JPS6339588A - 非抗生物質マ−カ−系 - Google Patents
非抗生物質マ−カ−系Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプラスミドの操作において使用される非抗生物
質マーカーに関する。
質マーカーに関する。
プラスミド操作の間に菌株中のプラスミドまたは類似物
の保持について選択する定めに、プラスミドまたは細菌
株によってコードさ几る抗生物質耐性Ｚ利用することに
知ら几ている。抗生物質耐性に強力なマーカー系を提供
するが、そ几に関連した重大な障害がある。第一に、大
部分の抗生物質に臨床上使用されているので、耐性生物
の使用は対象の細菌株に関係した病気を治療する際に治
療の選択の範囲をせばめることになる。この理由のため
に、いくつかの取締り機関に選択マーカーとして抗生物
質耐性を使用することを許可していない。
の保持について選択する定めに、プラスミドまたは細菌
株によってコードさ几る抗生物質耐性Ｚ利用することに
知ら几ている。抗生物質耐性に強力なマーカー系を提供
するが、そ几に関連した重大な障害がある。第一に、大
部分の抗生物質に臨床上使用されているので、耐性生物
の使用は対象の細菌株に関係した病気を治療する際に治
療の選択の範囲をせばめることになる。この理由のため
に、いくつかの取締り機関に選択マーカーとして抗生物
質耐性を使用することを許可していない。
非抗生物質耐性（例えば水銀（Ｈｇ）耐性）乞選択マー
カーとして利用する多くの試みかなされた。
カーとして利用する多くの試みかなされた。
しかしながら、この手法に発現中に揮発性水銀が発生す
ることを含めてたくさんの欠点を有している。こｎに装
置を洗浄するのがかなり困難であり、しかも汚染問題を
引き起こす。
ることを含めてたくさんの欠点を有している。こｎに装
置を洗浄するのがかなり困難であり、しかも汚染問題を
引き起こす。
抗生物質耐性を選択マーカーとして利用することに伴う
第二の問題は、この系が生物ｌ増殖させるとき常に抗生
物質の存在を必要とするということである。この必要条
件は増殖過程において相当面倒な問題であり、その必要
経費に増大させる。
第二の問題は、この系が生物ｌ増殖させるとき常に抗生
物質の存在を必要とするということである。この必要条
件は増殖過程において相当面倒な問題であり、その必要
経費に増大させる。
さらに、いくつかの場合において、抗生物質耐性にその
抗生物質を分解する酵素の発現のために生じる。例えば
、アンビシリン耐性にその抗生物質を分解するβ−ラク
タマーゼ酵素の発現のｔめに起こる。こうして、その選
択を維持するためには増殖培地に抗生物質を絶えず添加
することが必要である。
抗生物質を分解する酵素の発現のために生じる。例えば
、アンビシリン耐性にその抗生物質を分解するβ−ラク
タマーゼ酵素の発現のｔめに起こる。こうして、その選
択を維持するためには増殖培地に抗生物質を絶えず添加
することが必要である。
従って１本発明の目的に、従来技術に関連した１つまた
はそれ以上の難点を克服し、あるいは少なくとも軽減す
ることである。
はそれ以上の難点を克服し、あるいは少なくとも軽減す
ることである。
従って、本発明はその第１の面において、（ｉ） ｔ
ｈｙＡ＋遺伝子フラグメントお工び適当なプラスミドク
ローニングベクターヲ準備し；（１１）該ｔｈｙＡ＋遺
伝子フラグメントをプラスミドの適当な部位へ挿入する
； ことから成る非抗生物質マーカーを含むプラスミドの作
裂方法乞提供する。
ｈｙＡ＋遺伝子フラグメントお工び適当なプラスミドク
ローニングベクターヲ準備し；（１１）該ｔｈｙＡ＋遺
伝子フラグメントをプラスミドの適当な部位へ挿入する
； ことから成る非抗生物質マーカーを含むプラスミドの作
裂方法乞提供する。
上記プラスミドは少なくとも１つの抗生物質耐性コード
領域を含んでいてもよい。抗生物質耐性はテトラサイク
リン耐性またはアンビシリン耐性であり得る。従って１
本発明のこの面に、しる方法は、 （ｉｌｌ）少なくとも１つの抗生物質耐性セグメントヲ
不活性！Ｌ丁べく、ｔｈｙＡ＋遺伝子を保有するプラス
ミドを処理する； ことをさらに含む。
領域を含んでいてもよい。抗生物質耐性はテトラサイク
リン耐性またはアンビシリン耐性であり得る。従って１
本発明のこの面に、しる方法は、 （ｉｌｌ）少なくとも１つの抗生物質耐性セグメントヲ
不活性！Ｌ丁べく、ｔｈｙＡ＋遺伝子を保有するプラス
ミドを処理する； ことをさらに含む。
好適な態様において、第２および第６エ程は、１１１Ｙ
Ａ＋遺伝子フラグメン）Ｙ少なくとも１つの抗生物質耐
性コード領域内のある部位へ挿入して抗生物質耐性を排
除することにより組み合わせることができる。
Ａ＋遺伝子フラグメン）Ｙ少なくとも１つの抗生物質耐
性コード領域内のある部位へ挿入して抗生物質耐性を排
除することにより組み合わせることができる。
プラスミド中に２つ以上の抗生物質耐性セグメントが存
在する場合、工程（＋＋）ｕ抗生物質耐性をコードする
１つのセグメントヲ排除し、そして工程（１１１）はも
う１つの抗生物質耐性セグメントヲ排除することが理解
されるであろう。
在する場合、工程（＋＋）ｕ抗生物質耐性をコードする
１つのセグメントヲ排除し、そして工程（１１１）はも
う１つの抗生物質耐性セグメントヲ排除することが理解
されるであろう。
本発明のこの面によるプラスミドの作製において使用す
るｔｈｙＡ＋遺伝子フラグメントハ、どのような適当な
形で得らルてもよい。酵素チミジル酸シンターゼをコー
ドする大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１
２ 遺伝子（ｔｈｙＡ＋）Ｈ，それが小さいＤＮＡフラ
グメント（１，２ｋｂのＨｉ ｎｄ ＩＴＩ −Ｈｉ
ｎｄ Ｉ’ＩＩ ）上に存在し且つこの遺伝子における
染色体変異を補足することができるので特に適している
。ｔｈｙＡ＋遺伝子は非常に保存３２”Ｌ、そし℃バク
チリオフ。
るｔｈｙＡ＋遺伝子フラグメントハ、どのような適当な
形で得らルてもよい。酵素チミジル酸シンターゼをコー
ドする大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１
２ 遺伝子（ｔｈｙＡ＋）Ｈ，それが小さいＤＮＡフラ
グメント（１，２ｋｂのＨｉ ｎｄ ＩＴＩ −Ｈｉ
ｎｄ Ｉ’ＩＩ ）上に存在し且つこの遺伝子における
染色体変異を補足することができるので特に適している
。ｔｈｙＡ＋遺伝子は非常に保存３２”Ｌ、そし℃バク
チリオフ。
−ジ、原核生物および真核生物中に存在する。０ノ酵素
は保存されるので、クローニングさ几たｔｈｙＡ＋遺伝
子（例えば大腸菌に一１２由来のもの）は、以下で述べ
るように、関連した細菌種の染色体に存在する突然変異
ｔｈｙＡ遺伝子を補足することができる。ｔｈｙＡ＋遺
伝子を保有するフラグメンＨ−ｊ大腸菌に１２から単離
しうる。また、ｔｈｙＡ＋遺伝子源に適当なプラスミド
であり得る。プラスミドｐＢＴＡＨが適当であるとわか
った。
は保存されるので、クローニングさ几たｔｈｙＡ＋遺伝
子（例えば大腸菌に一１２由来のもの）は、以下で述べ
るように、関連した細菌種の染色体に存在する突然変異
ｔｈｙＡ遺伝子を補足することができる。ｔｈｙＡ＋遺
伝子を保有するフラグメンＨ−ｊ大腸菌に１２から単離
しうる。また、ｔｈｙＡ＋遺伝子源に適当なプラスミド
であり得る。プラスミドｐＢＴＡＨが適当であるとわか
った。
ｔｈｙＡ十遺伝子フラグメントはそのプラスミドから単
離し、そしてプラスミドの抗生物質耐性マーカーに挿入
するか、ま７′ｃはそのマーカー（複数の場合はいずれ
か１つのマーカー）と置換することができる。続いて、
そのプラスミドは対象のクローンｌ１ｌＳ遺伝子を保有
する。また、そのフラグメントニ対象のクローン比遺伝
子導入用のクローニングベクターとしてその後使用され
るプラスミドに挿入することができる。
離し、そしてプラスミドの抗生物質耐性マーカーに挿入
するか、ま７′ｃはそのマーカー（複数の場合はいずれ
か１つのマーカー）と置換することができる。続いて、
そのプラスミドは対象のクローンｌ１ｌＳ遺伝子を保有
する。また、そのフラグメントニ対象のクローン比遺伝
子導入用のクローニングベクターとしてその後使用され
るプラスミドに挿入することができる。
本発明方法で使用するプラスミドクローニングベクター
にいず几の適当なタイプのプラスミドであってもよい。
にいず几の適当なタイプのプラスミドであってもよい。
プラスミドクローニングベクターはプラスミｉ’ ｐＳ
Ｃｌｏｌ、ｐＵＣ１８，ｐＵｃ１９．ｐＢＲ３２２およ
びｒ＋ ＋３ Ｔ Ａ Ｉ−ｉから選択しうろ。
Ｃｌｏｌ、ｐＵＣ１８，ｐＵｃ１９．ｐＢＲ３２２およ
びｒ＋ ＋３ Ｔ Ａ Ｉ−ｉから選択しうろ。
−七発明の別の面では。
に１） ａ 当ｒｘプラスミドクローニングベクター
