JPS63269996A - タンパク質を安定化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、タンパク質の溶解性及び生物活性を実質的
に維持している新規な乾燥タンパク質に関する。この発
明はまた、この新規な産物の製造方法及びこの産物を生
物に投与してその成長を促進する方法に関する。

最近、生体に薬剤や医薬のような種々の有益な物質を投
与するための種々の方法及び装ｆが開示されている。例
えば、このような物質を、生体組織及び体液に対して適
合性を有する液体に溶解し、これを静脈管によって生体
に投与することができる。あるいは、溶液の形でこの物
質を注入ポンプによって投与することもできる。種々の
型式の注入ポンプを教示している多くの特許がある。例
えば、米国特許第４，１９０，０４８号は、生体内に埋
め込まれる、貯蔵器を有する装置及び生体内に埋め込ま
れるポンプを開示している。このポンプは、患者の皮膚
及びポンプ隔壁を介して注入物を注射することにより、
装置内の室に注入物を再充填することができる。

また、生体内に埋め込むことができ、有用物質が拡散す
るように構成された多くの装置も周知である。例えば、
ロング等の米国特許第３，２７９．９９６号は、シリコ
ーンゴムで形成され、シリコーンゴムに可溶でかつその
外表面から一定速度で拡散することができる治療剤を内
部に含むカプセルを生体内に埋め込むことにより、生体
への治療剤の制御された放出を行うための方法及び手段
を開示している。シーライス等の別の特許である米国特
許第３，８４５，７７０号は、薬剤を含む室を囲包する
半透膜を有する、薬剤の制御された放出を行うための浸
透圧に関する。壁は外部の体液に対しては透過性である
が、薬剤に対しては非透過性であり、薬剤を生体に分配
するための通路を有する。薬剤を放出するために、壁を
介して室に液体が吸入され、薬剤の溶液が生成される。

この溶液は、壁の透過性と、装置の壁を介する浸透圧勾
配とによって制御される速度で通路を介して配給される
。

有用な薬剤を放出するためのこれら及び他の種々のシス
テム及び装置があるにもかかわらず、いくつかの問題が
残っている。１つの問題は、いくつかの有用な薬剤、特
にある種のタンパク質のような高分子量の薬剤は、不安
定で、また体液又は他の水系溶媒に不溶であるというこ
とである。その結果、このような薬剤が遅放出装置内に
入れられ、体液と接触したシ、あるいはそれらが静脈内
投与のための溶液に加えられると、それらは不溶性の凝
集塊になる傾向がある。

この問題を解決する試みがなされている。例えば、ブラ
ックシアーの米国特許第４．４３９，１８１号は、イン
シュリン溶液が適切な機能をその流動性に依存している
注入ポンプ型の配給システム内での、可溶化インシュリ
ンの沈殿を防止するための方法を開示している。すなわ
ち、ブラックシアーは、溶液にグリセロールのような多
価アルコールを適量加えることによってインシュリンを
安定化することを開示している。

同様に、ドーマンの米国特許第４，３０６，５５３号は
、インシュリン溶液に低濃度の特異的な清浄剤を加える
ことによって溶液の流動性を維持することを教示してい
る。

これら２つの特許の教示はある場合には有用であるかも
しれないが、ポリペプチドを安定化するだめの他の方法
が求められている。

この発明によれば、新規な乾燥タンパク質産物及びその
製造方法が提示される。タンパク質に強力に結合するイ
オン性清浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ　）をタンパク質の
水溶液と混合し、このタンパク質−清浄剤混合物を乾燥
して乾燥産物を形成すると、清浄剤の量がタンパク質を
実質的に被覆するのに十分な場合には、該乾燥産物を次
いで水系媒体と接触させた際に、タンパク質の生物活性
及び溶解性が実質的に維持されるという驚くべき知見が
得られた。この発明はまた、上記新規乾燥タンパク質産
物を投与して生物の生物学的反応を高めることＫも関す
る。

