JPS63214200A - ウィルス遺伝子の定性・定量方法及びそのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中に存在するウィルス遺伝子の定性φ定
量方法及びそのためのキットに関する。

更に詳しくは、血清、尿或は唾液を試料として用い、該
試料にポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）水溶液或
はＰＥＧを含む塩水溶液から成る抽出液を加えて定温放
置（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）　Ｌ、遠心分離した後、分
離した沈降物を溶解し、該溶液内のウィルスＤＮＡとＤ
ＮＡプローブとをハイブリット形成させてウィルス遺伝
子を定性Φ定着する方法及び該定性・定量のためのキッ
トに関する。

（従来の技術） 従来１人体或は動物の発病源であるウィルスの検定を行
うために通常使用されていた血清学的方法としては、桃
源・抗体反応を利用した検定があった。しかしながら、
このような方法は検出感度、製造工程及び検定操作所用
時間等に様々な問題があった。

このような問題の解決を図るために、１３７０年代中半
か５の分子生物学の発展に供い、上記抗原抗体反応を利
用した方法に換る方法が多数提案されてきた０例えば、
ＤＮＡプローブ（ｐｒｏｂｅ）技術、即ち所定遺伝子を
ベクターに組込み、該ベクターを微生物に移入して大量
増墳させた後に分収し。

該ベクターに放射性或は非放射性標識物質を結合させて
ＤＮＡプローブとし、これと試料中に存在する相補的な
遺伝子とをハイブリット形成（Ｈｙｂｒｉ−ｄｉｚａｔ
ｉｏｎ）させる方法を挙げることができる［リグビー（
Ｒｉｇｂｙ）等、［ジャーナルオブモレキュラーバイオ
ロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ）　１１３　、２３
７〜２５１（７７）　：　ウアルド（Ｗａｒｄ）等、プ
ロシーディングズオブザナショナルアカデミーオブサイ
エンス（ＰＮＡＳ）亜、　４０４５〜４０４９（８３）
］　、該プローブ技術は様々な研究の手段として広く利
用されてきたが、１９８０年代から種々の実用分野にま
で応用されるようになった。しかしながら、プローブ技
術が臨床学的分野に応用されるためには解決すべき問題
点があった。

現在、推進されている研究は、ハイブリット形成（Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を簡便にできる方法、試料遺
伝子を容易に分離することが出来る方法、非放射性標識
物質及びより敏感なプローブの開発等に重点が置かれて
いる。

例えば、アイリ　エム、パルバ（Ａｉｒｉ　Ｍ、　Ｐａ
１ｖａ）等［ジーン（Ｇｅｎｅ）２１．７７〜８５（８
３）：ジャーナルオブクリニ力ルミクロバイオロジー（
Ｊ、　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ旧ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
）　　１６　（１）、　９８〜１００　（８３）］が開
発したサンドイツチ法がある。該方法は特定遺伝子を２
部分に分離し、一部分を固相化し、他部分には放射線同
位元素等を結合させＤＮＡプローブとして使用し１両者
を順次試料遺伝子とハイブリット形成させた後、固相よ
り反応しなかった標識遺伝子（即ちＤＮＡプローブ）を
除去することにより、容易に試料中の遺伝子を検定する
ことができる。該方法において、ｅ４識物質として放射
線同位元素１２！′Ｉを使用する場合、γ−カウンター
にて固相に残存するγ線量を測定することにより試料中
の遺伝子量が即時測定される。

また、１６８０年エール（Ｙａｌｅ）大学のウアルド博
士等［プロシーディングズオブザナショナルアカデミー
オブサイエンス（ＰＮＡＳ）８０　４０４５〜４０４ｉ
３（８３）］は、デオキシウリジン三燐酸（ｄＵＴＰ）
にビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）が結合したものを更に特定
遺伝子へ結合させてＤＮＡプローブとし、該プローブと
固相化した試料ＤＮＡとのハイブリット形成を遂行し。

しかる後に洗浄した固相にアビジン、−酵素、アビジン
蛍光染料等の接合子（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）等を反応さ
せ、固相の発光量により試料中の遺伝子量を測定する方
法を開発し、より敏感な接合子を発見すべく研究を続行
中である。

また、１６８２年から更に敏感なりＮＡプローブを開発
する研究が推進されてきており、例えばメシング（Ｍｅ
ｓｓ　ｉｎｇ）　［ヌクレイツクアシズリサーチ（Ｎ。

Ａ、Ｒ，）　Ｌ　３０９〜３２１（８１）：ジーン（Ｇ
ａｍｅ）１９．２Ｈｗ２７Ｅｌ（８２）］はＭ１３７ｙ
−ジ（ｐｈａｇｅ）を利用して一本鎖のＤＮＡプローブ
（ｓｉｎｇｌｅ　５ｔｒａｎｄ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅ）
を製造し、ブルタ（Ｂｕｌｔｌｅｒ）等［ジャーナルオ
ブバイオロジカルケミストリー（Ｊ、　ａｔ　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｗ、）訂げユ５７７２〜５７７８（８２）］
はＳＰ６転写プロモータ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を利用して一本鎖のＲＮＡプロー
ブを開発した。

しかし、以上説明したようなりＮＡプローブに関する研
究の著しい発展にもかかわらず、臨床学的分野への適用
は未だ解決すべき問題点、即ち試料から試料遺伝子を分
離する方法の開発が残されていた。

例えば、エフ、ボニノ（Ｆ、　Ｂｏｎｉｎｏ）　等［ヘ
パトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）ｉ　（５）、３８
Ｂ（８１）　］　、ジェイ。

スｍ−／ト（Ｓｃｏｔｔｏ）等［ヘパトロジー（Ｈｅｐ
ａｔｏｌｏｇｙ）３　（３）、２７９（８３）］、エム
、ベルニンガ（Ｍ、　Ｂｅｒｎｉｎｇｅｔ）等の方法［
ジャーナルオブメディカルヴイロロジ−（Ｊ、　ｏｆ　
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　　且、５７　（
８２）］、シー、エム、チュ（Ｃ，Ｍ、　Ｃｈｕ）　（
ヘパトロジー（Ｒａｐａｔｏｌｏｇｙ）　５（３）、４
３１（８５）］、シュンウェンチ璽−（Ｓｕｎｗｅｎ　
Ｃｈｏｕ）［ザニューイングランドジャーナルオブメデ
イシン（Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）　３０８　（１Ｂ）、　
９２１　（８３）］　、シュスタ（Ｓｈｕｓｔｅｒ）等
［ジャーナルオブメディカルヴイロロジー（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１９
．２７７（８Ｂ）］　、及びニス、エイ、スベクタ（Ｓ
、　Ａ、　５ｐｅｃ−ｔｏｒ）［クリニカルケミストリ
ー（ＣＩｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３１（９
）、１５１４（８５）１等の諸氏が用いた分離方法等は
臨床学において利用することが出来なかった。

（発明が解決しようとする問題点） 即ち、前記諸氏等により開発された方法では、血清、尿
或は唾液からウィルスを分離する場合、以下に説明する
二つの方法によっていた。