；（１））該プラスミドベクターに挿入された非抗生物
質選択マーカーとしての非復帰性ｔｈｙＡ＋遺伝子？含
む第１のクローン［ヒ］’） Ｎ Ａフラグメント；お
よび ｆｃ） 対象の遺伝子ビ含む少なくとも１つの別のク
ローン１どＤＮＡフラグメント； を含むプラスミドが提供さ几ろ。上記のプラスミドクロ
ーニングベクターぼ抗生物質耐性をコードする領域ビ含
まな（ハか、あるいはプラスミドクローニングベクター
上の抗生物質耐性コード領域がｔ ｈ ｙ Ａ、・遺伝
す乞己ピクローン比Ｄ Ｎ Ａフラグメントの挿入によ
り不活性１巳さ几ろか、また（１他の方法で不活性比さ
几ろ。対象の遺伝子はヒトおよび／または動物において
重要な病気の遺伝子央定築であり得ろ。従って、そ几ら
ぼ病気の予防に重要であるだろう。例えば、プラスミド
上の別のフラグメントはヒトのコレラの原因になるコレ
ラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）の外膜タンパ
ク質を発現するｏ ｍ ｐ Ｖ遺伝子ビ含むことができ
ろ。ｏｍｐＶ遺伝子は防御抗原を発現しつるので、それ
に抗コレラワクチンの製造において興味がもてる。
；（１））該プラスミドベクターに挿入された非抗生物
質選択マーカーとしての非復帰性ｔｈｙＡ＋遺伝子？含
む第１のクローン［ヒ］’） Ｎ Ａフラグメント；お
よび ｆｃ） 対象の遺伝子ビ含む少なくとも１つの別のク
ローン１どＤＮＡフラグメント； を含むプラスミドが提供さ几ろ。上記のプラスミドクロ
ーニングベクターぼ抗生物質耐性をコードする領域ビ含
まな（ハか、あるいはプラスミドクローニングベクター
上の抗生物質耐性コード領域がｔ ｈ ｙ Ａ、・遺伝
す乞己ピクローン比Ｄ Ｎ Ａフラグメントの挿入によ
り不活性１巳さ几ろか、また（１他の方法で不活性比さ
几ろ。対象の遺伝子はヒトおよび／または動物において
重要な病気の遺伝子央定築であり得ろ。従って、そ几ら
ぼ病気の予防に重要であるだろう。例えば、プラスミド
上の別のフラグメントはヒトのコレラの原因になるコレ
ラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）の外膜タンパ
ク質を発現するｏ ｍ ｐ Ｖ遺伝子ビ含むことができ
ろ。ｏｍｐＶ遺伝子は防御抗原を発現しつるので、それ
に抗コレラワクチンの製造において興味がもてる。
他の例において、プラスミド上の別のフラグメントにＯ
抗原を発現する遺伝子ビ含むことかでさる。Ｏ抗原は細
胞表面上のリボ多糖の部分である。
抗原を発現する遺伝子ビ含むことかでさる。Ｏ抗原は細
胞表面上のリボ多糖の部分である。
従って、それはヒトのコレラを治療するためのワクチン
の製造において興味がもてろ。
の製造において興味がもてろ。
対象ノ特定プラスミ）”１ｄｐＥＶＸ１．ｐＥＶＸ２゜
ｐＥＶＸ３ 、 ｐＥＶＸ５ 、 ｐＥＶＸ８ および
ｐＥＶＸ９と名づげらｎたプラスミドであり、これらの
試料はオーストラリア、アゾレード大学のカルチャーコ
レクションに維持されている。
ｐＥＶＸ３ 、 ｐＥＶＸ５ 、 ｐＥＶＸ８ および
ｐＥＶＸ９と名づげらｎたプラスミドであり、これらの
試料はオーストラリア、アゾレード大学のカルチャーコ
レクションに維持されている。
プラスミドｐＥＶＸ１に、簡単に述べろと１次のように
して作製された： （］） ｐＯｍｐＶ２１０からのＥｃｏＲＩ −Ｈｉ
ｎｄ ■−ｙラグメントＹｐＢＲ３２２のＳｃａＩ部位
にサブクローニングした。このフラグメントＵｏｍｐＶ
遺伝子を含み、ｐＯｍｐＶ５００と名づけたプラスミド
にＯｍｐＶタンパク質を発現する。
して作製された： （］） ｐＯｍｐＶ２１０からのＥｃｏＲＩ −Ｈｉ
ｎｄ ■−ｙラグメントＹｐＢＲ３２２のＳｃａＩ部位
にサブクローニングした。このフラグメントＵｏｍｐＶ
遺伝子を含み、ｐＯｍｐＶ５００と名づけたプラスミド
にＯｍｐＶタンパク質を発現する。
ｆ２） ｔｈｙＡ＋遺伝子馨含むプラスミドｐＩ３Ｔ
ＡＨからのｌｌ１ｎ旧ｌｌ−Ｈ１ｎ旧ｆ（−ｙラグメン
ト’（＜ｐＯｍｐＶ５０Ｏｔｙ′）Ｈｉ ｎ ｄｌｌＴ
部位にサブクローニングした。
ＡＨからのｌｌ１ｎ旧ｌｌ−Ｈ１ｎ旧ｆ（−ｙラグメン
ト’（＜ｐＯｍｐＶ５０Ｏｔｙ′）Ｈｉ ｎ ｄｌｌＴ
部位にサブクローニングした。
当らｎたプラスミド！’ｆｐＯｍｐＶ５Ｑｉと呼ばルた
。
。
（３： ｐＯｍｐＶ５０１のテトラサイクリン耐性コ
ード領域の大部分を除く欠失ば、そのプラスミド乞Ｎａ
ｅＩで消１こし、次にそのフラグメントＹ再連結′セ石
ことにより作ら几た。得ら几たプラスミドなそのＮａｅ
Ｉ割限部位をすべて失っていた。
ード領域の大部分を除く欠失ば、そのプラスミド乞Ｎａ
ｅＩで消１こし、次にそのフラグメントＹ再連結′セ石
ことにより作ら几た。得ら几たプラスミドなそのＮａｅ
Ｉ割限部位をすべて失っていた。
このプラスミド１ｄｐＥＶＸ１と呼ばれ、ＯｍｐＶタン
パク質ケ発現し、そしてｔｈｙＡ変異体乞補足すること
かできろ。
パク質ケ発現し、そしてｔｈｙＡ変異体乞補足すること
かできろ。
第１図にプラスミドｐＥＶＸ１の制限地図２表丁。
従って１本発明の好適な面でにプラスミドｐＥＶＸ１が
提供さｎる。
提供さｎる。
また１本発明のこの面においてプラスミドｐＥＶＸ２゜
ｐＥＶＸ３．ｐＥＶＸ５．ｐＥＶＸ８．ｐＥＶＸ９．ｐ
ＥＶＸ１３゜ｐＥＶＸ１４．ｐＥＶＸ１７．ｐＥＶＸ１
８．ｐＥＶＸ２ｉ 。
ｐＥＶＸ３．ｐＥＶＸ５．ｐＥＶＸ８．ｐＥＶＸ９．ｐ
ＥＶＸ１３゜ｐＥＶＸ１４．ｐＥＶＸ１７．ｐＥＶＸ１
８．ｐＥＶＸ２ｉ 。
ｐＥＶＸ２２、ｐＥＶＸ２５．ｐＥＶＸ２４．ｐＥＶＸ
２５゜ｐＥＶＸ３０ 、 ｐＥＶＸ３１ 、 ｐＥＶＸ
３３ 、 オＬ ヒｐＥＶＸ３７も興味の対象となる。
２５゜ｐＥＶＸ３０ 、 ｐＥＶＸ３１ 、 ｐＥＶＸ
３３ 、 オＬ ヒｐＥＶＸ３７も興味の対象となる。
プラスミドｐＥＶＸ２およびｐＥＶＸ３ｕ次のようにし
て作らｆ″Ｌ７を二ここでベースとなるプラスミドベク
タ−数のポＩＪ ＩＪンカー含有ｐＵｃ１８Ｔａった。
て作らｆ″Ｌ７を二ここでベースとなるプラスミドベク
タ−数のポＩＪ ＩＪンカー含有ｐＵｃ１８Ｔａった。
ｐＵＣ１８のアンビシリン耐性遺伝子は、そのプラスミ
ド’ｆ（Ｄ ｒ ａ Ｉで消比することにより欠失した
（この１）ｒａＩ酵素に平滑末端を形成させろ）。
ド’ｆ（Ｄ ｒ ａ Ｉで消比することにより欠失した
（この１）ｒａＩ酵素に平滑末端を形成させろ）。
ｐＢＴＡＨからの１．２ｋｂ Ｈｉ ｎｄｌ［ｔｈｙＡ
＋フラグメント１ｄＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ
フラグメント）で末端修復し、その後その平滑末端４
ＤｒａＩ消Ｉｔ、 ｐＵｃ １８に連結した。その連結
ＤＮＡ’＆用いて菌株Ｅｘ９８（大腸菌に１２ ｔｈ
ｙＡ）を形質転換し、そしてｔｈｙＡ十形質転換体を選
択した。形質転換体にそれらが含むプラスミドのタイプ
についてスクリーニングした。そ几ぞれ反対の方向にｔ
ｈｙＡ十遺伝子を含むプラスミドが発見さ几た。
＋フラグメント１ｄＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ
フラグメント）で末端修復し、その後その平滑末端４
ＤｒａＩ消Ｉｔ、 ｐＵｃ １８に連結した。その連結
ＤＮＡ’＆用いて菌株Ｅｘ９８（大腸菌に１２ ｔｈ
ｙＡ）を形質転換し、そしてｔｈｙＡ十形質転換体を選
択した。形質転換体にそれらが含むプラスミドのタイプ
についてスクリーニングした。そ几ぞれ反対の方向にｔ
ｈｙＡ十遺伝子を含むプラスミドが発見さ几た。
２つのこのようなプラスミドＨｐＥＶＸ２およびｐｇＶ
Ｘ３である。そ几らを第２図に示す。
Ｘ３である。そ几らを第２図に示す。
プラスミドｐＥＶＸ５に次のようにして作られた二本発
明者らに唯一の５ａｃＩ部位？もつ低コピー数のＮ】ｙ
Ａ＋ベクター１作ろうとした。このプラスミドはコレラ
菌０１７からのＯ抗原乞コードする遺伝子のサブクロー
ニングに有用であるだろう。
明者らに唯一の５ａｃＩ部位？もつ低コピー数のＮ】ｙ
Ａ＋ベクター１作ろうとした。このプラスミドはコレラ
菌０１７からのＯ抗原乞コードする遺伝子のサブクロー
ニングに有用であるだろう。
公知のプラスミドｐＳＣ１０１ に大腸菌に一１２Ｈｆ
ｒ供与菌株から、非常にわずかであるが集められるので
、このプラスミドが選ば几た。
ｒ供与菌株から、非常にわずかであるが集められるので
、このプラスミドが選ば几た。
唯一のＳａｃ Ｉ部位に次のようにしてｐＳＣ１０１に
導入３ｎｗ： ｐＳＣｌｏｌ をＳｍａＩで消比シ、次
いでＳｍａＩ平滑末端に５ａｃＩ’Ｊンカーを連結した
。
導入３ｎｗ： ｐＳＣｌｏｌ をＳｍａＩで消比シ、次
いでＳｍａＩ平滑末端に５ａｃＩ’Ｊンカーを連結した
。
５ａｃＩで消１どした後、このプラスミドを再環＋１：
、して菌株ＤＨ１（大腸菌に１２ ｒｅｃＡ）に形質
転換した。プラスミドＤＮＡ’！＆テトラサイクリン耐
