage sclerose af peritonealmembranen, hvilket igen vil forårsage en nedsættelse af udligningen eller fjer-35 nelsen af opløste stoffer (Schmidt et al., Arch. Int. Med., 141: 1265-1266, 1980).

4 DK 168692 B1

Disse ulemper gør det i høj grad ønskeligt at finde et passende alternativ til glucose som et osmotisk middel. Et antal stoffer har været foreslået til opfyldelse af kriterierne med hensyn til at være biologisk inaktiv, til ikke let at passere 5 peritonealmembranen, til at være ugiftig og til at udøve et passende osmotisk tryk ved strømningskoncentrationer. Hidtil har ingen af de foreslåede materialer vist sig at være nogen passende substitut for glucose. F.eks. har anvendelsen af dex-traner (Gjessing, Acta Med. Scan., 185: 237-239, 1960) eller 10 polyanioner (US-patentskrift nr. 4.339.433) været foreslået som følge af deres høje molekylvægt, som til et minimum skulle nedsætte deres diffusion tværs gennem bughinden ind i blodet. Lymfekarsystemets rolle ved processen til transport af opløste stoffer begrænser imidlertid tydeligvis fordelene ved den høje 15 molekylvægt i sig selv (Allen et al., Amer. J. Physiol., 119: 776-782, 1937) . Også med hensyn til polyanionerne er det uklart, hvorledes disses toksiske virkninger vil være, da de fleste er ikke-metaboliserbare. Lignende problemer med metabolisme iagttages med forbindelser såsom sorbitol, xylitol og 20 glucosepolymerer. Sorbitol, som metaboliseres meget langsomt, har været forbundet med tilfælde af hyperosmolært koma og dødsfald (Raja et al., Ann. Int. Med., 73: 993-994, 1970) og anvendes ikke længere. Både xylitol og glucosepolymerer har også tendens til at akkumulere i blodet og kan være forbundet 25 med ubehagelige bivirkninger (Bazyato et al., Trans Amer. Soc. Artif. Interm. Organs, 28: 280-286, 1982). Fructose, som er sammenlignelig med glucose med hensyn til dets osmotiske kapacitet, udviser også mange af de samme ulemper. Som følge af dettes, højere pris har det ikke opnået nogen udbredt anven-30 delse.

Mere lovende er den foreslåede anvendelse af aminosyrer til erstatning af glucose. Aminosyrer tolereres udmærket uden nogen kendte skadelige bivirkninger (Oren et al., Perit. Dial. Bull, 3: 66-72) . Som følge af deres lavere molekylvægt udviser 35 de en højere osmotisk virkning på massebasis end glucose. Imidlertid resulterer dette også sandsynligvis i en hurtigere 5 DK 168692 B1 optagelse i blodet, hvilket forårsager hurtigt tab af osmotisk gradient. Selv om aminosyreoptagelse i modsætning til optagelse af glucose kan være gunstig, idet det kan kompensere for proteintabet, der iagttages hos mange CAPD-patienter, er der 5 en betydelig ulempe i de næsten uoverkommelige priser for ami-nosyreopløsninger sammenlignet med glucose. Desuden giver den hurtigere optagelse af aminosyrer en betydelig nitrogenbyrde, som på signifikant måde øger blodets urinstofnitrogenniveauer.

Det ses således, at selv aminosyrer ikke giver de passende er-10 statninger.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse kan der imidlertid nu opnås forbedringer i metoden til peritoneal dialyse, som anvender et osmotisk middel, som ikke blot er et sikkert og gunstigt alternativ til glucose, men som også er økonomisk 15 mulig. Det har nu overraskende vist sig, at en blanding af forholdsvis lavmolekylære oligopeptider (300-2000 dalton) vundet ved enzymatisk hydrolyse af et protein af høj kvalitet, såsom valleprotein, kan anvendes som et effektivt osmotisk middel i en peritoneal dialyseopløsning. Sammenlignet med en 20 aminosyreopløsning forhindrer peptidernes noget højere molekylvægt den hurtige optagelse ind i blodet, hvorved der opnås mulighed for en mere effektiv opretholdelse af den osmotiske gradient, ligesom der forhindres en uønsket forøgelse af nitrogen i blodet. Peptidblandingen, som til sidst, skønt meget 25 langsomt, absorberes i serum, giver yderligere et værdifuldt kostmæssigt supplement, idet peptidblandingen er afledt af et protein med høj kvalitet. Endelig giver den omhandlede peptidblanding en ukostbar og let tilgængelig kilde for osmotisk middel. Andre peptidblandinger, der anvendes til medicinske 30 formål, har tidligere været beskrevet. F.eks. beskriver US-pa-tentskrift nr. 4.427.658 et proteinhydrolysat opnået ved enzymatisk hydrolyse af valleprotein. I dette tilfælde blev det anført, at der skulle gennemføres en næsten total enzymatisk hydrolyse uden adskillelse af større peptider fra mindre pep-35 tider. Derfor indeholder det resulterende produkt tilsyneladende peptider af betydeligt større størrelser, sandsynligvis 6 DK 168692 B1 op til 5000 dalton eller mere i den endelige blanding. Dette kan give en antigen og/eller allergisk risiko, da pinocytotisk optagelse fra bughinden til blodet er kendt. Dette er signifikant forskelligt fra de omhyggeligt adskilte blandinger, som 5 indgår i det peritoneale dialysat ifølge opfindelsen, og som har forholdsvis lav molekylvægt.

Den foreliggende opfindelse angår et peritonealt dialysat, som er ejendommeligt ved, at det som et osmotisk aktivt middel omfatter en osmotisk effektiv mængde af en blanding af peptider, 10 hvilken blanding i det væsentlige består af peptider med en molekylvægt på mellem 300 og 2000 dalton og en ækvivalentvægt på mellem 150 og 1500 i kombination med en elektrolytisk osmotisk afbalanceret peritoneal dialyseopløsning.

Opfindelsen angår også et terapeutisk præparat til anvendelse 15 som osmotisk aktivt middel ejendommeligt ved det i krav 10's kendetegnende del angivne.

