JPH0748399A - タンパク質及びペプチドの精製方法及び製造方法 - Google Patents
タンパク質及びペプチドの精製方法及び製造方法Info
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- JPH0748399A JPH0748399A JP718194A JP718194A JPH0748399A JP H0748399 A JPH0748399 A JP H0748399A JP 718194 A JP718194 A JP 718194A JP 718194 A JP718194 A JP 718194A JP H0748399 A JPH0748399 A JP H0748399A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2821—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
Abstract
(57)【要約】
【構成】 脂質含有水性媒体に含まれるタンパク質又は
ペプチドの精製方法であって、粗生成物に含まれるタン
パク質又はペプチドが固体相に吸着され、水混和性有機
溶媒又は生理学的に許容される水性緩衝液と水混和性有
機溶媒との混合物で洗うことにより固体相から脂質を除
去し、その後タンパク質又はペプチドを脂質のない状態
において溶離することを特徴とする上記方法。 【効果】 不必要な脂質を不安定なタンパク質を変成す
るというリスクなしに除去することができる。
ペプチドの精製方法であって、粗生成物に含まれるタン
パク質又はペプチドが固体相に吸着され、水混和性有機
溶媒又は生理学的に許容される水性緩衝液と水混和性有
機溶媒との混合物で洗うことにより固体相から脂質を除
去し、その後タンパク質又はペプチドを脂質のない状態
において溶離することを特徴とする上記方法。 【効果】 不必要な脂質を不安定なタンパク質を変成す
るというリスクなしに除去することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、脂質を含む水性媒体か
ら得られたタンパク質及びペプチドの精製方法、より具
体的には、粒度により分離を行う、一工程段階の濾過技
術を施す、タンパク質及びペプチドを精製する方法に関
する。
ら得られたタンパク質及びペプチドの精製方法、より具
体的には、粒度により分離を行う、一工程段階の濾過技
術を施す、タンパク質及びペプチドを精製する方法に関
する。
【０００２】
【従来技術】医薬用タンパク質及びペプチドを製造する
ための「ダウンストリームプロセッシング(downstream
processing) 」において、一般的には一連の精製工程が
次々と行われ、その工程としては、中でも、例えばウイ
ルス性不純物を分離するための、粒度により分離する濾
過技術、例えば選択的細孔サイズを用いたミクロ- 又は
限外濾過、及びタンパク質分子の異なる物理化学的特性
に基づくクロマトグラフ法があげられる。タンパク質及
びペプチドのバイオテクノロジーによる生成において培
地中の脂質の存在の結果、上記濾過技術において問題が
生じ、それらは血清、所定の組成物を有する精製された
脂質含有血清成分の添加又は所定の脂質混合物、例えば
水性脂質添加剤、例えばBayer Diagnostics により製造
されたEX-CYTE(登録商標)(ギルバート(L.J.Guilbert)、
イスコア(N.N. Iscore) 、Nature 263、594(1976年) 及
びイスコア(N.N. Iscore) 、メルシャー(F.Melchers)、
J. Exp. Med. 147、923(1978年) を参照されたい) の添
加のいずれかにより引き起こされる。従って、例えば、
疎水性相互作用の結果として限外濾過膜、例えばポリエ
ーテルスルホン膜に形成されたカバー層(covering laye
r)の結果として、膜の有効な細孔サイズは、生成物の収
率に好ましくない効果を伴って急に減少するか、又は膜
の細孔は脂質相互作用の結果として望ましい生成物を全
体的に通さなくする。この「脂質効果(lipid effect)」
が深刻になればなるほど、使用した膜の細孔のサイズは
小さくなる。もしこの無害の効果が、より大きな細孔サ
イズを有する膜の使用により阻止されるとしても、脂質
により平衡細孔サイズが変動しなくなるのに一定の時間
がかかるので、大きな細孔サイズの膜は、望ましくない
高分子量を有する分子又はそれに相当する大きな粒子、
例えば、ウイルスを第一相(initial phase) の間、具体
的には膜濾過の直後に通すであろう。
ための「ダウンストリームプロセッシング(downstream
processing) 」において、一般的には一連の精製工程が
次々と行われ、その工程としては、中でも、例えばウイ
ルス性不純物を分離するための、粒度により分離する濾
過技術、例えば選択的細孔サイズを用いたミクロ- 又は
限外濾過、及びタンパク質分子の異なる物理化学的特性
に基づくクロマトグラフ法があげられる。タンパク質及
びペプチドのバイオテクノロジーによる生成において培
地中の脂質の存在の結果、上記濾過技術において問題が
生じ、それらは血清、所定の組成物を有する精製された
脂質含有血清成分の添加又は所定の脂質混合物、例えば
水性脂質添加剤、例えばBayer Diagnostics により製造
されたEX-CYTE(登録商標)(ギルバート(L.J.Guilbert)、
イスコア(N.N. Iscore) 、Nature 263、594(1976年) 及
びイスコア(N.N. Iscore) 、メルシャー(F.Melchers)、
J. Exp. Med. 147、923(1978年) を参照されたい) の添
加のいずれかにより引き起こされる。従って、例えば、
疎水性相互作用の結果として限外濾過膜、例えばポリエ
ーテルスルホン膜に形成されたカバー層(covering laye
r)の結果として、膜の有効な細孔サイズは、生成物の収
率に好ましくない効果を伴って急に減少するか、又は膜
の細孔は脂質相互作用の結果として望ましい生成物を全
体的に通さなくする。この「脂質効果(lipid effect)」
が深刻になればなるほど、使用した膜の細孔のサイズは
小さくなる。もしこの無害の効果が、より大きな細孔サ
イズを有する膜の使用により阻止されるとしても、脂質
により平衡細孔サイズが変動しなくなるのに一定の時間
がかかるので、大きな細孔サイズの膜は、望ましくない
高分子量を有する分子又はそれに相当する大きな粒子、
例えば、ウイルスを第一相(initial phase) の間、具体
的には膜濾過の直後に通すであろう。
【０００３】ブライ(E.G. Bligh)及びダイヤー(W.J. Dy
er) は、クロロホルム- メタノール- 水混合物を使用し
て、動物組織、具体的には魚から脂質を抽出する方法を
記載した(Can. J. Biochem. Physiol., Vol.37, 911 〜
917 ページ(1959 年) を参照されたい) 。最適な脂質の
抽出は、クロロホルム及びメタノールの混合物と組織を
ホモジナイズすることにより達成され、組織に含まれた
水との単相の混合物を形成する。その後、ホモジナイズ
した物質を水及び／又はクロロホルムで希釈し、二相系
を形成する。ここでクロロホルム相は脂質を含有し、メ
タノール−水相は脂質を含まない。しかし、特定の条件
