DK168080B1 - Fremgangsmaade til fremstilling af lavmolekylaere peptider - Google Patents

Description

DK 168080 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstilling af lavmolekylære peptider med en molekylvægt på mellem ca. 300 og ca. 2000 daltons, der kan anvendes som osmotiske midler i et peritonealt dialysat.

5 Den normale funktion hos pattedyrs nyrer indbefatter en sådan aktivitet som opretholdelse af en konstant syre-base-balance og elektrolytbalance, fjernelse af overskydende væsker og fjernelse af uønskede produkter af legemets metabolisme fra blodet. Hos et individ med nyresygdom på slutstadiet kan denne 10 funktion hos nyren være reduceret til så lavt som 5% eller mindre af det normale niveau. Når nyrefunktionen er faldet til dette punkt, må der anvendes kunstige midler til erstatning for nyrens aktivitet, hvis livet skal opretholdes. Dette udføres klinisk ved anvendelse af dialyse. En af de mest alminde-15 lige metoder til opnåelse af dette er hæmodialyse, hvor patientens blod føres gennem en kunstig nyredialysemaskine. I denne maskine virker en syntetisk ikke-permeabel membran som en kunstig nyre, med hvilken patientens blod bringes i kontakt på den ene side, mens der på membranens modsatte side er en dia-20 lysevæske eller dialysat, hvis sammensætning er således, at de uønskede produkter i patientens blod naturligt vil passere tværs gennem membranen ved diffusion ind i væsken. Derved renses blodet i det væsentlige på samme måde som nyren ville have gjort det, og blodet føres tilbage til patientens legeme. Den-25 ne dialysemetode kræver, at patienten er fysisk forbundet med maskinen i adskillige timer, ofte flere gange om ugen. Skønt denne metode er effektiv, giver den af indlysende grunde et antal ulemper.

Nogle af de ulemper, der er forbundet med hæmodialyse, som 30 kræver ekstrakorporeal behandling af blod, overvindes ved anvendelse af metoder, som anvender patientens egen bughinde (peritoneum) som den nødvendige semipermeable membran. Bughinden er den membranagtige foring af det legemshulrum, der indeholder et stort antal blodkar og kapillarer, og som såle-35 des er i stand til at virke som en naturlig semipermeabel mem- DK 168080 B1 2 bran. Dialyseopløsning indføres i peritonealhulrummet med et kateter i bugvæggen. En passende opholdstid for dialysatet gør det muligt for dette at udveksle opløste materialer mellem dialysatet og blodet, og fjernelse af væske opnås ved at tilveje-5 bringe en passende osmotisk gradient fra blodet til dialysatet for at muliggøre vandoverstrømning fra blodet. Således føres den korrekte syre-base-balance, elektrolytbalance og væskebalance tilbage til blodet og dialyseopløsningen udtages simpelthen fra legemshulrummet gennem kateteret. Selv om der ek-10 sisterer mere end én type peritoneal dialyse, er den teknik, der er kendt som kontinuerlig, ambulatorisk peritoneal dialyse (CAPD), særligt begunstiget, da den ikke kræver, at patienten forbliver bundet til apparaturet, mens udbytningen af opløste stoffer og væske gennemføres. Den eneste nødvendige fastsid-15 dende periode er under infusion og dræning af dialyseopløsningen .

Et af de mest vanskelige træk ved peritoneal dialyse, og stadig et af de vigtigste, er at finde et passende osmotisk middel til indføjelse i dialysatet, hvormed der kunne opnås den 20 nødvendige osmotiske gradient. Med osmotisk aktivt middel, som anvendt i nærværende beskrivelse og krav, menes et stof, der er til stede i dialyseopløsningen, og som er i stand til at opretholde den osmotiske gradient, der er nødvendig til at forårsage transport af vand og giftige stoffer tværs gennem 25 bughinden ind i dialyseopløsningen. Det pågældende middel skal opfylde mindst to kritiske kriterier. For det første må det i større eller mindre omfang være biologisk inaktivt, dvs. ugiftigt og alligevel metabolisérbart, og for det andet må det fortrinsvis ikke passere hurtigt gennem bughinden ind i blo-30 det; dette ville muliggøre opretholdelse af den maksimale ultrafiltreringsgradient og ville også hindre toksicitet eller akkumulering af uønskede stoffer i blodet. Fravær af toksicitet er særligt vigtig, da næsten ethvert stof, der anbringes i bughinden, til sidst vil finde sin vej ind i kredsløbet, hvad 35 enten det bliver ved en langsom lymfatisk dræning eller ved dialyse igennem bughindemembranen. Hidtil har intet kendt stof 3 DK 168080 B1 fuldstændigt tilfredsstillet disse behov, selv om et antal forskellige materialer har været anvendt med varierende succes. Det middel, som for tiden har opnået den mest udstrakte accept, er glucose. Glucose har fordelen ved at være ugiftig 5 og er også let metaboliserbar, hvis det indtræder i blodet. Hovedproblemet med dets anvendelse er imidlertid, at det let optages i blodet fra dialysatet. Selv om ethvert stof, som nævnt ovenfor, til sidst vil finde sin vej ind i kredsløbet, passerer glucose bughinden så hurtigt, at den osmotiske gra-10 dient nedbrydes inden for 2-3 timers infusion. Dette kan endog forårsage omvending af ultrafiltreringsretningen, hvilket forårsager det uønskede resultat, at vand genabsorberes fra dialysatet mod afslutningen af den tid, der tillades for udbytning eller udveksling. Desuden kan den mængde glucose, der 15 indtages, repræsentere en stor andel af patientens energiindtagelse, idet den muligvis er så høj som 12-35%. Mens dette ikke på signifikant måde påvirker en ikke-diabetisk patient, kan det være en alvorlig metabolistisk byrde for en patient, hvis glucosetolerance allerede er svækket. Denne yderligere 20 belastning kan være inddraget i hyperglycæmi og obesitet, hvilket er iagttaget hos et antal CAPD-patienter. Diabetiske patienter lider af den yderligere ulempe og risiko, at de må tilsætte insulin til det peritoneale dialysat for at nedsætte risikoen for hypoglycæmina som følge af tilsat glucosebelast-25 ning.

Anvendelse af glucose giver også problemer ved fremstillingen af dialysatet. Sterilisation af dialysatet gennemføres typisk ved opvarmning, hvilket ved en fysiologisk pH-værdi vil få glucose til at karamellisere. For at kompensere for dette, ind-30 stilles dialysatets pH-værdi sædvanligvis til inden for området fra 5,0-5,5. Denne lave pH-værdi, der ligger så langt under det, der er normalt for legemet, kan være ansvarlig for den smerte, der opleves af nogle patienter ved indstrømning og kunne forårsage sclerose af peritonealmembranen, hvilket igen 35 vil forårsage en nedsættelse af udligningen eller fjernelsen af opløste stoffer (Schmidt et al., Arch. Int. Med., 141: DK 168080 B1 4 1265-1266, 1980).