Til fremstilling af det peritoneale dialysat benyttes en metode til isolering af opløste materialer med lav molekylvægt, hvilken metode omfatter, at man bringer en vandig opløsning i 20 kontakt med den ene side af en dialysemembran, der er i stand til at tillade transport af de opløste materialer, samtidigt bringes den modsatte side af membranen i kontakt med i det væsentlige rent vand vundet fra en omvendt-osmose-enhed, som fødes fra et reservoir, hvilket vand har en tilstrækkelig kon-25 centration af opløste materialer, til at tillade transport af de opløste materialer tværs gennem membranen ind i vandet, idet vandet fører og transporterer de opløste materialer til reservoiret, og akkumulerer de transporterede opløste materialer ind i reservoiret ved retention af opløste materialer 30 hos membranen til omvendt osmose.

Fig. 1 viser skematisk isolationsskemaet for den kombinerede dialyse/omvendt osmose.

7 DK 168692 B1

Fig. 2 viser mønsteret for eluering af peptidblandingen fremstillet i eks. IB.

Fig. 3 viser den gennemsnitlige mængde af peptider, udtrykt som aminendegruppe, der forbliver tilbage i bughinden over en 5 periode på 60 min.

Fig. 4 viser den gennemsnitlige mængde glucose, der bliver tilbage i bughinden over en periode på 60 min.

De omhandlede farmaceutiske præparater indeholder, som det aktive osmotiske middel, peptidfraktioner med afvigende molekyl-10 vægtfordelinger, idet hvert peptid har en øvre molekylvægtsafskæringsværdi på 2000 dalton. Generelt talt er peptidernes aminosyresammensætninger ikke særligt vigtig, og naturligvis vil den variere i overensstemmelse med den proteinkilde, hvorfra blandingen er opnået. Det vigtigste træk er udvælgelsen af 15 en population med lav molekylvægt, hvilken molekylvægt må være stor nok til at forhindre hurtig transport tværs gennem bughindemembranen og alligevel lille nok til at opretholde den krævede osmotiske gradient, som forklaret ovenfor. Det er blevet fastslået, at det mest effektive størrelsesområde for de 20 indbefattede peptider er ca. 300-2000 dalton, idet ækvivalentvægten bør være mellem ca. 150 og 1500, idet den foretrukne gennemsnitlige ækvivalentvægt ligger mellem ca. 250 og 750.

Peptidblandinger kan let fremstilles ved hydrolyse af større proteiner. Proteinhydrolyse kan gennemføres ved et antal kend-25 te metoder. F.eks. er en almindelig hydrolyseteknik kogning af proteinet i nærværelse af kraftige mineralsyrer eller alkalier. Dette har imidlertid den uheldige virkning, at der sker en potentiel ødelæggelse eller i det mindste ændring af et antal af de frigjorte aminosyrer. Det er også vanskeligt at kontrol-30 lere det produkt, der fremstilles. Sur hydrolyse vil ikke nødvendigvis bryde proteinet i den samme stilling i hvert tilfælde og giver således et uforudsigeligt produkt. Reaktionen er også ganske hurtig, og med mindre den overvåges omhyggeligt, 8 DK 168692 B1 vil den resultere i en samling af individuelle aminosyrer i stedet for den ønskede blanding af små peptider. Således anses sur hydrolyse ikke som værende velegnet til det foreliggende formål. En anden mulighed for hydrolytisk værktøj er et antal 5 kemiske reagenser såsom hydroxyamin eller 2-nitro-5-thiocyano-benzoat, som hver vil spalte et protein alene i specifikke dele af kæden. Det foretrukne valg er anvendelsen af enzymhydrolyse til opnåelse af de ønskede peptidblandinger. Enzymhydrolyse har den vigtige fordel, at den er forholdsvis let at 10 kontrollere, således at der ikke sker fuldstændig hydrolyse, og produktet har den ønskede molekylvægtssammensætning.

Der er et bredt udvalg af enzymer, hvoriblandt der kan vælges et passende hydrolytisk middel. Nogle af de mulige valg er blandt andet trypsin, chymotrypsin, papain, pepsin eller visse 15 mikrobielle proteaser. En blanding af proteolytiske enzymer såsom pancreatin (chymotrypsin og trypsin) kan også anvendes. Hvert af disse spalter generelt protein ved et specifikt sted, f .eks. vil trypsin kun spalte et protein ved carboxyl s iden af lysin- og argininrester. Chymotrypsin vil fortrinsvis angribe 20 ved en aromatisk aminosyres carboxylside. Pepsin foretrækker at spalte hydrofobe aminosyrer. De forskellige specifikke virkninger hos andre proteolytiske enzymer er velkendt og er let tilgængelig for den erfarne kemiker. På grund af denne specifikke virkning vil den som slutprodukt opnåede peptid-25 blanding være forskellig i afhængighed af, i det mindste delvis, hvilket enzym, der anvendes til hydrolyse. Som det bliver vist nedenfor, har imidlertid den faktiske sammensætning af peptid- blandingen ringe eller slet ingen betydning, når blot den korrekte osmolalitet opnås, og peptiderne er inden for det 30 ønskede størrelsesområde. Det vil let fremgå for fagfolk hvilke typer enzymer, der er anvendelige til det omhandlede formål .

En anden variabel, der påvirker typen af det fremstillede produkt, er naturligvis typen af det protein, der hydrolyseres.

35 Selv om praktisk talt en hvilken som helst type i kosten fore- 9 DK 168692 B1 kommende protein er et velegnet substrat, foretrækkes det, at det anvendte protein er et protein af høj kvalitet. Med betegnelsen protein af høj kvalitet anvendt i nærværende beskrivelse og i kravene menes et protein, der indeholder en høj andel, 5 i almindelighed mindst 50%, og fortrinsvis i området fra 60% til 70% essentielle aminosyrer, dvs. lysin, leucin, isoleucin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan, valin og histi-din. Generelt talt har animalsk protein tendens til at være af højere kvalitet i denne henseende i forhold til vegetabilsk 10 protein. Særligt gode kilder af protein af høj kvalitet er collagen, visse oksemælkeprodukter såsom valle, og ægprotein, navnlig ovalbumin, selv om ethvert protein, der giver de passende andele af aminosyrer, er anvendeligt. Imidlertid er visse typer af protein, såsom kasein, der indeholder en høj pro-15 centandel af phosphor, ikke passende substrater på grund af nødvendigheden af at begrænse phosphorindtagelse ved uræmi. Grunden til at der foretrækkes protein af høj kvalitet er, at skønt peptiderne ikke som aminosyrerne let diffunderer tværs gennem bughindemembranen, er en vis diffusion uundgåelig. Da i 20 det mindste nogle af peptiderne i blandingen til sidst vil passere ind i blodstrømmen, er det ønskeligt at sikre sig, at det, der indtræder i blodstrømmen, er af ernæringsmæssig værdi. Dialysatet tjener således også i et vist omfang som et pa-renteralt fodringstilskud, hvis der sker diffusion tværs gen-25 nem membranen.