下における溶液中の不安定なタンパク質は変性するかも
しれないので、この方法は医薬としてのタンパク質から
脂質を除去するのに好適でない。EP 0 197 554は、両親
媒性物(amphiphile)、ハイポクロライド(hypochlorid
e)、β- プロピオラクトン及び有機溶媒を使用し、動物
又はヒトの血液、例えば血液画分又は血液タンパク質か
ら得られる生成物におけるウイルスの不活性化及び発熱
の低下の方法を記載している。
er) は、クロロホルム- メタノール- 水混合物を使用し
て、動物組織、具体的には魚から脂質を抽出する方法を
記載した(Can. J. Biochem. Physiol., Vol.37, 911 〜
917 ページ(1959 年) を参照されたい) 。最適な脂質の
抽出は、クロロホルム及びメタノールの混合物と組織を
ホモジナイズすることにより達成され、組織に含まれた
水との単相の混合物を形成する。その後、ホモジナイズ
した物質を水及び／又はクロロホルムで希釈し、二相系
を形成する。ここでクロロホルム相は脂質を含有し、メ
タノール−水相は脂質を含まない。しかし、特定の条件
下における溶液中の不安定なタンパク質は変性するかも
しれないので、この方法は医薬としてのタンパク質から
脂質を除去するのに好適でない。EP 0 197 554は、両親
媒性物(amphiphile)、ハイポクロライド(hypochlorid
e)、β- プロピオラクトン及び有機溶媒を使用し、動物
又はヒトの血液、例えば血液画分又は血液タンパク質か
ら得られる生成物におけるウイルスの不活性化及び発熱
の低下の方法を記載している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、不必
要な脂質を不安定なタンパク質を変性するというリスク
を伴わずに除去し、粒度により分離する濾過技術の使用
の際に生じる上記問題が生じない、脂質含有水性媒体か
ら得られるタンパク質及びペプチドを精製する方法を開
発することである。
要な脂質を不安定なタンパク質を変性するというリスク
を伴わずに除去し、粒度により分離する濾過技術の使用
の際に生じる上記問題が生じない、脂質含有水性媒体か
ら得られるタンパク質及びペプチドを精製する方法を開
発することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、粗生成
物に含まれるタンパク質又はペプチドが固体相に吸着
し、水混和性有機溶媒及び生理学的に許容されうる緩衝
溶液の混合物で洗うことにより固体相から脂質が除去さ
れ、その後タンパク質又はペプチドを脂質を含まない状
態で溶離する精製工程により達成される。例えば、一般
的な膜タンパク質のような強い親和性のタンパク質を精
製する時、精製されるべきタンパク質又はペプチドの変
性というリスクがないという条件の下に、例えば、生理
学的に許容されうる水性緩衝溶液を添加することなしに
水混和性有機溶媒のみを使用して固体相から脂質を除去
することができる。
物に含まれるタンパク質又はペプチドが固体相に吸着
し、水混和性有機溶媒及び生理学的に許容されうる緩衝
溶液の混合物で洗うことにより固体相から脂質が除去さ
れ、その後タンパク質又はペプチドを脂質を含まない状
態で溶離する精製工程により達成される。例えば、一般
的な膜タンパク質のような強い親和性のタンパク質を精
製する時、精製されるべきタンパク質又はペプチドの変
性というリスクがないという条件の下に、例えば、生理
学的に許容されうる水性緩衝溶液を添加することなしに
水混和性有機溶媒のみを使用して固体相から脂質を除去
することができる。
【０００６】本発明の好ましい方法において、固体相か
らの溶離の後、タンパク質を粒度により分離する濾過技
術、例えば限外濾過にかける。タンパク質又はペプチド
の分子量により、限外濾過膜、例えばプラスチックポリ
マー又はセルロース膜、又は呼称排除限界が１〜500KD
のセラミックモジュールを使用して限外濾過を行っても
よい。ここで限外濾過モジュールの排除限界は、精製さ
れるべきタンパク質又はペプチドの分子量よりも大きい
ものである。限外濾過の間に実際に適用する分離のパラ
メーターは、精製されるべきタンパク質又はペプチドの
呼称分子量ではなく、異なる緩衝培地における水和の異
なる程度の結果としてある程度まで変化しうる当該培地
中の分子の有効容量サイズ又はストークス半径であるこ
とが確証されるにちがいない。ペプチドを精製するため
に、呼称排除限界が１〜20KDの膜を使用することが好ま
しい。クラスＡ、Ｄ、Ｅ及びＧの免疫グロブリンを精製
するために、呼称排除限界が150 〜350KD の限外濾過モ
ジュールを使用することが好ましく、Fab-断片及びr-tP
A のような同様の分子量の組み換えタンパク質を精製す
るために、呼称排除限界が50〜150KD の限外濾過モジュ
ールを使用することが好ましく、また、インターフェロ
ンを精製するためには呼称排除限界が20〜50KDの限外濾
過モジュールが好ましい。
らの溶離の後、タンパク質を粒度により分離する濾過技
術、例えば限外濾過にかける。タンパク質又はペプチド
の分子量により、限外濾過膜、例えばプラスチックポリ
マー又はセルロース膜、又は呼称排除限界が１〜500KD
のセラミックモジュールを使用して限外濾過を行っても
よい。ここで限外濾過モジュールの排除限界は、精製さ
れるべきタンパク質又はペプチドの分子量よりも大きい
ものである。限外濾過の間に実際に適用する分離のパラ
メーターは、精製されるべきタンパク質又はペプチドの
呼称分子量ではなく、異なる緩衝培地における水和の異
なる程度の結果としてある程度まで変化しうる当該培地
中の分子の有効容量サイズ又はストークス半径であるこ
とが確証されるにちがいない。ペプチドを精製するため
に、呼称排除限界が１〜20KDの膜を使用することが好ま
しい。クラスＡ、Ｄ、Ｅ及びＧの免疫グロブリンを精製
するために、呼称排除限界が150 〜350KD の限外濾過モ
ジュールを使用することが好ましく、Fab-断片及びr-tP
A のような同様の分子量の組み換えタンパク質を精製す
るために、呼称排除限界が50〜150KD の限外濾過モジュ
ールを使用することが好ましく、また、インターフェロ
ンを精製するためには呼称排除限界が20〜50KDの限外濾
過モジュールが好ましい。
【０００７】例えば炭素数２〜５のアルコール、エチレ
ングリコール、ジエチレングリコール、テトラヒドロフ
ラン、ジオキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド又はアセトニトリルを使用し、具
体的にはエタノール、n-プロパノール、i-プロパノー
ル、n-ブタノール、i-ブタノール又はtert. ブタノール
を使用して固体相から脂質を除去してもよい。n-プロパ
ノール及びi-プロパノールが特に好ましい。
ングリコール、ジエチレングリコール、テトラヒドロフ
ラン、ジオキサン、アセトン、ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド又はアセトニトリルを使用し、具
体的にはエタノール、n-プロパノール、i-プロパノー
ル、n-ブタノール、i-ブタノール又はtert. ブタノール
を使用して固体相から脂質を除去してもよい。n-プロパ
ノール及びi-プロパノールが特に好ましい。
【０００８】固体相から脂質を除去するのに使用する溶
媒は、生理学的に許容されうる水性緩衝溶液との混合物
