KR900005337B1 - 바이러스 유전자의 정성 · 정량방법 및 그의 키트 - Google Patents

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Description

바이러스 유전자의 정성·정량방법 및 그의 키트

본 발명은 시료중에 존재하는 바이러스 유전자의 정성·정량방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.

더 상세히 설명하면 혈청, 오줌 또는 침을 시료로하여, 이 시료에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 수용액 또는 PEG를 함유하는 염용액으로 구성된 추출액을 가하고 정온방치(incubation)하고 원심분리한 후, 분리한 침강물을 현탁하고, 이 용액내의 바이러스 DNA와 DNA-프로우브를 하이브리드 형성시켜 바이러스 유전자를 정성·정량하는 방법 및 이 정성·정량을 위한 키트에 관한 것이다.

종래, 인체나 동물의 발병원인 바이러스의 검정을 위해 통상 사용되어 오고 있는 혈청학적 방법으로는 항원-항체 반응을 이용한 검정방법이 있으나, 이러한 방법은 검출감도, 제조공정 및 검정조작소요 시간 등에 여러가지 문제가 있었다.

이러한 문제의 해결을 도모하기 위해 1970년대 중반부터의 분자 생물학의 발전에 따라 상기 항원-항체반응을 이용한 방법으로 변환한 방법이 다수 제안되어 왔다. 예를들면 DNA 프로우브(probe) 기술, 즉 소정유전자를 백터에 재조합(Recombination)하고 이 백터를 미생물에 이입하여 대량증식한 후, 분취하고 이 백터에 방사성 동위원소나 비방사성 물질을 결합시켜 DNA 프로우브로하고 이것과 시료중에 존재하는 상보적인 유전자를 하이브리드 형성시키는 방법을 들 수 있다. [참조 : Rigby et.al.J.Mol.Biol.l13,237-251(77) : Ward et.al PNAS 80,4045-4049(83) ]

이러한 DNA 프로우브 기술은 연구목적으로 많이 사용되어 왔으나, 1980년대에 들어와서 많은 실용분야에서 응용되고 있다. 그러나 DNA 프로우브 기술을 임상학분야에서 응용하기 위해서는 해결되어야 할 여러가지 문제점을 갖고있다. 현재 추진되고 있는 연구 방향은 하이브리드 형성을 간편히 할 수 있는 방법, 시료중의 유전자를 용이하게 분리할 수 있는 방법, 비방사성 표지 물질의 사용방법, 보다 민감한 프로우브 개발 등에 중점을 두고 있다.

그 예로 아이리 엠.팔바 등[Gene 21, 77-85(83).J.of Clinical Microbiology 18(1), 92-100(83)]이 개발한 샌드위치(sandwich) 방법은 특정 유전자를 2부분으로 분리하고 1부분은 고정상에 붙이고 타부분은 방사성 동위원소로 표지된 DNA 프로우브로 사용하여, 양자를 순차 시료 유전자와 하이브리드 형성시킨 후, 고상에서 반응하지 않은 표지유전자 즉, DNA 프로우브를 제거함으로서 용이하게 시료중의 유전자를 검정할 수 있다.

이 방법에서 표지물질로서 방사성 동위원소로¹²⁵I를 사용할 경우 Υ-카운터에서 고상에 잔존하는 Υ-선량을 측정함으로서 시료중의 유전자의 양이 즉각 측정된다. 한편, 와드 등은 [PNAS 80, 4045-4049(1983)] d UTP(deoxyuraciltriphosphate)에 비오틴(Biotin)이 결합된 것을 다시 특정 유전자에 결합하여 DNA 프로우브로 하고, 이 프로우브와 고상화한 시료 DNA외 하이브리드를 수행한 후 세정한 고상에 아비딘-효소(Avidin-Enzyme), 아비딘-형광염료(Avidin-fluorescent dye)등외 접합자(conjugate)등과 반응시켜 고상의 형광량에 의해 시료중의 유전자를 측정하는 방법을 개발하였으며, 보다 민감한 접합자를 찾고자 연구 중이다.

또한 1982년부터 프로우브를 보다 민감하게 만드는 방법에 대해 연구가 진행되고 있다. 예를 들면, 메싱 등 [N.A.R.9,309-321(81) ; Gene 19, 269-276(52)]은 ㎖3파아지(Phage)를 이용하여 단일가닥 DNA 프로우브(single-stranded DNA Probe)를 만들었으며, 불더 등[J.of Biol.Chem.257,5772-5778(82) ]은 SP 6 전사 프로모터(transcription promoter)를 이용하여 단일가닥 RNA 프로우브를 개발하였다.