Det mest foretrukne proteinsubstrat til peptidfremstilling er mælkevalleprotein. Valleprotein er det materiale, der forbliver i .opløsning efter syrning af mælk, dvs. efter udfældning af phophoproteinet kasein. Valleprotein udgøres primært af β-30 lactoglobulin, a-laet albumin, immunoglubolin og okse serumalbumin med over 60% sammensat af β-lactoglobulin- og of-lactoal-bumin-fraktioner. Disse to proteiners aminosyresammensætning er velkendt som vist i tabel 1. Valleprotein har de fordele, at det både er let tilgængeligt og forholdsvist billigt at 35 fremstille.

10 DK 168692 B1 TABEL 1

Aminosyresainmensætning af β-lactoglobulin og a-lactalbumin β-lactoglobulin a-lactalbumin 9 Asp (D) 13 5 4 Asn(N) 8 3 Asx(B) 8 Thr(T) 1 7 Ser(S) 7 9 Glu(E) 8 10 9 Gln(Q) 5 7 Glx(Z) 8 Pro(P) 2 3 Gly(G) 6 14 Ala (A) 3 15 5 Cys(C) 8 10 Val (V) 6 4 Met(M) 1 10 Ile(I) 8 22 Leu(L) 13 20 4 Tyr(Y) 4 4 Phe(F) 4 2 Try (W) 4 15 Lys(K) 12 2 His(H) 3 25 3 Arg(R) 1

De enkelte valleproteiner kan let isoleres ud fra deres frak-tionelle opløselighed i ammoniumsulfatopløsning. Der findes et antal planer for separationen af proteinet fra forskellige stoffer på basis af dets opløselighed i 264 g/1 ammoniumsulfat 30 (se f.eks. Armstrong et al.f Biochem. Biophys. Acta, 147: 60-72, 1967; Aschaffenberg et al., Biochem. J., 65: 273-277, 1957; Cervone et al., Biochem. Biophys. Acta, 295: 555-563, 1973). Alternativt er det også muligt at købe de enkelte valleproteiner (Sigma) eller som blandede proteinkoncentrater 11 DK 168692 B1 (Express Foods) .

Som tidligere nævnt vil det være umiddelbart klart for den faguddannede kemiker, at den aktuelle peptidsammensætning vil variere i overensstemmelse med proteinkilden og det til hydro-5 lysen anvendte enzym. Enzymet er regulerende, da som nævnt ovenfor hvert enzym angriber proteinet ved en eller flere specifikke aminosyrer. Således vil f.eks. anvendelsen af trypsin give den samme gruppe af små peptider ved hver anvendelse, dersom substratet er det samme. Derfor vil det med et givet 10 kontrolleret sæt af reaktionsbetingelser altid være muligt at fremstille en forudsigelig peptidblanding under anvendelse af det samme rene enzym og det samme udgangsprotein. Det er korrekt, at de fleste i handelen tilgængelige enzymer kan være forurenet med små mængder af andre proteaser. Disse forurenin-15 ger kan være ansvarlige for fremstillingen af betydelige mængder fri aminosyre, hvis peptiderne får lov til at forblive i kontakt med enzymet. Ved fjernelse af peptider af den ønskede størrelse fra reaktionsbeholderen, efterhånden som de fremstilles, kan man i stort omfang undgå problemet med fremstil-20 ling af uønskede aminosyrer. Det forstås let, at den faktiske sammensætning af peptidblandingen i det mindste med hensyn til hvilke peptider, der er til stede, faktisk i stort omfang er irrelevant. Den kritiske faktor er at sikre, at størrelsen af de fremstillede peptider holdes inden for de angivne grænser 25 fra 300 til 2000 dalton.

Som nævnt ovenfor er det vigtigt at overvåge den hydrolytiske proces·, efterhånden som den skrider frem for at sikre, at hydrolysen giver peptidsammensætninger med passende molekylvægt. Dette gennemføres let på grund af den relative langsomhed, 30 hvormed den enzymatiske proces forløber, men for yderligere at sikre, at signifikante mængder af aminosyrer ikke bliver en del af blandingen, kan reaktionen gennemføres ved en temperatur og/eller pH-værdi, der er forskellig fra det optimale for det anvendte enzym, således at hastigheden for enzymspaltnin-35 gen holdes meget lav. De betingelser, der kræves til fremstil- 12 DK 168692 B1 ling af den ønskede blanding, vil nødvendigvis variere i afhængighed af det anvendte enzym. Da enzymatisk hydrolyse af protein for hvert enzyms vedkommende er en velkendt procedure, er de betingelser, der kræves til den optimale proteolyse un-5 der anvendelse af et antal forskellige enzymer, let tilgængelig i litteraturen (se f.eks. US-patentskrifterne nr. 4.427.658 og 4.145.445 for blot at nævne nogle få af de kendte metoder). Det ligger inden for gennemsnitskemikerens evne uden al for meget forsøgsvirksomhed at vælge den fremgangsmåde, der 10 er bedst egnet til det substrat og det enzym, der anvendes, ud fra de tilgængelige oplysninger.

Selv om man ved den foreliggende opfindelse som nævnt kan anvende et hvilket som helst proteolytisk enzym eller en hvilken som helst kombination af enzymer, er et særligt foretrukket 15 enzym pankreatin eller alternativt de deri indgående enzymer chymotrypsin og trypsin. For yderligere at nedsætte problemet med opnåelse af overskydende mængder af aminosyrer, som følge af de potentielt forurenende proteaser, bør forholdet mellem enzymer og substrat holdes temmelig lavt inden for området 20 0,5% til et maksimum på ca. 5,0%. Efter at hydrolyseproceduren er tilendebragt, og den ønskede peptidkombination er opnået, kan peptiderne renses og separeres fra reaktionsblandingen ved et antal forskellige metoder. I stort omfang vil det endelige molekyl vægt område også afhænge af den metode, der anvendes til 25 adskillelse, som nævnt nedenfor.