において好ましく使用される。該溶媒は、５〜50容量
％、好ましくは10〜25容量％の比率で緩衝溶液中に存在
する。好ましくは、生理学的に許容されうる緩衝溶液
は、pHが５〜９であり、イオン強度が0.01〜2.00M のも
のが使用される。例えば、アセテート、ビカルボネー
ト、ボレート、シトレート、マレート、フォスフェー
ト、フタレート、サクシネート、グリシン、リシン、ヒ
スチジン又はトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン緩衝液、それらの混合物又は他の望ましい生理学的緩
衝溶液を、精製されるべき生成物が固体マトリックスに
結合したままでありかつ望ましくない不可逆のいかなる
変化も又は生成物の変異のいずれも生じないという影響
の下で、使用することが可能である。
媒は、生理学的に許容されうる水性緩衝溶液との混合物
において好ましく使用される。該溶媒は、５〜50容量
％、好ましくは10〜25容量％の比率で緩衝溶液中に存在
する。好ましくは、生理学的に許容されうる緩衝溶液
は、pHが５〜９であり、イオン強度が0.01〜2.00M のも
のが使用される。例えば、アセテート、ビカルボネー
ト、ボレート、シトレート、マレート、フォスフェー
ト、フタレート、サクシネート、グリシン、リシン、ヒ
スチジン又はトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン緩衝液、それらの混合物又は他の望ましい生理学的緩
衝溶液を、精製されるべき生成物が固体マトリックスに
結合したままでありかつ望ましくない不可逆のいかなる
変化も又は生成物の変異のいずれも生じないという影響
の下で、使用することが可能である。
【０００９】タンパク質又はペプチドの吸着に使用され
る固体相は、上記溶媒又は溶媒／緩衝液混合物の一つで
洗うことにより脂質を除去する間、結合型において精製
されるべき生成物を保持するいずれのクロマトグラフィ
ーマトリックスであってもよい。好適な固体相の例とし
ては、具体的には、陽イオン又は陰イオン交換体、疎水
性マトリックス又は精製されるべきタンパク質又はペプ
チド、例えば好適な抗体による免疫グロブリン又はイム
ノアフィニティ用のプロテインＡ又はプロテインＧに特
異的なアフィニティクロマトグラフィマトリックス及び
r-tPA 用のリシン又はアルギニンセファロースがあげら
れる。
る固体相は、上記溶媒又は溶媒／緩衝液混合物の一つで
洗うことにより脂質を除去する間、結合型において精製
されるべき生成物を保持するいずれのクロマトグラフィ
ーマトリックスであってもよい。好適な固体相の例とし
ては、具体的には、陽イオン又は陰イオン交換体、疎水
性マトリックス又は精製されるべきタンパク質又はペプ
チド、例えば好適な抗体による免疫グロブリン又はイム
ノアフィニティ用のプロテインＡ又はプロテインＧに特
異的なアフィニティクロマトグラフィマトリックス及び
r-tPA 用のリシン又はアルギニンセファロースがあげら
れる。
【００１０】脂質の除去の後、固体相を、上記の生理学
的に許容されうる緩衝溶液の一つであって有機溶媒を含
まないもので、好ましくは先の工程において脂質を除去
するのに使用した緩衝溶液で洗浄し、固体相から有機溶
媒を溶出する。その後、固体相に吸着したタンパク質又
はペプチドをそれ自体公知の方法、例えば、上記のよう
に生理学的に許容されうる緩衝溶液を、好適な脱着剤、
例えば上記生理学的に許容されうる緩衝溶液の一つ中の
塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、
ε- アミノカプロン酸又はクエン酸ナトリウムの溶液と
共に用いて、使用した溶離剤のpHを変化させるか使用し
た溶離剤に有機溶媒を添加することにより固体相から溶
離するか、溶離の上記方法を組み合わせて使用してもよ
い。しかし、固体相に吸着したタンパク質又はペプチド
の溶離は、上記のように生理学的に許容されうる緩衝溶
液を用いて好ましく行われる。
的に許容されうる緩衝溶液の一つであって有機溶媒を含
まないもので、好ましくは先の工程において脂質を除去
するのに使用した緩衝溶液で洗浄し、固体相から有機溶
媒を溶出する。その後、固体相に吸着したタンパク質又
はペプチドをそれ自体公知の方法、例えば、上記のよう
に生理学的に許容されうる緩衝溶液を、好適な脱着剤、
例えば上記生理学的に許容されうる緩衝溶液の一つ中の
塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、
ε- アミノカプロン酸又はクエン酸ナトリウムの溶液と
共に用いて、使用した溶離剤のpHを変化させるか使用し
た溶離剤に有機溶媒を添加することにより固体相から溶
離するか、溶離の上記方法を組み合わせて使用してもよ
い。しかし、固体相に吸着したタンパク質又はペプチド
の溶離は、上記のように生理学的に許容されうる緩衝溶
液を用いて好ましく行われる。
【００１１】本発明の方法は、脂質含有水性溶液に含ま
れるタンパク質又はペプチドを精製するために特に使用
することができ、ここでこれらタンパク質又はペプチド
は血清、所定の組成の脂質含有血清成分又は所定の脂質
混合物の添加を用いた組み換え方法又は融合技術により
製造され、これらタンパク質又はペプチドはヒト又は動
物に使用されること、例えば医薬、治療又は診断を目的
とするものである。組み換え方法又は融合技術と共に使
用してもよいいずれの脂質含有培地を使用してもよく、
脂質成分がウシ及び非ウシ起源の脂質、例えばコレステ
ロール、必須脂肪酸、リポタンパク質（HDL 、LDL 及び
VLDL) 、プロスタノイド、トリグリセリド又はリン脂
質、例えばレシチン、リゾレシチン、スフィンゴミエリ
ン、フォスファチジルエタノールアミン等であってもよ
い。脂質を、水性乳濁液として又は溶液の形態において
純粋な形態において、所望により好適な可溶化剤又は好
適な担体物質、例えばアルブミンと共に培地に加えても
よい。好ましくは、購入することができる脂質組成物、
例えばEX-CYTE(登録商標)(Bayer Diagnostics)を培地
に、例えば培地１リットル当たり１〜５mlの量で加えて
もよい。
れるタンパク質又はペプチドを精製するために特に使用
することができ、ここでこれらタンパク質又はペプチド
は血清、所定の組成の脂質含有血清成分又は所定の脂質
混合物の添加を用いた組み換え方法又は融合技術により
製造され、これらタンパク質又はペプチドはヒト又は動
物に使用されること、例えば医薬、治療又は診断を目的
とするものである。組み換え方法又は融合技術と共に使
用してもよいいずれの脂質含有培地を使用してもよく、
脂質成分がウシ及び非ウシ起源の脂質、例えばコレステ
ロール、必須脂肪酸、リポタンパク質（HDL 、LDL 及び
VLDL) 、プロスタノイド、トリグリセリド又はリン脂
質、例えばレシチン、リゾレシチン、スフィンゴミエリ
ン、フォスファチジルエタノールアミン等であってもよ
い。脂質を、水性乳濁液として又は溶液の形態において
純粋な形態において、所望により好適な可溶化剤又は好
適な担体物質、例えばアルブミンと共に培地に加えても
よい。好ましくは、購入することができる脂質組成物、
例えばEX-CYTE(登録商標)(Bayer Diagnostics)を培地
に、例えば培地１リットル当たり１〜５mlの量で加えて
もよい。
【００１２】本発明の方法は、約500KD までの分子量を