性形質転換体から単離し、そ几ら’ｆｓａｃＩおよびＳ
ｍａＩで消１１Ｚすることによりスクリーニングした。
、して菌株ＤＨ１（大腸菌に１２ ｒｅｃＡ）に形質
転換した。プラスミドＤＮＡ’！＆テトラサイクリン耐
性形質転換体から単離し、そ几ら’ｆｓａｃＩおよびＳ
ｍａＩで消１１Ｚすることによりスクリーニングした。
５ａｃＩ部位とＳｍａＩ部位をもつ１つのプラスミドに
ｐＥＶＸ４と呼ばｎ、た。
ｐＥＶＸ４と呼ばｎ、た。
ｐＥＶＸ４のテトラサイクリン耐性を不活性比し且つそ
の中にｔｈｙＡ＋マーカーを４人するために、プラスミ
ドｐＥｖＸ４をＨｉｎｄｆｆＩで消比り、ｐＢＴＡＨか
らの１．２ ｋ ｂ Ｉ（ｉ ｎｄ ｎＴ ｔ ｈ ｙ
Ａ” ７ ラグメントに連結した。このＤＮＡＹ用いて
菌株Ｅｘ９８を形質転換し、そしてｔｈｙＡ＋形質転換
体を選択した。いくつかの形質転換体のプラスミド内容
物の試験（はそれぞれが同一のプラスミドをもつことを
示し、それらの１つカニｐＥＶＸ５と呼ばれた。このプ
ラスミドに第５図に示す。
の中にｔｈｙＡ＋マーカーを４人するために、プラスミ
ドｐＥｖＸ４をＨｉｎｄｆｆＩで消比り、ｐＢＴＡＨか
らの１．２ ｋ ｂ Ｉ（ｉ ｎｄ ｎＴ ｔ ｈ ｙ
Ａ” ７ ラグメントに連結した。このＤＮＡＹ用いて
菌株Ｅｘ９８を形質転換し、そしてｔｈｙＡ＋形質転換
体を選択した。いくつかの形質転換体のプラスミド内容
物の試験（はそれぞれが同一のプラスミドをもつことを
示し、それらの１つカニｐＥＶＸ５と呼ばれた。このプ
ラスミドに第５図に示す。
プラスミドｐＥＶＸ８およびｐＥＶＸ９ ’ｔ１次のよ
うにして作られた二本発明者らに細菌細胞の表面上の２
つのコレラ菌抗原を同時に発現させるために、両方の抗
原を発現するプラスミドを作ろうと思った。このプラス
ミドはワクチン菌株をつくる上でいくつかの利点な有す
る。
うにして作られた二本発明者らに細菌細胞の表面上の２
つのコレラ菌抗原を同時に発現させるために、両方の抗
原を発現するプラスミドを作ろうと思った。このプラス
ミドはワクチン菌株をつくる上でいくつかの利点な有す
る。
選択マーカーとしてｔｈｙＡ＋ｉ含み且つＯｍｐ”ｉ’
タンパク質乞発現するプラスミドｐ、ＥＶＸ １が使用
ｇｎ九。このプラスミドに、転写終止領域にｏｍｐＶ遺
伝子の末端に存在する唯一の５ａｃＩ部位を有する。〕
”ラスミドｐＥＶＸ１”１ＳａｃＩで（肖（巴し、そし
て５ａｃＩで消１ｕ Ｌ ＊ ｐ ＥＶＸ７ ＤＮＡ
に連結した。ｐ ＥＶＸ７ ’ｔｉ ｐ ＰＭ １０
０２由来の１９．５ｋｂのＳａｃ Ｉフラグメントをも
つｐＵｃ１８であり、コレラ菌０１７からのＯ抗原の生
合成をコードする遺伝子を含む。その連結Ｄ Ｎ Ａで
菌株Ｅｘ９８を形質転換し、ｔｈｙ＋形質転換体乞選択
し、そして１９．５ｋｂのＳａｃ Ｉ挿入物を含むプラ
スミドについてスクリーニングした。
タンパク質乞発現するプラスミドｐ、ＥＶＸ １が使用
ｇｎ九。このプラスミドに、転写終止領域にｏｍｐＶ遺
伝子の末端に存在する唯一の５ａｃＩ部位を有する。〕
”ラスミドｐＥＶＸ１”１ＳａｃＩで（肖（巴し、そし
て５ａｃＩで消１ｕ Ｌ ＊ ｐ ＥＶＸ７ ＤＮＡ
に連結した。ｐ ＥＶＸ７ ’ｔｉ ｐ ＰＭ １０
０２由来の１９．５ｋｂのＳａｃ Ｉフラグメントをも
つｐＵｃ１８であり、コレラ菌０１７からのＯ抗原の生
合成をコードする遺伝子を含む。その連結Ｄ Ｎ Ａで
菌株Ｅｘ９８を形質転換し、ｔｈｙ＋形質転換体乞選択
し、そして１９．５ｋｂのＳａｃ Ｉ挿入物を含むプラ
スミドについてスクリーニングした。
互いに反対の方向で１９．５ ｋ ｂの５ａｃＩフラグ
メン）Ｙ含む２つのこのようなプラスミドｉ”［ｐＥＶ
Ｘ８およびｐ ＥＶＸ９と呼ばｔｌ、た。こ几らのプラ
スミドを保有する菌株はコレラ菌ＯｍｐＶタンパク質と
Ｏ抗原の両方を発現し、陽性選択マーカーとしてｔｈｙ
Ａ”（ｆもっている。こ几らのプラスミドに第４図に示
す。
メン）Ｙ含む２つのこのようなプラスミドｉ”［ｐＥＶ
Ｘ８およびｐ ＥＶＸ９と呼ばｔｌ、た。こ几らのプラ
スミドを保有する菌株はコレラ菌ＯｍｐＶタンパク質と
Ｏ抗原の両方を発現し、陽性選択マーカーとしてｔｈｙ
Ａ”（ｆもっている。こ几らのプラスミドに第４図に示
す。
本発明のさらに別の面において。
（ａｌ（ｉ） 予め選ばれた細菌株の試料、および（
１１）非抗生物質マーカーとして非復帰性ｔｈｙＡ＋遺
伝子を含むプラスミド 乞邸備し； （ｂ） ｔｈｙＡ十遺伝子ｌ欠損した予め選ばれたｃ
細菌株の変異体を選択し；そして ｆｃ） 選択された該細菌株のチミン依存性変異体を
該プラスミド中のクローンｌ［ｔｈｙＡ十遺伝子で補足
する； ことから成る非抗生物質マーカーを含む細菌株の作製方
法が提供されろ。
１１）非抗生物質マーカーとして非復帰性ｔｈｙＡ＋遺
伝子を含むプラスミド 乞邸備し； （ｂ） ｔｈｙＡ十遺伝子ｌ欠損した予め選ばれたｃ
細菌株の変異体を選択し；そして ｆｃ） 選択された該細菌株のチミン依存性変異体を
該プラスミド中のクローンｌ［ｔｈｙＡ十遺伝子で補足
する； ことから成る非抗生物質マーカーを含む細菌株の作製方
法が提供されろ。
この方法はさらに以下の工程を含む：
（ｄ） 最少培地上で斯く形成された予め選は７″し
た該細菌株のｔｈｙＡ＋クローン欠選択する。
た該細菌株のｔｈｙＡ＋クローン欠選択する。
最少培地にチミンビ含まない。ｔｈｙＡ選択工程ｆｂ）
Ｕ、予め選はｒした細菌株Ｚ高レベルのチミンの存在下
に適当な培地上で生育させろこと乞含む。
Ｕ、予め選はｒした細菌株Ｚ高レベルのチミンの存在下
に適当な培地上で生育させろこと乞含む。
その適当な培地はアンチ葉酸を含みうろ。抗生物質には
トリメトプリムやアミノプテリンが含まｎろ。
トリメトプリムやアミノプテリンが含まｎろ。
非抗生物質選択マーカーとしてのｔｈｙＡ 遺伝子の
選択は特別の利点ビもｍら丁ことカニ理解さｎるであろ
う。符に、上記方法の選択工程ｆｂｌでに。
選択は特別の利点ビもｍら丁ことカニ理解さｎるであろ
う。符に、上記方法の選択工程ｆｂｌでに。
ｔｈｙＡ＋遺伝子を欠損した変異体が高レベルのチミン
の存在下にトリメトプリムやアミノプテリンのような抗
生物質を含む培地上で簡単に選択される。このような変
異体は上記培地での十分な生育のために高レベルのチミ
ンを必要とする。第二に、ｔｈｙＡ十系に宿主細菌株の
表現型を変更しない。
の存在下にトリメトプリムやアミノプテリンのような抗
生物質を含む培地上で簡単に選択される。このような変
異体は上記培地での十分な生育のために高レベルのチミ
ンを必要とする。第二に、ｔｈｙＡ十系に宿主細菌株の
表現型を変更しない。
第三に、チミン依存性細菌の生育にとって利用し得ろ遊
離チミンが不十分であるような場合には、そのプラスミ
ドの保持についてｉｎ ｖｉｖｏ での選択が期待で
きろ。従って、ｔｈｙＡ＋クローンの選択がチミンケ全
く含まない最少培地で行われる場合、ｔｈｙＡ＋クロー
ンのみがこの培地上で生育して維持される。もしもこの
プラスミドクローンが本来安定であるならば、続いてこ
のクローンの大規模増殖が所望の培地上で行われろ。増
殖培地がチミンを欠く場合に、そのクローンの選択が維
持さｎる。
離チミンが不十分であるような場合には、そのプラスミ
ドの保持についてｉｎ ｖｉｖｏ での選択が期待で
きろ。従って、ｔｈｙＡ＋クローンの選択がチミンケ全
く含まない最少培地で行われる場合、ｔｈｙＡ＋クロー
ンのみがこの培地上で生育して維持される。もしもこの
プラスミドクローンが本来安定であるならば、続いてこ
のクローンの大規模増殖が所望の培地上で行われろ。増
殖培地がチミンを欠く場合に、そのクローンの選択が維
持さｎる。
ｔｈｙＡ＋遺伝子で補うための予め選ばｔｌ、を細菌株
は適当な腸内細菌のいずれであってもよい。サルモネラ
菌株まｔはビブリオ菌株が利用され得る。
は適当な腸内細菌のいずれであってもよい。サルモネラ
菌株まｔはビブリオ菌株が利用され得る。
サルモネラ菌株のトリメトプリム耐性誘導体が使用さ几
ろ。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ）Ｇ３０ およびチフス菌（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ のトリメトプ
リム耐性誘導体が適当であるとわかった。コレラ菌の菌
株も使用できろ。
ろ。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ）Ｇ３０ およびチフス菌（Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ のトリメトプ
リム耐性誘導体が適当であるとわかった。コレラ菌の菌
株も使用できろ。
以上のようにして作らｎた細菌株に経口生ワクチンとし
て使用し得ろことが理解されるだろう。
て使用し得ろことが理解されるだろう。