De foretrukne osmotiske aktive midler er terapeutiske præparater, der omfatter en blanding af peptider fremstillet ved enzymatisk hydrolyse af et protein af høj kvalitet, hvilken blanding har følgende egenskaber: 30 a) blandingen består i det væsentlige af peptider med molekylvægte mellem 300 og 2000 dalton, b) blandingen indeholder ikke mere end 5 mol% fri aminosyre, 13 DK 168692 B1 c) blandingen indeholder mindst 50% essentielle aminosyrer i peptidform, d) blandingen er osmotisk effektiv, når den i tilstrækkelig mængde sættes til en peritoneal dialysatopløsning, og 5 e) blandingen har en blandingsækvivalentvægt på mellem ca. 150 og 1500.

Særligt foretrukne præparater er sådanne, hvori proteinet af høj kvalitet er valleprotein, som er hydrolyseret med en kombination af trypsin og chymotrypsin, og hvor den endelige 10 blanding har et indhold af essentielle aminosyrer på ca. 60-70%. Disse præparater kan anvendes terapeutisk som de osmotiske midler i peritoneale dialyseopløsninger som nævnt ovenfor, men på grund af deres høje koncentrationer af essentielle aminosyrer kan de også anvendes delvis som et parenteralt føde-15 tilskud.

Som det fremgår klart af den ovennævnte diskussion, er de egenskaber hos slutproduktet, som er vigtigst, at peptiderne, der er indeholdt i opløsningen, ligger inden for et meget specifikt molekylvægtsområde, dvs. mellem ca. 300 og ca. 2000 20 dalton. Peptidmolekylernes ækvivalentvægt, som er udtrykket for molekylernes molekylvægt i forhold til molekylets ladning, er fortrinsvis i området fra 150 til 1500. Ladningen på molekylerne bidrager til den samlede osmotiske koefficient af blandingen og opløsningen. Molekyler med større molekylvægt 25 end 2000 dalton skaber meget ringe osmotisk fremkaldt ultrafiltrering, og meget små molekyler siver for hurtigt over i kredsløbet. Det er således vigtigt, at det er muligt at kontrollere den hydrolytiske reaktion og det resulterende produkt på en eller anden måde, som vil sikre, at det krævede molekyl-30 vægtsområde opnås.

Der foreligger et antal forskellige metoder inden for kendt teknik til isolering og/eller oprensning af peptidkomponenter 14 DK 168692 B1 fra en opløsning. F.eks. kan trichloreddikesyre (TCA) anvendes til at udfælde ethvert tilbageværende protein og enzym, som er i reaktionsopløsningen. Alternativt udfælder et vandblandbart proteinudfældningsopløsningsmiddel, såsom acetonitril (ACN) 5 protein, ved ca. 35-40% ACN, idet peptiderne forbliver i opløsning. Desuden kan man anvende rumfangsudelukkelsesmetoden ved tilsætning af polyethylenoxid til fremkaldelse af en faseadskillelse. Imidlertid kan ingen af disse metoder sikre, at der opnås det nøjagtigt ønskede produkt, dvs. en peptidblan-10 ding med en specifik molekylvægtssammensætning.

Ultrafiltrering er en metode, der hyppigst anvendes, når der ønskes et slutprodukt med specifik molekylvægt. Imidlertid har ultrafiltrering også en alvorlig ulempe forbundet med sig, idet der ikke kan opnås en pålidelig adskillelse, medmindre 15 der er mindst ca. en 10-foldig difference i molekylvægten for de bestanddele, der skal adskilles. Ved forsøgsmæssig anvendelse i forbindelse med opspaltning af det her omhandlede produkt har det således rutinemæssigt vist sig, at molekyler med molekylvægt betydeligt over 2000 dalton vil fremkomme i slut-20 opløsningen til trods for valget af et ultrafiltreringsfilter med en cut-off-værdi på molekylvægten 2000 (se eks. 2) . Der er således ganske simpelt ikke for tiden nogen pålidelig metode tilgængelig til direkte isolering af produkter med lav molekylvægt fra en moderblanding, som er heterogen med hensyn til 25 bestanddelenes molekylstørrelser.

I forbindelse med fremstillingen af de omhandlede osmotiske midler- er der imidlertid blevet udviklet et system til isolering af lavmolekylære opløste materialer fra en heterodispers molekylvægtblanding. Den foreliggende metode, der er baseret 30 på en simpel men uventet kombination af dialyse og omvendt osmose, har vist sig at være særligt medgørlig til opnåelse af den peptidadskillelse, der kræves til det omhandlede produkt. Imidlertid er dens anvendelse ikke begrænset til peptider. Den kan i virkeligheden anvendes til adskillelse af praktisk talt 35 enhver type af opløste stoffer med lav molekylvægt. Med "lav 15 DK 168692 B1 molekylvægt", som anvendt i nærværende beskrivelse og krav, menes molekyler af størrelsen ca. 5000 dalton eller mindre.

I generelle træk forløber fremgangsmåden, der er vist skematisk på fig. 1, på følgende måde: den vandige opløsning, der 5 indeholder de opløste stoffer, der skal isoleres, perfunderes gennem en dialysatorenhed og føres tilbage til kildereservoiret ("reaktionsbeholder" på fig. 1) . Dialysatormembranen vaskes på siden modsat den vandige opløsning med en strøm af frisk vand tilvejebragt af en omvendt-osmose-enhed. Omvendt-10 osmose-enheden giver under tryk en forsyning af i det væsentlige rent vand under forudsætning af, at en tilstrækkelig koncentrationsgradient muliggør dialyse af de forholdsvis koncentrerede opløste materialer tværs gennem membranen og ind i strømmen. Da stoffer med en molekylvægt på over 2000 dalton 15 normalt ikke dialyseres med en signifikant hastighed tværs gennem en dialysemembran, vil disse større stoffer forblive i opløsning og føres tilbage til kildereservoiret, mens produkter med lav molekylvægt (mindre end 2000 dalton) vil passere over i den friske vandstrøm og strømme ind i omvendt-osmose-20 reservoiret. Når væsken fra omvendt-osmose-reservoiret bringes under tryk, vil omvendt-osmose-elementet kun lade rent vand sive igennem, og dette vand bringes igen i kontakt med dialy-satormembranen, hvor det igen vil akkumulere de dialyserbare, lavmolekylære stoffer og transportere dem til omvendt-osmose-25 reservoiret, hvor de koncentreres. Fremgangsmåden kan fortsættes indtil et sådant tidspunkt, hvor det osmotiske tilbagetryk i omvendt-osmose-reservoiret signifikant vanskeliggør fremstillingen af frisk vand, eller indtil kildematerialet er brugt op. De koncentrerede produkter fremstillet på denne måde 30 kan derefter yderligere isoleres ved kendte metoder eller kan anvendes, som de er i afhængighed af fordringerne.