有する組み換え体及び自然のままのタンパク質又はペプ
チドを上記のような培地から精製するために好ましく使
用されるが、使用した緩衝条件下において、精製される
べき組み換え体又は自然のままのタンパク質又はペプチ
ド分子のストークス半径が十分に小さく、相当するタン
パク質又はペプチドが膜の細孔を通過するような方法に
おいて、限外濾過の間に使用した限外濾過モジュールの
排除限界を、精製されるタンパク質又はペプチドの分子
量に適合させる。最も好ましくは、該方法を、クラス
Ａ、Ｄ、Ｅ及びＧの免疫グロブリン、具体的にはタイプ
IgG2のモノクローナル抗体、例えばモノクローナル抗体
抗-ICAM を精製するため、インターフェロン、具体的に
はインターフェロン- ωを精製するため及び脂質含有水
性媒体からr-tPA 又はFab-断片を精製するために使用す
る。
有する組み換え体及び自然のままのタンパク質又はペプ
チドを上記のような培地から精製するために好ましく使
用されるが、使用した緩衝条件下において、精製される
べき組み換え体又は自然のままのタンパク質又はペプチ
ド分子のストークス半径が十分に小さく、相当するタン
パク質又はペプチドが膜の細孔を通過するような方法に
おいて、限外濾過の間に使用した限外濾過モジュールの
排除限界を、精製されるタンパク質又はペプチドの分子
量に適合させる。最も好ましくは、該方法を、クラス
Ａ、Ｄ、Ｅ及びＧの免疫グロブリン、具体的にはタイプ
IgG2のモノクローナル抗体、例えばモノクローナル抗体
抗-ICAM を精製するため、インターフェロン、具体的に
はインターフェロン- ωを精製するため及び脂質含有水
性媒体からr-tPA 又はFab-断片を精製するために使用す
る。
【００１３】また、本発明は、バイオテクノロジー方
法、例えば組み換え技術又は融合技術によるタンパク質
又はペプチドを、細胞に望ましいタンパク質又はペプチ
ドの産生に適した条件下において適した培地において細
胞を培養することにより製造する方法に関し、ここで血
清又は血清の代わりの所定の組成の精製した脂質含有血
清成分又は所定の脂質混合物のいずれかを培地に加え、
タンパク質又はペプチドを、培地において発現させるか
又は培養後の細胞からはずし、多くの精製工程により脂
質及びタンパク質又はペプチドを含む最終培地から回収
し、ここで精製工程の少なくとも一つにおいて該タンパ
ク質又はペプチドは、粒度により分離する濾過技術にか
けられるものであり、後の濾過技術が行われる前に脂質
をタンパク質又はペプチドから分離し、該タンパク質又
はペプチドを上記精製方法により単離することを特徴と
するものである。
法、例えば組み換え技術又は融合技術によるタンパク質
又はペプチドを、細胞に望ましいタンパク質又はペプチ
ドの産生に適した条件下において適した培地において細
胞を培養することにより製造する方法に関し、ここで血
清又は血清の代わりの所定の組成の精製した脂質含有血
清成分又は所定の脂質混合物のいずれかを培地に加え、
タンパク質又はペプチドを、培地において発現させるか
又は培養後の細胞からはずし、多くの精製工程により脂
質及びタンパク質又はペプチドを含む最終培地から回収
し、ここで精製工程の少なくとも一つにおいて該タンパ
ク質又はペプチドは、粒度により分離する濾過技術にか
けられるものであり、後の濾過技術が行われる前に脂質
をタンパク質又はペプチドから分離し、該タンパク質又
はペプチドを上記精製方法により単離することを特徴と
するものである。
【００１４】哺乳類の細胞から得られる産物の生成の一
つの重要な態様は、例として、ウイルスのような生物学
的起源の不純物の存在という潜在的リスクである。従っ
て、in vivo における使用を意図したタンパク質産物に
おいてそのような不純物のいずれも不活性であるか又は
生成物から除去されることを確実とすることに注意が払
われなければならない。上記のような脂質に起因する限
外濾過方法の間の有害な効果は限外濾過の前の本発明に
よる脂質の除去により避けられるので、本発明の方法
は、脂質含有培地、具体的には脂質を含有する水性培地
からタンパク質を精製し、組み換え技術又は融合技術に
よりタンパク質又はペプチドを製造する時でも、望まし
い生成物から感染性のウイルス粒子を除去するのに好適
であると知られている限外濾過方法を用いることを可能
とする。さらに、このことは、より小さな孔のサイズ、
例えば呼称排除限界が200 から150KD の限外濾過モジュ
ールを使用することを可能とする、即ち、それらの容量
サイズにおいて望ましい生成物の分子の大きさに緊密な
分子又は粒子を分離することが可能である。従って、ウ
イルスの除去の有効性は実質的に改善される。
つの重要な態様は、例として、ウイルスのような生物学
的起源の不純物の存在という潜在的リスクである。従っ
て、in vivo における使用を意図したタンパク質産物に
おいてそのような不純物のいずれも不活性であるか又は
生成物から除去されることを確実とすることに注意が払
われなければならない。上記のような脂質に起因する限
外濾過方法の間の有害な効果は限外濾過の前の本発明に
よる脂質の除去により避けられるので、本発明の方法
は、脂質含有培地、具体的には脂質を含有する水性培地
からタンパク質を精製し、組み換え技術又は融合技術に
よりタンパク質又はペプチドを製造する時でも、望まし
い生成物から感染性のウイルス粒子を除去するのに好適
であると知られている限外濾過方法を用いることを可能
とする。さらに、このことは、より小さな孔のサイズ、
例えば呼称排除限界が200 から150KD の限外濾過モジュ
ールを使用することを可能とする、即ち、それらの容量
サイズにおいて望ましい生成物の分子の大きさに緊密な
分子又は粒子を分離することが可能である。従って、ウ
イルスの除去の有効性は実質的に改善される。
【００１５】図面の説明 図１： 実施例１に従ってS-セファロースFFにおいて10
mMクエン酸ナトリウム：イソプロパノール＝80：20(v:
v) で洗うことにより脂質除去したモノクローナル抗体
抗-ICAM のクロマトグラフィプロフィール（UV 280nm)
。溶出：50mM クエン酸ナトリウム、100mM NaCl、pH
＝7.8 、線流れ速度(linear flow rate): 200cm h -1。 図２： 実施例２に従ってプロテインG-セファロースFF
において20mMクエン酸ナトリウム：イソプロパノール＝
80：20(v:v) で洗うことにより脂質除去したモノクロー
ナル抗体抗-ICAM のクロマトグラフィプロフィール（UV
280nm) 。溶出：0.1Mグリシン/H3PO4、pH＝3.5 、線流
れ速度(linear flow rate): 120cm h -1。
mMクエン酸ナトリウム：イソプロパノール＝80：20(v:
v) で洗うことにより脂質除去したモノクローナル抗体
抗-ICAM のクロマトグラフィプロフィール（UV 280nm)
。溶出：50mM クエン酸ナトリウム、100mM NaCl、pH
＝7.8 、線流れ速度(linear flow rate): 200cm h -1。 図２： 実施例２に従ってプロテインG-セファロースFF
において20mMクエン酸ナトリウム：イソプロパノール＝
80：20(v:v) で洗うことにより脂質除去したモノクロー
ナル抗体抗-ICAM のクロマトグラフィプロフィール（UV
280nm) 。溶出：0.1Mグリシン/H3PO4、pH＝3.5 、線流
れ速度(linear flow rate): 120cm h -1。