この場合に、ｔｈｙＡ＋遺伝子を含むフラグメントをも
つプラスミドはさらに対象の病気の遺伝子決定基（例え
ば上記のようなｏｍｐＶまたはＯ抗原）ン含むフラグメ
ントｌもつであろう。
つプラスミドはさらに対象の病気の遺伝子決定基（例え
ば上記のようなｏｍｐＶまたはＯ抗原）ン含むフラグメ
ントｌもつであろう。
実施例
生育培地：細菌細胞に通常以下に記載する培地のいず几
かで生育させｔ。
かで生育させｔ。
（ａｌ 栄養培地： Ｌａｂ Ｌｅｍｃｏ（Ｏｘｏｉ
ｄ社）１９ｇ／ｌ。
ｄ社）１９ｇ／ｌ。
ペプト７ （Ｏｘｏｉｄ社）１０ｇ／ｇおよび塩化ナト
リウム５９／ｌ含有 （ｂ） ルリア（Ｌｕｒｉａ）培地：バクトートリプ
トン（Ｄｉｆｃｏ社） ’ＶＯｇ／ｌ 、バクトー酵母
エキス（Ｄｉ ｒｃｏ社）５ｇ／ｌおよび塩比ナトリウ
ム５ ｇ／ｌ含有 （ｃ） デイフコ（Ｄｉ ｒｃｏ）栄養培地：栄養培
地（］）ｉｆｃ。
リウム５９／ｌ含有 （ｂ） ルリア（Ｌｕｒｉａ）培地：バクトートリプ
トン（Ｄｉｆｃｏ社） ’ＶＯｇ／ｌ 、バクトー酵母
エキス（Ｄｉ ｒｃｏ社）５ｇ／ｌおよび塩比ナトリウ
ム５ ｇ／ｌ含有 （ｃ） デイフコ（Ｄｉ ｒｃｏ）栄養培地：栄養培
地（］）ｉｆｃ。
社）１６ｇ／ｅおよび塩１巴ナトリクム５ ｇ／ｌ含有
ｆｄ）Ｍ９最少塩培地二Ｍ９塩、グルコース０．５％お
よびカザミノ１Ｗ（Ｄｉｆｃｏ社）０．５％含有上記培
地には、寒天（Ｏｘｏｉｄ社）１．５％ｗ／ｖ ’ｆｌ
加えて固まらせた。必要な場合には培地にテトラサイク
リン８μｇ／ｍｌ ’に加えた。ｔｈｙＡ突然変異体の
生育および維持のためには培地にチミ７５０μ、ｑ／
ｍｔ乞加えた。
よびカザミノ１Ｗ（Ｄｉｆｃｏ社）０．５％含有上記培
地には、寒天（Ｏｘｏｉｄ社）１．５％ｗ／ｖ ’ｆｌ
加えて固まらせた。必要な場合には培地にテトラサイク
リン８μｇ／ｍｌ ’に加えた。ｔｈｙＡ突然変異体の
生育および維持のためには培地にチミ７５０μ、ｑ／
ｍｔ乞加えた。
インキュベーションハ全て３７°Ｃで行った。
ｔｈｙＡ突然変異体の還択：生育に高レベルのチミンを
要求する突然変異株（即ち、ｔｈｙＡタイプ）を以下の
ようにして選択した。
要求する突然変異株（即ち、ｔｈｙＡタイプ）を以下の
ようにして選択した。
チミンを補充した栄養培地中で細菌株を一夜生育させた
。次いでこの培養物の一部（０，１ｍ１−０．２５、Ｔ
Ｌｌ）ヲチミン５０μｇ７ｍｌおよびトリメトプリム（
Ｓ ｉ ｇｍａ社’） ２５Ａ、９／１１ Ｙ含むＭ
９最少塩培地上にお・ハた。２４〜２８時間インキュベ
ーションした後、この培地上で生育しｔ数個のコロニー
を選択培地上に画線培養精製して、チミン添加または不
添加培地上での生育能ン試験した。生育可能なものから
非復帰性のｔｈｙＡ突然変異株乞選択し九〇形質転換：
ｔｈｙＡ＋プラスミド”＜ｔｈｙＡ突然変異株に形質
転換するには以下に記載の方法７用いた。
。次いでこの培養物の一部（０，１ｍ１−０．２５、Ｔ
Ｌｌ）ヲチミン５０μｇ７ｍｌおよびトリメトプリム（
Ｓ ｉ ｇｍａ社’） ２５Ａ、９／１１ Ｙ含むＭ
９最少塩培地上にお・ハた。２４〜２８時間インキュベ
ーションした後、この培地上で生育しｔ数個のコロニー
を選択培地上に画線培養精製して、チミン添加または不
添加培地上での生育能ン試験した。生育可能なものから
非復帰性のｔｈｙＡ突然変異株乞選択し九〇形質転換：
ｔｈｙＡ＋プラスミド”＜ｔｈｙＡ突然変異株に形質
転換するには以下に記載の方法７用いた。
即ち、菌株をチミン含有の栄養培地中に稀釈し、対数増
殖期の真中まで生育させた。細胞を遠心分離ニヨッテ回
収し、冷ＭｇＣＴｏ １００ｍＭの０．５容量中に再懸
濁し、再度遠心分離し、そして最後に冷ＣａＣ４１００
ｍＭの０．１容量に再懸濁した。氷上に１時間おい友後
、細胞０．２ｍｌ！ＹＴＥ（） ＩＪス塩酸１０ｍＭ、
ｐＨ７，５、ＥＤＴＡ １ｍＭ） Ｉ ００μｍｇ中
のプラスミドＤＮＡ ［］、１ｍＪ中に加えた。細胞お
よびＤ Ｎ Ａ’を氷上で３０分間インキュベーション
し、次いで４２°Ｃで２分間熱シヨツクを与え之。栄養
培地（３４１Ａりを加え、３７°Ｃで１時間インキーベ
ーションした後、細胞を遠心分離し、Ｍ９最少塩（グル
コースまたはカザミノ酪不含）で−回洗浄し。
殖期の真中まで生育させた。細胞を遠心分離ニヨッテ回
収し、冷ＭｇＣＴｏ １００ｍＭの０．５容量中に再懸
濁し、再度遠心分離し、そして最後に冷ＣａＣ４１００
ｍＭの０．１容量に再懸濁した。氷上に１時間おい友後
、細胞０．２ｍｌ！ＹＴＥ（） ＩＪス塩酸１０ｍＭ、
ｐＨ７，５、ＥＤＴＡ １ｍＭ） Ｉ ００μｍｇ中
のプラスミドＤＮＡ ［］、１ｍＪ中に加えた。細胞お
よびＤ Ｎ Ａ’を氷上で３０分間インキュベーション
し、次いで４２°Ｃで２分間熱シヨツクを与え之。栄養
培地（３４１Ａりを加え、３７°Ｃで１時間インキーベ
ーションした後、細胞を遠心分離し、Ｍ９最少塩（グル
コースまたはカザミノ酪不含）で−回洗浄し。
そして同じ培地中に再懸濁した。次に細胞ｗ Ｍ ９漫
少塩培地上におきｔｈｙＡ＋（チミン非依存性）形質転
換体を選択した。
少塩培地上におきｔｈｙＡ＋（チミン非依存性）形質転
換体を選択した。
プラスミドＤＮＡの調製ニ
プラスミドＤＮＡの単離には以下の２通りの似た方法、
即ちクローンの迅速なスクリーニング用ノ小規模（１０
ｍｇ）法およびクローニングベクターの調製と最終的プ
ラスミドの創製用の大規模（５００〜１００１００Ｏ法
を用いた。いず九の方法も凍結融解およびリゾチーム、
ＥＤＴＡおよびトリトンｘ−ｉｏｏの添加による細胞溶
菌とそれに続く遠心分離とによって清澄な溶解物を得る
工程を含む。
即ちクローンの迅速なスクリーニング用ノ小規模（１０
ｍｇ）法およびクローニングベクターの調製と最終的プ
ラスミドの創製用の大規模（５００〜１００１００Ｏ法
を用いた。いず九の方法も凍結融解およびリゾチーム、
ＥＤＴＡおよびトリトンｘ−ｉｏｏの添加による細胞溶
菌とそれに続く遠心分離とによって清澄な溶解物を得る
工程を含む。
小規模法では溶解物をフェノール処理し、沈澱化させて
乾燥した。大規模法では溶解物をＣｓＣ１−臭１しエチ
ジウム遠心分離に付し、プラスミドＤＮＡを単離し之。
乾燥した。大規模法では溶解物をＣｓＣ１−臭１しエチ
ジウム遠心分離に付し、プラスミドＤＮＡを単離し之。
プラスミドｐＢＴＡＨＨメルレーン・ベル７オード（Ｍ
ｅｒｌｅｎｅ Ｂｅ１ｆｏｒｄ） 博士から恵与さ′
ｔ″Ｌ九ＲＵＥＩ Ｏ（ｐＢＴＡＨ）株から単離した。
ｅｒｌｅｎｅ Ｂｅ１ｆｏｒｄ） 博士から恵与さ′
ｔ″Ｌ九ＲＵＥＩ Ｏ（ｐＢＴＡＨ）株から単離した。
このプラスミド１００μｇをＨｉｎｄＩＩＩで完全に切
断した。１％Ｗ／Ｖ アガロースゲル電気泳動によっ
て１．２ｋｂのｔｈｙＡ＋フラグメントをベクターから
分離した。
断した。１％Ｗ／Ｖ アガロースゲル電気泳動によっ
て１．２ｋｂのｔｈｙＡ＋フラグメントをベクターから
分離した。
このフラグメント底金むアガロースゲルの領域をゲルか
ら切り出し、水４ｍＪｙ含む透析袋に入几て１ｏｏｖで
３時間電気溶出した。溶出方向を２分間逆にしｔ後１袋
の中の液体を出してＤＥ５２（ワットマン）カラムに装
填した。カラムを低塩緩衝液（トリス塩’１１３５０ｍ
Ｍ、ｐＨ８，０お工びＥＤＴＡ １０ｒｒＭ中のＮａＣ
１Ｏ，１６Ｍ）で洗浄した。次いでＤＮＡフラグメント
ヲ高塩高価緩衝液記と同じ組成でＮａ Ｃ１が１Ｍ）で
溶出しｔｏこのフラグメント乞エタノールで沈澱させ、
遠心分離によって回収し、洗浄した後乾燥した。こｎ′
ｆ！ニドリス塩酸１０ ｍＭ 、 ＥＤＴＡｌｍＭ、ｐ
Ｈ７，４の液２００μＪ中に再懸濁し、必要に応じて使
用した。
ら切り出し、水４ｍＪｙ含む透析袋に入几て１ｏｏｖで
３時間電気溶出した。溶出方向を２分間逆にしｔ後１袋
の中の液体を出してＤＥ５２（ワットマン）カラムに装
填した。カラムを低塩緩衝液（トリス塩’１１３５０ｍ
Ｍ、ｐＨ８，０お工びＥＤＴＡ １０ｒｒＭ中のＮａＣ
１Ｏ，１６Ｍ）で洗浄した。次いでＤＮＡフラグメント
ヲ高塩高価緩衝液記と同じ組成でＮａ Ｃ１が１Ｍ）で
溶出しｔｏこのフラグメント乞エタノールで沈澱させ、
遠心分離によって回収し、洗浄した後乾燥した。こｎ′
ｆ！ニドリス塩酸１０ ｍＭ 、 ＥＤＴＡｌｍＭ、ｐ
Ｈ７，４の液２００μＪ中に再懸濁し、必要に応じて使
用した。
ＤＮＡ操作
ＤＮＡの操作法に積率的なものを用いた。制限酵素によ
る切断は本質的に酵素の調造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍの各社）の指示に従って
実施した。
る切断は本質的に酵素の調造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍの各社）の指示に従って
実施した。
コロニー免疫プロ、ト
栄養寒天培地上に生育させｔ細菌細胞ヲニトロセルロー
スフィルター上ニ移しトリ、ヘニンク（Ｈｅｎｎｉｎｇ