Principperne bag såvel dialyseprocessen som processen med omvendt osmose er velkendte og behøver ikke at omtales i større detaljer her. Omvendt osmose anvendes rutinemæssigt til rens-35 ning af vand (se US-patentskrift nr. 3.774.763) og kan karak- 16 DK 168692 B1 teriseres som en proces, hvor højt tryk på en koncentreret opløsning tillader passage gennem en semipermeabel membran af opløsningsmidlet fra den koncentrerede opløsning til et mere fortyndet fluidum (f.eks. vand eller luft). Fremgangsmåden 5 renser samtidigt opløsningsmidlet og isolerer de opløste stoffer, der er indeholdt deri. Dialyse kan defineres som en passiv proces, hvor resultatet er overføring af opløste molekyler fra en væske med en høj koncentration af opløste stoffer til en væske, der har en lav koncentration af opløste stoffer ved 10 transport af de opløste stoffer tværs gennem en membran, der adskiller de to væsker. Anvendelse af dialyse alene er i et stort omfang for tiden begrænset til adskillelse af meget små molekyler fra meget store molekyler, sådan som tilfældet er ved hæmodialyse.

15 Forskellige membranadskillelsesmetoder har tidligere været kombineret til opnåelse af forskellige formål. F.eks. anvendes ifølge US-patentskrift nr. 3.472.765 en kombination af omvendt osmose og ultrafiltrering til adskillelse af mikroorganismer i et biologisk reaktionssystem fra deres bærevæske eller deres 20 ønskelige metabol i seringsprodukter. Denne metode hviler i et stort omfang på ultrafiltreringsmembraners antagne molekylvægt s af skæring (cut-off). På lignende måde kombineres ifølge US-patentskrift nr. 4.000.065 omvendt osmose og ultrafiltrering for at rense vandige opløsninger, der indeholder lave 25 koncentrationer af organiske forureninger, som kan have molekylvægte på mindre end 10.000. Denne metode afhænger i stort omfang af de begrænsede opløselighedsgrænser for de indeholdte forureninger og hviler også tungt på ultrafiltrering til opnåelse af det ønskede resultat. Hver af disse processer angi-30 ves at skulle være i stand til at udskille stoffer med lav molekylvægt fra vandige opløsninger. Imidlertid beskriver ingen af dem en adskillelsesprocedure, hvor et produkt, der indeholder et snævert område af opløste stoffer med lav molekylvægt, kan adskilles fra andre opløste stoffer, som kan ligge meget 35 tæt på med hensyn til molekylvægt. Den yderligere upålidelighed med hensyn til ultrafiltreringsmembranens afskæringspunkt 17 DK 168692 B1 har tidligere været omtalt. Således ville ingen af disse fremgangsmåder vise sig at være egnede til fremstilling af det foreliggende produkt. US-patentskrift nr. 3.774.763 beskriver en metode til vandrensning under anvendelse af omvendt osmose, 5 hvilket rensede vand derefter muligvis anvendes til en hæmo-dialyseenhed. Imidlertid er proceduren til omvendt osmose kompliceret og kræver et antal yderligere elementer såsom afioni-seringsindretninger og yderligere, når vandet først er renset, er der ikke nogen forsat indvirkning med en dialyseenhed.

10 Den her beskrevne hidtil ukendte fremgangsmåde kræver imidlertid ikke, at de opløste stoffer skal have lav opløselighed i den vandige opløsning, og den indebærer heller ikke de ulemper, der er forbundet med ultrafiltreringsprocedurerne. I stedet udnytter den foreliggende fremgangsmåde dialyseprocessens 15 begrænsninger som en fordel til at udskille molekyler på 2000 dalton eller derunder fra en heterogen blanding af forbindelser, som kan ligge meget tæt i molekylvægt, og separeringen forøges ved anvendelse af omvendt-osmose-processen til både at give en kontinuerlig kilde af rent vand til dialyseprocessen 20 og til kontinuerligt at akkumulere det dialyserbare produkt i koncentreret fom i omvendt-osmose-reservoiret. Det opnåede slutprodukt er et, der opfylder kravene til en opløsning, der indeholder et specificeret område af peptider med lav molekylvægt. Fremgangsmåden er simpel, kræver i det væsentlige kun en 25 to-trins procedure, der kan gentages kontinuerligt, indtil koncentrationen af opløst stof i omvendt-osmose-reservoiret er således, at det forhindrer opbygning af et tilstrækkeligt tryk til at fortsætte trinnet med omvendt osmose. Fremgangsmåden har den yderligere fordel, at den ikke nødvendigvis kræver 30 nogen yderligere foranstaltninger til separation eller oprensning, efter at den er tilendebragt.

De elementer, der skal anvendes ved gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan være et hvilket som helst dialyseapparat og et hvilket som helst omvendt-osmose-apparat 35 ifølge kendt teknik. Hver enhed kan også betjenes i overens- 18 DK 168692 B1 stemmelse med kendte fremgangsmåder med hensyn til temperatur, tryk, fødehastighed osv. Operationstrykket i dialysatoren skal generelt ikke være over 500 mm, fortrinsvis mindre. Operationstrykket for højtryksdelen i omvendt-osmose-enheden må være 5 over det osmotiske tryk af opløsningen i omvendt-osmose-reservoiret og må være tilstrækkeligt forhøjet til at give en permeatstrøm af frisk vand, mod hvilken strømmen, der indeholder opløste materialer fra reaktionsbeholderen, dialyseres. Det typiske arbejdstryk i enheden for omvendt osmose ved frem-10 stilling af det omhandlede produkt er mellem 1,00 MPa og 2,10 MPa (150-300 psi) og fortrinsvis mellem 1,38 MPa og 1,72 MPa. Imidlertid vil det stå klart for den erfarne fagmand, at trykket kan varieres i overensstemmelse med det produkt, der skal isoleres, hvis det er forskelligt fra små peptider. Passende 15 forbindelser til de to enheder er en hvilken som helst type af lavtryksrør sammensat af et inaktivt, ugiftigt materiale såsom plast eller silicone. Undtagelsen er forbindelsen mellem pumpen og cirkulationsledningen til omvendt osmose, som kræver høj tryks-plastledninger.

