JPS6335525A - 動物用ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は動物用ワクチンに関するものである。

〔従来の技術〕

従来、免疫を強化するための油性アジュバントとして完
全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバ
ント（以下これらを７０インドアジユバントと略称する
）が使用されて来た。これらのアジュバントには基本的
な成分として界面活性剤であるアラ＊　−ルＣ（Ｍａｎ
ｎｉｄｅ　ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ　）と流動パラフィン
とが通常流動ハラフイ７４３〜４５％、アラセール０５
〜７％、ワクチン原液５０％の割合になるように利用さ
れるが、このようなアジュバントは乳剤化されにりく、
乳剤としての安定性も悪（、また高粘度のため注射が容
易でなく、動物に注射すると発熱、接種部位の壊死、硬
結等接種反応が強い。これらの理由から免疫が強化され
ることは承知していても、これらをワクチンの製造に応
用することは出来なかった。

〔発明が解決しようとする問題〕

以上述べたように、従来の技術においては、界面活性剤
と流動パラフィンとを併用した油性アジュバントに乳剤
化されやすく、乳剤としての安定性も良く、低粘度でし
かも接種時の接種反応が弱く、ワクチンの製造にも応用
出来るものはないという問題点があった。

〔問題点を解決するための手段〕

上記の問題点を解決するために、この発明は界面活性剤
無水フンニトール・オレイン酸エステル（Ａｎｈｙｄｒ
ｏ　ｍａｎｎｉｔｏｌ　ｏｌｅｉｃ　ｅｓｔｅｒｓ　、
以下ＡＭＯＥと略称）と流動パラフィンとから成る油中
水滴（Ｗ／Ｏ）型の親水性油性アジュバントを応用した
動物用ワクチンとする手段を採用したものである。以下
その詳細を述へる。

まず、この発明における界面活性剤ＡＭＯＥは具体的に
は分子量４２８、元素比Ｃ：　Ｈ：　０＝２４：４４：
６で化学構造式 ％式％） で示されるものであり、単糖マンニット部分が脱水エー
テル結合をして環状となった無水マンニットオクタグセ
／エートエーテルである。

このような界面活性剤ＡＭＯＥを流動パラフィンと混合
するときの配合割合は通常流動パラフィン９０％に対し
Ａ　Ｍ　ＯＥを１０％とすることが望ましい。なぜなら
ば、ＡＭＯＥがこの値未満の少量ではアジュバント効果
が不安定であり、逆にこの値を越える多量では乳剤化が
困難となって好ましくないからである。また、流動パラ
フィンとＡＭＯＥとから成る親水性油性アジュバントに
配合する抗原（ワクチン原液）の量は、アジュバント７
０％に対して抗原３０％であることが望ましい。それは
、抗原の量がこの値未満の少量でも、またこの値を越え
る多量でもアジュバント効果が不安定となるので好まし
くないからである。

〔実施例〕

実施例１： 鶏伝染性気管支炎（ＩＢ）ウィルス滋賀株を１０日齢発
育鶏卵の尿膜腔内に１０　　ＥＩＤ、／ｅｇｇ　を接種
し、３７℃で２日間培養し感染尿膜膣液（ＣＡＦ）を採
取した。これにホルマリン（日本薬局方）全２％添加し
、３７℃で２４時間、さらに２２℃で２日間不活化感作
したものをウィルス抗原とした。

このウィルス抗原の不活化前ウィルス含有量は８．０ １０Ｅ■Ｄ５ｏ／ｍ１であツタ。

このようにして得られた不活化ＩＢウィルス抗原３容遣
部に対し、ＡＭＯＥアジュバント７容量部を添加し、こ
れをホモジナイザーで均質化し、ワクチンを試作した。

この試作ワクチンを３５日齢ＳＰＦ　卵用鶏ヒナ５０羽
の脚部筋肉内に１羽当り１、　Ｏｍｌずつ注射して免疫
群とし、８羽の非免疫同居対照群をおいた。その後臨床
症状を特に脚の運動異常に主眼を置いて観察するととも
に注射後１週目および３週目に免疫昨冬５羽を殺処分し
、注射局所反応を検索した。また非免疫同居対照群も含
め全例から、注射後４週目までは毎週、その後は４週間
隔で２４週目まで採血を行ない、１Ｂ中中和体価（５０
％ブラック減少法により中和指数を算出）を測定し、そ
の推移を観察した。さらに、注射後４週目、８週目、１
６週目、２４週目に免疫群１０羽、対照群２羽を用い、
ＩＢウィルス滋賀株の１００　ＣＩＤ（点眼接種による
気管線毛運動停止効果で測定した鶏感染価）を点鼻攻撃
し、６日後に殺処分して気管の線毛運動を観察した。そ
の結果はつぎのとおりであった。