그러나 전술한 많은 발전에도 불구하고 DNA 프로우브 기술은 아직 임상학적으로 응용분야를 넓혀가기에는 문제점을 갖고 있다. 즉, 시료로부터 유전자를 용이하게 분리하는 방법의 개발이 요구되고 있다.

예를 들면 에프.보니노 등의 방법[Hepatology 1(5), 386(81)] 제이.스코토 등의 방법[Hepatologr 3(3), 779(83)] 엠.베르닝거 등의 방법[J.of Medical Virology 9. 57(82)] 시.엠.추[Hepatology 5(3), 431(85)]순웬 초우[The New England Journal of Medicine 308(16), 921(83)] 슈 스터 등[Journal of Medical Virology 19, 277(86)] 에스.에이.스펙터[Clinical Chemistry 31, (9) 1514(85)] 등이 사용한 바이러스 유전자의 분리방법들은 임상학적으로 이용하기에는 불가능하다.

상기의 논문에 개시된 바이러스 유전자의 분리방법은 2종류로 대별된다. 즉 혈청과 오줌 또는 침으로부터 바이러스를 분리하고자할 때 초고속 원심분리기를 이용하여 바이러스 입자를 침전시킨뒤 침전물을 나트릅 도데실 설페이트(SDS)와 프로티나제 K로 처리하여 바이러스 입자를 파쇄한 후 페놀/클로로포름(1 : 1)으로 추출하여 수용액 상태의 바이러스 DNA를 분리하는 방법과 혈청내에 직접 SDS와 프로티나제 K를 가하여 혈청내에 있는 바이러스를 1-2시간 동안 파쇄한 후 페놀/클로로포름으로 추출하여 수용액 상태의 바이러스 유전자를 분리하는 방법이다.

이하 종래의 바이러스 유전자의 분리·검정방법을 구체적으로 설명한다.

1) 초고속 원심분리기를 이용한 바이러스 유전자의 분리·검정방법.

1-a) 헐청중에 존재하는 바이러스 유전자의 분리·검정방법.

600μℓ 혈청을 30% 자당쿠션(sucrose cushion) 400μℓ에 가한 후 4℃에서 20,000rpm으로 20시간 초고속 원심분리하여 얻은 침전물을 1mM EDTA, 10mM Tris-HCI(pH 8.0)의 용액 35μℓ에 현탁시키고, 프로티나제 K(1mg/㎖) 5μℓ와 1% SDS 용액 5μℓ를 가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 100mM Tris-HCI(pH 8.0)로 포화된 페놀을 45μℓ 가한 후 약간 흔들어 준 후 실온에서 12,000rpm으로 5분간 원심분리하여 상징액을 분리하여 시료로 사용한다. 96-웰 플레이트(96-well Plate)에 상기의 시료를 50μℓ씩 넣고 1N NaOH 수용액 50μℓ를 의한 후 10분간 진탕한 후 1M Tris-HCI(pH 7.5), 2.5M NaCl의 현탁 200μℓ를 가한 후 즉시 6× SSC(SSC : 0.15M NaCl, 0.Ol5M Na₃Citrate, pH 7.0)로 포화된 니트로셀루로즈막이 장착된 96-웰 석션기(96-well Suction Apparatus)에 가하여 흡인기로 빨아낸다.

니트로셀루로즈막을 공기중에서 15분간 방치하고, 다시 80℃의 진공오븐에서 건조시킨다. 폴리비닐백에 니트로셀루로즈막을 넣고 하이브리드 형성 용액을 가한 후 열융착기(Heat Sealer)로 네 가장자리를 밀봉하고 42℃에서 8시간 이상 방치한다. 그런다음 폴리비닐백의 1곳을 자르고 DNA 프로우브를 가한 후 다시 붙이고 하이브리드 형성을 수행하기 위해 42℃에서 20-24시간 동안 방치시킨다.

반응이 완료된 후 하이브리드 반응된 니트로셀루로즈막을 꺼내어 고농도 용액과 저농도 용액으로 세척한 후 풍건하고 오토래디오그래퍼로 교잡반응된 바이러스 유전자를 검정하는 방법이다.

1-b) 오줌에 존재하는 바이러스 유전자의 분리·검정방법.