この発明は、乾燥されたタンパク質産物を製造する方法
にも関する。このタンパク質産物は、生体内に埋め込ま
れる配給装置中に入れられた場合、又は静脈内注射若し
くは注入ポンプによって投与される溶液に加えられた場
合に、その生物活性を維持し、そして不溶化の問題をほ
とんど起こさない。すなわち、十分な量のイオン性清浄
剤と生物活性を有するタンパク質とを、タンパク質を乾
燥する前に混合してタンパク質を実質的に完全に清浄剤
で被覆し、次いでこのタンパク質−清浄剤混合物を乾燥
すると、得られた乾燥産物は、生体内に投与されて体液
と接触した際、又は他の水系流体と接触した際に、タン
パク質の生物活性を維持しておシ、有意な不溶化の問題
も起きないことを見出した。

この発明の方法は、乾燥状態ＶＣ６る種々の高分子量及
び低分子量ポリペプチド及びタンパク質であって、湿潤
、化した後に再溶解しない凝集塊を形成する傾向を有す
るものに対して適用できる。

「高分子量」という用語は、少なくとも約ｉｏ、ｏｏ。

ダルトンの分子量を有するポリペプチドを意味する。こ
の明細書で、「タンパク質」という用語は、組換えＤＮ
Ａ技術を用いて生産されたものを包含する、天然及び合
成タンパク質及びポリペプチドの両方を包含する。この
語は全長を有するポリペプチド及びタンパク質並びにそ
れらの生物学的に活性な誘導体及び断片の両方を包含す
る。生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドは、
生体に投与された後、生物の生物学的プロセスに対して
効果を示すものである。

この発明の１つの好ましい具体例において、タンパク質
はウシやブタのソマトトロピン（ときには成長ホルモン
とも呼ばれる）のような動物のソマトトロピンである。

生物活性を有するソマトトロピンを含む組成物は、動物
の生長速度、食餌効率、肉組成（ｃａｒｃａｓｓ　ｃｏ
ｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　）及び／又は泌乳量を向上させる
ために動物に投与することができる。ソマトトロピンは
、切除された下垂体から常法により単離することができ
る。あるいは、ソマトトロピンは、ソマトトロピンの生
産を指示する組換えＤＮＡを含む、遺伝子操作された微
生物から得ることもできる。例えばバイオジエン・エヌ
φヴイによる欧州特許出願筒８３３０４５７４．３号（
公開番号０　１０３　３９５号）を参照のこと。

このようなソマトトロピンの製造方法は公知であり、例
えば上記の欧州特許出願（これはウシソマトトロピンの
製造を記載している）及びブタソマトトロピンの製造を
記載した欧州特許出願筒８３３５７１７．７　（公開番
号０　１０４　９２０号）に記載されている。

ソマトトロピンは幾分種特異的であるが、動物のソマト
トロピンはかなり一致したアミノ酸配列を有しておシ、
これらは種を超えて活性を有することが示されている。

さらに、ソマトトロピンの活性を有する稽々の断片が発
見されている。この明細書において、ソマトトロピンと
いう用語は、全長を有する天然及び組換えソマトトロピ
ン並びに成長促進能力を有するそれらの誘導体を包含す
る意図で用いている。これらの誘導体は、ウシソマトト
ロピンのΔ４及び△９構造（Ｎ末端からそれぞれ４及び
９アミノ酸が欠失しているポリペプチドで、バイオジエ
ンの欧州特許出願筒８３３０４５７４．３に記載されて
いる）並びに、ブタの成熟ソマトトピンから最初の７ア
ミノ酸が欠落したアミノ酸配列を有するΔ７ｐｓＴと呼
ばれるポリペプチド（欧州特許出願筒８３３０５７１７
．７に記載）のような、ポリペプチドホルモンの生物学
的に活性な断片を包含する。ソマトトロピンという用語
はまた外来性のＮ末端メチオニンを含むポリペプチドの
活性断片をも包含する。