Disse ulemper gør det i høj grad ønskeligt at finde et passende alternativ til glucose som et osmotisk middel. Et antal stoffer har været foreslået til opfyldelse af kriterierne med 5 hensyn til at være biologisk inaktiv, til ikke let. at passere peritonealmembranen, til at være ugiftig og til at udøve et passende osmotisk tryk ved strømningskoncentrationer. Hidtil har ingen af de foreslåede materialer vist sig at være nogen passende substitut for glucose. F.eks. har anvendelsen af dex-10 traner (Gjessing, Acta Med. Scan., 185: 237-239, 1960) eller polyanioner (US-patentskrift nr. 4.339.433) været foreslået som følge af deres høje molekylvægt, som til et minimum skulle nedsætte deres diffusion tværs gennem bughinden ind i blodet. Lymfekarsystemets rolle ved processen til transport af opløs-15 te stoffer begrænser imidlertid tydeligvis fordelene ved den høje molekylvægt i sig selv (Allen et al., Amer. J. Physiol., 119: 776-782, 1937) . Også med hensyn til polyanioneme er det uklart, hvorledes disses toksiske virkninger vil være, da de fleste er ikke-metaboliserbare. Lignende problemer med metabo-20 lisme iagttages med forbindelser såsom sorbitol, xylitol og glucosepolymerer. Sorbitol, som metaboliseres meget langsomt, har været forbundet med tilfælde af hyperosmolært koma og dødsfald (Raja et al., Ann. Int. Med., 73: 993-994, 1970) og anvendes ikke længere. Både xylitol og glucosepolymerer har 25 også tendens til at akkumulere i blodet og kan være forbundet med ubehagelige bivirkninger (Bazyato et al., Trans Amer. Soc. Artif. Interm. Organs, 28: 280-286, 1982). Fructose, som er sammenlignelig med glucose med hensyn til dets osmotiske kapacitet, udviser også mange af de samme ulemper. Som følge af 30 dettes højere pris har det ikke opnået nogen udbredt anvendelse.

Mere lovende er den foreslåede anvendelse af aminosyrer til erstatning af glucose. Aminosyrer tolereres udmærket uden nogen kendte skadelige bivirkninger (Oren et al., Perit. Dial.

35 Bull, 3: 66-72). Som følge af deres lavere molekylvægt udviser 5 DK 168080 B1 de en højere osmotisk virkning på massebasis end glucose. Imidlertid resulterer dette også sandsynligvis i en hurtigere optagelse i blodet, hvilket forårsager hurtigt tab af osmotisk gradient. Selv om aminosyreoptagelse i modsætning til optagel-5 se af glucose kan være gunstig, idet det kan kompensere for proteintabet, der iagttages hos mange CAPD-patienter, er der en betydelig ulempe i de næsten uoverkommelige priser for ami-nosyreopløsninger sammenlignet med glucose. Desuden giver den hurtigere optagelse af aminosyrer en betydelig nitrogenbyrde, 10 som på signifikant måde øger blodets urinstofnitrogenniveauer. Det ses således, at selv aminosyrer ikke giver de passende erstatninger.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer imidlertid nu forbedringer i metoden til peritoneal dialyse, som anvender et 15 osmotisk middel, som ikke blot er et sikkert og gunstigt alternativ til glucose, men som også er økonomisk mulig. Det har nu overraskende vist sig, at en blanding af forholdsvis lavmolekylære oligopeptider (300-2000 dalton) vundet ved enzymatisk hydrolyse af et protein af høj kvalitet, såsom valleprotein, 20 kan anvendes som et effektivt osmotisk middel i en peritoneal dialyseopløsning. Sammenlignet med en aminosyreopløsning forhindrer peptidernes noget højere molekylvægt den hurtige optagelse ind i blodet, hvorved der opnås mulighed for en mere effektiv opretholdelse af den osmotiske gradient, ligesom der 25 forhindres en uønsket forøgelse af nitrogen i blodet. Peptidblandingen, som til sidst, skønt meget langsomt, absorberes i serum, giver yderligere et værdifuldt kostmæssigt supplement, idet peptidblandingen er afledt af et protein med høj kvalitet. Endelig giver den omhandlede peptidblanding en ukostbar 30 og let tilgængelig kilde for osmotisk middel. Andre peptidblandinger, der anvendes til medicinske formål, har tidligere været beskrevet. F.eks. beskriver US-patentskrift nr. 4.427.658 et proteinhydrolysat opnået ved enzymatisk hydrolyse af valleprotein. I dette tilfælde blev det anført, at der skul-35 le gennemføres en næsten total enzymatisk hydrolyse uden adskillelse af større peptider fra mindre peptider. Derfor in- DK 168080 B1 6 deholder det resulterende produkt tilsyneladende peptider af betydeligt større størrelser, sandsynligvis op til 5000 dalton eller mere i den endelige blanding. Dette kan give en antigen og/eller allergisk risiko, da pinocytotisk optagelse fra bug-5 hinden til blodet er kendt. Dette er signifikant forskelligt fra de omhyggeligt adskilte blandinger fremstillet ifølge opfindelsen, som har forholdsvis lav molekylvægt.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af lavmolekylære peptider med en molekylvægt på mel-10 lem ca. 300 og ca. 2000 daltons, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter, at man a) behandler et protein af høj kvalitet i en vandig opløsning under hydrolyserende betingelser med mindst ét hydrolytisk enzym til fremstilling af en peptidholdig opløsning, hvori i det 15 mindste nogle af peptiderne har en lav molekylvægt på mellem ca. 300 og ca. 2000 daltons, og i det mindste nogle af peptiderne har en molekylvægt over ca. 2000 daltons, b) bringer den peptidholdige opløsning i kontakt med én side af en dialysemembran, mens i alt væsentligt rent vand, opnået 20 fra trin (d) , bringes i kontakt med den anden side af dialysemembranen under effektive dialyseseparationsbetingelser, idet dialysemembranen er effektiv til at tillade transport derigennem af de lavmolekylære peptider med molekylvægt mellem ca.

300 og ca. 2000 daltons, mens den tilbageholder peptiderne med 25 en molekylvægt over ca. 2000 daltons i den peptidholdige opløsning, og idet vandet har en tilstrækkelig lav koncentration af opløste peptider, som er effektiv til at tillade transport af de lavmolekylære peptider over membranen ind i vandet, c) fører vandet og de transporterede lavmolekylære peptider 30 indeholdt deri fra den anden side af dialysemembranen til et reservoir, d) fører vand, indeholdende transporterede lavmolekylære pep- 7 DK 168080 B1 tider, fra reservoiret i kontakt med én side af en membran til omvendt osmose (RO) under separationsbetingelser for omvendt osmose, herunder tryk, som er effektiv til at forårsage, at i alt væsentligt rent vand transporteres over RO-membranen til 5 tilvejebringelse af en mængde i alt væsentligt rent vand til brug i trin (b) og til at tilbageholde ved den ene side af RO-membranen en mængde vand indeholdende de transporterede lavmolekylære peptider i en højere koncentration end i vandet, der føres til RO-membranen, og 10 e) fører vandet indeholdende de transporterede lavmolekylære peptider i en højere koncentration fra den ene side af RO-membranen til reservoiret til tilvejebringelse i reservoiret af en vandig opløsning af lavmolekylære peptider i en koncentration, som er væsentligt højere end i vandet indeholdende de 15 transporterede lavmolekylære peptider, som føres til reservoiret i trin (c).

Fig. 1 viser skematisk isolationsskemaet for den kombinerede dialyse/omvendt osmose.