その第１の方法は、超高速遠心分離法を利用して試料中
のウィルス粒子を沈降させた後、該沈降物をドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びプロテイナーゼＫにて処理
して、ウィルス粒子を破砕し、得られた溶液に対してフ
ェノル／クロロホルム（１／１）を油層として用いた抽
出操作を行い、水層側にウィルスＤＮＡのみを分離する
ものである。

また他の方法は、血清等の試料中に直接ＳＤＳ及びプロ
テイナーゼＫを加え、試料中に存在するつｌルスを１〜
２鱒間かけて破砕した後、フエノル／クロロホルムによ
り抽出操作を行いウィルス遺伝子を分離していた。

以下、従来のウィルス遺伝子分離・検定方法を具体的に
説明する。

１−ａ）血清中に存在するウィルス遺伝子の分離検定方
法 ８００　ＩＬ見の血清を４００１ＬＲの３０％蔗糖クッ
ション（ｓｕｃｒｏｓｅ　ｃｕｓｈｉｏｎ）上へ加えた
後、４℃で２０．０００回転／分（ｒｐ鳳）にて２０時
間遠心分離し、得られた沈降物に１ミリモル／ｉ（脂Ｍ
）エチレンジアミン四酢酸（ＥＯＴＡ）及び１０鳳にト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（
Ｔｒｉｓ−ＨＣ文）（ｐＨ８，０）を含む溶解緩衝液３
５ｕＬｊＬを加えて溶解した後、プロテイナーゼＫ　（
１ｍｇ／ｍｕ）　５ＩＬ見と１％ＳＤＳ水溶液５ＪＬｉ
を加え、３７℃で２時間反応させる。しかる後に、１０
０　ｍＷ　Ｔｒｉｓ−ＨｅｆＬ（ｐＨ８，０）で飽和さ
れたフェノールを４５ｇ１加え、若干振盪した後室温で
１２，０００ｒｐ■にて５分間遠心分離し、上澄液を分
離して試料溶液として使用する。

該試料溶液を３８−ウェルプレート（９［１−Ｗｅ　ｌ
　Ｉｐｌａｔｅ）の各ウェルに５０ｇ１ずつ導入し、更
に１Ｍ（モル／　ｌ　）　（７）　ＮａＯＨを含む水溶
液５０ｕｆＬを加え、１０分間振盪する。しかる後に各
ウェルに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、２．
５Ｍ　ＮａＣ１を含む中和液２００ｊＬｌを加え、即時
６　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ［ＳＳＣ：　０．１５Ｍ　Ｎａ１ｌ
　。

０．０１５Ｍコハク酸ナトリウム　（Ｈａ３ｃｉｔｒａ
ｔｅ）（ｐＨ７，０）、尚明細書中でａＸはａ倍濃度を
示す］で飽和されたニトロセルロース膜が装着された３
６−ウェルサクション器にて吸引する０次に、該ニトロ
セルロース膜を空気中で１５分間放置し、更に８０℃の
真空オープンで乾燥した後、ポリビニルバッグに該ニト
ロセルロース膜及びハイブリット形成用溶液を導入後、
熱融着器（Ｈｅａｔ　５ｅａｌｅｒ）によりバッグの四
辺を密封し、４２℃で８時間以上放置する。しかる後に
バッグの一辺を開封し、ＤＮＡプローブを導入して再度
封をし、ハイブリット形成を遂行するため４２℃で２０
〜２４時間放置反応する０反応完了後に該ニトロセルロ
ース膜を高濃度Ｓ　Ｓ　Ｃ（２Ｘ　ＳＳＣ，０，１＄　
５ＤＳ）及び低’ｔ５度５ＳＣ（Ｉ　Ｘ　ＳＳＣ，０，
１＄　５ＯＳ）４．：　テ洗浄し、風乾した後、ニトロ
セルロース膜をオートラジオグラフィして検定する。

１−ｂ）尿中に存在するウィルス遺伝子の分離方法法１
０ｍ文をニスダブリュー２８−ロータ（ＳＷ−２８ｒｏ
ｔｏｒ）により２０，０ＯＯｒｐ量で１時間遠心分離し
た後、沈降物をＤＮＡ溶解緩衝液［０，Ｉ　Ｍ　ＮａＣ
１。

１０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨｅｆＬ、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ
（ｐＨ８，０）］に溶解し、ＳＤＳ、リボヌクルレアー
ゼ（ＲＮａｓｅ）及びプロテイナーゼにで処理し、更に
油層としてフェノール／クロロホルム（１／１）を用い
て抽出した後、水層側に含まれるＤＮＡをエタノールに
て沈澱させる。これを適量のＴＥ緩衝液［１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＭ　。

１　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　］に溶解して試料
として使用する。

前記１−ａ）と同様に得られた試料中のＤＮＡを固相化
し、ＤＮＡプローブとハイブリット形成をさせた後、ニ
トロセルロース膜をオートラジオグラフィして検定する
。

１−ｃ）唾液に存在するライスル遺伝子の分離方法等張
塩溶液にてくびを洗った溶液を２０，０００ｒｐｍ［ツ
ルパルニスニス２４（ｓｏｒｖａｌｌ　Ｓ９２４月で２
時間超遠心分離し、沈降物を溶解緩衝液［３％サルコシ
ル（ｓａｒｋｏｓｙｌ；Ｎドデシルサルコシン酸ナトリ
ウム）　０．０７５Ｍ　丁ｒ：５−ＨＣｆＬ（ｐＨ８，
５，０，０２５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，１）］　２００
　ＩＬｌに溶解し、　１１００ＩＬ／騰又プロテイナー
ゼＫにて１時間３７℃で処理し、しかる後に得られる溶
液をフェノール／クロロホルムを用いて抽出した後、水
層側に含まれるウィルスＤＮＡを試料として使用する。

前記１−ａ）と同様に、得られたウィルスＤＮＡを固相
化しＤＮＡプローブとハイブリット形成させた後、ニト
ロセルロース膜をオートラジオグラフィして検定する。

血清３００ｕＬ、−４１にブロテイナーゼＫ　（１０ｍ
ｇ／　ａｎ　）を含むＳＤＳカクテル［２５鵬に酢酸ナ
トリウム（ＮａＡｃ）（ｐＨ７，５）、２．５１１Ｍ　
エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（Ｎａｚ　ＥＤＴＡ
）、０．５＄Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　１２．５ｇｇ／馬立剪断
熱変性された鮭精子ＤＮＡ、　２５ＩＬｇ／　ｍ文イー
スト転移ＲＮ　Ａ　（Ｙｅａｓｔ　ｔ−ＲＮＡ）１１０
０　ＪＬｌを加え、７０℃で１時間反応させた後、水で
飽和されたフェノール４００　ｐ見を加えて若干振盪し
、しかる後にクロロホルム／イソアミルアルコル（２４
／１）４００ＩＬｊＬを加え、更に振盪した後、１２，
０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。下層の有機層を
除去した後、更にクロロホルム４００ル文を加えて振盪
し、室温で１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、
上澄液を試料として使用する。前記１−ａ）と同様に該
上澄液に含まれるＤＮＡを固相化し、ＤＮＡプローブと
ハイブリット形成させた後、ニトロセルロース膜をオー
トラジオグラフィして検定する。