） ら（Ａｎａｌ 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、 ９７
＋ １５３〜１５７．１９７９）の方法に従ってその
まま溶菌した。
スフィルター上ニ移しトリ、ヘニンク（Ｈｅｎｎｉｎｇ
） ら（Ａｎａｌ 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、 ９７
＋ １５３〜１５７．１９７９）の方法に従ってその
まま溶菌した。
ホークス（Ｈａｗｋｅｓ）ら（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 、 １１９ ＊１４２〜１４７．１９８２）の
記載に従りて、ビブリオ−’ｓｒｖラエ（Ｖｉｂｒｉｏ
ｃｈｏｌｅｒａｅ）に対するウサギ抗血清を用い、続
いて西洋ワサビパーオキシダーゼと結合させｔヤギ抗−
（ウサギＩ ｇＧ）Ｙ：用いることによって陽性に反応
するクローンを検出した。
ｅｍ、 、 １１９ ＊１４２〜１４７．１９８２）の
記載に従りて、ビブリオ−’ｓｒｖラエ（Ｖｉｂｒｉｏ
ｃｈｏｌｅｒａｅ）に対するウサギ抗血清を用い、続
いて西洋ワサビパーオキシダーゼと結合させｔヤギ抗−
（ウサギＩ ｇＧ）Ｙ：用いることによって陽性に反応
するクローンを検出した。
実施例１
ｐＥＶＸｌの創製
ビブリオ・コレラエからのＯｍｐＶタンパク質乞発現し
、かつ選択マーカーとしてｔｈｙＡ”’に有するプラス
ミドを以下の方法によって創製しｔ０プラスミドｐＯｍ
ｐＶ２１０からｏｍｐＶ遺伝子馨含むＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄ［制限酵素フラグメントな単離した。このフラグメ
ントの両端’ＹＤＮＡポリメラーゼ（フレノウフラグメ
ント）で（ｌｆ５復し、こ几ｔあらかじめＳｃａＩで切
断し、かつ同様に両端を修復しておいたｐＢＲ３２２と
Ｔ４リガーゼを用いて連結した。テトラサイクリン耐性
形質転換体をＯｍｐＶタンパク質用の抗血清を用いて免
疫プロットによりスクリーニングしｔ０陽性クローン１
個を同定し、このプラスミド’ｒ：ｐＯｍｐＶ５００
と称した。
、かつ選択マーカーとしてｔｈｙＡ”’に有するプラス
ミドを以下の方法によって創製しｔ０プラスミドｐＯｍ
ｐＶ２１０からｏｍｐＶ遺伝子馨含むＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄ［制限酵素フラグメントな単離した。このフラグメ
ントの両端’ＹＤＮＡポリメラーゼ（フレノウフラグメ
ント）で（ｌｆ５復し、こ几ｔあらかじめＳｃａＩで切
断し、かつ同様に両端を修復しておいたｐＢＲ３２２と
Ｔ４リガーゼを用いて連結した。テトラサイクリン耐性
形質転換体をＯｍｐＶタンパク質用の抗血清を用いて免
疫プロットによりスクリーニングしｔ０陽性クローン１
個を同定し、このプラスミド’ｒ：ｐＯｍｐＶ５００
と称した。
ｐＯｍｐＶ５００をＨｉｎｄｒｒＩで切断し、プラスミ
ドｐＢＴＡＨから得ておい７ｔ１．２ｋｂのＨｉ ｎ
ｄｌ’［ｔｈｙＡ＋フラグメントビ挿入することによっ
てプラスミドｐＯｍｐＶ５００にｔｂｙＡ十選択マーカ
ーを導入した。
ドｐＢＴＡＨから得ておい７ｔ１．２ｋｂのＨｉ ｎ
ｄｌ’［ｔｈｙＡ＋フラグメントビ挿入することによっ
てプラスミドｐＯｍｐＶ５００にｔｂｙＡ十選択マーカ
ーを導入した。
ＥＸ９８菌株に形質転換しｔ後、ｔｈｙＡ十形質転換体
をＭ９最少塩培地上で選択した。得られたクローンは予
期し之プラスミドを有しており、更に発現したＯｍｐＶ
タンパク質も有していた。このような１個のプラスミド
’ｒ：ｐＯｍｐＶ５０１と称しｔ０テト°ラサイクリン
耐性遺伝子のほとんど？除去するためにｐＯｍｐＶ５０
１に欠失を行った。このプラスミドｇＮａｅＩで切断し
、再結合した。処理したプラスミドをＥＸ９８に形質転
換した後、得ら几を形質転換体（ｔｈｙＡ＋）”用いて
ｐＯｍｐＶ５０１．１：リモ小さいプラスミドをスクリ
ーニングした。
をＭ９最少塩培地上で選択した。得られたクローンは予
期し之プラスミドを有しており、更に発現したＯｍｐＶ
タンパク質も有していた。このような１個のプラスミド
’ｒ：ｐＯｍｐＶ５０１と称しｔ０テト°ラサイクリン
耐性遺伝子のほとんど？除去するためにｐＯｍｐＶ５０
１に欠失を行った。このプラスミドｇＮａｅＩで切断し
、再結合した。処理したプラスミドをＥＸ９８に形質転
換した後、得ら几を形質転換体（ｔｈｙＡ＋）”用いて
ｐＯｍｐＶ５０１．１：リモ小さいプラスミドをスクリ
ーニングした。
ｐＥＶＸｌと称する１個の欠失プラスミドは予期したよ
りちやや大きな欠失？有しており、そのＮａｅＩ制限部
位の全てを失っていた。ｐＥＶＸｌの制限酵累地図乞第
１図に示す。
りちやや大きな欠失？有しており、そのＮａｅＩ制限部
位の全てを失っていた。ｐＥＶＸｌの制限酵累地図乞第
１図に示す。
ｐＥＶＸＩの利用
ビブリオ・コレラエのｏｍｐＶ遺伝子遺伝子上サルモネ
ラィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）Ｇ３０およびサルモネラ・チフ４ （Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２’１ａ に導入
するためにぼ、ｔｈｙＡ＋選択が有用な非抗生物質性の
選択マーカーとなることが判明した。
ラィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）Ｇ３０およびサルモネラ・チフ４ （Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２’１ａ に導入
するためにぼ、ｔｈｙＡ＋選択が有用な非抗生物質性の
選択マーカーとなることが判明した。
Ｇ３０およびＴｙ２１ａのｔ ｈ ｙ Ａ突然変異誘導
体を上記のようにして単離した。こ几らの菌株（各々Ｅ
Ｘ１６３お工びＥＸ１６４ ）ばｐＥＶＸｌで形質転換
し、ｔｈｙＡ＋を指標として選択した。（ｐＥＶＸｌど
ＥＸ１６３に形質転換する前に、ｐＥＶＸｌを宿主の６
つの制限酵素系の全て？欠いているサルモ不う・チフィ
ムリウムＬＴ２菌株であるＥＸ１４３に形質転換するこ
とＫ ｘすｐＥＶＸｌ ％’１次通過させた（Ｊｉｒｓ
ｔ ｐａｓｓａｇｅｄ） こと（・て、主意丁べきで
ある。）得ら几た形質転換体に正しいプラスミド２宵し
ており、ｉ ｆｃ 高１／ベルの０ｍ ｐ Ｖタンパク
質を発現していた。Ｇ ３０お工びＴｙ２ｉａ誘導体の
いずへのプラスミドも安定に保持されていると思わｎｌ
こ。
体を上記のようにして単離した。こ几らの菌株（各々Ｅ
Ｘ１６３お工びＥＸ１６４ ）ばｐＥＶＸｌで形質転換
し、ｔｈｙＡ＋を指標として選択した。（ｐＥＶＸｌど
ＥＸ１６３に形質転換する前に、ｐＥＶＸｌを宿主の６
つの制限酵素系の全て？欠いているサルモ不う・チフィ
ムリウムＬＴ２菌株であるＥＸ１４３に形質転換するこ
とＫ ｘすｐＥＶＸｌ ％’１次通過させた（Ｊｉｒｓ
ｔ ｐａｓｓａｇｅｄ） こと（・て、主意丁べきで
ある。）得ら几た形質転換体に正しいプラスミド２宵し
ており、ｉ ｆｃ 高１／ベルの０ｍ ｐ Ｖタンパク
質を発現していた。Ｇ ３０お工びＴｙ２ｉａ誘導体の
いずへのプラスミドも安定に保持されていると思わｎｌ
こ。
というのは栄養培地中で生育し１也培養物をチミジン添
加ま之に不添加の培地上におくことてよって検定したと
ころ該培養物はそのｔｈｙＡ＋マーカーを保持していた
からである。
加ま之に不添加の培地上におくことてよって検定したと
ころ該培養物はそのｔｈｙＡ＋マーカーを保持していた
からである。
実施例２
ｐＥＶＸｌ７およびｐＥＶＸｌ８の創製プラスミドｐＵ
ｃ１８からｐＥＶＸ２およびｐＴＶＸ３を削欠するのに
用い１このと同じ方法によって、プラスミドｐＵｃ１９
からプラスミドｐ Ｅ Ｖ Ｘｌ ７ およびｐＥＶＸ
ｌ８を創製した。ｐＥＶＸｌ７およびｐＥＶＸｌ８（第
５図） ｎ各ｋ ｐＥＶＸ２ ｊ−１：ヒｐＥＶＸ３と
同じ方向に挿入されたｔｈｙＡ十遺伝子？有しているが
、反対方向にボｉ） リンカ−２有している。
ｃ１８からｐＥＶＸ２およびｐＴＶＸ３を削欠するのに
用い１このと同じ方法によって、プラスミドｐＵｃ１９
からプラスミドｐ Ｅ Ｖ Ｘｌ ７ およびｐＥＶＸ
ｌ８を創製した。ｐＥＶＸｌ７およびｐＥＶＸｌ８（第
５図） ｎ各ｋ ｐＥＶＸ２ ｊ−１：ヒｐＥＶＸ３と
同じ方向に挿入されたｔｈｙＡ十遺伝子？有しているが
、反対方向にボｉ） リンカ−２有している。
実捲例６
ｐ ＥＶ Ｘ ２３の創製
プラスミドｐＢＴＡＨＵそｎ自体クローニングベクター
として使用できる。しがしながら、ｐＢＲ３２２；て苓
づぐｔｈｙＡ＋クローニングベクターの融通性を増加さ
せろために、我々ばｐＢＴＡＨから得た１、１２ｋｂの
ｔｈｙＡ フラグメントをｐＢＲ３２２の５ａｃＩ部
位（アンビシリン耐性遺伝子中に立置する）に再りロー