Fig. 2 viser mønsteret for eluering af peptidblandingen frem-20 stillet i eks. IB.

Fig. 3 viser den gennemsnitlige mængde af peptider, udtrykt som aminendegruppe, der forbliver tilbage i bughinden over en periode på 60 min.

Fig. 4 viser den gennemsnitlige mængde glucose, der bliver 25 tilbage i bughinden over en periode på 60 min.

De omhandlede farmaceutiske præparater indeholder, som det aktive osmotiske middel, peptidfraktioner med afvigende molekylvægtfordelinger, idet hvert peptid har en øvre molekylvægtsafskæringsværdi på 2000 dalton. Generelt talt er peptidernes 30 aminosyresammensætninger ikke særligt vigtig, og naturligvis vil den variere i overensstemmelse med den proteinkilde, hvor- DK 168080 B1 8 fra blandingen er opnået. Det vigtigste træk er udvælgelsen af en population med lav molekylvægt, hvilken molekylvægt må være stor nok til at forhindre hurtig transport tværs gennem bughindemembranen og alligevel lille nok til at opretholde den 5 krævede osmotiske gradient, som forklaret ovenfor. Det er blevet fastslået, at det mest effektive størrelsesområde for de indbefattede peptider er ca. 300-2000 dalton, idet ækvivalentvægten bør være mellem ca. 150 og 1500, idet den foretrukne gennemsnitlige ækvivalent vægt ligger mellem ca. 250 og 750.

10 Peptidblandinger kan let fremstilles ved hydrolyse af større proteiner. Proteinhydrolyse kan gennemføres ved et antal kendte metoder. P.eks. er en almindelig hydrolyseteknik kogning af proteinet i nærværelse af kraftige mineralsyrer eller alkalier. Dette har imidlertid den uheldige virkning, at der sker en 15 potentiel ødelæggelse eller i det mindste ændring af et antal af de frigjorte aminosyrer. Det er også vanskeligt at kontrollere det produkt, der fremstilles. Sur hydrolyse vil ikke nødvendigvis bryde proteinet i den samme stilling i hvert tilfælde og giver således et uforudsigeligt produkt. Reaktionen er 20 også ganske hurtig, og med mindre den overvåges omhyggeligt, vil den resultere i en samling af individuelle aminosyrer i stedet for den ønskede blanding af små peptider. Således anses sur hydrolyse ikke som værende velegnet til det foreliggende formål. En anden mulighed for hydrolytisk værktøj er et antal 25 kemiske reagenser, såsom hydroxyamin eller 2-nitro-5-thiocya-nobenzoat, som hver vil spalte et protein alene i specifikke dele af kæden. Det foretrukne valg er anvendelsen af enzymhydrolyse til opnåelse af de ønskede peptidblandinger. Enzymhydrolyse har den vigtige, fordel, at den er forholdsvis let at 30 kontrollere, således at der ikke sker fuldstændig hydrolyse, og produktet har den ønskede molekyl vægt s sammensætning.

Der er et bredt udvalg af enzymer, hvoriblandt der kan vælges et passende hydrolytisk middel. Nogle af de mulige valg er blandt andet trypsin, chymotrypsin, papain, pepsin eller visse 35 mikrobielle proteaser. En blanding af proteolytiske enzymer, 9 DK 168080 B1 såsom pancreatin (chymotrypsin og trypsin), kan også anvendes. Hvert af disse spalter generelt protein ved et specifikt sted, f.eks. vil trypsin kun spalte et protein ved carboxylsiden af lysin- og argininrester. Chymotrypsin vil fortrinsvis angribe 5 ved en aromatisk aminosyres carboxylside. Pepsin foretrækker at spalte hydrofobe aminosyrer. De forskellige specifikke virkninger hos andre proteolytiske enzymer er velkendt og er let tilgængelig for den erfarne kemiker. På grund af denne specifikke virkning vil den som slutprodukt opnåede peptid-10 blanding være forskellig i afhængighed af, i det mindste delvis, hvilket enzym, der anvendes til hydrolyse. Som det bliver vist nedenfor, har imidlertid den faktiske sammensætning af peptidblandingen ringe eller slet ingen betydning, når blot den korrekte osmolalitet opnås, og peptiderne er inden for det 15 ønskede størrelsesområde. Det vil let fremgå for fagfolk, hvilke typer enzymer der er anvendelige til det omhandlede formål.

En anden variabel, der påvirker typen af det fremstillede produkt, er naturligvis typen af det protein, der hydrolyseres.

20 Selv om praktisk talt en hvilken som helst type i kosten forekommende protein er et velegnet substrat, foretrækkes det, at det anvendte protein er et protein af høj kvalitet. Med betegnelsen protein af høj kvalitet anvendt i nærværende beskrivelse og i kravet menes et protein, der indeholder en høj andel, 25 i almindelighed mindst 50%, og fortrinsvis i området fra 60% til 70% essentielle aminosyrer, dvs. lysin, leucin, isoleucin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan, valin og histi-din. Generelt talt har animalsk protein tendens til at være af højere kvalitet i denne henseende i forhold til vegetabilsk 30 protein. Særligt gode kilder af protein af høj kvalitet er collagen, visse oksemælkeprodukter såsom valle, og ægprotein, navnlig ovalbumin, selv om ethvert protein, der giver de passende andele af aminosyrer, er anvendeligt. Imidlertid er visse typer af protein, såsom kasein, der indeholder en høj 35 procentandel af phosphor, ikke passende substrater på grund af nødvendigheden af at begrænse phosphorindtagelse ved uræmi.

DK 168080 B1 10

Grunden til at der foretrækkes protein af høj kvalitet er, at skønt peptiderne ikke som aminosyrerne let diffunderer tværs gennem bughindemembranen, er en vis diffusion uundgåelig. Da i det mindste nogle af peptiderne i blandingen til sidst vil 5 passere ind i blodstrømmen, er det ønskeligt at sikre sig, at det, der indtræder i blodstrømmen, er af ernæringsmæssig værdi. Dialysatet tjener således også i et vist omfang som et pa-renteralt fodringstilskud, hvis der sker diffusion tværs gennem membranen.

10 Det mest foretrukne proteinsubstrat til peptidfremstilling er mælkevalleprotein. Valleprotein er det materiale, der forbliver i opløsning efter syrning af mælk, dvs. efter udfældning af phophoproteinet kasein. Valleprotein udgøres primært af /3-lactoglobulin, α-lactalbumin, immunoglubolin og okseserumalbu- 15 min med over 60% sammensat af /3-lactoglobulin- og οί-lactoal-bumin-fraktioner. Disse to proteiners aminosyresammensætning er velkendt som vist i tabel 1. Valleprotein har de fordele, at det både er let tilgængeligt og forholdsvist billigt at fremstille.