以上説明した様に、前記２方法は長時間且つ複雑な操作
を要するのみならず、高価な装置及び試薬を使用するた
め、臨床学への適用が困難であった。更に、前記の方法
で使用されたＳＤＳ或はブロテイナーゼＫが試料蛋白質
と非特異的に反応するために１反応後のウィルス遺伝子
の回収率が低く、また溶媒抽出時に、ウィルス遺伝子の
損失があるためウィルス遺伝子を正確に定量することが
できなかった。

また、抽出されたＤＮＡとＤＮＡプローブとをハイブリ
ット形成させ反応したＤＮＡを定量する場合、試料とな
るＤＮＡを固相化する必要がある。この時通常使用され
る固相及びプローブとしてニトロセルロース膜、シーン
スクリーン（ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ）　　、　　Ａ　　
Ｂ　Ｍ紙（＋ｗ−ａｍｉｎｅ　　ｂｅｎｚｙｌｏｘ７ｍ
ｅｔｂｙｌｐａｐｅｒ）　、　ＤＢＭ紙（ｄｉａｚｏｂ
ｅｎｚ２１ｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐａｐｅｒ）及びゼータ
プローブ（Ｚｅｔａ　ｐｒｏｂｅ■：米国Ｂｉｏ−Ｒｏ
ｄ社製品）を列半製品るが、これらの固相及びプローブ
は蛋白質、−末鎖ＤＮＡ、−末鎖ＲＮＡ及び遺伝子抽出
物に含まれる蛋白質等のいずれとも親和性を持っている
ため、固相に遺伝子だけ付着させることができない、そ
の結果、限定された空間でウィルス遺伝子とＲＮＡ蛋白
質等間の付着競争が起り抽出物中に存在する遺伝子の損
失が惹起され番、該問題も試料遺伝子を定量することが
できない理由となる。

本発明は以上説明した現状に鑑み成されたものであり、
本発明の目的は試料からウィルス遺伝子を簡便に分離し
１分離遺伝子の付着率を求めて、試料遺伝子を定性・定
量する方法及びそのためのキットを提供することにある
。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、前記従来技術の問題点を解決するため鋭
意研究、検討した結果、ウィルス粒子の外皮が蛋白質、
多糖類等より成り、これらがポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）によって塩析される特性を利用し、ウィルス遺
伝子を効果的且つ簡便に分離、定量することが出来ると
いう知見を得、本発明を成すに至った。

以下１本発明の詳細な説明する。

本発明の方法は、ＰＥＧ水溶液或はＰＥＧを含む塩水溶
液を抽出液として用い試料からウィルス粒子を凝集・沈
降させることを特徴とする。前記でＰＥＧを含む塩水溶
液の塩としては、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、
硫酸アンモニウム及び燐酸カリウム等を使用することが
できる。

また、ウィルス粒子を沈降させるに際して、試料中に存
在する他の物質も一緒に沈降するので、該沈降物を試料
として用い、固相に付着させる場合、ウィルスＤＮＡの
固相への付着率を求めなければならない、放射線同位元
素をａｉ＊物質とするＤＮＡプローブを用いて分離され
たウィルスＤＮＡの固相への付着率を求めると平均２５
％であった。従って、ハイブリット形成後の結果に４を
乗して、陽性対照群と比べて定量しなければならない。

以下１本発明の方法を段階的に説明する。

１、ＰＥＧの濃度決定 ＰＥＧ最終濃度が１．２．３．４．５．６．７．１０％
（Ｗ／Ｖ）となるようにＰＥＧ水溶液或はＰＥＧを含む
塩水溶液を調製し患者の血清、尿或は唾液に加えて渦動
（マｏｒｔｅｘ）　ｌ、た後、室温で５分間定温放置し
、更に１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上澄
液を分取し、新しい試験管に保管した。

一方沈降物を溶解液によって溶解し、両者に変性液を加
えて変性させ、更に中和液を加えて試料とした。しかる
後に得られた２種の試料溶液をニトロセルロース膜が装
着されたウェルサクシ、ン器に通した。

試料が完全に吸引されたことを確認した後、ニトロセル
ロース膜を取り出して風乾し、更に８０℃のオーブンで
１時間乾燥させた。該ニトロセルロース膜を４２℃に加
熱されたハイブリット形成液と供にポリビニルバッグに
、ハイブリット形成液０．１■ｌ／ニトロセルロース膜
１　ｃｍ２となるように導入し、更に１ｍｌのハイブリ
ット形成液を加えて該バッグを密封し、４２℃で１０分
間反応させ、更にバッグ内にＤＮＡプローブを導入し、
４２℃で２０時間ハイブリット形成させた。ニトロセル
ロース膜を高濃度ｓ　ｓ　ｃ　＜　２　Ｘ　ｓｓｃ、　
ｏ、ｔｘ　ｓｏｓ＞ニテ８０℃で４５分間２回洗浄した
後、風乾し、該ニトロセルロース膜の放射線量を測定し
た。得られた結果を以下の第１表に示した。第１表から
も明らかなように、ＰＥＧ最終濃度５％以上から上澄液
にウィルス遺伝子が検出されなくなり、ウィルス粒子が
完全に沈降されたことがわかる。

２、ＰＥＧを加えた後の定温放置時間の決定ＰＥＧの最
終濃度が５％となるようにＰＥＧを含む塩水溶液を調製
し、以下の操作を行った。即ち、試料にＰＥＧを含む塩
水溶液１００終１を加え、渦動した後、時間を３．５．
１Ｏ５２０分に変化させて定温放置し、各々５分間遠心
分離した。上澄液を５分間新しい試験管に保管し、沈降
物を溶解液に溶解した。得られた２種の試料溶液中のＤ
ＮＡを各々ニトロセルロース膜に付着させ、更に前記と
同様にＤＮＡプローブとハイブリット形成させ、ニトロ
セルロース膜の放射線量を測定した。得られた結果を下
記第２表に示す。

第２表から明らかな様に、１０分間及び２０分間定温放
置したものには、上澄液からウィルス遺伝子が若干検出
された。この理由はＰＥＧにより、ウィルス粒子が損傷
を受け、ウィルス遺伝子が外部へ出、その結果遠心分離
により沈降せず上澄液に混入するためである。

第２表 （単位二〇ｐ膳） 陽性対照群　　１ｐｇ：　１１２　ｃｐ腸腸性性対照群
４４　ｃｐ腸５０　　：２７８９　　　　　　　　４７
１００　　：５３９８　　　　　　　　５２２００　　
ニア１１３　　　　　　　　５４４００　　　：８３Ｇ
４　　　　　　　　　　　　　　　３８８００　　：９
１Ｇ３　　　　　　　　４８８００　　　：９８４３　
　　　　　　　　　　　　　　５８１０００　　　：９
９８θ　　　　　　　　　　　　　　　４３３、ＰＥＧ
を加え、定温放置した後の、遠心分離時間による回収率 ポリエチレングリコールの最終濃度が５％なるようにＰ
ＥＧを含む塩水溶液を試料に加え、渦動した後、室温で
５分間放置し、１２，０００ｒｐ■で１゜２．３，５，
７．１５分間遠心分離し、得られた沈降物及び上澄液中
のウィルスＤＮＡを前記方法と同様に固相化した後にＤ
ＮＡプローブとハイブリット形成させ、ニトロセルロー
ス膜の放射線量を測定した。得られた結果を以下の第３
表に示す、第３表からも明らかなように遠心時間５分以
上から丑澄液よりウィルスＤＮＡは検出されなくなった
。