安全性については第１表に示したように注射後の臨床症
状に異常は認められず１および３週目に５羽ずつ殺処分
し、注射局所反応を剖検したところ、１週目では皮下お
よび筋肉に注射物の残留がみられたが、著しい病変はな
く、３週目ではこれがかなり軽減されており、増悪化の
傾向は認められなかった。

有効性については第２表に抗体の推移を示したが、第３
週に抗体が検出され、第８週では３．１と良好な値を示
し、その後高い値を保持し、第２４週においても３．２
を示していた。第３表には攻撃試験成績を示したが、い
ずれの時点においても免疫群は全例が気管線毛運動に異
常と認めず、対照群は線毛運動を停止しており、免疫群
に完全な防御能が付与されていることがわかる。以上の
有効性に関する成績は、特に免疫効果の持続期間の長さ
を示しており、Ａ、Ｍ　ＯＥアジュバントをワクチン第
　　３　　表 イこ添加し、アジュバントワクチンとして応用したとき
の顕著な免疫増強効果を示したものである。

実施例２： ニューカッスル病（ＮＤ）ウィルス石井株ヲ１゜日齢発
育鶏卵の尿膜腔内に１０５・０Ｅ　Ｉ　Ｄｓｏ　／ｅ　
ｇｇ接種し、３７℃で５日間培養し、感染尿膜腔液（Ｃ
ＡＦ）を採取し、これにホルマリン（日本薬局方）を０
．２％添加し、３７℃、２４時間、さらに２２℃で２日
間不活化感作したものをウィルス抗原とした。

なお、この液の不活化前ウィルス含有量は１０９°５Ｅ
ＩＤ５ｏ／ｍ１テアツタ。

このようにして得られた不活化ＮＤウィルス抗原１容量
部に対し、りん酸緩衝食塩液２容量部を混合した後、Ａ
ＭＯＥアジュバントを７容量部加え、これをホモジナイ
ザーで均質化してワクチンを試作した。この試作ワクチ
ンを実施例１におけると同様３５日齢ＳＰＦ卵用鶏ヒナ
５０羽の脚部筋肉内に１羽当り１．　Ｏｍｌずつ注射し
て免疫群とし、８羽の非免疫同居対照群をおいた。そし
て注射後臨床症状を、特に脚の運動異常を主眼に観察す
るとともに、注射後１週目および３週目に免疫昨冬５羽
を殺処分し、注射局所反応を検索し、また、対照群も含
め金側から、注射後４週目までは毎週、その後は４週間
ごさに２４週目まで採血を行ない、ＮＤウィルスに対す
る赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体価を測定し、その推移を
観察した。さらに、注射後４週目、８週目、１６週目お
よび２４週目に免疫群１０羽、対照群２羽を用いＮＤウ
ィルス強毒株の１００ＯＯＣＬＤ（′ｐＡ致死１）を胸
部筋肉内に接種し、攻撃試験を行ない、２週間にわたり
臨床症状を観察した。観察終了時に採血しＨＩ抗体価を
測定した。これらの結果はっぎのとおりであった。

まず、安全性については第４表に示したように、注射後
の臨床症状に異常は認められず、第１週日および第３週
日に５羽ずつ殺処分し、注射局所反応を剖検したところ
、第１週日では皮下および肋間に注射物の残留が見られ
たが著しい病変はなく、第３週日ではこれがかなり軽減
されており増悪化する傾向は認められなかった。

有効性については、抗体の推移を示した第５表から明ら
かなように、第２〜４週日にかけてＧＭＸ　１０００倍
以上とわが国における現行市販のワクチンに比べて驚異
的に高いＨ１抗体価を示し、個体のバラツキも少なく、
その後の低下も著しく緩やかで２４週目においてもＧＭ
Ｘ３３１倍ときわめて高い値を保持していた。また、第
６表には攻撃試験成績を示したが、いずれの時点でも免
疫群の金側は無症状で耐過し、攻撃後の抗体上弊も見ら
れず、２４週目においても完全な防御能が示された。こ
のような有効性に関連する成績はきわめて優れたもので
あり、ＡＭＯＥアジュバントをワクチンに添加し、アジ
ュバントワクチンとして応用し第　　６　　表 注）７　無症状耐過羽数／攻撃羽数 注）８　攻撃的抗体より攻撃後に抗体が２管以上上昇し
た羽数／攻撃羽数 たときの顕著な免疫増強効果を示したものといえる。

実施例３： わが国の野外発生例の腸と糞便から、初代大賢（ＤＫ）
培養細胞で分離したイヌパルボウィルス（ｃｐｖ）をＤ
Ｋ培養細胞に１ｏ代継代したウィルスを種ウィルスとし
た。