ンＩＫシた。得ら几たプラスミドｐＥＶＸ２３ ’＝１
以下のようにし、て創製した。即ち、ｐＢＲ３２２’１
ｓｃａＩで完全に切断した。次いでこのプラスミドをｐ
ＢＴＡＨがら単離しがっ末端修復したｔ ｈ ｙ Ａ十
Ｉ−Ｉ ｉ ｎ ｄｒｒＩフラグメントに連結した。
として使用できる。しがしながら、ｐＢＲ３２２；て苓
づぐｔｈｙＡ＋クローニングベクターの融通性を増加さ
せろために、我々ばｐＢＴＡＨから得た１、１２ｋｂの
ｔｈｙＡ フラグメントをｐＢＲ３２２の５ａｃＩ部
位（アンビシリン耐性遺伝子中に立置する）に再りロー
ンＩＫシた。得ら几たプラスミドｐＥＶＸ２３ ’＝１
以下のようにし、て創製した。即ち、ｐＢＲ３２２’１
ｓｃａＩで完全に切断した。次いでこのプラスミドをｐ
ＢＴＡＨがら単離しがっ末端修復したｔ ｈ ｙ Ａ十
Ｉ−Ｉ ｉ ｎ ｄｒｒＩフラグメントに連結した。
連猜したＤＮＡをＥＸ９８に形質転換ｊ−１ｔｈｙＡ±
形質転換体を最少培地上で選択した。ｔｈｙＡ＋挿入物
の方向性ぽＰｓｔＩで切断すること尾よって決２１、−
ｔＯｌつの培養物から得たプラスミド？ｉ）Ｅ〜’ｘ２
ｓ（第６図）と称し一〇このプラスミド２有する菌株に
アンビンリンに、茎受注でテトラサイクリ：／、二、耐
性である。
形質転換体を最少培地上で選択した。ｔｈｙＡ＋挿入物
の方向性ぽＰｓｔＩで切断すること尾よって決２１、−
ｔＯｌつの培養物から得たプラスミド？ｉ）Ｅ〜’ｘ２
ｓ（第６図）と称し一〇このプラスミド２有する菌株に
アンビンリンに、茎受注でテトラサイクリ：／、二、耐
性である。
実施例４
ｐ ＥＶＸ １３およびｐＥＶＸｌ４の創製上記し１ｔ
ｈｙＡ十−ビブリオ・コレラ二〇−抗原、帝生クローン
に加えて、ｐＥＶＸ５に基づく数種の他のクローンも創
製した。
ｈｙＡ十−ビブリオ・コレラ二〇−抗原、帝生クローン
に加えて、ｐＥＶＸ５に基づく数種の他のクローンも創
製した。
ｐ ＥＶＸ １３ オ、Ｊ： ヒｐ ＥＶＸ １４ｐＥ
ＶＸ５’；ｘＳａｃＩで切断り、５ａｃＩで切断したｐ
ＥＶＸ７ ＤＮＡ に連ｉＬ；？−０連１ＤＮＡ￥Ｅ
Ｘ９８菌株に形質転換し、ｔｈｙＡ十形質転換体を選択
し、そして１９．５ｋｂの５ａｃＩ挿入物を有するプラ
スミドｔスクリーニングし＊、１９．５ｋｂのＳ ａ
ｃ Ｉ挿入物を反対方向に有する互いに関連する２つの
プラスミド？ｐＥＶＸ１３ およびＩ）ＥＶＸ１４
と称し九〇Ｃ几らのプラスミド２有する菌株なオガヮ（
吸ａｗａ）−タイプのビブリオ・コレラエ〇−抗原’ｙ
−ｆｆｉ生する。
ＶＸ５’；ｘＳａｃＩで切断り、５ａｃＩで切断したｐ
ＥＶＸ７ ＤＮＡ に連ｉＬ；？−０連１ＤＮＡ￥Ｅ
Ｘ９８菌株に形質転換し、ｔｈｙＡ十形質転換体を選択
し、そして１９．５ｋｂの５ａｃＩ挿入物を有するプラ
スミドｔスクリーニングし＊、１９．５ｋｂのＳ ａ
ｃ Ｉ挿入物を反対方向に有する互いに関連する２つの
プラスミド？ｐＥＶＸ１３ およびＩ）ＥＶＸ１４
と称し九〇Ｃ几らのプラスミド２有する菌株なオガヮ（
吸ａｗａ）−タイプのビブリオ・コレラエ〇−抗原’ｙ
−ｆｆｉ生する。
実施例５
ｐＥＶＸ２１ ：Ｌｌ：びＩ）ＥＶＸ２２ ｔ１７’）
ｆｉｌｌ：３％プラスミドｐ ＥＶＸ２１ お：びｐ
Ｅ Ｖ Ｘ ２２ぼ、こｎらが、イナバ（Ｉｈａｂａ）
クイズのビブリオ・コレラ二〇−抗原の産生暑コードす
るという点乞除いて上記と同様の方法によってｐＥＶＸ
５から創製した。
ｆｉｌｌ：３％プラスミドｐ ＥＶＸ２１ お：びｐ
Ｅ Ｖ Ｘ ２２ぼ、こｎらが、イナバ（Ｉｈａｂａ）
クイズのビブリオ・コレラ二〇−抗原の産生暑コードす
るという点乞除いて上記と同様の方法によってｐＥＶＸ
５から創製した。
ｐＥＶＸ２１ 中の挿入物はｐＥＶＸ１４ 中の挿入
物と同じ方向性を有しており、ｐＥＶＸ２２中の挿入物
、ｄｒ＋ＥＶＸ１３ 中の挿入物と同じ方向性を有して
いる。ｐＥＶＸ１３ オＬびｐＥＶＸ１４ ！’１ ｐ
ＥＶＸ２０ カら創製された。このプラスミド（ｐＥＶ
Ｘ２０）はビブリオ−＝＋レラエ５６９Ｂ （イナバ）
とｐＯｍｐＶ５００とから創製された。５６９Ｂ菌株の
ＤＮＡを５ａｃＩで完全に切断した。この切断ＤＮＡＹ
５〜２０％Ｗ／ Ｖ のＭＨ状状ショ糖グラジェント
上分画した。
物と同じ方向性を有しており、ｐＥＶＸ２２中の挿入物
、ｄｒ＋ＥＶＸ１３ 中の挿入物と同じ方向性を有して
いる。ｐＥＶＸ１３ オＬびｐＥＶＸ１４ ！’１ ｐ
ＥＶＸ２０ カら創製された。このプラスミド（ｐＥＶ
Ｘ２０）はビブリオ−＝＋レラエ５６９Ｂ （イナバ）
とｐＯｍｐＶ５００とから創製された。５６９Ｂ菌株の
ＤＮＡを５ａｃＩで完全に切断した。この切断ＤＮＡＹ
５〜２０％Ｗ／ Ｖ のＭＨ状状ショ糖グラジェント
上分画した。
ｆ１２０ｋｂのフラグメントラ回収し、別途５ａｃＩで
切断しかつアルカリ性ホスファターゼ処理’ｔｔ、ｙｃ
ｐＯｍｐＶ５００に連結Ｌ７ｔ。この連結ＤＮＡＹＤＨ
Ｉ菌株に形質転換し、そしてテトラサイクリン耐性の形
質転換体を選択した。ビブリオ・コンチエ０−抗原を産
生するコロニーを検出した。１つの培養物から得たプラ
スミド”ｔｐＥＶＸ２０ と称し之。
切断しかつアルカリ性ホスファターゼ処理’ｔｔ、ｙｃ
ｐＯｍｐＶ５００に連結Ｌ７ｔ。この連結ＤＮＡＹＤＨ
Ｉ菌株に形質転換し、そしてテトラサイクリン耐性の形
質転換体を選択した。ビブリオ・コンチエ０−抗原を産
生するコロニーを検出した。１つの培養物から得たプラ
スミド”ｔｐＥＶＸ２０ と称し之。
このプラスミドはイナバ特異的〇−抗原をコードする１
９．５ｋｂの５ａｃＩフラグメント源として用い１乙。
９．５ｋｂの５ａｃＩフラグメント源として用い１乙。
実施例６
ｐＥＶＸ２４の創製
ブタ下痢ワクチンの成分として、Ｋ ９９の産生をコー
ドするプラスミドを創製した。プラスミドｐＦＫ９９を
ＢａｍＨＩで切断し、Ｋ９９線毛（ｒ ｉｍｂｒｉａｅ
）の産生乞コードするフラグメン）Ｙ単離し几。プラス
ミドｐＥＶＸ２３ ’ｋＢａｍＨＩで切断し、アルカリ
性ホスファターゼで処理してＩ（９９フラグメントに連
結した。連結したＤ Ｎ Ａ’ｔＥＸ９８に形質転換し
、ｔｈｙＡ十形質転換体を選択した。Ｋ９９を産生ずる
１つの形質転換体は予期した構造７有しており、ｐＥＶ
Ｘ２４ と命名した。
ドするプラスミドを創製した。プラスミドｐＦＫ９９を
ＢａｍＨＩで切断し、Ｋ９９線毛（ｒ ｉｍｂｒｉａｅ
）の産生乞コードするフラグメン）Ｙ単離し几。プラス
ミドｐＥＶＸ２３ ’ｋＢａｍＨＩで切断し、アルカリ
性ホスファターゼで処理してＩ（９９フラグメントに連
結した。連結したＤ Ｎ Ａ’ｔＥＸ９８に形質転換し
、ｔｈｙＡ十形質転換体を選択した。Ｋ９９を産生ずる
１つの形質転換体は予期した構造７有しており、ｐＥＶ
Ｘ２４ と命名した。
実施例７
ｐＥＶＸ２５の創製
ブタ下痢ワクチンの第２の成分ＨＫ８８の産生をコード
するプラスミドである。Ｋ８８ｖコードする６、５ｋｂ
の５ａｕ３ａフラグメント乞ｐ ＦＭ２０５から単離し
、末端を修復した後、別途ＳｃａＩで切断し、アルカリ
性ホスファターゼで処理しておいｉ ｐ Ｂ ＴＡＨと
連結し九〇続いてＥＸ９８に形質転換し、ｔｈｙＡ＋Ｙ
選択し、そしてスクリーニングすることによってｐＥＶ
Ｘ２５を単離した。
するプラスミドである。Ｋ８８ｖコードする６、５ｋｂ
の５ａｕ３ａフラグメント乞ｐ ＦＭ２０５から単離し
、末端を修復した後、別途ＳｃａＩで切断し、アルカリ
性ホスファターゼで処理しておいｉ ｐ Ｂ ＴＡＨと
連結し九〇続いてＥＸ９８に形質転換し、ｔｈｙＡ＋Ｙ
選択し、そしてスクリーニングすることによってｐＥＶ
Ｘ２５を単離した。
実施例８
ｐＥＶＸ ３０ オー１： ヒｐ ＥＶＸ ３ ｉ ）
創製ブタ下痢ワクチンの第３成分子１９８７Ｐ線毛乞コ
ードするプラスミドに基づいている。これらのプラスミ
ドに以下の方法により創製した。
創製ブタ下痢ワクチンの第３成分子１９８７Ｐ線毛乞コ
ードするプラスミドに基づいている。これらのプラスミ
ドに以下の方法により創製した。
まず最初に９８７Ｐｉ毛を発現するコスミドクローンで
あるｐ ＥＶＸ２６を単離した。ｐＥＶＸ２６を５ａｕ
３ａで部分的に切断し、このＤ Ｎ Ａ ＹＢａｍＨＩ
で切断したｐＡＣＹＣ１８４に連結することにより。
あるｐ ＥＶＸ２６を単離した。ｐＥＶＸ２６を５ａｕ
３ａで部分的に切断し、このＤ Ｎ Ａ ＹＢａｍＨＩ
で切断したｐＡＣＹＣ１８４に連結することにより。
９８７Ｐ線毛乞発現したサブクローンｐＥＶＸ２６ ’
；１単離した。単離さｔｌ、几１つのプラスミドをｐＥ
ＶＸ２９と称した。プラスミドｐＥＶＸ２９ ＹＳｐｈ
Ｉで切断し、そしてＳ ｐ ｌｉ Ｉフラグメントを精
製した。これを末端修復し、別途ＳｃａＩで切断し、ア
ルカリ性ホスファターゼ処理したｐＢＴＡＨに連結した
。連結したＤ Ｎ Ａ乞ＥＸ９８菌株に形質転換し、ｔ
ｈｙＡ＋形質転換体を選択した。９８７Ｐｖ発現する２
つの培養物を単離し、性状決定した。一方のプラスミド