20 TABEL 1

Amino syre sammensætning af jS-lactoglobulin og a-laet albumin /3-lactoglobulin a-laet albumin 9 Asp (D) 13 4 Asn(N) 8 25 3 Asx(B) 8 Thr(T) 7 7 Ser (S) 7 9 Glu (E) 8 9 Gln(Q) 5 30 7 Glx(Z) 8 Pro(P) 2 3 Gly (G) 6 DK 168080 B1 11 14 Ala (A) 3 5 Cys(C) 8 10 Val (V) 6 4 Met(Μ) 1 5 10 Ile(I) 8 22 Leu(L) 13 4 Tyr(Y) 4 4 Phe(F) 4 2 Try (W) 4 10 15 Lys (K) 12 2 His(H) 3 3 Arg (R) 1

De enkelte valleproteiner kan let isoleres ud fra deres frak-tionelle opløselighed i ammoniumsulfatopløsning. Der findes et 15 antal planer for separationen af proteinet fra forskellige stoffer på basis af dets opløselighed i 264 g/1 ammoniumsulfat (se f.eks. Armstrong et al., Biochem. Biophys. Acta, 147: 60--72, 1967/ Aschaffenberg et al., Biochem. J., 65: 273-277, 1957; Cervone et al., Biochem. Biophys. Acta, 295: 555-563, 20 1973) . Alternativt er det også muligt at købe de enkelte val- leproteiner (Sigma) eller som blandede proteinkoncentrater (Express Foods).

Som tidligere nævnt vil det være umiddelbart klart for den faguddannede kemiker, at den aktuelle peptidsammensætning vil 25 variere i overensstemmelse med proteinkilden og det til hydrolysen anvendte enzym. Enzymet er regulerende, da som nævnt ovenfor hvert enzym angriber proteinet ved en eller flere specifikke aminosyrer. Således vil f.eks. anvendelsen af trypsin give den samme gruppe af små peptider ved hver anvendelse, 30 dersom substratet er det samme. Derfor vil det med et givet kontrolleret sæt af reaktionsbetingelser altid være muligt at fremstille en forudsigelig peptidblanding under anvendelse af det samme rene enzym og det samme udgangsprotein. Det er korrekt, at de fleste i handelen tilgængelige enzymer kan være 35 forurenet med små mængder af andre proteaser. Disse forure- DK 168080 B1 12 ninger kan være ansvarlige for fremstillingen af betydelige mængder fri aminosyre, hvis peptiderne får lov til at forblive i kontakt med enzymet. Ved fjernelse af peptider af den ønskede størrelse fra reaktionsbeholderen, efterhånden som de frem-5 stilles, kan man i stort omfang undgå problemet med fremstilling af uønskede aminosyrer. Det forstås let, at den faktiske sammensætning af peptidblandingen i det mindste med hensyn til hvilke peptider, der er til stede, faktisk i stort omfang er irrelevant. Den kritiske faktor er at sikre, at størrelsen af 10 de fremstillede peptider holdes inden for de angivne grænser fra 300 til 2000 dalton.

Som nævnt ovenfor er det vigtigt at overvåge den hydrolytiske proces, efterhånden som den skrider frem for at sikre, at hydrolysen giver peptidsammensætninger med passende molekylvægt.

15 Dette gennemføres let på grund af den relative langsomhed, hvormed den enzymatiske proces forløber, men for yderligere at sikre, at signifikante mængder af aminosyrer ikke bliver en del af blandingen, kan reaktionen gennemføres ved en temperatur og/eller pH-værdi, der er forskellig fra det optimale for 20 det anvendte enzym, således at hastigheden for enzymspaltningen holdes meget lav. De betingelser, der kræves til fremstilling af den ønskede blanding, vil nødvendigvis variere i afhængighed af det anvendte enzym. Da enzymatisk hydrolyse af protein for hvert enzyms vedkommende er en velkendt procedure, 25 er de betingelser, der kræves til den optimale proteolyse under anvendelse af et antal forskellige enzymer, let tilgængelig i litteraturen (se f.eks. US-patentskrifterne nr. 4.427.658 og 4.145.445 for blot at nævne nogle få af de kendte metoder) . Det ligger inden for gennemsnitskemikerens evne uden 30 al for meget forsøgsvirksomhed at vælge den fremgangsmåde, der er bedst egnet til det substrat og det enzym, der anvendes, ud fra de tilgængelige oplysninger.

Selv om man ved den foreliggende opfindelse som nævnt kan anvende et hvilket som helst proteolytisk enzym eller en hvilken 35 som helst kombination af enzymer, er et særligt foretrukket DK 168080 B1 13 enzym pankreatin eller alternativt de deri indgående enzymer chymotrypsin og trypsin. For yderligere at nedsætte problemet med opnåelse af overskydende mængder af aminosyrer som følge af de potentielt forurenende proteaser bør forholdet mellem 5 enzymer og substrat holdes temmelig lavt inden for området 0,5% til et maksimum på ca. 5,0%. Efter at hydrolyseproceduren er tilendebragt, og den ønskede peptidkombination er opnået, kan peptiderne renses og separeres fra reaktionsblandingen ved et antal forskellige metoder. I stort omfang vil det endelige 10 molekyl vægt område også afhænge af den metode, der anvendes til adskillelse som nævnt nedenfor.

De foretrukne produkter til dialyse er terapeutiske præparater, der omfatter en blanding af peptider fremstillet ved enzymatisk hydrolyse af et protein af høj kvalitet, hvilken 15 blanding har følgende egenskaber: a) blandingen består i det væsentlige af peptider med molekylvægte mellem 300 og 2000 dalton, b) blandingen indeholder ikke mere end 5 mol% fri aminosyre, c) blandingen indeholder mindst 50% essentielle aminosyrer i 20 peptidform, d) blandingen er osmotisk effektiv, når den i tilstrækkelig mængde sættes til en peritoneal dialysatopløsning, og e) blandingen har en blandingsækvivalentvægt på mellem ca. 150 og 1500.

25 Særligt foretrukne præparater er sådanne, hvori proteinet af høj kvalitet er valleprotein, som er hydrolyseret med en kombination af trypsin og chymotrypsin, og hvor den endelige blanding har et indhold af essentielle aminosyrer på ca. 60-70%. Disse præparater kan anvendes terapeutisk som de osmo-30 tiske midler i peritoneale dialyseopløsninger, som nævnt ovenfor, men på grund af deres høje koncentrationer af essentielle aminosyrer kan de også anvendes delvis som et parenteralt fødet il skud.

Som det fremgår klart af den ovennævnte diskussion, er de DK 168080 B1 14 egenskaber hos slutproduktet, som er vigtigst, at peptiderne, der er indeholdt i opløsningen, ligger inden for et meget specifikt molekylvægtsområde, dvs. mellem ca. 300 og ca. 2000 dalton. Peptidmolekylernes ækvivalentvægt, som er udtrykket 5 for molekylernes molekylvægt i forhold til molekylets ladning, er fortrinsvis i området fra 150 til 1500. Ladningen på molekylerne bidrager til den samlede osmotiske koefficient af blandingen og opløsningen. Molekyler med større molekylvægt end 2000 dalton skaber meget ringe osmotisk fremkaldt ultra-10 filtrering og meget små molekyler siver for hurtigt over i kredsløbet. Det er således vigtigt, at det er muligt at kontrollere den hydrolytiske reaktion og det resulterende produkt på en eller anden måde, som vil sikre, at det krævede molekylvægt s område opnås.