４、ニトロセルロース膜への付着率の決定３２個の試料
を用い、本考案の方法によりウィルス遺伝子を分離して
試料溶液を得、ａｘｓｓｃにより飽和されたニトロセル
ロース膜が２枚重ねて装着された８Ｂ−ウェルサクショ
ン器により吸引し、前記方法と同様にウィルス遺伝子を
ニトロセルロース膜に付着せしめ、ＤＮＡプローブとの
ハイブリット形成の後、前記２枚のニトロセルロース膜
の放射線量を測定すると、第２ニトロセルロース膜から
も放射線が検出された。しかし、陽性対照群に対して同
様の操作を行ったところ、第２ニトロセルロースから放
射線が検出されなかった。これは、陽性対照群は他の物
質の汚染がなくＤＮＡだけが存在するために他の物質と
付着競争せず第１ニトロセルロース膜に完全に付着され
るが、試料には、他の物質が含まれており、ウィルスＤ
ＮＡが他の物質との付着競争により第１ニトロセルロー
ス膜に完全に付着されないで流出することによる。従っ
て、血清中に存在するウィルス遺伝子量の真価を決める
ためには、試料に存在するウィルス遺伝子の付着率を求
めなければならない。

本発明はこの付着率を下記の通り実験して求める。

ウィルスＤＮＡを２単位のＤＮＡポリメラーゼＩと各々
１００　μ層のデオキシアデノシン三燐酸（ｄＡＴＰ）
　、　　デオキシグアノシン三燐酸（ｄＧＴＰ）　、デ
オキシチミジン三燐酸（ｄＴＴＰ）及び３２　ｐ−デオ
キシシチジン三燐酸（’２Ｐ−ｄＣＴＰ）　１００ルＣ
３とを混合して室温で３０分間反応させた後、放射線同
位元素により標識されたウィルス遺伝子を含む溶液を分
離した。ＰＥＧ水溶液またはＰＥＧを含む塩水溶液を用
いる本発明の方法により分離された沈降物を溶解したも
のに前記溶液を５μ文ずつ加え、前記方法と同様に固相
化し、固相をβ−カウンティングして得た値と全体放射
線量とを比較し、付着率を求めた。

１００個の試料に対して、上記操作を行い、以下のｉ４
表に示す様な結果を得た。第４表からも明らかなように
、試料によって若干の差異はあるが、平均２５％のウィ
ルス粒子が第１ニトロセルロース膜に付着されることが
確認された。最大付着率は５０％、最小付着率は１７％
であった。

この結果により試料中に存在するウィルス遺伝子量の最
大値、最小値及び平均値を定量することが出来る。即ち
、ハイブリット形成反応されたニトロセルロース膜を切
断し、チェレンコフ（Ｃｅｒｅｎｋｏマ）カウンティン
グして得られた値に、４．２．６を乗することにより平
均値、最小値。

最大値を求められる。

５、ＰＥＧを用いた方法と、プロテイナーゼＫを直接用
いた方法及び超遠心分離による方法との比較 同一試料を使用して、３種類の方法により比較実験した
結果を以下の第５表に示した。該表からＰＥＧを用いた
方法が超遠心分離方法と比較して１．２倍程度、プロテ
イナーゼＫを直接用いた方法と比較して４倍程度の回収
率の増加が認められる。

第５表　　　　　　　　　　　　　　　　　（単位：　
ｃｐｓ）５０　　　：１７４５　　　　　　　　　４５
１００　　　：４５１３　　　　　　　　　４２２００
　　　：８４７？　　　　　　　　　　４３４（１０ニ
ア２１３　　　　　　　　　５２８００　　　：　８４
５８　　　　　　　　３８８００　　　：！３１０８　
　　　　　　　　４７１０００　　　：　９４１Ｂ４４ 本発明の方法を更に効果的且つ容易に実施するためには
、以下の構成のウィルス遺伝子の定性・定着用キットが
有利である。

本発明のキットは８８個の試料を同時に検定することが
出来る。

キットは下記の構成より成る。

１）Ｄ　Ｎ　Ａプローブ（比放射能）１．２Ｘ１０’　
ｃｐｓ／ＩＬｇＤＮＡ） ２）変性液：　ＬＭ　　ＮａＯＨ５ｒａｎ３）中和液：
　ＩＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）及び２．
５Ｍ　　ＮａＣ１２，０ｍｎ ４）ハイブリット形成液１５層文 ５０％　ホルムアミド ５倍濃度のＳＳＣ ３０ｍＭ　　燐酸ナトリウム ０．２％　ポリビニルピロリドン ０．２％　ＢＳＡ ０．２％　蔗糖とエピクロロヒドリンの共重合体（例え
ばフィコール）及び剪断熱 性させた蛙精子ＤＮＡ １　層８７層文 ５）２００倍濃（１）　Ｓ　Ｓ　Ｃ２００ｍｌＢ）１０
％　Ｓ　ＯＳ水溶液　　　　　　　　　　２０ｓＪ１７
）陽性対照液 ８）陰性対照液 ３）ポリビニル　バッグ　　　　　　　　　１枚１０）
ニトロセルロース膜　　　　　　　　　１枚１１）Ｊ紙
（Ｗｈａｔｍａｎ　３ＭＭ　ｐａｐｅｒ）　　　　　　
　４枚１２）９Ｂ−ウェルプレート（９Ｂ−Ｗｅｌｌ　
ｐｌａｔｅ）１３）抽出液＝２０〜４０％のＰＥＧ水溶
液或はＰＥＧを含む塩水溶液　　　　１０〜４０層文１
４）溶解液：　Ｔ　Ｅ　（ｐＨ８，０）、蒸溜水、ｓＤ
ｓ水溶液及びポリオキシエチレンオクチル フェニルエーテル水溶液からなる群 から選択される１種 １５〜６０１文 以下本発明のキットの使用方法を説明する。

小形遠心分離チューブに血清３００ｇ１を加えた後、抽
出液（１３）１００　ｕＬｌを加え、渦動する。室温で
５分間放置し、更に１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分
離した後、上澄液を捨て沈降物を溶解液（１４）にて溶
解する。得られた溶液を５０島文ずつ８８−ウェルプレ
ー）　（１２）の各ウェルに導入し、各ウェルに５０ｐ
Ｊｌの変性液（２）を加えた後、室温で１０分間放置す
る。各ウェルに中和液（３）　　２００％ｌを加え、２
０　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（５）より調整された６ＸＳＳＣに
て飽和されたニトロセルロース膜（１０）が装着された
９８−ウェルサクション器により、１０分間吸引した０
次に、ニトロセルロース膜を出して間風乾した後、８０
℃の真空オーブンで３０分間乾燥し、ポリビニルバッグ
（１９）へ移し、４２℃の水浴であらかじめ熱せられた
ハイブリット形成液（４）　１０層２を加え、１０分間
放置し、更に該バッグ（８）にＤＮＡプローブ（１）を
加える。