오줌 10㎖를 SW-28 rotor로 20,000rpm에서 1시간 원심분리한 후 침강물을 DNA 용해 완충액[0.1M NaCl, 10mM Tris-HCl. 10mM EDTA(pH 8.0)]에 현탁시키고, SDS, RNase, 프로티나제 K를 포함하는 용액을 가하여 바이러스 입자를 파쇄하고 페놀/클로로포름으로 추출한 후 수용액층의 바이러스 유전자를 에탄올로 침강시킨다.

상기의 침전물을 적당량의 TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)으로 용해시켜 시료로 사용한다.

전술한 1-a)와 같이 시료 유전자를 고정상에 붙이고 DNA 프로우브와 하이브리드 형성 반응을 수행하여 결과를 오토래디오그래피로 검정한다.

1-C) 침에 존재하는 바이러스 유전자의 분리·검정방법.

등장염용액으로 목을 씻은 용액을 20,000rpm(Sorvall SS24)에서 2시간 초고속 원심분리하고 침전물을 용해 완충액[3% sarcosyl(N-도데실 살코실산 나트륨) 0.075M Tris-HCl(pH 8.0) 0.025M EDTA(pH 8.1)] 200μℓ에 현탁하여 100μg/mℓ 프로티나제 K를 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 페놀/클로로포름으로 추출한 후 수용액층을 시료로 사용한다.

전술한 1-a)와 같이 시료 유전자를 고정상에 붙이고 DNA 프로우브와 하이브리드 형성 반응을 수행하여 오토래디오그래피를 수행하였다.

2) 직접 프로티나제 K를 이용한 혈청중의 바이러스 유전자의 분리방법.

혈청 300μℓ에 프로티나제 K(10mg/㎖)가 들어 있는 SDS 칵테일[25mM NaAc(pH 7.5), 2.5mM Na₂EDTA 0.5% SDS, 12.5μg/㎖ 전단된 청어 정자 DNA, 25μg/㎖ 이스트 t-RNA] 100μℓ를 가하고에서 1시간 반응신킨 후 물로 포화된 페놀 400㎖를 가하여 흔들어 준 후 클로로포름/이소아밀 알코올(24/1) 400μℓ를 다시 가하여 흔들어 주고 실온에서 15분간 12,000rpm으로 원심분리하여 하층의 유기용매를 제거한 다음, 다시 클로로포름 400μℓ를 가해 진탕한 다음 실온에서 12,000rpm에서 5분간 원심분리하고 상징액을 분리하여 시료로 사용하였다.

전술한 1-a)와 같이 시료 유전자를 고상화하고 DNA 프로우브와 하이브리드 형성을 수행하여 니트로셀루로즈막을 오토래디오그래피하여 검정한다.

전술한 바와같이 2가지 바이러스 유전자의 분리 방법 모두 많은 시간과 복잡한 과정을 요할 뿐만 아니라 고가의 장비와 시약을 요하므로 임상학적 적용이 거의 불가능한 상태이다. 또한 전술한 방법에서 사용된 SDS나 프로티나제 K가 시료중의 단백질과 비특이적인 반응을 하기 때문에 반응후 바이러스 유전자의 회수율이 매우 낮고, 또한 유기용매 추출시 바이러스 유전자가 손실 있기 때문에 시료중의 바이러스 유전자를 정량할 수 없다.

유전자 추출물을 DNA 프로우브와 하이브리드 형성을 수행하여 정량하고자 할 때 시료로되는 DNA를 고상화할 필요가 있다. 이때. 통상 사용되는 고상 및 프로우브로서는 니트로셀루로즈막, 진 스크린(gene screen), ABM 지 (m-aminobengyl-loxymethyl paper) DBM 지 (diazobenzyloxymethylpaper)와 제타-프로우브(zeta-probe)를 예로 들 수 있는데 이들 고정상은 단백질, 단일가닥 DNA 그리고 단일가닥 RNA에 모두 친화성을 갖고 있어서 고정상에 유전자만 부착되는 것이 아니라 유전자 추출물에 섞여 있는 단백질도 부착되기 때문에 한정된 공간에서 유전자와 단백질 사이의 부착경쟁이 생겨서 추출물에 존재하는 유전자의 손실을 야기시킨다. 이러한 문제도 시료 유전자를 정량화할 수 없는 이유가 된다.

본 발명자들은 이러한 여러가지의 단점을 제거하고자 예의 연구한 결과, 바이러스 입자의 외피가 단백질, 다당류(polysaccharide)등으로 이루어져 있으며, 이러한 것들은 폴리에틸렌글리콜에 의해 염석되어 침전된다는 성질을 이용하여 바이러스 유전자를 효과적이고 간편하게 분리 및 정성· 정량할 수 있는 방법을 개발하게 되었다.