【００１６】図３： a)脂質を含まないモノクローナル
抗体抗-ICAM の300KD 限外濾過の濾液のUVプロフィール
(280nm) （膜を通る生成物の全透過）。 b)実施例３による脂質含有モノクローナル抗体抗-ICAM
の300KD 限外濾過の濾液のUVプロフィール(280nm) 。限
外濾過工程の開始後すぐに、生成物により膜が不浸透性
になった結果として、透過液体の吸光度は急に低下し
た。 図４〜６： 実施例４による脂質を含まないモノクロー
ナル抗体抗-ICAM の限外濾過のUVプロフィール。 膜：ポリエーテルスルホン、350cm2 濃度：12 mg ml-1 緩衝液：リン酸緩衝生理食塩溶液 収率：95〜100 ％ 呼称排除限界：a) 300KD（図４） b) 200KD（図５） c) 150KD（図６） 以下の実施例により本発明を具体的に説明する。
抗体抗-ICAM の300KD 限外濾過の濾液のUVプロフィール
(280nm) （膜を通る生成物の全透過）。 b)実施例３による脂質含有モノクローナル抗体抗-ICAM
の300KD 限外濾過の濾液のUVプロフィール(280nm) 。限
外濾過工程の開始後すぐに、生成物により膜が不浸透性
になった結果として、透過液体の吸光度は急に低下し
た。 図４〜６： 実施例４による脂質を含まないモノクロー
ナル抗体抗-ICAM の限外濾過のUVプロフィール。 膜：ポリエーテルスルホン、350cm2 濃度：12 mg ml-1 緩衝液：リン酸緩衝生理食塩溶液 収率：95〜100 ％ 呼称排除限界：a) 300KD（図４） b) 200KD（図５） c) 150KD（図６） 以下の実施例により本発明を具体的に説明する。
【００１７】
【実施例】実施例１ 媒体１リットル当たりEX-CYTE(登録商標)III(Bayer Dia
gnostics) 2.5ml を脂質添加剤として加えた培地から得
たモノクローナル抗体抗-ICAM の粗生成物（この粗生成
物はミクロフィルターにかけ(microfiltered) （0.1 〜
0.2 μm ) 、細胞を除去し、陽イオン交換クロマトグラ
フィに好適なpHに調節し、かつ好適な電導度に調節した
ものである）を、あらかじめ10mMのクエン酸ナトリウム
の水性緩衝溶液（pH 6.25)で平衡にした陽イオン交換マ
トリックスS-セファロースFF(Pharmacia)(カラムの直径
５cm、充填レベル 10.3cm)に吸着させた。充填後、カラ
ムを平衡にした緩衝液及びイソプロパノール80：20(v:
v) の混合物で洗浄し、脂質を除去した。その後、溶媒
を含まない緩衝液で再び平衡にし、続いて抗体を高いイ
オン強度の水性緩衝溶液（50mM クエン酸ナトリウム、
100mM NaCl、pH 7.8、線流れ速度(linear flow rate) 2
00 cm h -1) で溶離した。その後、マトリックスを１M
NaOHで再生した（図１を参照されたい）。
gnostics) 2.5ml を脂質添加剤として加えた培地から得
たモノクローナル抗体抗-ICAM の粗生成物（この粗生成
物はミクロフィルターにかけ(microfiltered) （0.1 〜
0.2 μm ) 、細胞を除去し、陽イオン交換クロマトグラ
フィに好適なpHに調節し、かつ好適な電導度に調節した
ものである）を、あらかじめ10mMのクエン酸ナトリウム
の水性緩衝溶液（pH 6.25)で平衡にした陽イオン交換マ
トリックスS-セファロースFF(Pharmacia)(カラムの直径
５cm、充填レベル 10.3cm)に吸着させた。充填後、カラ
ムを平衡にした緩衝液及びイソプロパノール80：20(v:
v) の混合物で洗浄し、脂質を除去した。その後、溶媒
を含まない緩衝液で再び平衡にし、続いて抗体を高いイ
オン強度の水性緩衝溶液（50mM クエン酸ナトリウム、
100mM NaCl、pH 7.8、線流れ速度(linear flow rate) 2
00 cm h -1) で溶離した。その後、マトリックスを１M
NaOHで再生した（図１を参照されたい）。
【００１８】実施例２ 媒体１リットル当たりEX-CYTE(登録商標)III(Bayer Dia
gnostics) 2.5ml を脂質添加剤として加えた培地から得
たモノクローナル抗体抗-ICAM の粗生成物（この粗生成
物はミクロフィルターにかけ(microfiltered) （0.1 〜
0.2 μm ) 、細胞を除去し、アフィニティクロマトグラ
フィに好適なpHに調節し、かつ好適な電導度に調節した
ものである）を、あらかじめ20mMクエン酸ナトリウムの
水性緩衝溶液（pH 6.25)で平衡にしたアフィニティクロ
マトグラフィマトリックスプロテインG-セファロースFF
(Pharmacia)(カラムの直径18cm、充填レベル 17cm)に吸
着させた。充填後、カラムを平衡にした緩衝液及びイソ
プロパノール80：20(v:v)の混合物で洗浄し、脂質を除
去した。その後、溶媒を含まない緩衝液で再び平衡に
し、その後、抗体を低いpHにおいて水性緩衝溶液（0.1M
グリシン/H3PO4、pH3.5、線流れ速度(linear flow ra
te) 120 cm h -1) で溶離した。その後、マトリックス
を１M 酢酸で、その後６M 尿素溶液で再生した（図２を
参照されたい）。
gnostics) 2.5ml を脂質添加剤として加えた培地から得
たモノクローナル抗体抗-ICAM の粗生成物（この粗生成
物はミクロフィルターにかけ(microfiltered) （0.1 〜
0.2 μm ) 、細胞を除去し、アフィニティクロマトグラ
フィに好適なpHに調節し、かつ好適な電導度に調節した
ものである）を、あらかじめ20mMクエン酸ナトリウムの
水性緩衝溶液（pH 6.25)で平衡にしたアフィニティクロ
マトグラフィマトリックスプロテインG-セファロースFF
(Pharmacia)(カラムの直径18cm、充填レベル 17cm)に吸
着させた。充填後、カラムを平衡にした緩衝液及びイソ
プロパノール80：20(v:v)の混合物で洗浄し、脂質を除
去した。その後、溶媒を含まない緩衝液で再び平衡に
し、その後、抗体を低いpHにおいて水性緩衝溶液（0.1M
グリシン/H3PO4、pH3.5、線流れ速度(linear flow ra
te) 120 cm h -1) で溶離した。その後、マトリックス
を１M 酢酸で、その後６M 尿素溶液で再生した（図２を
参照されたい）。
【００１９】以下の実施例３〜５に記載したモノクロー
ナル抗体抗-ICAM の限外濾過を、接線下流濾過(tangent
ial flow filtration)を用いて行った。様々な呼称排除
限界の膜を使用し、生成物の収率を測定した。以下の装
置を使用した： Filtron(USA)により製造した膜ホルダー(membrane hold
er) 「Minisette 」 チューブポンプ(tube pump)Watson Marlow 501 U 膜カセット： Filtron(USA)により製造したMinisette 300 KD オメ
ガ、350 cm2 Filtron(USA)により製造したMinisette 200 KD オメ
ガ、350 cm2 Filtron(USA)により製造したMinisette 150 KD オメ
ガ、350 cm2 各試験バッチにおいて、濃度12mg/ml においてタンパク
質を含有する容量500mlのサンプルを相当する膜カセッ
トを通して限外濾過した。リン酸緩衝生理食塩溶液を緩