Ｇ４２℃で２０時間放置した後、ニトロセルロース膜（
ｌＯ）を２０　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（５）及び１０％Ｓ　Ｏ
Ｓ　（８）にて調整された洗浄液（２ＸＳＳＣ，０，１
％５ＤＳ）２００層文が導入されたプラスチック箱へ移
して室温で１０分間振盪しながら洗浄し、この操作を更
に３回反復する０次に、６５℃に加熱された２０×Ｓ　
Ｓ　Ｃ（５）及び１０％Ｓ　ＯＳ　（１３）により調整
した洗浄液（ＩＸＳＳＣ，０，１％５ＤＳ）５００１交
が入れられたプラスチック箱へニトロセルロース膜（１
０）を移し、６５℃の水浴で４５分間放置しこの操作を
再度反復した。

結果の分析は種々の公知放射線量測定法、例えばニトロ
セルロース膜（１０）をオートラジオグラフィした後、
ウィルス付着部位にあたるフィルムの吸光度を４０５ｎ
ｍで測定し、試料の吸光度に２゜４．６を各々乗して吸
光度の真の最小値、平均値及び最大値を求める。

または、ニトロセルロース膜の試料ＤＮＡ付着部位を切
り出し、チェレンコブ（Ｃｅｒｅｎｋｏマ）カウンティ
ングした後、陽性対照群の計測値とＤＮＡの量を各々対
数（ｌｏｇ）値へ変換して作成した検量線と対比して試
料の遺伝子の量を求める。

以下実施例により本発明を更に具体的に説明する。

（実施例１） 血清中のへパティテス　ビー　ウィルス［ＨＢＶ（ｈｅ
ｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ）　］遺伝子の定量１
）プローブの製造 ＨＢＶの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）陽性血漿を４℃で９．
０００ｒｐ■にて１５分間遠心分離して浮遊物を除去し
た後、　１００，０００ｇで３〜４時間超高速遠心分離
し。

ＨＢＶ本体であるデーン粒子と他の細胞成分を沈降させ
た。該沈降物を緩衝液［１０■Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ文（
ｐＨ７，８）、　０．ＩＭ　ＮａＣ１、ｌ　ｙＩｇｈａ
ｌウシ血清７ルブミン（ＢＳＡ；Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒ
ｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎｓ）　］にて気をつけて懸濁した
後、前記緩衝液にて作った３０％蔗糖クッり曹ンの上に
置き、スピンコ　ニスダブリュー４１（ｓｐｉｎｃｏ　
５Ｗ４１）ロータにより４０，０００ｒｐｓ＋にて４時
間遠心分離した。沈降物を前記緩衝液により再び懸濁さ
せた後、同様の遠心分離操作を反復した。

これを少量の溶解緩衝液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　（ｐＨ７，８）、０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ、　１０．５
％ノニデットーＰ４０（ＨＰ−４０；Ｎｏｎ１ｄｅｔ−
Ｐ　４０．ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテ
ル ｅｔｈａｎｏｌｌにて溶解した後，即時エンドジニアス
ＤＮＡポリメラーゼ活性（Ｅｎｄｏｇａｎｅｏｕｓ　Ｄ
ＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｓ　ａｃｔｉｖ＋ｔｙ）を利
用して，　ＨＢＶ　ＤＮＡを合成した．この時の条件は
４０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ（ｐＨ　７．８）、１６
厘Ｍ　　　ＭｇＣ　　交　２　、　４６膳１４ＮＨ４ｃ
ｌ　　、　０．２ｍＭ　　ｄＮＴＰｓからなる反応液を
使用して３７℃で３〜５時間反応させた．反応が終った
ものからＤＮＡを分離するために溶液へ０．５％ＳＤＳ
、５鳳に　ＥＤＴＡ．ブロテイナーゼＫ（１諺ｇ／腸１
）を各々力■え、２時間反応させた後、フェノール／ク
ロロホルム（１：ｌ）を用いた抽出操作により不純物を
除去し、エタノールにてＤＮＡを沈澱させた。

ＨＢＶ　　ＤＮＡ及びプラスミド（ｐＢＲ　３２２）を
各々制限酵素ＢａｍＨＩにて切断し、ＨＢＶＤＮＡ断片
とｐＢＲ　３２２とを混合した後Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
作用させて組換えＤＮＡを作った．しかる後に組み換え
ＤＮＡを細菌（大腸菌ＨＢ　１０１）に移入し菌株を大
量倍養して、組換えＤＮＡを分離した。

分離された組換えＤＮＡｔ−１％ｇ取り出し、ニー／ク
トランスレーシ璽ン（旧ｃｋ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
）を行った０反応容器中には１０×ニツクトランスレー
シヨン緩衝液５ル立、　３２　Ｐ−ｄＣＴＰ（１００終
Ｉ　Ｃｉ）、ＤＮＡポリメラーゼエ２単位、Ｄ　Ｎａ５
ｅ　Ｉ　　４０ｐｇ及び、組換えＤＮＡ７ｐｇｉ：混合
し、１６℃で１時間反応させた。このように得たＨＢＶ
プローブの比放射能（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒａｄｉｏ　
　ａｃｔｉｖｉｔｙ）は１．８ＸｌＯ＠ｃｐ■／終ｇで
あった・ ２）血清からのＨＢＶ　　ＤＮＡの分離遠心分離チュー
ブ（１，５ｓｉ）に血清３００ＩＬｆＬ及び２０％ポリ
エチレングリコールを含む塩水溶液１００ｕＪＬを導入
して１０秒間渦動した後、室温で５分間放置し、１２，
０００ｒｐｍにて遠心分離して得た沈降物を蒸溜水、Ｔ
　Ｅ　［１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１０ｍＭ　Ｔｒｊｓ−Ｈ
ＣｆＬ（ｐＨ８，０）］　、　１％ＳＤＳ或は１％ＮＦ
４０（ポリオキシエチレンオクチルフィニルエーテル）
等からなる群から選択される１種２００ｋｌにより溶解
して試料溶液として使用する。

３）試料ＤＮＡ固相化 ＤＮＡを付着する前に、２枚の一紙とニトロセルロース
膜を蒸留水に入れ、５分間放置した後ニトロセルロース
膜が２枚のψ紙の上面に位置するように一紙とニトロセ
ルロース膜を８８−ウェルサクション器に装着しておく
。

次に得られた試料溶液を９８−ウェルプレートに各々５
ｅ終文ずつ導入した後にＩ　Ｎ　　ＮａＯＨ５０ｐ　ｌ
を加え、　１０分間振盪し、更にｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−
ＨＣｆＬ（ｐＨ７，５）と２．５　Ｍ　ＮａＣ１とを含
む水溶液２００ＩＬ見を加えた。しかる後に、前記ニト
ロセルロース膜が装着された３Ｂ−ウェルサクション器
により吸引し。