15 Der foreligger et antal forskellige metoder inden for kendt teknik til isolering og/eller oprensning af peptidkomponenter fra en opløsning. F.eks. kan trichloreddikesyre (TCA) anvendes til at udfælde ethvert tilbageværende protein og enzym, som er i reaktionsopløsningen. Alternativt udfælder et vandblandbart 20 proteinudfældningsopløsningsmiddel, såsom acetonitril (ACN) , protein ved ca. 35-40% ACN, idet peptiderne forbliver i opløsning. Desuden kan man anvende rumfangsudelukkelsesmetoden ved tilsætning af polyethylenoxid til fremkaldelse af en faseadskillelse. Imidlertid kan ingen af disse metoder sikre, at 25 der opnås det nøjagtigt ønskede produkt, dvs. en peptidblanding med en specifik molekylvægtssammensætning.

Ultrafiltrering er en metode, der hyppigst anvendes, når der ønskes et slutprodukt med specifik molekylvægt. Imidlertid har ultrafiltrering også en alvorlig ulempe forbundet med sig, 30 idet der ikke kan opnås en pålidelig adskillelse, med mindre der er mindst ca. en 10-foldig difference i molekylvægten for de bestanddele, der skal adskilles. Ved forsøgsmæssig anvendelse i forbindelse med opspaltning af det her omhandlede produkt har det således rutinemæssigt vist sig, at molekyler med 35 molekylvægt betydeligt over 2000 dalton vil fremkomme i slut- DK 168080 B1 15 opløsningen til trods for valget af et ultrafiltreringsfilter med en cut-off-værdi på molekylvægten 2000 (se eks. 2). Der er således ganske simpelt ikke for tiden nogen pålidelig metode tilgængelig til direkte isolering af produkter med lav mole-5 kylvægt fra en moderblanding, som er heterogen med hensyn til bestanddelenes molekylstørrelser.

I forbindelse med fremstillingen af de omhandlede osmotiske midler er der imidlertid blevet udviklet et system til isolering af lavmolekylære opløste materialer fra en heterodispers 10 molekylvægtblanding. Den foreliggende metode, der er baseret på en simpel men uventet kombination af dialyse og omvendt osmose, har vist sig at være særligt medgørlig til opnåelse af den peptidadskillelse, der kræves til det omhandlede produkt. Imidlertid er dens anvendelse ikke begrænset til peptider. Den 15 kan i virkeligheden anvendes til adskillelse af praktisk talt enhver type af opløste stoffer med lav molekylvægt. Med "lav molekylvægt" som anvendt i nærværende beskrivelse og krav menes molekyler af størrelsen ca. 5000 dalton eller mindre.

I generelle træk forløber fremgangsmåden, der er vist skema-20 tisk på fig. 1, på følgende måde.· den vandige opløsning, der indeholder de opløste stoffer, der skal isoleres, perfunderes gennem en dialysatorenhed og føres tilbage til kildereservoiret ("reaktionsbeholder" på fig. 1) . Dialysatormembranen vaskes på siden modsat den vandige opløsning med en strøm af 25 frisk vand tilvejebragt af en omvendt-osmose-enhed. Omvendt-osmose-enheden giver under tryk en forsyning af i det væsentlige rent vand under forudsætning af, at en tilstrækkelig koncentrationsgradient muliggør dialyse af de forholdsvis koncentrerede opløste materialer tværs gennem membranen og ind i 30 strømmen. Da stoffer med en molekylvægt på over 2000 dalton normalt ikke dialyseres med en signifikant hastighed tværs gennem en dialysemembran, vil disse større stoffer forblive i opløsning og føres tilbage til kildereservoiret, mens produkter med lav molekylvægt (mindre end 2000 dalton) vil passere 35 over i den friske vandstrøm og strømme ind i omvendt-osmose- DK 168080 B1 16 reservoiret. Når væsken fra omvendt-osmose-reservoiret bringes under tryk, vil omvendt-osmose-elementet kun lade rent vand sive igennem, og dette vand bringes igen i kontakt med dialy-satormembranen, hvor det igen vil akkumulere de dialyserbare, 5 lavmolekylære stoffer og transportere dem til omvendt-osmose-reservoiret, hvor de koncentreres. Fremgangsmåden kan fortsættes indtil et sådant tidspunkt, hvor det osmotiske tilbagetryk i omvendt-osmose-reservoiret signifikant vanskeliggør fremstillingen af frisk vand, eller indtil kildematerialet er 10 brugt op. De koncentrerede produkter fremstillet på denne måde kan derefter yderligere isoleres ved kendte metoder eller kan anvendes som de er i afhængighed af fordringerne.

Principperne bag såvel dialyseprocessen som processen med omvendt osmose er velkendte og behøver ikke at omtales i større 15 detaljer her. Omvendt osmose anvendes rutinemæssigt til rensning af vand (se US-patentskrift nr. 3.774.763) og kan karakteriseres som en proces, hvor højt tryk på en koncentreret opløsning tillader passage gennem en semipermeabel membran af opløsningsmidlet fra den koncentrerede opløsning til et mere 20 fortyndet fluidum (f .eks. vand eller luft) . Fremgangsmåden renser samtidigt opløsningsmidlet og isolerer de opløste stoffer, der er indeholdt deri. Dialyse kan defineres som en passiv proces, hvor resultatet er overføring af opløste molekyler fra en væske med en høj koncentration af opløste stoffer til en 25 væske, der har en lav koncentration af opløste stoffer ved transport af de opløste stoffer tværs gennem en membran, der adskiller de to væsker. Anvendelse af dialyse alene er i et stort omfang for tiden begrænset til adskillelse af meget små molekyler fra meget store molekyler, sådan som tilfældet er 30 ved hæmodialyse.

Forskellige membranadskillelsesmetoder har tidligere været kombineret til opnåelse af forskellige formål. F.eks. anvendes ifølge US-patent skri ft nr. 3.472.765 en kombination af omvendt osmose og ultrafiltrering til adskillelse af mikroorganismer i 35 et biologisk reakt i ons system fra deres bærevæske eller deres DK 168080 B1 17 ønskelige metaboliseringsprodukter. Denne metode hviler i et stort omfang på ultrafiltreringsmembraners antagne molekylvægt saf skæring (cut-off). På lignende måde kombineres ifølge US-patentskrift nr. 4.000.065 omvendt osmose og ultrafiltre-5 ring for at rense vandige opløsninger, der indeholder lave koncentrationer af organiske forureninger, som kan have molekylvægte på mindre end 10.000. Denne metode afhænger i stort omfang af de begrænsede opløselighedsgrænser for de indeholdte forureninger og hviler også tungt på ultrafiltrering til op-10 nåelse af det ønskede resultat. Hver af disse processer angives at skulle være i stand til at udskille stoffer med lav molekylvægt fra vandige opløsninger. Imidlertid beskriver ingen af dem en adskillelsesprocedure, hvor et produkt, der indeholder et snævert område af opløste stoffer med lav molekylvægt, 15 kan adskilles fra andre opløste stoffer, som kan ligge meget tæt på med hensyn til molekylvægt. Den yderligere upålidelighed med hensyn til ultrafiltreringsmembranens afskæringspunkt har tidligere været omtalt. Således ville ingen af disse fremgangsmåder vise sig at være egnede til fremstilling af det fo-20 religgende produkt. US-patentskrift nr. 3.774.763 beskriver en metode til vandrensning under anvendelse af omvendt osmose, hvilket rensede vand derefter muligvis anvendes til en hæmodi-alyseenhed. Imidlertid er proceduren til omvendt osmose kompliceret og kræver et antal yderligere elementer såsom afioni-25 seringsindretninger og yderligere, når vandet først er renset, er der ikke nogen forsat indvirkning med en dialyseenhed.