ソマトトロピン及び他のタンパク質を一般的な方法で回
収及び精製すると、タンパク質の水溶液が得られる。こ
の発明の方法によると、溶液からソマトトロピン又は他
のタンパク質を回収する前に、イオン性清浄剤がタンパ
ク質に加えるのが有利である。望ましくは、清浄剤は、
清浄剤で被覆されたタンパク質が乾燥され、体液のよう
な水系流体と接触した際に、タンパク質が溶解する能力
を維持するようにタンパク質を被覆するのに十分な量で
加えられる。望ましくは、タンパク質分子が実質的に清
浄剤によって被覆されるのに十分な量の清浄剤が加えら
れる。一般的に、清浄剤とタンパク質との重量対重量比
は少なくとも約４０二６０、好ましくは少なくとも約５
０：５０である。

もしタンパク質を実質的に被覆するのには十分でない量
の清浄剤が加えられたならば、タンパク質が乾燥され、
体液と接触した際におけるタンパク質の溶解性の喪失の
程度は、減少せずＫよシ一層大きくなる。理論によって
限定することを望まないが、少量の清浄剤の存在により
タンパク質が部分的に被覆され、タンパク質が部分的に
ほどかれる（　ｕｎｆｏｌｄｅｄ　）ものと思われる。

次いで水系流体と接触すると、タンパク質分子の被覆さ
れていない、はどかれていない領域が被覆され、はどか
れた領域よりも強く相互作用を起こし、それによって凝
集塊の相対量が増大する。もし、タンパク質分子を実質
的に完全に被覆するだけの十分量の清浄剤が加えられた
ならば、タンパク質分子は湿潤化された時に相互作用で
きず、有意な凝集が起きない。

この発明の方法において、種々の強力結合イオン性清浄
剤を用いることができる。この明細書において、「強力
結合」という用語は、強力な疎水性及び／又はイオン性
相互作用を意味する。陰イオン清浄剤を用いるか、ある
いは陽イオン清浄剤を用いるかの選択は、タンパク質が
利用可能な陽電荷を有しているか陰電荷を有しているか
により決定される。好ましい陰イオン清浄剤は、一般式
几Ｏ８０８Ｍ（ただし、Ｒは一般的に炭素数約１６以下
のアルキル基、Ｍはナトリウム又はカリウムイオンのよ
うな陽イオンを示す）で示される硫酸アルキルである。

特に好ましい陰イオン清浄剤はドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ　）である。

清浄剤をタンパク質溶液と混合した後、混合物を乾燥す
る。この工程は従来技術により行なうことができる。好
ましい方法は凍結乾燥である。

乾燥タンパク質−清浄剤混合物（この明細書において乾
燥タンパク質産物ともいう）を次いで生物に投与するこ
とができる。これは例えば、従来技術によ）静脈内注射
又は注入ポンプによって投与される溶液に加えることに
より投与することができる。この発明の乾燥タンパク質
産物の生体内での使用を模することを意図した生体外実
験により、清浄剤の存在によってタンパク質の生物活性
が損なわれないことが示された。

この発明を実施例に基づいてさらに例示するが、実施例
は限定的なものと解釈ナベきではない。

実施例１ 生体外湿潤化 ５Ｄｓｔ−ｔ■／ｄ組換えブタソマトトロピン（ｒｐｓ
Ｔ）　（バイオジエンの欧州特許出願第８３３０４５７
４．３号に記載の方法に実質的に従って製造したもの）
溶液に溶解し、これを凍結乾燥し、ＳＤＳの含量が重量
基単で０％、０．２％、ｌチ、６％、２０％又は５０％
である産物を得た。

これらの凍結乾燥混合物の５〜を１０μ沼のＰＢＳ　（
１４０ｍＭ　ＮａＣＪ３、ｌ　Ｑ　ｍＭ　ＮａＢＨＰＯ
４、ｐＨ７，４＋　ＮａＮ　Ｂ　（０，２％）−１−Ｈ
Ｃ，ｇ（湿潤化−を７．４に調整するためのもの）で３
７℃で１５日間湿潤化した。この湿潤化操作は、乾燥タ
ンパク質産物が配給装置中に挿入され、生体内に埋め込
まれて生物流体と接触する場合を模したものである。