20 Der kendes mange forskellige membraner, der er egnede til anvendelse ved dialyseprocesser og processer med omvendt osmose (se f.eks. Kirk-Othmer red., Encyclopedia of Chemical Technology, 3. udg., bind 7, "Dialysis", 1979 og bind 20, "Reverse Osmosis", 1982) . Praktisk talt enhver kendt membran med dialy-25 tiske egenskaber kan anvendes til dialyse. Sådanne kan f.eks. være fremstillet af cellulose, celluloseacetat, ethylenvinyl-alkohol, polyacrylonitril eller polymethylmethacrylat. Ved fremstilling af peptidblandinger anvendes der fortrinsvis cellulosemembraner, navnlig membraner med hule fibre og de til-30 hørende dialysatorer. Disse membraner er tilgængelige i en række af permeabiliteter, hvoraf de fleste er egnede til den foreliggende fremgangsmåde. Valget af hvilken membran, der skal anvendes, foretages på basis af den gennemsnitsstørrelse, der ønskes hos de ønskede molekyler. F.eks. er en membran med 35 "normal" permeabilitet, såsom den, der er indeholdt i HF-140 dialysatoren (Cobe Laboratories) , generelt impermeabel for alt 19 DK 168692 B1 med en molekylvægt på over 1500. Hvis der imidlertid ønskes en lidt større molekylvægtsstørrelse, er visse typer af fibre, såsom D2-HDF (Enka) , stadig permeable op til en molekylvægt på 3000-4000 dalton. Permeabiliteterne for i handelen tilgængeli-5 ge membraner er kendt, og det ligger inden for de erfarne fagfolks evner at bestemme, hvilken af membranerne, der er bedst egnet til det pågældende formål i afhængighed af størrelsen og typen af molekyler, der skal isoleres. Med hensyn til membraner til omvendt osmose er enhver membran, der har et højt ni-10 veau for tilbageholdelse af elektrolytter, velegnet. Membraner sammensat af tynde film i en spiralviklet udformning har vist sig at være særlig nyttige til anvendelse ved den omhandlede fremgangsmåde. Imidlertid kan membraner med hule fibre også anvendes effektivt ved den omhandlede fremgangsmåde.

15 Ved siden af valget af membran kan man, hvis kilden for den opløsning, der indeholder opløste stoffer, er et biologisk reaktionsprodukt, regulere gennemsnitsstørrelsen for slutproduktblandingen ved at begrænse hastigheden for enzymatisk spaltning eller hastigheden for den mikrobielle metabolisme-20 proces, der fremstiller produktet. Når der f.eks. er involveret en enzymatisk spaltningsproces, kan reaktionshastigheden holdes nede ved at holde en lav enzymkoncentration i forhold til substratet. Hastigheden kan også ændres ved at køre reaktionen ved en temperatur eller en pH-værdi, der er mindre end 25 det optimale for enzymet eller den mikroorganisme, der anven des. Sådanne modifikationer ligger inden for fagfolks muligheder og evner. Det vil også være klart for fagfolk, at modifikationer i reaktionsprocessen kan kombineres med valget af membran for på den mest effektive og nøjagtige måde at frem-30 stille det ønskede produkt. Med andre ord, når man antager, at molekylvægten hos det ønskede produkt er kendt, er det en forholdsvis simpel opgave ved rutinemæssige, korte gennemførelser af den omhandlede fremgangsmåde at bestemme, hvilken kombination, der giver de mest tilfredsstillende resultater for det 35 ønskede produkt.

20 DK 168692 B1

Som nævnt ovenfor er den omhandlede fremgangsmåde særligt velegnet til fremstilling af peptidblandinger med lav molekylvægt, og den kan anvendes kommercielt i forbindelse med hydrolyse af andre typer af proteiner såsom soyabønneproteiner, æg-5 proteiner eller mælkeproteiner. Den kan også let tilpasses til anvendelsen med en hvilken som helst anden heterogen, ikke-peptidbiånding, hvorfra det er nødvendigt eller ønskeligt at isolere stoffer med lav molekylvægt. F.eks. fremstilles ved mange biologisk baserede fremgangsmåder de ønskede lavmoleky-10 lære produkter hyppigt i nærværelse af et antal hormonale forureninger og proteinforureninger, hvorfra adskillelsen af produktet udgør et alvorligt problem. Dette kan f.eks. opnås ved behandling af majsstivelsehydrolysat for at isolere lavmolekylære maltodextriner. Når majsstivelse hydrolyseres enzymatisk, 15 spaltes stivelsen med høj molekylvægt tilfældigt til fremstilling af stadigt mindre dextriner. Efterhånden som processen fortsætter, kan enzymaktiviteten standses på et vist punkt til opnåelse af en polydispers blanding af polyglycoser (maltodex- · triner) , som anvendes ved levnedsmiddelbearbejdnings industrien 20 som bageadditiver eller sødemidler. Hvis den enzymatiske aktivitet får lov til at fortsætte, er slutproduktet glucose. Anvendelsen af den foreliggende fremgangsmåde gør det muligt kontinuerligt at isolere maltodextriner med lav molekylvægt fra en enzymreaktionsbeholder, en procedure, som ikke hidtil 25 har været mulig. På tilsvarende måde har visse fraktioner af heparin, et antikoaguleringsmiddel, antithrombotisk virkning uden den antikoagulerende virkning. Selv om sådanne fraktioner er ganske værdifulde, er det vanskeligt at adskille dem fra de større-molekyler på grund af deres størrelse (ca. 3.000 dal-30 ton). Den foreliggende fremgangsmåde giver et middel, hvormed det ønskede fragment let kan adskilles fra en heterogen blanding af forbindelser.