衝液として使用した。入力圧力は0.5 バールであり、出
力圧力は０〜0.2 バールであった。これにより、膜内外
圧力(transmembrane pressure)は0.25〜0.35バールとな
った。
ナル抗体抗-ICAM の限外濾過を、接線下流濾過(tangent
ial flow filtration)を用いて行った。様々な呼称排除
限界の膜を使用し、生成物の収率を測定した。以下の装
置を使用した： Filtron(USA)により製造した膜ホルダー(membrane hold
er) 「Minisette 」 チューブポンプ(tube pump)Watson Marlow 501 U 膜カセット： Filtron(USA)により製造したMinisette 300 KD オメ
ガ、350 cm2 Filtron(USA)により製造したMinisette 200 KD オメ
ガ、350 cm2 Filtron(USA)により製造したMinisette 150 KD オメ
ガ、350 cm2 各試験バッチにおいて、濃度12mg/ml においてタンパク
質を含有する容量500mlのサンプルを相当する膜カセッ
トを通して限外濾過した。リン酸緩衝生理食塩溶液を緩
衝液として使用した。入力圧力は0.5 バールであり、出
力圧力は０〜0.2 バールであった。これにより、膜内外
圧力(transmembrane pressure)は0.25〜0.35バールとな
った。
【００２０】 入力圧力 出力圧力 膜内外圧力 （バール） （バール） （バール） ──────────────────────────────── 300 KD 0.5 0.0 0.25 200 KD 0.5 0.15 0.33 150 KD 0.5 0.20 0.35 ──────────────────────────────── クロス流速(cross flow rate) は1.4 ml cm -2 min-1で
あった。生成物を含む濾液の流れをUV- 測定細胞により
検出し、相当する濾過プロフィールをペンレコーダーを
用いて記載した。
あった。生成物を含む濾液の流れをUV- 測定細胞により
検出し、相当する濾過プロフィールをペンレコーダーを
用いて記載した。
【００２１】実施例３ 実施例１と同様に前処理したが、平衡状態の緩衝液：イ
ソプロパノール＝80：20(v:v) による洗浄工程にかけ
ず、それゆえに脂質をまだ含んでいるモノクローナル抗
体抗-ICAM の粗生成物を呼称排除限界が300KD の膜を用
いて限外濾過した。限外濾過方法を開始した直後、生成
物は膜の細孔をもはや通過しないので、吸光度はすばや
く減少する（図３b を参照されたい) 。実施例４ 実施例１により得られたモノクローナル抗体抗-ICAM の
脂質を含まない粗生成物を、呼称排除限界が300KD 、20
0KD 及び150KD の膜を用いて限外濾過した。排除限界が
小さくなるにつれて透過速度は減少する、即ち、全体の
濾過にかかる時間がそれに従って増加する。しかし、３
つの場合すべてにおいて、生成物は大部分が定量的に限
外濾過される（図４〜６を参照されたい）。濾液におけ
る回収率は、300KD に関しては98％であり、200KD 及び
150KD 膜に関してはそれぞれ100％であった。
ソプロパノール＝80：20(v:v) による洗浄工程にかけ
ず、それゆえに脂質をまだ含んでいるモノクローナル抗
体抗-ICAM の粗生成物を呼称排除限界が300KD の膜を用
いて限外濾過した。限外濾過方法を開始した直後、生成
物は膜の細孔をもはや通過しないので、吸光度はすばや
く減少する（図３b を参照されたい) 。実施例４ 実施例１により得られたモノクローナル抗体抗-ICAM の
脂質を含まない粗生成物を、呼称排除限界が300KD 、20
0KD 及び150KD の膜を用いて限外濾過した。排除限界が
小さくなるにつれて透過速度は減少する、即ち、全体の
濾過にかかる時間がそれに従って増加する。しかし、３
つの場合すべてにおいて、生成物は大部分が定量的に限
外濾過される（図４〜６を参照されたい）。濾液におけ
る回収率は、300KD に関しては98％であり、200KD 及び
150KD 膜に関してはそれぞれ100％であった。
【００２２】実施例５ スピッキング(spiking) 実験〔Virus Removal and Inac
tivation、ウォルター(J.K. Walter) 、ワーツ(W. Wer
z) 、バーソルド(W. Berthold) 著、Biotech Forum Eur
ope Vol. 9 、No. 9 、560 〜564 ページ、1992年；Dow
nstream Processing of products obtained from cell
cultures 、ウォルター(J.K. Walter) 著、Bio Enginee
ring 5 、14〜19ページ、1990年；Virus Removal/Inact
ibation in Downstream Processing 、ウォルター(J.K.
Walter) 、ワーツ(W. Werz) 、ゴッフ(P. Mc Goff)、
ワーナー(R.G. Werner) 、バーソルド(W. Berthold)
著、11. ESACT meeting 、Brighton、GB、９月号 2 〜
6 頁、1991年、以下のものにおいて公表された：Animal
Cell Technology：Developments, Process & Product
s、編集者スパイヤー(R.E. Spier)、グリフィス(J.B. G
riffiths)、マクドナルド(C. MacDonald)、Butterworth
-Heinemann Ltd.、オックスフォード、1992年 p.624〜6
34 〕を用いて、実施例１により脂質を除去したモノク
ローナル抗体抗-ICAM の粗生成物の限外濾過によるウイ
ルス除去の最終的な有効性を測定した。使用した試験ウ
イルスは、非コートウイルス(uncoated virus) Reo 3及
びコートパラインフルエンザ 3 (PI-3) ウイルスであっ
た。感染性ウイルス粒子の公知の濃度に相当するウイル
ス溶液の所定の量をモノクローナル抗体抗-ICAM の脂質
を含まない粗生成物のサンプルに加え、次に呼称排除限
界が300KD 及び200KD の膜を用いて限外濾過した。300K
D 及び200KD 限外濾過に関して、ウイルスの枯渇を３つ
のサンプルについて測定し、測定した充填物のウイルス
力価を測定した濾液の力価と比較した。以下の表１は、
対数型において枯渇率を示すものである。300KDの限外
濾過と比べると、ウイルスの枯渇における有意な改良
は、200KD の呼称限外濾過膜を使用することにより達成
することができる。
tivation、ウォルター(J.K. Walter) 、ワーツ(W. Wer
z) 、バーソルド(W. Berthold) 著、Biotech Forum Eur
ope Vol. 9 、No. 9 、560 〜564 ページ、1992年；Dow
nstream Processing of products obtained from cell
cultures 、ウォルター(J.K. Walter) 著、Bio Enginee
ring 5 、14〜19ページ、1990年；Virus Removal/Inact
ibation in Downstream Processing 、ウォルター(J.K.