Den her beskrevne hidtil ukendte fremgangsmåde kræver imidlertid ikke, at de opløste stoffer skal have lav opløselighed i den vandige opløsning, og den indebærer heller ikke de ulem-30 per, der er forbundet med ultrafiltreringsprocedurerne. I stedet udnytter den foreliggende fremgangsmåde dialyseprocessens begrænsninger som en fordel til at udskille molekyler på 2000 dalton eller derunder fra en heterogen blanding af forbindelser, som kan ligge meget tæt i molekylvægt, og separeringen 35 forøges ved anvendelse af omvendt-osmose-processen til både at give en kontinuerlig kilde af rent vand til dialyseprocessen DK 168080 B1 18 og til kontinuerligt at akkumulere det dialyserbare produkt i koncentreret form i omvendt-osmose-reservoiret. Det opnåede slutprodukt er et, der opfylder kravene til en opløsning, der indeholder et specificeret område af peptider med lav molekyl-5 vægt. Fremgangsmåden er simpel, kræver i det væsentlige kun en to-trins procedure, der kan gentages kontinuerligt, indtil koncentrationen af opløst stof i omvendt-osmose-reservoiret er således, at det forhindrer opbygning af et tilstrækkeligt tryk til at fortsætte trinnet med omvendt osmose. Fremgangsmåden 10 har den yderligere fordel, at den ikke nødvendigvis kræver nogen yderligere foranstaltninger til separation eller oprensning, efter at den er tilendebragt.

De elementer, der skal anvendes ved gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan være et hvilket som helst 15 dialyseapparat og et hvilket som helst omvendt-osmose-apparat ifølge kendt teknik. Hver enhed kan også betjenes i overensstemmelse med kendte fremgangsmåder med hensyn til temperatur, tryk, fødehastighed osv. Operationstrykket i dialysatoren skal generelt ikke være over 500 mm, fortrinsvis mindre. Operati-20 onstrykket for højtryksdelen i omvendt-osmose-enheden må være over det osmotiske tryk af opløsningen i omvendt-osmosereservoiret og må være tilstrækkeligt forhøjet til at give en per-meatstrøm af frisk vand, mod hvilken strømmen, der indeholder opløste materialer fra reaktionsbeholderen, dialyseres. Det 25 typiske arbejdstryk i enheden for omvendt osmose ved fremstilling af det omhandlede produkt er mellem 1,00 MPa og 2,10 MPa (150-300 psi) og fortrinsvis mellem 1,38 MPa og 1,72 MPa. Imidlertid vil det stå klart for den erfarne fagmand, at trykket kan varieres i overensstemmelse med det produkt, der skal 30 isoleres, hvis det er forskelligt fra små peptider. Passende forbindelser til de to enheder er en hvilken som helst type af lavtryksrør sammensat af et inaktivt, ugiftigt materiale såsom plast eller silicone. Undtagelsen er forbindelsen mellem pumpen og cirkulationsledningen til omvendt osmose, som kræver 35 højtryks-plastledninger.

DK 168080 B1 19

Der kendes mange forskellige membraner, der er egnede til anvendelse ved dialyseprocesser og processer med omvendt osmose (se f.eks. Kirk-Othmer red., Encyclopedia of Chemical Techno-logy, 3. udg., bind 7, "Dialysis", 1979 og bind 20, "Reverse 5 Osmosis", 1982). Praktisk talt enhver kendt membran med dialy-tiske egenskaber kan anvendes til dialyse. Sådanne kan f.eks. være fremstillet af cellulose, celluloseacetat, ethylenvinyl-alkohol, polyacrylonitril eller polymethylmethacrylat. Ved fremstilling af peptidblandinger anvendes der fortrinsvis cel-10 lulosemembraner, navnlig membraner med hule fibre og de tilhørende dialysatorer. Disse membraner er tilgængelige i en række af permeabiliteter, hvoraf de fleste er egnede til den foreliggende fremgangsmåde. Valget af hvilken membran, der skal anvendes, foretages på basis af den gennemsnitsstørrelse, der 15 ønskes hos de ønskede molekyler. F.eks. er en membran med "normal" permeabilitet, såsom den, der er indeholdt i HF-140 dialysatoren (Cobe Laboratories), generelt impermeabel for alt med en molekylvægt på over 1500. Hvis der imidlertid ønskes en lidt større molekylvægtsstørrelse, er visse typer af fibre, 20 såsom D2-HDF (Enka) , stadig permeable op til en molekylvægt på 3000-4000 dalton. Permeabiliteterne for i handelen tilgængelige membraner er kendt, og det ligger inden for de erfarne fagfolks evner at bestemme, hvilken af membranerne, der er bedst egnet til det pågældende formål i afhængighed af størrelsen og 25 typen af molekyler, der skal isoleres. Med hensyn til membraner til omvendt osmose er enhver membran, der har et højt niveau for tilbageholdelse af elektrolytter, velegnet. Membraner sammensat af tynde film i en spiralviklet udformning har vist sig at være særlig nyttige til anvendelse ved den omhandlede 30 fremgangsmåde. Imidlertid kan membraner med hule fibre også anvendes effektivt ved den omhandlede fremgangsmåde.

Ved siden af valget af membran kan man, hvis kilden for den opløsning, der indeholder opløste stoffer, er et biologisk reaktionsprodukt, regulere gennemsnitsstørrelsen for slutpro-35 duktblandingen ved at begrænse hastigheden for enzymatisk spaltning eller hastigheden for den mikrobielle metabolisme- DK 168080 B1 20 proces, der fremstiller produktet. Når der f .eks. er involveret en enzymatisk spaltningsproces, kan reaktionshastigheden holdes nede ved at holde en lav enzymkoncentration i forhold til substratet. Hastigheden kan også ændres ved at køre reak-5 tionen ved en temperatur eller en pH-værdi, der er mindre end det optimale for enzymet eller den mikroorganisme, der anven des. Sådanne modifikationer ligger inden for fagfolks muligheder og evner. Det vil også være klart for fagfolk, at modifikationer i reaktionsprocessen kan kombineres med valget af 10 membran for på den mest effektive og nøjagtige måde at fremstille det ønskede produkt. Med andre ord, når man antager, at molekylvægten hos det ønskede produkt er kendt, er det en forholdsvis simpel opgave ved rutinemæssige, korte gennemførelser af den omhandlede fremgangsmåde at bestemme, hvilken kombina-15 tion, der giver de mest tilfredsstillende resultater for det ønskede produkt.