Med hensyn til det omhandlede produkt kan den rensede peptidblanding kombineres med en hvilken som helst osmotisk afbalan-35 ceret vandig opløsning, der er passende til anvendelse som et peritonealt dialysat. Et anvendeligt dialysat må, for at være 21 DK 168692 B1 effektivt osmotisk afbalanceret til det omhandlede formål, indeholde en koncentration af elektrolytter, der er tilstrækkelig til at fremkalde diffusion af vand og uønskede metabolise-ringsprodukter tværs gennem bughinden. Der findes ikke nogen 5 "standard"-dialyseopløsning, da behovet kan variere fra det ene individ til det andet. En almindelig opløsning vil f.eks. indeholde specifikke mængder af natrium, chlorid, lactat, magnesium og calcium. Indholdet af en typisk dialysatopløsning er vist i tabel 2, uden at mængden af osmotisk middel er angivet.

10 I en glucoseopløsning ville glucosemonohydrat typisk blive tilsat i en mængde på fra ca. 1,5 til ca. 4,25%. Det vil forstås, at dette blot repræsenterer et eksempel på en mulig opløsning og at variationer i mønsteret vil være tydelige for fagfolk. Andelen af peptidblanding i dialysatet kan variere, 15 men vil normalt ligge i området fra ca. l til ca. 15 vægt% af dialysatopløsningen. Under alle omstændigheder skal mængden af peptid være tilstrækkeligt til sammen med understøttende elektrolytter at give en osmolalitet på ca. 300-500 mOsm/1 (280 mOsm/1 er serums normale osmolalitet og elektrolytterne bidra-20 ger i sig selv sædvanligvis til en osmolalitet på ca. 260 mOsm/1). Indgivelse af dialysatet gennemføres på en måde, der sædvanligvis følges til peritoneal dialyse. Eksempler på metoder til peritoneal dialyse er beskrevet i Peritoneal Dialysis, K. Nolph, red., Martinus Nighoff Publishers, 1981. Den særlige 25 behandlingsplan, der kræves for enhver individuel patient, bestemmes let af patientens læge.

TABEL 2

Bestanddele i en typisk peritonealudskylningsopløsning (i mækv/1) 30 Na 132,0

Ca 3,5

Mg 0,5

Cl 96,0 lactat-anion 40,0 DK 168692 B1 2 2

Den foreliggende opfindelse vil tydeligere kunne forstås ved henvisning til følgende ikke-begrænsende eksempler:

Eksempel 1

Det følgende eksempel viser en fremgangsmåde til fremstilling 5 af peptidblandingen.

A. 150 g SAVOR PRO (Express Foods, Inc., Louisville, Kentucky, U.S.A.), et 75% valleproteinkoncentrat, opløstes i 3 1 destilleret vand og dialyseredes til fjernelse af tilbageværende lactose og salte. Denne behandling tjente til at sænke opløsnin-10 gens ledningsevne fra 700 til 26 μΩ.

Opløsningens pH-værdi indstilledes til 8,0 og opløsningen blev bragt til 40°C. Derefter overførtes opløsningen til en enzymreaktionsbeholder og cirkuleredes gennem en dialysator (som vist på fig. 1) . Dialysatorens dialysatside forsynedes med 15 rent vand fra udgangen af en enhed med omvendt osmose (R.O.) under anvendelse af et af tynde film sammensat spiralviklet element (Film-Tec). Dialysatet tilbageførtes til produktreser-voirbeholderen, hvorfra R.O.-enheden blev forsynet. Cirkulationshastigheden gennem R.O. fra produktreservoiret var 10 20 gange så stort som dets fremstillingshastighed for rent vand for at maksimere sidstnævnte. Enheden blev betjent ved et tryk på ca. 1,38-1,72 MPa. Med begge kredsløb i gang sattes 1,5 g Sigma-trypsin og 1,5 g Sigma-chymotrypsin til enzymreaktions-beholderen. Efterhånden som enzymspaltningen skred fremad, op-25 retholdtes reaktionsblandingens pH-værdi ved hjælp af tilsætning af NaOH. Efterhånden som der i reaktionsbeholderen blev dannet peptider på mindre end 2000 dalton, blev disse dialyseret gennem dialysemembranen (HF-140 hemodialyzer, Cobe Laboratories, Lakewood Colorado) over i produktreservoiret, hvor de 30 forblev, da R.O.-enheden var tilbageholdende selv for små elektrolytter, såsom NaCl. Reaktionsbeholderen fik lov til at køre i 2 timer med udtagning af prøver hvert 10. minut. Produktreservoiret fortsatte med at stige i peptidkoncentration 23 DK 168692 B1 og osmolalitet. Slutproduktet opnået fra produktreservoiret var 46,5 g (31% udbytte) med en gennemsnitlig ækvivalent vægt på 408. Analyse af produktet på en P2-geludelukkelseskolonne under anvendelse af 30% eddikesyre som elueringsmiddel viste i 5 det væsentlige intet peptid i harpiksens tomme rumfang, hvilket viser, at alle peptider er mindre end 1800 dalton.

B. Reaktionen ifølge A blev gentaget på nøjagtig samme måde bortset fra, at der blev anvendt en mere permeabel dialysator (Fresenius D-6 dialysator, Bad Homburg, Forbundsrepublikken 10 Tyskland; D2-HDF fibre, Enka AG) . Dette muliggjorde ekstraktion af en højere procentandel af større peptidfragmenter, end det var muligt ved A. Elueringen gennemførtes som under A og resultaterne er vist på 2. Ækvivalentvægten for produktet var 483.

15 Eksempel 2 Følgende eksempel viser en fremgangsmåde, hvor peptidblandingen renses ved ultrafiltrering i stedet for dialyse og omvendt osmose.

a. En 3% opløsning af valleproteinkoncentrat (85% protein) 20 bringes til pH=8. Trypsin fra Sigma Chem. Co. (#T2395) tilsattes i et forhold på 1:100 regnet på proteinet, efter at opløsningen var blevet bragt til 50°C. Udgangsproteinopløsningens osmolalitet (ved frysepunktssænkning) var 47 mOsm/1. Ved afslutningen af 30 min. reaktionstid ultrafiltreredes opløsnin-25 gen gennem en cellulosemembran (med en begrænsende afskæringsværdi på 5000 dalton) . Da pH-værdien var bragt tilbage til udgangsværdien, var osmolaliteten 112 mOsm/1. Geludelukkelses-kromatografi af ultrafiltratet viste, at til trods for den af fabrikanten angivne lave afskæringsværdi var en lille del af 30 of-lactalbumin-udgangsmaterialet (molvægt = 14.200) trængt igennem ultrafilteret sammen med et bredt molekylvægtsområde af peptidprodukt.