Walter) 、ワーツ(W. Werz) 、ゴッフ(P. Mc Goff)、
ワーナー(R.G. Werner) 、バーソルド(W. Berthold)
著、11. ESACT meeting 、Brighton、GB、９月号 2 〜
6 頁、1991年、以下のものにおいて公表された：Animal
Cell Technology：Developments, Process & Product
s、編集者スパイヤー(R.E. Spier)、グリフィス(J.B. G
riffiths)、マクドナルド(C. MacDonald)、Butterworth
-Heinemann Ltd.、オックスフォード、1992年 p.624〜6
34 〕を用いて、実施例１により脂質を除去したモノク
ローナル抗体抗-ICAM の粗生成物の限外濾過によるウイ
ルス除去の最終的な有効性を測定した。使用した試験ウ
イルスは、非コートウイルス(uncoated virus) Reo 3及
びコートパラインフルエンザ 3 (PI-3) ウイルスであっ
た。感染性ウイルス粒子の公知の濃度に相当するウイル
ス溶液の所定の量をモノクローナル抗体抗-ICAM の脂質
を含まない粗生成物のサンプルに加え、次に呼称排除限
界が300KD 及び200KD の膜を用いて限外濾過した。300K
D 及び200KD 限外濾過に関して、ウイルスの枯渇を３つ
のサンプルについて測定し、測定した充填物のウイルス
力価を測定した濾液の力価と比較した。以下の表１は、
対数型において枯渇率を示すものである。300KDの限外
濾過と比べると、ウイルスの枯渇における有意な改良
は、200KD の呼称限外濾過膜を使用することにより達成
することができる。
【００２３】 表１：200KD 及び300KD の限外濾過によるウイルスの枯渇 実 験 Reo 3 ──────────────────────────────────── 呼称排除限界 サンプル 力価 容量 全ウイルス 枯渇率 [log ml -1] [ml] [log] [log] ──────────────────────────────────── 300KD 第一の充填物 5.68 100.00 7.68 第一の濾液 2.68 164.56 4.89 2.79 第一の保留物 4.43 50.00 6.13 第二の充填物 5.30 100.00 7.30 第二の濾液 2.30 163.35 4.51 2.79 第二の保留物 5.18 50.00 6.88 第三の充填物 6.05 100.00 8.05 第三の濾液 3.30 160.73 5.51 2.54 第三の保留物 4.93 50.00 6.63 ──────────────────────────────────── 200KD 第一の充填物 5.93 100.00 7.93 第一の濾液 測定せず 163.32 測定せず 5.93 第一の保留物 5.05 50.00 6.75 第二の充填物 6.18 100.00 8.18 第二の濾液 測定せず 157.55 測定せず 6.18 第二の保留物 5.05 50.00 6.75 第三の充填物 5.68 100.00 7.68 第三の濾液 ＜1.80 164.64 ＜4.02 ＞3.66 第三の保留物 5.30 50.00 6.99 ──────────────────────────────────── 実 験 PI-3 ──────────────────────────────────── 呼称排除限界 サンプル 力価 容量 全ウイルス 枯渇率 [log ml -1] [ml] [log] [log] ──────────────────────────────────── 300KD 第一の充填物 6.30 100.00 8.30 第一の濾液 2.55 164.45 4.77 3.53 第一の保留物 6.30 50.00 7.99 第二の充填物 6.43 100.00 8.43 第二の濾液 ＜1.80 176.14 ＜4.05 ＞4.38 第二の保留物 6.05 50.00 7.75 第三の充填物 6.68 100.00 8.68 第三の濾液 2.05 164.56 4.27 4.41 第三の保留物 6.05 50.00 7.75 ──────────────────────────────────── 200KD 第一の充填物 6.68 100.00 8.68 第一の濾液 ＜1.80 157.28 ＜3.99 ＞4.69 第一の保留物 6.18 50.00 7.88 第二の充填物 6.80 100.00 8.80 第二の濾液 測定せず 148.74 測定せず 6.80 第二の保留物 6.93 50.00 8.63 第三の充填物 6.93 100.00 8.93 第三の濾液 測定せず 158.86 測定せず 6.93 第三の保留物 6.68 50.00 8.38 ──────────────────────────────────── タンパク質：モノクローナル抗体抗−ICAM, 5 mg/ml Reo PI-3 使用セルバンクの力価： 107.8 ml-1 107.18 ml-1 加えたウイルス溶液の希釈率： 1:10 1:10 感染性ウイルス粒子： 106.8 ml-1 106.18 ml-1
【図１】 実施例１によりS-セファロースFFにおいて10
mMクエン酸ナトリウム：イソプロパノール＝80：20(v:
v) で洗い脂質除去したモノクローナル抗体抗-ICAM の
クロマトグラフィプロフィール（UV 280nm) 。
mMクエン酸ナトリウム：イソプロパノール＝80：20(v:
v) で洗い脂質除去したモノクローナル抗体抗-ICAM の
クロマトグラフィプロフィール（UV 280nm) 。
【図２】 実施例２によりプロテインG-セファロースFF
において20mMクエン酸ナトリウム：イソプロパノール＝
80：20(v:v) で洗い脂質除去したモノクローナル抗体抗
-ICAM のクロマトグラフィプロフィール（UV 280nm) 。
において20mMクエン酸ナトリウム：イソプロパノール＝
80：20(v:v) で洗い脂質除去したモノクローナル抗体抗
-ICAM のクロマトグラフィプロフィール（UV 280nm) 。
【図３】 a)脂質を含まないモノクローナル抗体抗-ICA
M の300KD 限外濾過の濾液のUVプロフィール(280nm)
（膜を通る生成物の全透過）。b)実施例３による脂質含
有モノクローナル抗体抗-ICAM の300KD 限外濾過の濾液
のUVプロフィール(280nm) 。
M の300KD 限外濾過の濾液のUVプロフィール(280nm)
（膜を通る生成物の全透過）。b)実施例３による脂質含
有モノクローナル抗体抗-ICAM の300KD 限外濾過の濾液
のUVプロフィール(280nm) 。
【図４】 実施例４による脂質を含まないモノクローナ
ル抗体抗-ICAM の呼称排除限界300KD の限外濾過のUVプ
ロフィール(280nm) 。
ル抗体抗-ICAM の呼称排除限界300KD の限外濾過のUVプ
ロフィール(280nm) 。
【図５】 実施例４による脂質を含まないモノクローナ
ル抗体抗-ICAM の呼称排除限界200KD の限外濾過のUVプ
ロフィール(280nm) 。
ル抗体抗-ICAM の呼称排除限界200KD の限外濾過のUVプ
ロフィール(280nm) 。
【図６】 実施例４による脂質を含まないモノクローナ
ル抗体抗-ICAM の呼称排除限界150KD の限外濾過のUVプ
ロフィール(280nm) 。
ル抗体抗-ICAM の呼称排除限界150KD の限外濾過のUVプ
ロフィール(280nm) 。
フロントページの続き (72)発明者 ヴォルフガンク ベルトールト ドイツ連邦共和国 デー88400 ビベラッ ハ フリードリッヒ エーベルト シュト ラーセ 32 (72)発明者 ディーター マース ドイツ連邦共和国 デー88400 ビベラッ ハ ローパッハヴェーク 42 (72)発明者 フランツ ノーテルフェル ドイツ連邦共和国 デー88400 ビベラッ ハ トロイトヴェーク 11
Claims (14)
- 【請求項１】 脂質含有水性媒体に含まれるタンパク質
又はペプチドの精製方法であって、粗生成物に含まれる