Som nævnt ovenfor er den omhandlede fremgangsmåde særligt velegnet til fremstilling af peptidblandinger med lav molekylvægt, og den kan anvendes kommercielt i forbindelse med hydro-20 lyse af andre typer af proteiner såsom soyabønneproteiner, ægproteiner eller mælkeproteiner. Den kan også let tilpasses til anvendelsen med en hvilken som helst anden heterogen, ikke-peptidblanding, hvorfra det er nødvendigt eller ønskeligt at isolere stoffer med lav molekylvægt. F.eks. fremstilles ved 25 mange biologisk baserede fremgangsmåder de ønskede lavmolekylære produkter hyppigt i nærværelse af et antal hormonale forureninger og proteinforureninger, hvorfra adskillelsen af produktet udgør et alvorligt problem. Dette kan f.eks. opnås ved behandling af majsstivelsehydrolysat for at isolere lavmoleky-30 lære maltodextriner. Når majsstivelse hydrolyseres enzymatisk, spaltes stivelsen med høj molekylvægt tilfældigt til fremstilling af stadigt mindre dextriner. Efterhånden som processen fortsætter, kan enzymaktiviteten standses på et vist punkt til opnåelse af en polydispers blanding af polyglycoser (maltodex-35 triner) , som anvendes ved 1 evnedsmiddelbearbe j dnings industri -en, som bageadditiver eller sødemidler. Hvis den enzymatiske DK 168080 B1 21 aktivitet får lov til at fortsætte, er slutproduktet glucose. Anvendelsen af den foreliggende fremgangsmåde gør det muligt kontinuerligt at isolere maltodextriner med lav molekylvægt fra en enzymreaktionsbeholder, en procedure, som ikke hidtil 5 har været mulig. På tilsvarende måde har visse fraktioner af heparin, et antikoaguleringsmiddel, antithrombotisk virkning uden den antikoagulerende virkning. Selv om sådanne fraktioner er ganske værdifulde, er det vanskeligt at adskille dem fra de større molekyler på grund af deres størrelse (ca. 3.000 dal-10 ton). Den foreliggende fremgangsmåde giver et middel, hvormed det ønskede fragment let kan adskilles fra en heterogen blanding af forbindelser.

Med hensyn til det omhandlede produkt kan den rensede peptidblanding kombineres med en hvilken som helst osmotisk afbalan-15 ceret vandig opløsning, der er passende til anvendelse som et peritonealt dialysat. Et anvendeligt dialysat må, for at være effektivt osmotisk afbalanceret til det omhandlede formål, indeholde en koncentration af elektrolytter, der er tilstrækkelig til at fremkalde diffusion af vand og uønskede metabolise-20 ringsprodukter tværs gennem bughinden. Der findes ikke nogen "standard"-dialyseopløsning, da behovet kan variere fra det ene individ til det andet. En almindelig opløsning vil f.eks. indeholde specifikke mængder af natrium, chlorid, lactat, magnesium og calcium. Indholdet af en typisk dialysatopløsning er 25 vist i tabel 2, uden at mængden af osmotisk middel er angivet.

I en glucoseopløsning ville glucosemonohydrat typisk blive tilsat i en mængde på fra ca. 1,5 til ca. 4,25%. Det vil forstås, at dette blot repræsenterer et eksempel på en mulig opløsning, og at variationer i mønsteret vil være tydelige for 30 fagfolk. Andelen af peptidblanding i dialysatet kan variere, men vil normalt ligge i området fra ca. 1 til ca. 15 vægt% af dialysatopløsningen. Under alle omstændigheder skal mængden af peptid være tilstrækkeligt til sammen med understøttende elektrolytter at give en osmolalitet på ca. 300-500 mOsm/1 (280 35 mOsm/1 er serums normale osmolalitet og elektrolytterne bidrager i sig selv sædvanligvis til en osmolalitet på ca. 260 DK 168080 B1 22 mOsm/1). Indgivelse af dialysatet gennemføres på en måde, der sædvanligvis følges til peritoneal dialyse. Eksempler på metoder til peritoneal dialyse er beskrevet i Peritoneal Dialysis, K. Nolph, red., Martinus Nighoff Publishers, 1981. Den særlige 5 behandlingsplan, der kræves for enhver individuel patient, bestemmes let af patientens læge.

TABEL 2

Bestanddele i en typisk peritonealudskylningsopløsning (i mækv/1) 10 Na 132,0

Ca 3,5

Mg 0,5

Cl 96,0 lactat-anion 40,0 15 Den foreliggende opfindelse vil tydeligere kunne forstås ved henvisning til følgende ikke-begrænsende eksempler:

Eksempel 1

Det følgende eksempel viser en fremgangsmåde til fremstilling af peptidblandingen.

20 A. 150 g SAVOR PRO (Express Foods, Inc., Louisville, Kentucky, U.S.A.), et 75% valleproteinkoncentrat, opløstes i 3 1 destilleret vand og dialyseredes til fjernelse af tilbageværende lactose og salte. Denne behandling tjente til at sænke opløsningens ledningsevne fra 700 til 26 μΩ.

25 Opløsningens pH-værdi instilledes til 8,0, og opløsningen blev bragt til 40°C. Derefter overførtes opløsningen til en enzymreaktionsbeholder og cirkuleredes gennem en dialysator (som vist på fig. 1) . Dialysatorens dialysatside forsynedes med rent vand fra udgangen af en enhed med omvendt osmose (R.O.) DK 168080 B1 23 under anvendelse af et af tynde film sammensat spiralviklet element (Film-Tec) . Dialysatet tilbageførtes til produktreser-voirbeholderen, hvorfra R.O.-enheden blev forsynet. Cirkulationshastigheden gennem R.O. fra produktreservoiret var 10 5 gange så stort som dets fremstillingshastighed for rent vand for at maksimere sidstnævnte. Enheden blev betjent ved et tryk på ca. 1,38-1,72 MPa. Med begge kredsløb i gang sattes 1,5 g Sigma-trypsin og 1,5 g S igma-chymo trypsin til enzymreaktions-beholderen. Efterhånden som enzymspaltningen skred fremad, op-10 retholdtes reaktionsblandingens pH-værdi ved hjælp af tilsætning af NaOH. Efterhånden som der i reaktionsbeholderen blev dannet peptider på mindre end 2000 dalton, blev disse dialyseret gennem dialysemembranen (HF-140 hemodialyzer, Cobe Laboratories, Lakewood Colorado) over i produktreservoiret, hvor de 15 forblev, da R.O.-enheden var tilbageholdende selv for små elektrolytter såsom NaCl. Reaktionsbeholderen fik lov til at køre i 2 timer med udtagning af prøver hvert 10. minut. Produktreservoiret fortsatte med at stige i peptidkoncentration og osmolalitet. Slutproduktet opnået fra produktreservoiret 20 var 46,5 g (31% udbytte) med en gennemsnitlig ækvivalent vægt på 408. Analyse af produktet på en P2-geludelukkelseskolonne under anvendelse af 30% eddikesyre som elueringsmiddel viste i det væsentlige intet peptid i harpiksens tomme rumfang, hvilket viser, at alle peptider er mindre end 1800 dalton.

25 B. Reaktionen ifølge A blev gentaget på nøjagtig samme måde bortset fra, at der blev anvendt en mere permeabel dialysator (Fresenius D-6 dialysator, Bad Homburg, Forbundsrepublikken Tyskland; D2-HDF fibre, Enka AG) . Dette muliggjorde ekstraktion af en højere procentandel af større peptidfragmenter, end 3 0 det var muligt ved A. Elueringen gennemførtes som under A og resultaterne er vist på 2. Ækvivalent væg ten for produktet var 483 .