ＹｐＥＶＸ３０ と称し、こｉ″Ｌは挿入ＤＮＡの端部
に小さな欠失（約１ｋｂＬａ’有していた。他方は予期
した構造を有するプラスミドｐ Ｅｖｘｓ ｉ であっ
たＯ 実施例９ ｐＥＶＸ３３およびｐＥＶＸ３７の創製ブタ下痢ワクチ
ンの第４成分１ｄＦ４１ｉ毛産生をコードするプラスミ
ドに基づいている。こ几らのプラスミドに以下の方法に
よって創製した。
；１単離した。単離さｔｌ、几１つのプラスミドをｐＥ
ＶＸ２９と称した。プラスミドｐＥＶＸ２９ ＹＳｐｈ
Ｉで切断し、そしてＳ ｐ ｌｉ Ｉフラグメントを精
製した。これを末端修復し、別途ＳｃａＩで切断し、ア
ルカリ性ホスファターゼ処理したｐＢＴＡＨに連結した
。連結したＤ Ｎ Ａ乞ＥＸ９８菌株に形質転換し、ｔ
ｈｙＡ＋形質転換体を選択した。９８７Ｐｖ発現する２
つの培養物を単離し、性状決定した。一方のプラスミド
ＹｐＥＶＸ３０ と称し、こｉ″Ｌは挿入ＤＮＡの端部
に小さな欠失（約１ｋｂＬａ’有していた。他方は予期
した構造を有するプラスミドｐ Ｅｖｘｓ ｉ であっ
たＯ 実施例９ ｐＥＶＸ３３およびｐＥＶＸ３７の創製ブタ下痢ワクチ
ンの第４成分１ｄＦ４１ｉ毛産生をコードするプラスミ
ドに基づいている。こ几らのプラスミドに以下の方法に
よって創製した。
まず最初にＦ４１線毛乞発現するコスミドクローンｐＥ
ＶＸ２８ Ｙ単Ｍした。このプラスミドを５ａｕ３ａで
部分的に切断し、その大きさを小さくするために再連結
した。ｐＥＶＸ３２から１２．３ｋｂのＨｉｎｄｌ’［
フラグメントを単離し、そしてＨｉｎｄｒＴＩで切断し
たｐＥＶＸ２３ に連結した。このＤ Ｎ Ａ乞ＥＸ９
８に形質転換し、そしてｔｈｙＡ＋形質伝換体を選択し
た。１つの培養物はＦ’４１勝毛ケ産生じ、そしてｐＥ
ＶＸ３３ と命名する予期したプラスミドを有していた
。ｐＥＶＸ３３をＣＩａＩで切断し、再連結しそしてそ
のＤ Ｎ ＡをＥＸ９８に形質転換することによってｐ
ＥＶＸ３３の大きさを減少した。
ＶＸ２８ Ｙ単Ｍした。このプラスミドを５ａｕ３ａで
部分的に切断し、その大きさを小さくするために再連結
した。ｐＥＶＸ３２から１２．３ｋｂのＨｉｎｄｌ’［
フラグメントを単離し、そしてＨｉｎｄｒＴＩで切断し
たｐＥＶＸ２３ に連結した。このＤ Ｎ Ａ乞ＥＸ９
８に形質転換し、そしてｔｈｙＡ＋形質伝換体を選択し
た。１つの培養物はＦ’４１勝毛ケ産生じ、そしてｐＥ
ＶＸ３３ と命名する予期したプラスミドを有していた
。ｐＥＶＸ３３をＣＩａＩで切断し、再連結しそしてそ
のＤ Ｎ ＡをＥＸ９８に形質転換することによってｐ
ＥＶＸ３３の大きさを減少した。
ＣＩａＩフラグメントの欠失を有する１つのプラスミド
乞ｐＥＶＸ３７ と称した。
乞ｐＥＶＸ３７ と称した。
最後に、上記した本発明の精神を逸脱することなしに他
の多くの修飾および／または変更がなしうろこと乞理解
丁べきである。
の多くの修飾および／または変更がなしうろこと乞理解
丁べきである。
第１図にプラスミドｐＥＶＸ１の制限地図を示し；第２
図にプラスミドｐＥＶＸ２およびｐ ＥＶＸ３（但し、
ｐＥＶＸ２と反対方向にｔｈｙＡ遺伝子を含む）の制限
地図を示し； 第６図はプラスミドｐＥＶＸ５の制限地図？示し；篇４
図にプラスミドｐＥＶＸ８およびｐＥＶＸ９（但し、ｐ
ＥＶＸ８と反対方向に５ａｃＩ挿入物乞含む）の制限地
図を示し： ｉ５図ｉグｙスミ）’ｐＥＶＸ１７ おｆびｐＥＶＸ１
８（但し、ｐＥＶＸ１７ と反対方向に挿入さ几たｔｈ
ｙＡ”フラグメントラ含む）の制限地図を示し；そして
第６図にプラスミドｐＥＶＸ２３の制限地図な示図面の
浄書（内容に変更なし） 〜・１・ Ｓａｃ １ Ｆｉｇ、５
図にプラスミドｐＥＶＸ２およびｐ ＥＶＸ３（但し、
ｐＥＶＸ２と反対方向にｔｈｙＡ遺伝子を含む）の制限
地図を示し； 第６図はプラスミドｐＥＶＸ５の制限地図？示し；篇４
図にプラスミドｐＥＶＸ８およびｐＥＶＸ９（但し、ｐ
ＥＶＸ８と反対方向に５ａｃＩ挿入物乞含む）の制限地
図を示し： ｉ５図ｉグｙスミ）’ｐＥＶＸ１７ おｆびｐＥＶＸ１
８（但し、ｐＥＶＸ１７ と反対方向に挿入さ几たｔｈ
ｙＡ”フラグメントラ含む）の制限地図を示し；そして
第６図にプラスミドｐＥＶＸ２３の制限地図な示図面の
浄書（内容に変更なし） 〜・１・ Ｓａｃ １ Ｆｉｇ、５
Claims (18)
- （１）適当なプラスミドクローニングベクター；および
それに結合された非復帰性ｔｈｙＡ＾＋遺伝子を含む第
１のクローン比ＤＮＡフラグメント；を含む非抗生物質
マーカーをもつプラスミド。 - （２）第１のクローン化ＤＮＡフラグメントはｔｈｙＡ
＾＋遺伝子を含むプラスミドｐＢＴＡＨ由来のＨｉｎｄ
III−ＨｉｎｄIIIフラグメントである、特許請求の範囲
第１項記載のプラスミド。 - （３）プラスミドクローニングベクターの少なくとも１
つの抗生物質耐性コード領域はｔｈｙＡ＾＋遺伝子を含
むクローン化ＤＮＡフラグメントの挿入により不活性化
されるか、あるいは他の方法で不活性化される、特許請
求の範囲第１項記載のプラスミド。 - （４）抗生物質耐性コード領域は適当な酵素で消化する
ことにより不活性化される、特許請求の範囲第６項記載
のプラスミド。 - （５）少なくとも１つの抗生物質耐性コード領域はアン
ビシリンおよび／またはテトラサイクリン耐性コード領
域である、特許請求の範囲第４項記載のプラスミド。 - （６）プラスミドクローニングベクターはプラスミドｐ
ＳＣ１０１、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２お
よびｐＢＴＡＨから選択される、特許請求の範囲第５項
記載のプラスミド。 - （７）ヒトおよび／または動物において重要な病原体の
遺伝子決定基を含む少なくとも１つの別のクローン比Ｄ
ＮＡフラグメントをさらに含む、特許請求の範囲第２項
記載のプラスミド。 - （８）プラスミドクローニングベクターはＤｒａ I で
の消化により不活性比されるアンビシリン耐性コード領
域を含み、消化された該プラスミドクローニングベクタ
ーにｔｈｙＡ＾＋遺伝子を含むプラスミドｐＢＴＡＨ由
来のＨｉｎｄIII−ＨｌｎｄIIIフラグメントを連結する
、特許請求の範囲第５項記載のプラスミド。 - （９）少なくとも１つの別のクローン比ＤＮＡフラグメ
ントはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）の外
膜タンパク質を発現する遺伝子および／またはＯ抗原を
発現する遺伝子を含む、特許請求の範囲第７項記載のプ
ラスミド。 - （１０）少なくとも１つの別のクローン化ＤＮＡフラグ
メントはプラスミドｐＯｍｐＶ２１０由来のＥｃｏＲ
I −ＨｉｎｄIIIフラグメントを含む、特許請求の範囲
第９項記載のプラスミド。 - （１１）プラスミドクローニングベクターはｐＢＲ３２
２であり；ｔｈｙＡ＾＋遺伝子を含むプラスミドｐＢＴ
ＡＨ由来のＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIIIフラグメントを該
プラスミドクローニングベクターのＨｉｎｄIII部位に
サブクローニングして第１のクローン化ＤＮＡフラグメ
ントを形成し；プラスミドｐＯｍｐＶ２１０由来のＥｃ
ｏＲ I −ＨｉｎｄIIIフラグメントを該プラスミドクロ
ーニングベクターのＳｃａ I 部位にサブクローニング
して、病原体の遺伝子決定基を含む別のクローン化ＤＮ
Ａフラグメントを形成し；そして該プラスミドのテトラ
サイクリン耐性コード領域をＮａｅ I で消化すること
により欠失し、次に斯く形成されたフラグメントを再連
結する、特許請求の範囲第１０項記載のプラスミド。 - （１２）プラスミドｐＥＶＸ１、ｐＥＶＸ２、ｐＥＶＸ
３、ｐＥＶＸ５、ｐＥＶＸ８、ｐＥＶＸ９、ｐＥＶＸ１
３、ｐＥＶＸ１４、ｐＥＶＸ１７、ｐＥＶＸ１８、ｐＥ
ＶＸ２１、ｐＥＶＸ２２、ｐＥＶＸ２５、ｐＥＶＸ２４
、ｐＥＶＸ２５、ｐＥＶＸ３０、ｐＥＶＸ５１、ｐＥＶ
Ｘ３３およびｐＥＶＸ３７から選択される、特許請求の
範囲第１項記載のプラスミド。 - （１３）ｔｈｙＡ＾＋遺伝子を含む第１のクローン化Ｄ
ＮＡフラグメント、および適当なプラスミドクローニン
グベクターを準備し；そして 該ｔｈｙＡ＾＋遺伝子フラグメントを該プラスミドの適
当な部位へ挿入し、それによりｔｈｙＡ＾＋遺伝子を非
復帰性クローニングベクターとする；ことを含む非抗生
物質マーカーを保有するプラスミドの作製方法。 - （１４）プラスミドクローニングベクターは少なくとも
１つの抗生物質耐性コード領域を含み、該方法は少なく
とも１つの抗生物質耐性コード領域を不活性化すべくｔ
ｈｙＡ＾＋遺伝子を含むプラスミドを処理する工程をさ
らに含む、特許請求の範囲第１３項記載の方法。 - （１５）少なくとも１つの抗生物質耐性はテトラサイク
リンおよび／またはアンビシリン耐性コード領域である