まず、健康な子猫より採取した腎臓皮質をトリプシンで
消化し、細胞増殖用培養液を用いて０．５％細胞浮遊液
を作り、２本の回転培養瓶に４００ｍｌずつ分注し、３
７℃で３日間培養して約５０％に細胞単層を形成させた
。この培養細胞にｌｏｇ　１０”０ＴＣＩＤ５．／Ｉｎ
１の前記種ウィルスを５０ｍ１ずつ接種し、３７℃で６
０分吸着後ウィルス液を除き、細胞増殖用培養液を５０
０ｍ１ずつ圧加し、３７℃で２日間培養して細胞単層を
形成させ、培養液を吸引除去して細胞維持用培養液５０
０ｍ１に液交換し、３７℃で７日間培養して感染培養液
を採取した。この感染培養液のウィルス価はＩｏｇｌＱ
　　ＴＣＩＤ５ｏ／ｍｌでブタ赤血球に対する赤血球凝
集価は２０４８倍であった。

このようにして採取した培養液にホルマリンを０．２％
添加し、３０℃で７日間感作してウィルスを不活化した
後、亜硫酸水素ナトリウムでホルマリンを中和した。こ
の不活化ウィルス液３容量に対し、ＡＭＯＥアジュバン
ト７容量の割合で混合し、さらに保存剤としてチメロサ
ールを０．０１％添加した後、４ｍｌバイアルに１　ｍ
ｌずつ分注してワクチンとした。

ＣＰＶに対する赤血球凝集抑制（ＨＩ　）抗体陰性の２
〜４力月齢、体重３．２〜５．６　ｋｇの子犬１０頭を
用い、８頭を免疫群、２頭を無処理対照群とした（第７
表参照）。上記ワクチンを免疫群８頭中の４頭の背部皮
下に、残り４頭の後肢筋肉内にそれぞれ１ｍｌずつ注射
し、注射時の疼痛、注射局所の発赤および硬結について
３週間の継続観察、発熱、食欲減退、元気消失、嘔吐、
下痢などの一般第　　７　　表 臨床症状を観察したが、いずれの子犬にも異常は全く認
められず安全性に優れ、一方このワクチンの有効性につ
いては第８表に示したように、ワクチン注射後経日的に
採血しｃｐｖに対するＨＩ抗体価を測定するとともに２
４週目には Ｉ　ｏ　ｇ　ｌ　Ｑ　”　ＴＣＩ　Ｄｓｏ　７ｍ１のｃ
ｐｖ強毒ウィルス（２９−Ｆ株）を１頭当り５ｍｌずつ
経口接種して攻撃試験を実施した結果、第　　８　　表 免疫群は注射後いずれも顕著なＨＩ抗体の上昇が見られ
、２４週目においてもなお高いＨＩ抗体価を保有してお
り、また２４週目における攻撃試験にも何ら臨床症状を
認めることなく耐過生存し、糞便と血液からのウィルス
検出も陰性であったが、対照犬２頭は糞便と血液とから
はウィルスが検出され、ｃｐｖ感染症特有の嘔吐、下痢
等の臨床症状を呈して死亡したことから、ＡＭＯＥアジ
ュバントはＣＰＶ不活化ワクチンに対しても著しい免疫
増強効果を示すことが明らかである。

実施例４： わが国の野外発生例より得たＴｈｅｉｌｅｒｉａ　ｓｅ
ｒｇｅｎｔｉ（以下これヲＴ、　、ｉと略称する）感染
血液を、摘牌牛に皮下注射して感染させ、赤血球におけ
る寄生率が３５％以上となった時点で全採血し、赤血球
をりん酸緩衝生理食塩液（以下これをＰＢＳと略称する
）にて５回遠心洗浄後、１ｍｌ中にＴ、ｓがＩ×１９　
個以上含まれるように調型し、ホルマリンを最終濃度０
．２％になるように加え、２２℃、１０日間感作し不活
化した。不活化終了後、Ｔ、ｓが１ｍｌ、□中に１０１
０個含まれるように濃縮して抗原原液とし、この抗原原
液３容量部をＡＭＯＥアジュバント７容量部と混合し、
ホモジナイザーにより乳化し、チメロサールを０．０１
％加えて２０ｍ１バイアルに１５ｍ１ずつ分注しワクチ
ンとした。

・得られたワクチンを３ｍｌ；ずつ第１群および第２群
の各２頭の牛に筋肉内注射し、また第３群の２頭にはＡ
ＭＯＥアジュバントを加えないＴ、Ｓ抗原原液０．９ｍ
ｓを同じく筋肉内に注射し、それぞれの試験中について
螢光抗体間接法（以下これをＩＦＡ法と略称する）によ
り測定した抗体価（以下ＩＦＡ価と呼ぶ）の推移を比較
した処、図に示すような結果を得た。