Eksempel 2 Følgende eksempel viser en fremgangsmåde, hvor peptidblandin- DK 168080 B1 24 gen renses ved ultrafiltrering i stedet for dialyse og omvendt osmose.

a. En 3% opløsning af valleproteinkoncentrat (85% protein) bringes til pH=8. Trypsin fra Sigma Chem. Co. (#T2395) til- 5 sattes i et forhold på 1:100 regnet på proteinet, efter at opløsningen var blevet bragt til 50°C. Udgangsproteinopløsningens osmolalitet (ved frysepunktssænkning) var 47 mOsm/1. Ved afslutningen af 30 min. reaktionstid ultrafiltreredes opløsningen gennem en cellulosemembran (med en begrænsende afskæ-10 ringsværdi på 5000 dalton) . Da pH-værdien var bragt tilbage til udgangsværdien, var osmolaliteten 112 mOsm/1. Geludelukkelseskromatografi af ultrafiltratet viste, at til trods for den af fabrikanten angivne lave af skæringsværdi var en lille del af a-laet albumin-udgangsmaterialet (mol vægt = 14.200) 15 trængt igennem ultrafilteret sammen med et bredt molekylvægts-område af peptidprodukt.

b. En 5% opløsning af fast valleprotein i deioniseret vand viste sig at have en osmolalitet på 18 mOsm/1. Opløsningen dialyseredes for at nedsætte elektrolytindholdet, og derefter vi- 20 ste den en osmolalitet på 13 mOsm/1. Et ultrafiltrat (gennem en membran med en nominel af skærings værdi ved 20.000 dalton) af denne opløsning havde en osmolalitet på kun 3 mOsm/1, mens retentatet steg til 19 mOsm/1, hvilket viser, at der var en meget lille mængde opløst stof med lav molekylvægt (dvs. lac-25 tose, salte osv.), som bidrog til osmolaliteten i den som udgangsmateriale anvendte valleopløsning. Når UF-retentatet omsattes med trypsin ved pH=8, havde det resulterende hydrolysat en osmolalitet på 59 mOsm/1. Hydrolysatet ultrafiltreredes gennem den samme membran som nævnt ovenfor; filtrates osmola-30 litet fandtes at være 21 mOsm/1. Ultrafiltreringsforsøgene viste, at proteinfordøjelsen ikke var fuldstændig, og at det produkt, der blev opnået ved ultrafiltrering af hydrolysatet, indeholdt betydelige mængder af store peptidfragmenter. GPC-analyser fastslog, at ultrafiltratet ikke blot indeholdt store 35 peptider, men også noget a-lactalbumin-udgangsmateriale.

DK 168080 B1 25

Eksempel 3 Følgende repræsenterer elektrolytbestanddelene i den peritone-ale dialysatopløsning, der anvendes her (g/1):

NaCl 5,38 5 CaCl2 0,257

MgCl2 0,0508

Na-lactat 4,48

De ovennævnte bestanddele giver en osmolalitet på ca. 260 mOsm/1. Til den ovennævnte blanding sattes 61,1 g af peptid-10 blandingen per 1 vand, hvilket giver en osmolalitet på ca. 126 mOsm/1, hvilket giver opløsningen som helhed en osmolalitet, der er tilnærmelsesvis ækvivalent med osmolaliteten hos en 2,5% glucoseopløsning.

Eksempel 4 15 Under anvendelse af peptidblandingen fra eks. IB i en opløsning, som beskrevet i eksempel 3, gennemførtes forsøg til sammenligning af effektiviteten hos de lavmolekylære peptider som osmotiske midler i forhold til glucoses effektivitet.

Ved prøverne blev der anvendt 4 kaniner afprøvet i A-B-række-20 følge, således at hver kanin tjente som kontroldyr for sig selv. Hvert dyr dialyseredes med enten 2,5% glucose eller alternativt med tilstrækkeligt med peptid til at bringe opløsningens osmolalitet til tilnærmelsesvis til osmolaliteten af 2,5% glucoseopløsningen (385 mOsm/1). Hvert dyrs peritoneal-25 hulrum fyldtes med ca. 50 ml dialysat per kg legemsvægt. De indførte rumfang og fluidumforøgelsen (som følge af osmotisk ultrafiltrering) ved afslutningen af 60 min. er opstillet i følgende tabel:

Claims (1)

10 Ved den samme osmolalitet som glucose viser peptiderne en næsten 100% forøgelse af den osmotiske pumpeaktivitet efter 60 min., åbenbart som følge af den lavere hastighed for tab af peptid sammenlignet med glucose til kredsløbet. Fig. 3 og 4 viser de gennemsnitlige amin-ende-gruppe-koncentrationer i 15 forhold til tid, og glucose i forhold til tid i bughinden. Dette bekræfter, at kun 20% af pept idet (målt ved endegrupper) går tabt sammenlignet med næsten 35% tabt glucose. Disse resultater er endnu mere signifikante i lyset af den kendsgerning, at glucose endnu ikke var ækvilibreret til plasmaniveau-20 er efter 60 min. Fremgangsmåde til fremstilling af lavmolekylære peptider med en molekylvægt på mellem ca. 300 og ca. 2000 daltons, k e n -25 detegnet ved, at den omfatter, at man a) behandler et protein af høj kvalitet i en vandig opløsning under hydrolyserende betingelser med mindst ét hydrolytisk enzym til fremstilling af en peptidholdig opløsning, hvori i det mindste nogle af peptiderne har en lav molekylvægt på mellem 30 ca. 300 og ca. 2000 daltons, og i det mindste nogle af peptiderne har en molekylvægt over ca. 2000 daltons, DK 168080 B1 27 b) bringer den peptidholdige opløsning i kontakt med én side af en dialysemembran, mens i alt væsentligt rent vand, opnået fra trin (d), bringes i kontakt med den anden side af dialysemembranen under effektive dialyseseparationsbetingelser, idet 5 dialysemembranen er effektiv til at tillade transport derigennem af de lavmolekylære peptider med molekylvægt mellem ca. 300 og ca. 2000 daltons, mens den tilbageholder peptiderne med en molekylvægt over ca. 2000 daltons i den peptidholdige opløsning, og idet vandet har en tilstrækkelig lav koncentration 10 af opløste peptider, som er effektiv til at tillade transport af de lavmolekylære peptider over membranen ind i vandet, c) fører vandet og de transporterede lavmolekylære peptider indeholdt deri fra den anden side af dialysemembranen til et reservoir, 15 d) fører vand, indeholdende transporterede lavmolekylære peptider, fra reservoiret i kontakt med én side af en membran til omvendt osmose (RO) under separationsbetingelser for omvendt osmose, herunder tryk, som er effektiv til at forårsage, at i alt væsentligt rent vand transporteres over RO-membranen til 20 tilvejebringelse af en mængde i alt væsentligt rent vand til brug i trin (b) , og til at tilbageholde ved den ene side af RO-membranen en mængde vand indeholdende de transporterede lavmolekylære peptider i en højere koncentration end i vandet, der føres til RO-membranen, og 25 e) fører vandet indeholdende de transporterede lavmolekylære peptider i en højere koncentration fra den ene side af RO-membranen til reservoiret til tilvejebringelse i reservoiret af en vandig opløsning af lavmolekylære peptider i en koncentration, som er væsentligt højere end i vandet indeholdende de 30 transporterede lavmolekylære peptider, som føres til reservoiret i trin (c).