付着させた。ニトロセルロース膜を取出して１０分間風
乾した後、８０℃の真空オーブンで３０分間乾燥　。

し、得られた乾燥ニトロセルロース膜をポリビニルバッ
グに入れて密封し、使用するまで室温で保管する。

４）ハイブリット形成 ニトロセルロース膜が導入されたポリビニルバッグに４
２℃にあらかじめ加熱されたハイブリット形成用液を該
溶液０．１１１／ニトロセルロース膜１ｃｒｎ’＋１　
　膳立となるように加え、４２℃の水浴中にて１０分間
放置した後、比放射能１．４　ＸＩＯ”　ｃｐｓ／ｐｇ
のＤＮＡプローブを加え、２００時間反応せた。

５）洗浄及び固相に残存する放射線量の測定ポリビニル
バッグからニトロセルロース膜を取り出して２ＸＳＳＣ
と、０．１％ＳＤＳを含む水溶液２００ｍｌが導入され
たプラスチック箱に移し、室温で１０分間振盪した後、
前記操作を更に３回反復した。該ニトロセルロース膜を
６５℃にあらかじめ加熱されたｌＸ５ＳＣ及び０．１％
ＳＤＳを含む溶液５００腸文が導入されたプラスチック
箱へ移し、６５℃の水浴内で４５分間放置した後、前記
操作を更に１回反復した。ニトロセルロース膜の放射線
量を以下の２方法にて測定した。

（５−ａ）　　チェレンコブーカウンテイングによる測
定法。

ニトロセルロース膜の試料遺伝子付着部位を切取ってチ
ェレンコブーカウンテイングを３０分間行う、試料中の
ウィルス遺伝子の量は検量線によって求める。検量線は
陽性対照群のＤＮＡの量を対数値に変換した値をＸ軸に
採り、夫々のＤＮＡ量に対応する陽性対照群の計測値か
ら陰性対照群の計測値を減じた値を対数値に変換した値
をＹ軸上に採った点をグラフにプロットし、直線の最小
２乗法（１１ｎｅａｒ　１　ｅａｓｔ　５ｑｕａｒｅ　
ｍｅｔｈｏｄ）によって前記点より直線式を求めた後、
直線式のＹ軸に示される値を指数函数に変換して、検量
線の対数一対数（ｌｏｇ−１ｅｇ）グラフに移して作成
する。試料の測定値を４倍にして平均値を求め、６倍に
して最大値を、２倍にして最小値を求めた後、陽性対照
群と測定する。

Ｘ　＋　（２，７Ｘ　１Ｏ−６）　Ｘ　１３＝粒子の数
／１見（式中、Ｘは試料の計測された値を陽性対照と比
べて得たＤＮＡの量で、その単位はｐｇである）（５−
ｂ）　　オートラジオグラフィを応用した測定法ニトロ
セルロース膜をサランラップ（ＳＡＲＡＮＷＲＡＰ）に
て包んでフィルターに装着し、更に強化スクリーンが入
れられたカセットに装着して、これにＸ線フ゛イルムを
密着せしめ、−７０℃で２０時間放置した。得られたＸ
線フィルムを現像し、ニトロセルロース膜の試料ＤＮＡ
付着部位と密着した部分を切り取り、吸光度計［マルチ
ティータチック（ｍｕｌｔｉ　ｔｉｔｅｒｔｅｋ）］に
より４０５ｎｍでの吸光度を測定する。検量線は上記の
（５−ａ）と同様の方法によって求める。その時、陽性
対照群値は２００゜１００、５０．　　ｌｐｇである４
つの値だけを用いて直線式を求める。試料の各々に４．
６及び２を乗じて真の吸光値の平均値、最大値及び最小
値を求めた。この吸光度と、陽性対照群と比較対照して
試料中の遺伝子量を定量した。

試料のデーン粒子の数は下記の式によって求められる。

Ｘ　＋　（２，７Ｘ　１Ｏ−６）　Ｘ　１３＝粒子の数
／ｌ１ｆｔ（式中、Ｘは前記と同様である。） 該実施例の結果を下記の第６表に示す。

第６表 試　料　　　　ｃｐｓ　　　ＨＢＶ　ＤＮＡ　（１）量
　　デーン粒子（ｐｇ）　　　　（ｔｊじｌ） ＨＢｅＡｇ高力値血清　　７４８５　　　　７１００　
　３．４Ｘ　１１０１ＯＨＢｅＡ中力値血清　　？４５
　　　　３８５　　１．８Ｘ　１１０９ＨＢｅＡ低力値
血清　　１３０　　　　３４　　１．８Ｘ　１１０８Ｈ
ＢｅＡ陰性血清　　　　３２　　　　　　Ｎ　　　　　
Ｎ対照用　　　　ＤＮＡの量（ｐｇ）　　　ｃｐ諺陽性
対照群　１　　　　１　　　　　９４　　　　ＨＢＶＤ
ＮＡ／’　　　　４　　　２００　　　１６４０　　　
　ｔｔ／／　　　　６　　　　ＥＩ　ＯＯ３９８７ｔｔ
陰性対照群 ブレンク 、・さ　、プローブ： ３．３　Ｋｂ（７）　ＨＢＶ　ＤＮＡを精製、比放射能
は１．８×１０”　ｃｐｓ／ＩＬｇである。

ハ　ブリー　ゞ　・： ５０％ホルムアシド、５ＸＳＳＣ，５０ｍＭ燐酸ナトリ
ウム、　０．２％ポリビニルピロリドン、　０．２％ウ
シ血清アルブミン、０．２％フィコール、ｌ■ｇｏａｌ
剪断熱変性させた鮭精子ＤＮＡを含むハイブリット形成
液を用い温度４２℃で２０時間行なう。

汲ｊ： ２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ各々２００層文に室温で１
０分間洗浄、４回実施、ｌＸ５ＳＣ，０，１５０Ｓ５０
ｈ見に６５℃で４５分間洗浄、２回実施。

上記の第６表中、 Ｎは”検出されない“を示し、 −は”存在しない“を示す。

（実施例２） 尿中のサイトメガロウィルス［ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇ
ａｌ。

マ１ｒｕｓ）］遺伝子の定性 ｌ）プローブの製造 ＨＣＭＶ　　ＡＤ　ＩＥＩＩＩ（ＡＴＣＣ）を人体肺繊
維芽細胞で培養してＨＣＭＶを分離した後、ＥｃｏＲＩ
により切断し、ｐＢＲ３２５に組み込んで組換ＤＮＡと
し、（以下、組換ベクトルをｐＢｃＭＶと称する）該組
換ＤＮＡをクローニング（ａｔｏｎｉｎｇ）　シてＨＣ
ＭＶ菌株間の交叉反応を起す組換え菌株を選別し、該菌
株によりクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ）された組換え
ＤＮＡを分離して”　Ｐ−ｄＣＴＰをニックトランスレ
ージ璽ンにより組換えＤＮＡへ挿入させて、ＤＮＡプロ
ーブとして使用した。上記にて得たＣＭＶプローブの比
放射能は１．８Ｘ　１０’　ｃａｐ／ＩＬｇである。