、特許請求の範囲第１４項記載の方法。 - （１６）第２および第５工程は、ｔｈｙＡ＾＋遺伝子フ
ラグメントをプラスミドクローニングベクターの少なく
とも１つの抗生物質耐性コード領域内のある部位へ挿入
して抗生物質耐性を排除することにより、組み合わされ
る、特許請求の範囲第１５項記載の方法。 - （１７）（ａ）（ｉ）予め選ばれた細菌株の試料、およ
び （ｉｉ）適当なプラスミドクローニングベクター、およ
びそれに結合された非復帰性ｔｈｙＡ＾＋遺伝子を含む
第１のクローン化ＤＮＡフラグメントを含む非抗生物質
マーカーを保有するプラスミドを準備し； （ｂ）ｔｈｙＡ＾＋遺伝子を欠損した予め選ばれた細菌
株の突然変異体を選択し； （ｃ）選択されたその予め選ばれた細菌株のチミン依存
性変異体を該プラスミド中のクローン化ｔｈｙＡ＾＋遺
伝子で補足し；そして （ｄ）斯く形成された予め選ばれた細菌株のｔｈｙＡ＾
＋クローンを最少培地上で選択する； ことを含む、非抗生物質マーカーを保有する細菌株の作
製方法。 - （１８）細菌株はサルモネラ菌株またはビブリオ菌株で
ある、特許請求の範囲第１７項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPH655386 | 1986-06-24 | ||
| AU6553 | 1988-02-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6339588A true JPS6339588A (ja) | 1988-02-20 |
Family
ID=3771671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62157463A Pending JPS6339588A (ja) | 1986-06-24 | 1987-06-24 | 非抗生物質マ−カ−系 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0251579A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6339588A (ja) |
| DK (1) | DK318887A (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6043057A (en) * | 1988-09-16 | 2000-03-28 | Vitec Aktiebolag | Recombinant systems for expression of the cholera B-sub-unit with the aid of foreign promoters and/or leader peptides |
| SE462285B (sv) * | 1988-09-16 | 1990-05-28 | Jan Roland Holmgren | Expression av koleratoxinets bindande subenhet med hjaelp av fraemmande promotor- och/eller ledarpeptidstrukturer |
| IE892131A1 (en) * | 1989-06-30 | 1991-01-02 | Univ Cork | Marker genes for genetic manipulation |
| TW201794B (ja) * | 1991-05-03 | 1993-03-11 | American Cyanamid Co | |
| US5356797A (en) * | 1991-11-15 | 1994-10-18 | Board Of Regents, The University Of Texas | Membrane expression of heterologous genes |
| EP0692031B1 (en) * | 1993-02-22 | 2007-04-11 | The General Hospital Corporation | Heterologous antigens in live cell vaccine strains |
| AU7410798A (en) * | 1996-11-29 | 1998-06-22 | General Hospital Corporation, The | Heterologous antigens in live cell V |
| CU22661A1 (es) * | 1997-12-30 | 2001-04-27 | Cnic Ct Nac Investigaciones | Nuevos candidatos vacunales de vibrio cholerae y método de obtención |
| SE9801852D0 (sv) | 1998-05-26 | 1998-05-26 | Sbl Vaccin Ab | Method of producing thy A-strains of Vibro cholerae, suck strains and their use |
| US6358705B1 (en) | 1998-07-16 | 2002-03-19 | Novo Nordisk A/S | Method of making proteins in transformed yeast cells |
| DE10309557A1 (de) * | 2003-03-04 | 2004-09-23 | Henkel Kgaa | Ein Translokationsenzym als Selektionsmarker |
| DE102007021001A1 (de) | 2007-05-04 | 2008-11-06 | Ab Enzymes Gmbh | Expressionssystem zur antibiotikafreien Produktion von Polypeptiden |
| WO2017097383A1 (de) | 2015-12-11 | 2017-06-15 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismenstamm und verfahren zur antibiotikafreien, fermentativen herstellung von niedermolekularen substanzen und proteinen |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2508059A1 (fr) * | 1981-06-23 | 1982-12-24 | Centre Nat Rech Scient | Plasmide incorporant le gene polynucleotide phosphorylase, souches bacteriennes transformees comportant ledit plasmide et procede de preparation de polynucleotide phosphorylase |
| EP0175699A4 (en) * | 1984-02-01 | 1988-06-13 | Enterovax Res Pty Ltd | BACTERIAL STRAINS. |
| AU600885B2 (en) * | 1984-05-25 | 1990-08-30 | Zymogenetics Inc. | Stable DNA constructs |
| JPS6158595A (ja) * | 1984-08-28 | 1986-03-25 | ジェネックス・コーポレイション | 徴生物によるタンパク質規模生産方法 |
-
1987
- 1987-06-18 EP EP87305404A patent/EP0251579A3/en not_active Withdrawn
- 1987-06-23 DK DK318887A patent/DK318887A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-06-24 JP JP62157463A patent/JPS6339588A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK318887A (da) | 1987-12-25 |
| EP0251579A3 (en) | 1989-03-22 |
| EP0251579A2 (en) | 1988-01-07 |
| DK318887D0 (da) | 1987-06-23 |
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