24 DK 168692 B1 b. En 5% opløsning af fast valleprotein i deioniseret vand viste sig at have en osmolalitet på 18 mOsm/1. Opløsningen dialyseredes for at nedsætte elektrolytindholdet, og derefter viste den en osmolalitet på 13 mOsm/1. Et ultrafiltrat (gennem 5 en membran med en nominel afskæringsværdi ved 20.000 dalton) af denne opløsning havde en osmolalitet på kun 3 mOsm/1, mens retentatet steg til 19 mOsm/1, hvilket viser, at der var en meget lille mængde opløst stof med lav molekylvægt (dvs. lactose, salte osv.), som bidrog til osmolaliteten i den som ud-10 gangsmateriale anvendte valleopløsning. Når UF-retentatet omsattes med trypsin ved pH=8, havde det resulterende hydrolysat en osmolalitet på 59 mOsm/1. Hydrolysatet ultrafiltreredes gennem den samme membran som nævnt ovenfor; filtratets osmolalitet fandtes at være 21 mOsm/1. Ultrafiltreringsforsøgene vi-15 ste, at proteinfordøjelsen ikke var fuldstændig, og at det produkt, der blev opnået ved ultrafiltrering af hydrolysatet, indeholdt betydelige mængder af store peptidfragmenter. GPC-analyser fastslog, at ultrafiltratet ikke blot indeholdt store peptider men også noget a-lactalbumin-udgangsmateriale.

20 Eksempel 3 Følgende repræsenterer elektrolytbestanddelene i den perito-neale dialysatopløsning, der anvendes her (g/1):

NaCl 5,38

CaCl2 0,257 25 MgCl2 0,0508

Na-lactat 4,48

De ovennævnte bestanddele giver en osmolalitet på ca. 260 mOsm/1. Til den ovennævnte blanding sattes 61,1 g af peptidblandingen per liter vand, hvilket giver en osmolalitet på ca.

30 126 mOsm/1, hvilket giver opløsningen som helhed en osraolali- tet, der er tilnærmelsesvis ækvivalent med osmolaliteten hos en 2,5% glucoseopløsning.

25 DK 168692 B1

Eksempel 4

Under anvendelse af peptidblandingen fra eks. IB i en opløsning som beskrevet i eks. 3 gennemførtes forsøg til sammenligning af effektiviteten hos de lavmolekylære peptider som osmo-5 tiske midler i forhold til glucoses effektivitet.

Ved prøverne blev der anvendt 4 kaniner afprøvet i A-B-række-følge, således at hver kanin tjente som kontroldyr for sig selv. Hvert dyr dialyseredes med enten 2,5% glucose eller alternativt med tilstrækkeligt med peptid til at bringe opløs-10 ningens osmolalitet til tilnærmelsesvis til osmolaliteten af 2,5% glucoseopløsningen (385 mOsm/1) . Hvert dyrs peritoneal-hulrum fyldtes med ca. 50 ml dialysat per kg legemsvægt. De indførte rumfang og fluidumforøgelsen (som følge af osmotisk ultrafiltrering) ved afslutningen af 60 min. er opstillet i 15 følgende tabel:

Glucoseopløsning Peptidopløsning

Dyr Vol.ml. Vol.ml. Forøgel- Vol.ml. Vol.ml. Forøgelse, % se, % t=0 t=60 t=0 t=60 20 nr.1 190,0 192,0 0,01 204,4 232,0 13,5 nr.2 142,3 161,0 12,9 139,0 164,0 18,0 nr.3 175,9 189,0 7,4 183,2 200,0 9,2 nr.4 168,8 177,0 5,5 157,3 172,0 9,3

Gnsn. 6,5 12,5 25 Ved den samme osmolalitet som glucose viser peptiderne en næsten 100% forøgelse af den osmotiske pumpeaktivitet efter 60 min., åbenbart som følge af den lavere hastighed for tab af peptid sammenlignet med glucose til kredsløbet. Fig. 3 og 4 viser de gennemsnitlige aminende-gruppe-koncentrationer i for-30 hold til tid, og glucose i forhold til tid i bughinden. Dette bekræfter, at kun 20% af peptidet (målt ved endegrupper) går

Claims (10)

1. Peritonealt dialysat, kendetegnet ved, at det som et osmotisk aktivt middel indeholder en osmotisk effektiv mængde af en blanding af peptider, hvilken blanding i det væ- 10 sentlige består af peptid med en molekylvægt på ca. 300 til 2000 dalton og en ækvivalentvægt mellem ca. 150 og ca. 1500.

2. Dialysat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at peptiderne er fremstillet ved hydrolyse af i det mindste et protein af høj kvalitet.

3. Dialysat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at hydrolysen er en enzymatisk hydrolyse.

4. Dialysat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at proteinet er valleprotein.

5. Dialysat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at enzymet er valgt fra gruppen bestående af trypsin, chymotrypsin, pepsin, papain, pankreatin, mikrobielle proteaser og blandinger deraf.

5 Patentkrav.

6. Dialysat ifølge et hvilket som helst af de foregående 25 krav, kendetegnet ved, at det også indeholder en osmotisk afbalanceret, vandig elektrolytopløsning.

7. Dialysat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at peptiderne i kombination med elektrolytter er til stede i en mængde, der er tilstrække- DK 168692 B1 lig til at give en osmolalitet på ca. 300 til ca. 500 mOsm/1.

8. Dialysat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at blandingen indeholder mindre end 5 mol% fri aminosyre.

9. Dialysat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at peptiderne omfatter ca. 1 til 15 vaagt% af opløsningen.

10. Terapeutisk præparat til anvendelse som osmotisk aktivt middel, kendetegnet ved, at det omfatter en blan-10 ding af peptider fremstillet ved enzymatisk hydrolyse af protein af høj kvalitet, hvilken blanding har følgende egenskaber: a) blandingen består i det væsentlige af peptider med en molekylvægt på mellem 300 og 2000, 15 b) blandingen indeholder ikke mere end 5 mol% fri aminosyre, c) blandingen indeholder mindst ca. 50% essentielle aminosyrer, d) blandingen er osmotisk effektiv, når den i en tilstrækkelig mængde sættes til en peritoneal dialysatopløsning, og 20 e) blandingen består i det væsentlige af peptider med en ækvivalentvægt på mellem ca. 150 og 1500.