２）尿からのウィルスＤＮＡの分離 患者の尿１ｍｉへ４０％のポリエチレングリコールを含
む塩水溶液３００１Ｌｕを加え、渦動した後。

室温で５分間放置し、更に１２，０００ｒｐｍで遠心分
離し、得られた沈降物を１００　ＩＬ文の水、Ｔ　Ｅ　
（ｐＨ８，０）、１％ＳＤＳ、或はｌＯ％Ｎ　Ｆ　−４
０等で溶解して試料として使用した。

３）試料ＤＮＡの固相化 試料５０ル文を９６−ウェルプレートへ導入した後、夫
々のウェルにＩ　Ｍ　ＮａＯＨを含む溶液５０ｇ１を加
え、１０分間放置した。しかる後に、夫々のウェルに２
００ＪＬｌの中和液を加え、即時８Ｂ−ウェルサクショ
ン器にかけ、１０分間アスピレータを利用してニトロセ
ルロース膜に付着させた。ニトロセルロース膜を出して
、空気中にて放置し、更に８０℃の真空オーブンで３０
分間乾燥させた後ポリビニルバッグに入れて室温で保管
する。

０ハイブリツド形成 ４０℃にあらかじめ加熱されたハイブリット形成用液を
バッグへ導入して密封し、水浴中で１０分間放置した後
、バッグ内にプローブを加え２０時間放置した。

５）洗浄 ２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを含む洗浄液２００腸文が
導入されたプラスチック箱内ヘニトロセルロース膜を移
して室温で１０分間振盪する。この操作を更に３回反復
した。６５℃で予熱されたｌ×ｓｓｃ、０．１％ＳＤＳ
を含む洗浄液５００■交が導入されたプラスチック箱へ
ニトロセルロース膜を移し再度洗浄した。オートラジオ
グラフィを用いる方法或はチェレンコブー力つンティン
グにより結果を得た。

該実施例の結果を下記の第７表に示す。

第７表 ０２ｍ 訪 患者の尿　　　　　　　　　　３４Ｂ ＣＸＶ　ニ感染さし？、ＭＲＣ−５　　　８４３（Ｉ　
Ｘ　１０”細胞） 肢皿１ 陽性対照群　　　　　１４５ＨＣＭＶ　ＤＮＡ（１＋ｗ
ｇ）陰性対照群　　　　　　２１　　正常人の尿ブレン
ク９６ｘＳＳＣＤＨ衝液 組換ベクターＰＢＣＭＶのＥｃｏＲＩ　　断片を精製比
放射能は　１．８Ｘ　１０”　ｃｐｓ／ＩＬｇ公コニ（
１二」Ｌ瓦応： 第１表参照 １萱： 第１表参照 （実施例３） 以下の構成より成るＨＢＶ　　ＤＮＡプローブキットを
作製した。

１）ＤＮＡプローブ（ＨＢＶ）　　（比放射能）１．２
Ｘ　１０”０１１１１１／ＪＬｇ　ＩＩＤＮＡ） ２）変性液：　ＬＭ　　ＮａＯＨ５ｍｌ３）中和液：　
ＬＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆＬ（ｐＨ７，５）＋２．５　
Ｍ　　ＮａＣ！Ｌ２０　ｔＪＬ４）ハイブリー２ド形成
液　　　　　　　　１５１１文５０％ホルムアミド Ｘ５ＳＣ ５０腸に　燐酸ナトリウム ０．２％ポリビニルピロリドン ０．２％ＢＳＡ Ｏ・２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ） １　ｍｇ／ｍ文剪断熱剪断熱変性鮮魚精子ＤＮＡ５）２
０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ２００履文 ６）１０％ＳＤＳ水溶液　　　　　　　　　２０　ｒａ
交７）陽性対照液　　　　　　　　　　　　７個８）陰
性対照液　　　　　　　　　　　　　１個８）ポリビニ
ルバッグ　　　　　　　　　　１個１０）−紙（讐ｈａ
ｔｍａｎ　３ＭＭ　ｐａｐｅｒ）　　　　　　　４枚１
１）ニトロセルロース膜　　　　　　　　　１枚１２）
９Ｂ−ウェルプレート １３）抽出液：２５％のポリエチレングリコールを含む
塩水溶液　　　　　　　　１ＯＩＩ又１４）溶解液：Ｔ
Ｅ緩衝液（ｐＨ８，０）　　　　　２０　ｔａｎ遠心分
離チューブへ３００１Ｌ１の血清を加え、抽出液（１３
）１００　ｇ文を加えた後、渦動した後、室温で５分間
放置した＊　１２，０００ｒｐｍで５分遠心分離した後
、沈降物を出し、溶解液（１４）２００　ｈ　ｌにて解
した後、前記方法によって検定する。

実施例の結果を下記の第８表に示す。

第８表 患者の血清１　３Ｂ１１１２　　１６５０　　　８．９
Ｘ　１０”２　　　１４８　　　　４３　　　　　２Ｘ
１０７３　　１７９８　　　　２１３０　　　　　１．
３Ｘ１０１４　　５３８　　　　５４　　　　　２、Ｅ
ｉＸ　１０”５　　８８８　　　　５９　　　　　２．
８Ｘ　１Ｏａ６　　１９８２　　　　４０８　　　　　
１．１ｌＸ１Ｇ８７８２Ｎ　　　　　　　　　　　Ｎ ８　　　２１２　　　　　１Ｂ　　　　　　７．７Ｘ１
０７９　　　１２８　　　　　３．２　　　　１．５Ｘ
　１０７１０　　１３８　　　　　　Ｇ、８　　　　１
．７Ｘ　１０７１１　　１７５　　　　　７．１　　　
　３．４Ｘ　１Ｇ７１２　　５５７　　　　　５２　　
　　　２．５Ｘ１０”１３　　９１２　　　　　７２　
　　　　３．５Ｘ１０”１４　　８９Ｅｌ　　　　　　
？１　　　　　　３．４Ｘ１０ａ１５　　１５Ｇ　　　
　　　　４．７　　　　２．３Ｘ　１０７１６　　２１
０　　　　　１５　　　　　７．２Ｘ１０７１７　　４
１３０　　　　　４７　　　　　．２．３Ｘ１０ａ１６
　　７４８４　　　２３８０　　　　　　１、ｌＸｌ０
１０１９　　９１６　　　　　７３　　　　　　３．５
Ｘ１０’２０　　　［！１１３　　　２０１０　　　　
　　９．７Ｘ１０９２１　　１０１３８　　　　　８８
　　　　　　４．２Ｘ１０”２２８４Ｎ　　　　　　　
　　　　Ｎ ２３４３Ｎ　　　　　　　　　　Ｎ ２４　　１０９　　　　　　２．８　　　　１．３Ｘ　
１０７陽性対照群＄　　　　１　　９８　　　　ＨＢＶ
ＤＮＡ５　　　　４００　７８９θ 陰性対照群　　　　−３３正常人の血清ブレンク　　　
　　−１１５ｘｓｓｃ緩衝液３．３Ｋ　ｂ　（７）　Ｈ
ＢＶ　ＤＮＡを精製、比放射能は１．８×１０”　ｃｐ
■／井■ ｉ１図表参照 汲」 第１図表参照 （実施例４） 以下の構成より成るＣＭＶ　　ＤＮＡ　　プローブキッ
トを作製した。