非湿潤化試料は乾燥状態で一２０℃で第１５日まで貯蔵
した。全ての試料をｌｄのＰ　Ｂ　Ｓ　＋ＮａＮＢ、−
７，４中に懸濁させ、超音波処理してペレットを分散さ
せた。懸濁液をよシ大きなチューブに移し、Ｌｍ９／ｍ
ｌの８Ｔ濃度になるように希釈した。１時間毎に逆向き
にかきまぜながら可溶化し、４時間後、１０μ形の懸濁
液を採った。１０μ２の上清を採る前にチューブを１５
００　ｘｇで１０分間遠心処理した。

試料のタンパク質含量をピアスＢＣＡタンパク質分析（
Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡタンパク質分析）（表１参照）に
より分析した。

湿潤化後の溶解度に濃度依存性が反映されていた。湿潤
化０日後、溶解度はＳＤＳ濃度に関係なく高かった（８
３−１０４チ）。しかしながら。

湿潤化１５日後には、平均溶解度が９５．６％である、
５０重量％の８ＤＳが存在した場合を除き、全ての場合
に溶解度は１０チ未満であった。ＳＤＳｇｋ度が２０％
の場合には、他の場合と異なり、不溶性ＳＴのベレット
は再懸濁しても溶解しなかった。２０％ＳＤＳの場合に
は、ＳＴ分子がＳＤＳで部分的に被覆されたのみであろ
うことが予想される。このような部分的被覆の条件下に
おいて被覆されなかった８Ｔ分子の領域は、ＳＤＳが結
合していないＳＴ分子の同じ領域と比べて、はどけ易く
なっているかもしれないと理論づけられる。

なぜなら、適正に折りたたまれた分子の安定性は、分子
の多くの領域の寄与を受けているからである。

これらの領域のいくつかをＳＤＳで被覆すると、それら
の領域が正常な分子内相互作用に関与することが妨げら
れ、非被覆領域の脱安走化（すなわち、はどけやすさ）
をもたらすであろう。異なるＳＴ分子のこれらのほどけ
た領域は相互作用する傾向を有し、湿潤化の間に凝集す
る。このことは、清浄剤の安定化効果のためにタンパク
質分子を実質的に完全に被覆することが必要であること
を示唆している。

表　　　１ ８ＤＳの存在下に訃ける生体外湿潤化後のｒｐｓＴの溶
解度０　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　９３
．１０　　　　　　　　　１５　　　　　　　　　　４
、１０　　　　　　　　　１５　　　　　　　　　　６
、４０　　　　　　　　　１５　　　　　　　　　　７
．４０．２　　　　　　　　　０　　　　　　　　　９
７．００．２　　　　　　　　　０　　　　　　　　　
９８．００．２　　　　　　　　１５　　　　　　　　
　　０．８０．２　　　　　　　　１５　　　　　　　
　　　４４１　　　　　　　　　　　　　　０　　　　
　　　　　　　１０４、０１　　　　　　　　　　　　
　　０　　　　　　　　　　　　９４、９１　　　　　
　　　　１５　　　　　　　　　　０、０１　　　　　
　　　　　　　　１５　　　　　　　　　　　　　　０
、０６　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　９３
、７６　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　
　　　　　８３．０６　　　　　　　　　　　　　１５
　　　　　　　　　　　　　　０．０６　　　　　　　
　　　　　　１５　　　　　　　　　　　　　　０．０
２０　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　
　　　１０１、０２０　　　　　　　　　　　　　　０
　　　　　　　　　　　　８７、１２０　　　　　　　
　　１５　　　　　　　　　　０、０２０　　　　　　
　　　　　　１５　　　　　　　　　　　　　　０、０
５０　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　
　　　　　９６、４５０　　　　　　　　　１５　　　
　　　　　　９１、７５０　　　　　　　　　　　　１
５　　　　　　　　　　　　９９．５ａ「第０日」試料
は一２０℃で乾燥状態で１５日間貯蕨され、ＰＨ１に溶
解する前に１分間未満湿潤化した。