ここで、ＩＦＡ価の測定方法はつぎのとおりである。

■ＩＦＡ抗体の作製： りん酸緩衝生理食塩水ｐＨ７，２（ＰＢＳ）で５回以上
遠心洗浄したＴ、５寄生率２０％以上の感染中Ｓ血球を
０．２％ゼラチン溶液に４０容量％の濃度に浮遊させ、
これを無螢光スライドグラスの端から端までむらのない
ように塗抹し、風乾後冷アセトンにて１５分間固定して
抗原とした。

■ＩＦＡＩＦＡ価術式： 塗抹抗原面をマニキュアを用いて四分割し、マニキュア
が乾いた後、被検血清「−次抗体」をＰＢＳで希釈して
順次滴下して抗原面に広げ湿箱中に入れて３７℃で１時
間感作する。つぎに抗原スライドをＰＢＳで１５分ずつ
３回振とう洗浄し、風乾した後、犬牌臓の抗体産生細胞
を用いた検定により４単位に調製した抗犬γ−グロブリ
ン家兎螢光抗体「二次抗体」を滴下して、−次抗体と同
様に感作し、感作終了後抗原スライドをＰＢＳで５分ず
つ３回洗浄し、乾燥させないように注意しながら炭酸緩
衝無螢光グリセリンｐＨ９，０を用いてカバーグラスで
封入し、透過型螢光顕微鏡で鏡検する。Ｔ、　ｓに特異
螢光が認められる最高布釈度の逆数をＩＦＡ価とし、４
０倍以下を陰性とする。

図から明らかなように、ＡＭＯＥアジュバントを用いた
第１群および第２群では抗原単独注射の第３群に比較し
てきわめて高い抗体原が最終免疫注射終了後１５０日以
上にわたって持続されることか証明されＡＭＯＥアジュ
バントが本抗原に対しきわめて強いアジュバント作用を
示すことが明確となった。また、このワクチンの安全性
について、注射局所の硬結、発熱、食欲減退等の観察を
行なったが、これらの異常は全く見られなかった。

〔効果〕

以上述べたことから、この発明の動物用ワクチンは従来
のフロインドアジュバントワクチンに比べつぎのような
優れた効果を現わすものであることが明らかである。す
なわち ｉｌ＋　　従来のフロインドアジュバントワクチンは流
動パラフィン４３〜４５、アラセールＡ５〜７、ワクチ
ン原液５０の配合割合で調製されるのに対して、この発
明のワクチンは流動パラフィン６３、ＡＭＯＥ７、ワク
チン原液３０の配合割合で優れた効果を示すのでワクチ
ン原液の使用ｊ量は少１でよく、合理的な製造が可能で
ある。

（２）　　従来のフロインドアジュバントに比べてＡＭ
ＯＲアジュバントの粘度は約１１５０であり、乳剤化お
よび注射がきわめて容易である。

（３）　　乳剤の安定性について、７０インドアジユバ
ントワクチンは室温、４℃で保存するときは短期間に油
層と水層とに分離するが、この発明のワクチンは長期間
（１年以上）変化することなく良好な乳化状態を保持す
る。

（４）従来のフロインドアジュバントワクチンの接種反
応に比較して、発熱、接種部位での壊死、硬結などの反
応は、この発明のワクチンにおいては軽度かまたは殆ん
ど見られない。これはワクチンが油性でありながら界面
活性剤であるＡＭＯＥの特性番こよって接種局所の組織
に均一によく分散されるためである。

（５）　　この発明のワクチンの免疫効果は７０イン、
ドアシュバントワクチンと比較して同等もしくはそれ以
上で、りん酸アルミニウムゲル、水酸化アルミニウムゲ
ルなどのワクチンと比較すると、抗体価の上昇および持
続性の点で有意差が認められる。

【図面の簡単な説明】

図はこの発明の実施例４におけるワクチン接種牛の抗体
価（ＩＦＡ価）の経日的推移を示す図である。 ０・・・第１群、○・・・第２群、△・・・第３群特許
出願人　　　株式会社微生物化学研究所同　　代理人　
　　鎌　　　１）　　　文　　　−−Ｉ　Ｆ　Ａ価　　
　　　　　　　や 二二

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、界面活性剤無水マンニトール・オレイン酸エステル
   と流動パラフィンとから成る油中水滴（Ｗ／Ｏ）型の親
   水性油性アジユバントを使用したことを特徴とする動物
   用ワクチン。 ２、動物用不活化ワクチンである特許請求の範囲第１項
   記載の動物用ワクチン。 ３、動物用コンポーネントワクチンである特許請求の範
   囲第１項記載の動物用ワクチン。 ４、動物用サブユニツトワクチンである特許請求の範囲
   第１項記載の動物用ワクチン。