１）ＤＮＡプローブ（ＣＭＶ）　　（比放射能）１．２
Ｘ　１０＠ｃｐｓ／ｇｇＤＮＡ） ２）変性液：　ＬＭ　　Ｎａ０）１　　　　　　　　５
　ｍｆＬ３）中和液：　ＩＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ！Ｌ（
ｐＨ７，５）＋２．５　　Ｍ　　　ＮａＣ１２０ｔａｎ
０ハイブリット液　　　　　　　　　　１５　ａｎ５０
％ホルムアミド ＸＳＳＣ ３０ｍＭ　　燐酸ナトリウム ０．２％ポリビニルピロリドン ０．２％ＢＳＡ ０．２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ　４０Ｇ）１　Ｂ／
■文剪断熱変性された蛙精子ＤＮＡ５）２０Ｘ　Ｓ　Ｓ
　Ｃ２００■文 Ｂ）１０％Ｓ　ＯＳ　　　　　　　　　　　　　２０厘
立７）陽性対照液　　　　　　　　　　　　　１個８）
陰性対照液　　　　　　　　　　　　　１個９）ポリビ
ニルＢａｇ　　　　　　　　　　　　　１個１０）ニト
ロセルロース膜　　　　　　　　　１枚ｌｌ）′ｆＪ紙
（Ｗｈａｔｍａｎ　３ＭＭ　ｐａｐｅｒ）　　　　　　
　４枚１２）９８−ウェルプレート １３）抽出液＝４０％のポリエチレングリコールの塩水
溶液　　　　　　　　　４０鳳文 １４）溶解液二ＴＥ緩衝液（ｐＨ８，０）　　　　　２
０腸文使用方法は尿１層文を遠心分離チューブへ入れて
、抽出液（１３）　３００ｐ文を加えた後、渦動した後
、室温で５分間放置した。　１２，０００ｒｐｍで１５
分間遠心分離した後、沈降物を溶解液（１４）　１００
　ＩＬｌにより溶解して前記の方法によって定性した。

該実施例の結果を下記の第９表に示した。

第９表 試　　料　　　　　　　　　　ｃｓ＋ｐ　　　　　　　
検定患者の尿　１１５Ｂ　　　　　陽性 ２１７８　　　　　陽性 ３５４３　　　　　陽性 ４８７８　　　　　陽性 ｓ　　　　　１１９４　　　　　陽性 ６７１４　　　　　陽性 ７８９７　　　　　陽性 ８　　　　３４５２　　　　　陽性 ９４３１　　　　　陽性 １０　　　　３２１　　　　　陽性 ｔｔ　　　　　ｔｔｏ　　　　　陽性 １２　　　　５７Ｇ　　　　　陽性 １３　　　　５７Ｇ　　　　　陽性 １４３２　　　　　陰性 １５　　　　１６４　　　　　陽性 １６　　　　２１３　　　　　陽性 １７　　　　９８４　　　　　陽性 １６　　　　７４０　　　　　陽性 １９３１　　　　　陰性 ２０　　　　１０４１　　　　　陽性 ２１　　　　３３Ｂ　　　　　陽性 ２２　　　　２７５　　　　　陽性 ２３　　　　１１４　　　　　陽性 ２４　　　　１０５　　　　　陽性 陽性対照群　　　　１２４７ｆｔ　　　　ＣＭＶ　ＤＮ
Ａ　１１０００ｐ陰性対照群　　　　　　３８　　　　
正常人の血清組換ベクターｐＢｃＭＶのＥｃｏＲＩ断片
を精製、比放射能は１．８Ｘ　１０・ｃｐ耀／ＩＬ■ユ
土ヱユユエ玉茜： 第１表参照 ａＪ！： 第１表参照 （発明の効果） 以上述べたように、本発明によれば、患者の尿、血清或
は唾液を試料として使ってポリエチレングリコール或は
その塩溶液に加え反応し、遠心分離した後、沈降物を溶
解して分離した後、／＼イブリッド形成させて、ウィル
ス遺伝子を効果的と筒便に分離定性・定量することがで
きる。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中に存在するウィルス遺伝子を定性・定量す
   る方法において、試料にポリエチレングリコールを含む
   水溶液或は塩水溶液から成る抽出液を加え、渦動した後
   に室温で放置し、しかる後に遠心分離して得た沈降物を
   溶解液にて溶解し、更にＤＮＡプローブとハイブリット
   形成させ、得られた結果に付着率を乗じて定性・定量す
   ることを特徴とするウィルス遺伝子の定性・定量方法。
2. （２）前記試料が血清、尿及び唾液から成る群から選択
   される１種であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項に記載のウィルス遺伝子の定性・定量方法。
3. （３）前記試料に前記抽出液を加えた際のポリエチレン
   グリコールの最終濃度が５ｗｔ％以上となることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載のウィルス遺伝子の
   定性・定量方法。
4. （４）前記抽出液と前記試料とを混合した後放置する時
   間が５分間以下であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項に記載のウィルス遺伝子の定性・定量方法。
5. （５）前記抽出液と前記試料とを混合物した後、１２，
   ０００ｒｐｍで５分間以上遠心分離することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載のウィルス遺伝子の定性
   ・定量方法。
6. （６）得られた計測値に付着率である２、４及び６を乗
   じて、試料中ウィルス遺伝子の量を最小値、平均値及び
   最大値として定量することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項に記載のウィルス遺伝子の定性・定量方法。
7. （７）計測値より得られたウィルス遺伝子量を下記の式
   に代入して試料中のデーン粒子数を求めることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載のウィルス遺伝子の定
   性・定量方法。 Ｘ÷（２．７×１０＾−＾６）×＝粒子の数／ｍｌ（式
   中、×は試料の計測された値を陽性対照と比べて得た遺
   伝子の量で、その単位はｐｇである。）
8. （８）血清、尿又は唾液に存在するウィルス遺伝子を定
   性・定量するためキットであって、ポリエチレングリコ
   ールを含む水溶液又は塩水溶液からなり、試料に加えウ
   ィルス粒子を分離沈降するための抽出液と、得られた分
   離沈降物を溶解する溶解液とを含むことを特徴とするウ
   ィルス遺伝子の定性・定量用キット。
9. （９）前記抽出液として２０〜４０％のポリエチレング
   リコールを含む水溶液又は塩水溶液を１０〜４０ｍｌ含
   有することを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の
   ウィルス遺伝子の定性・定量用キット。
10. （１０）前記溶解液としてＴＥ緩衝液［１０ミリモル／
    ｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ミリモル／ｌエチレンジアミン
    四酢酸（ｐＨ８．０）］、蒸留水、ＳＤＳ水溶液及びポ
    リオキシエチレンオクチルフェニルエテール水溶液から
    なる群から選択される１種を１５〜１６ｍｌ含むことを
    特徴とする特許請求の範囲第８項に記載のウィルス遺伝
    子の定性・定量用キット。