ｂ「溶解度」は、所定の期間湿潤化した後の上清画分中
の測定可能なｒｐｓＴを、湿潤化後０日の懸濁液画分中
の溶解度で除したものを表わす。

実施例２ ラット成長活性測定 ０％又は５０％の８Ｄ８を含む、湿潤化され、又はされ
ていない遺伝子組換えにより得られたブタソマトトロピ
ン試料を緩衝液Ａ　（０，１５Ｍ　ＮａＣ−ｅ。

０、０３　Ｍ　ＮａＨＣＯＢ、ｐ）１９．５）中に３０
〜１２０μｇ／νの濃度に希釈した。溶液は注射と注射
の間は冷蔵庫内に貯蔵した。

１１０匹のラットを１群ｌＯ匹のｔｉ群にランダムに分
けた。表２に示すように、１つの群にはネガティブ対照
として０．２−の緩衝液Ａを注射した。他の群には、０
％又は５０チのＳＤＳを含む湿潤化した又はしていない
０．２ゴのｒｐｓＴ溶液を注射した。注射は毎日、９日
間行なった（湿潤化操作は実施例１に記載したものと同
じである）。

ラットには、表２に示すように、２又は３の異なる投与
量（６，１２又は２４μｇ／ラット／日）を注射した。

ラットの体重を毎日測定した。成長は、第１０日におけ
るラットの体重と第１日における最初の体重との差によ
り計算した（表２参照のこと）。

高い投与量（２４μｇ／日）において、全てのｒｐｓＴ
（湿潤化した又はしていない、８ＤＳを含む又は含まな
いもの）はラットの成長を有意に促進した（一方的ダネ
イ試験（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ　Ｄｕｎｎｅｔ’５ｔｅｓ
ｔ　）、ｐ　＜　０．０１に基づく結果、表２参照）。

低い投与量（６μｇ７日）では、８Ｄ８の存在下で湿潤
化されたｒｐｓＴはラットの成長を有意に促進したが、
８Ｄ８の不存在下で湿潤化されたものはほとんど変化を
示さなかった。５０％ＳＤＳを含むｒｐｓＴは湿潤化の
前後で同程度の生物活性を有していた。このデータは、
ＳＤＳが湿潤化ｒ　ｐｓＴの成長活性を安定化したこと
を示している。これらの結果はまた、注射後、結合した
ＳＤＳが解離することがｒｐ８Ｔ分子の生物活性を発生
させるのく十分であることを示している。

表　　　２ ｒｐ８Ｔのラット成長活性の安定化に対する８ＤＳ２４
　　　１１．３”　　　３．５ 本変数の分析後一方的ダネイ試験を用いて統計処理した
ところネガティブ対照から有意に異なっている（Ｐ＜０
．０１）。従って、これらの試料は生物学的に活性であ
ると考えられる。