タンパク質又はペプチドが固体相に吸着され、水混和性
有機溶媒又は生理学的に許容される水性緩衝液と水混和
性有機溶媒との混合物で洗うことにより固体相から脂質
を除去し、その後タンパク質又はペプチドを脂質のない
状態において溶離することを特徴とする上記方法。 - 【請求項２】 固体相からの溶離後、タンパク質又はペ
プチドを、粒度によって分離する濾過技術にかける、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 濾過技術が限外濾過であり、呼称排除限
界が１〜500 KDの限外濾過モジュールを使用し、ここで
限外濾過モジュールの呼称排除限界が精製されるべきタ
ンパク質又はペプチドの分子量よりも大きい、請求項２
に記載の方法。 - 【請求項４】 限外濾過モジュールが限外濾過膜であ
る、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 水性媒体がペプチドを含有し、限外濾過
膜の呼称排除限界が１〜20 KD であるか、 水性媒体がクラスＡ、Ｄ、Ｅ又はＧの免疫グロブリンを
含有し、限外濾過膜の呼称排除限界が150 〜350KD であ
るか、 水性媒体がFab-断片を含有し、限外濾過膜の呼称排除限
界が50〜150KD であるか、 水性媒体がr-tPA を含有し、限外濾過膜の呼称排除限界
が50〜150KD であるか、又は、 水性媒体がインターフェロンを含有し、限外濾過膜の呼
称排除限界が20〜50KDである、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 有機溶媒が生理学的に許容されうる緩衝
溶液に５〜50容量％の量で含有される、請求項１〜５の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 有機溶媒が炭素原子数２〜５のアルコー
ル、エチレングリコール、ジエチレングリコール、テト
ラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド又はアセトニトリルで
ある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 生理学的に許容されうる緩衝溶液のpHが
５〜９であり、イオン強度が0.01〜2.00M であり、該緩
衝液がアセテート、ビカルボネート、ボレート、シトレ
ート、マレート、フォスフェート、フタレート、スクシ
ネート、グリシン、リシン、ヒスチジン又はトリス（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン緩衝液又はそれらの混
合物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項９】 クロマトグラフマトリックスをタンパク
質又はペプチドの吸着のために固体相として使用する、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 タンパク質又はペプチドを、バイオテ
クノロジーにより、血清又は精製した脂質含有血清成分
又は所定の脂質混合物を培地に加えることにより製造す
る、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 生理学的に許容されうる緩衝溶液、生
理学的に許容されうる緩衝溶液中の塩化ナトリウム溶
液、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ε−アミノカ
プロン酸又はクエン酸ナトリウムを含む溶液を用いて、
溶離剤のpHを変えること、有機溶媒を溶離剤に加えるこ
と又は溶離剤のイオン強度を増加することにより、固体
相に吸着したタンパク質又はペプチドを固体相から溶離
すること、及び溶離の方法を組み合わせて使用する、請
求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】 脂質含有水性媒体に含まれるタンパク
質又はペプチドからウイルス性不純物を除去する方法で
あって、粗生成物に含まれるタンパク質又はペプチドを
固体相に吸着し、脂質を水混和有機溶媒又は生理学的に
許容されうる水性緩衝溶液と水混和有機溶媒との混合物
で洗うことにより固体相から除去し、脂質を含まない状
態のタンパク質又はペプチドを生理学的に許容されうる
水性緩衝溶液において固体相から溶離し、つぎにタンパ
ク質又はペプチドを限外濾過によりウイルス性不純物か
ら分離することを特徴とする上記方法。 - 【請求項１３】 細胞の望ましいタンパク質又はペプチ
ドの産生に適した条件下で適した培地において細胞を培
養することによる組み換え方法又はハイブリドーマ技術
を用いるタンパク質又はペプチドの製造方法であって、
血清又は、精製した脂質含有血清成分又は所定の脂質混
合物のいずれかを培地に加え、タンパク質又はペプチド
を、培地において発現させるか、培養後細胞から多くの
精製工程により取り出し、脂質及びタンパク質又はペプ
チドを含有する最終培地から得られ、脂質を含まない状
態において単離され、ここで、タンパク質又はペプチド
は精製工程の少なくとも一つにおいて粒度により分離す
る濾過技術にかけられるものであり、この後の濾過技術
が行われる前に脂質がタンパク質又はペプチドから単離
されかつタンパク質又はペプチドが請求項１〜１１のい
ずれか１項に記載の精製方法により単離されることを特
徴とする上記方法。 - 【請求項１４】 精製されるべきタンパク質が、クラス
Ａ、Ｄ、Ｅ及びＧの免疫グロブリン、インターフェロ
ン、r-tPA 及びFab-断片からなる群より選ばれる、請求
項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19934302163 DE4302163A1 (de) | 1993-01-27 | 1993-01-27 | Verfahren zur Reinigung von Proteinen und Peptiden |
| DE4302163:8 | 1993-01-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0748399A true JPH0748399A (ja) | 1995-02-21 |
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ID=6479006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP718194A Pending JPH0748399A (ja) | 1993-01-27 | 1994-01-26 | タンパク質及びペプチドの精製方法及び製造方法 |
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|---|---|
| EP (1) | EP0610729A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0748399A (ja) |
| DE (1) | DE4302163A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
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-
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-
1994
- 1994-01-26 JP JP718194A patent/JPH0748399A/ja active Pending
- 1994-01-27 EP EP94101211A patent/EP0610729A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4302163A1 (de) | 1994-07-28 |
| EP0610729A1 (de) | 1994-08-17 |
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