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. （１）乾燥タンパク質産物を製造する方法であって、ａ
   ）タンパク質と、このタンパク質を実質的に被覆するの
   に十分な量の、前記タンパク質に強力に結合することが
   できるイオン性清浄剤とを含む水溶液を形成する工程と
   、 ｂ）前記タンパク質−清浄剤混合物を乾燥する工程と、 を備え、前記タンパク質の生物活性及び溶解度は前記乾
   燥タンパク質−清浄剤混合物が水系流体と接触した際に
   も実質的に維持されることからなる方法。
2. （２）乾燥タンパク質産物を製造する方法であって、ａ
   ）タンパク質とイオン性清浄剤とを含み、清浄剤とタン
   パク質の重量対重量比が少なくとも約４０：６０である
   水溶液を形成する工程と、ｂ）前記タンパク質−清浄剤
   混合物を乾燥する工程と、 を備え、前記タンパク質の生物活性及び溶解度は乾燥タ
   ンパク質−清浄剤混合物が水系流体と接触した際にも実
   質的に維持されることからなる方法。
3. （３）前記清浄剤と前記タンパク質との重量比が約１：
   １である請求項１又は２記載の方法。
4. （４）前記イオン性清浄剤が陰イオン性清浄剤である請
   求項１又は２記載の方法。
5. （５）前記清浄剤が硫酸アルキルを含む請求項１又は２
   記載の方法。
6. （６）前記清浄剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求
   項５記載の方法。
7. （７）前記イオン性清浄剤が陽イオン性清浄剤である請
   求項１又は２記載の方法。
8. （８）前記タンパク質−清浄剤混合物が凍結乾燥によっ
   て乾燥される請求項１記載の方法。
9. （９）前記タンパク質が天然又は遺伝子組換え技術によ
   り製造された動物のソマトトロピンである請求項１又は
   ２記載の方法。
10. （１０）前記タンパク質が遺伝子組換え技術により製造
    されたブタソマトトロピンである請求項９記載の方法。
11. （１１）前記タンパク質がΔ７ｒｐＳＴである請求項１
    ０記載の方法。
12. （１２）前記タンパク質が遺伝子組換え技術により製造
    されたウシソマトトロピンである請求項９記載の方法。
13. （１３）前記タンパク質がΔ４ｒｐＳＴである請求項１
    ２記載の方法。
14. （１４）前記タンパク質がΔ９ｒｐＳＴである請求項１
    ２記載の方法。
15. （１５）請求項１記載の方法により製造された生物活性
    を有する乾燥されたタンパク質−清浄剤産物。
16. （１６）前記清浄剤と前記タンパク質の重量対重量比が
    少なくとも約４０：６０である請求項１５記載の産物。
17. （１７）前記清浄剤と前記タンパク質の重量対重量比が
    約１：１である請求項１６に記載の産物。
18. （１８）前記清浄剤がドデシル硫酸ナトリウムである請
    求項１４又は１５記載の産物。
19. （１９）前記タンパク質が天然又は遺伝子組換え技術に
    より製造された動物のソマトトロピンである請求項１８
    記載の産物。
20. （２０）前記ソマトトロピンが天然の、又は遺伝子操作
    により製造されたブタソマトトロピンである請求項１９
    記載の産物。
21. （２１）前記ソマトトロピンが天然の、又は遺伝子操作
    により製造されたウシソマトトロピンである請求項１９
    記載の産物。
22. （２２）タンパク質とイオン性清浄剤との混合物を含み
    、前記清浄剤は前記タンパク質に強力に結合され、前記
    清浄剤と前記タンパク質との比は前記タンパク質が前記
    清浄剤によって実質的に完全に被覆される比である、生
    物活性を有する乾燥されたタンパク質産物。
23. （２３）前記清浄剤と前記タンパク質の重量対重量比が
    少なくとも約４０：６０である請求項２２記載のタンパ
    ク質産物。
24. （２４）前記清浄剤と前記タンパク質との重量対重量比
    が約１：１である請求項２３記載のタンパク質産物。
25. （２５）前記タンパク質が天然の、又は遺伝子組換え技
    術により製造されたソマトトロピンであり、前記清浄剤
    がドデシル硫酸ナトリウムである請求項２２又は２３記
    載のタンパク質産物。
26. （２６）前記タンパク質が遺伝子組換え技術により製造
    されたウシソマトトロピンである請求項２５記載のタン
    パク質産物。
27. （２７）前記タンパク質がΔ７ｒｐＳＴである請求項２
    ６記載のタンパク質産物。
28. （２８）前記タンパク質が遺伝子組換え技術により製造
    されたウシソマトトロピンである請求項２５記載のタン
    パク質産物。
29. （２９）前記タンパク質がΔ４ｒｐＳＴである請求項２
    ８記載のタンパク質産物。
30. （３０）前記タンパク質がΔ９ｒｐＳＴである請求項２
    ８記載の方法。
31. （３１）生物の成長を促進する量の請求項２５記載の生
    物活性を有する乾燥されたタンパク質産物を生物に投与
    することを含む生物の成長速度増加方法。
32. （３２）前記タンパク質が遺伝子組換え技術により製造
    されたブタソマトトロピンである請求項３１記載の方法
    。
33. （３３）前記タンパク質が遺伝子組換え技術により製造
    されたウシソマトトロピンである請求項３１記載の方法
    。
34. （３４）前記乾燥タンパク質産物が生物学的に許容でき
    る流体中に溶解され、体内に注射される請求項３１記載
    の方法。