본 발명의 목적은 시료로부터 바이러스 유전자를 간편하게 분리하고 분리유전자의 부착율을 구하여 시료 유전자를 정성·정량하는 방법 및 그의 키트를 제공하는데 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 방법은 PEG 수용액 혹은 PEG를 함유하는 영수용액을 추출물로서 사용하고 시료로부터 바이러스 입자를 응집 침강시킬 수 있는 것을 특징으로 한다. 전기에서 PEG를 함유하는 염수용액으로서는 염화나트륨, 염화마그네슘, 황산암모늄 및 인삼칼륨 등을 사용할 수 있다.

또한 바이러스 입자를 침강시킬 때, 시료중에 존재하는 타물질도 모두 침강시키기 때문에 이 침강물을 시료로서 사용하고, 고상에 부착한 경우, 바이러스 DNA의 고상으로의 부착율을 구하지 않으면 안된다. 방사성 동위원소를 표지물질로하는 DNA 프로우브를 사용하여 분리된 바이러스 DNA의 고상에의 부착율을 구하면 평균 25%이었다. 따라서 하이브리드 형성후의 결과에 4를 곱하여 양성대조군과 비교하여 정량하여야 한다.

이하 본 발명을 단계별로 나누어 구체적으로 설명한다.

1. PEG 최종 농도 결정.

PEG최종농도를 1,2,3,4,5,6,7,10%(W/V)되도록 PEG 수용액 또는 PEG를 함유하는 염수용액을 환자의 혈청,오줌 또는 침에 가하고 간단히 와동(渦動, vortex)시킨 후 5분간 실온에서 방치한 다음 실온에서 12,000rpm으로 5분간 원심분리한다. 상징액을 채취하여 새로운 튜브에 보관하고 침전물을 현탁액으로 현탁시키고 양자를 변성액으로 변성시킨 뒤 중화액으로 중화시키고 시료로 했다.

이렇게 얻어진 2종의 시료용액을 6×SSC로 포화된 니트로셀루로즈막이 장착된 96-웰 석션기에 가하여 시료가 완전히 흡인된 것을 확인한 후 니트로셀루로즈막을 꺼내 풍건하고 80℃의 진공오븐에서 30분 동안 건조시킨다. 42℃로 가열된 하이브리드 형성액을 플리비닐백에 하이브리드 형성액 0.1㎖/니트로셀루로즈막 1c㎠로 되도록 도입하고 다시 1㎖의 하이브리드 형성액을 가하고, 이 백을 밀봉하고 42℃에서 10분간 반응시키고 다시 백내에 DNA 프로우브를 도입하고 42℃에서 20시간 하이브리드 형성을 시켰다. 니트로셀루로즈막을 고농도 용액(2×SSC, 0.1% SDS)으로 실온에서 10분간 4회 세척하고 저농도용액(1×SSC, 0.1% SDS)으로 65℃에서 45분간 2회 세척한 후 풍건하고 오토래디오그래피하였다. 얻어진 결과를 하기표 1에 나타냈다.

표 1에서 나타난 바와같이 PEG의 죄종농도가 5% 이상에서부터는 상징액에서 바이러스 입자가 검출되지 않는 사실을 알 수 있다.

[표 1]

2. PEG를 가한 후의 정온방치 시간 결정.

PEG의 최종농도가 5% 되도록 PEG를 함유하는 염수용액을 조제하고 아래 조작을 수행했다. 즉 PEG함유하는 염수용액 100μℓ를 가하고 와동한 후 시간을 3분, 5분, 10분, 20분으로 변화시키면서 실온에서 방치하고 12,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 상징액을 새로운 튜브에 보관하고 침강물을 용해액에 녹인 것에 변성액을 가하고 중화액으로 처리한 후, 각각 상기 1방법에 따라 니트로셀루로즈막에 부착시키고 하이브리드 형성과 하기 표 2에서 명백한 바와같이 오토래디오그래피를 수행하였다. 10분과 20분 정온방치 시킨 시료에서는 상징액에서 바이러스 유전자가 약간 검찰되었다. 이러한 이유는 PEG에 의해 바이러스 입자가 손상을 받아서 바이러스 유전자가 바깥으로 나와 원심분리할 때 침강이 않된 채로 상징액에 혼입되어 있기 때문이다.

[표 2]

3. PEG를 가하고 정온방치 시킨 후 원심분리 시간에 따른 회수율.

폴리에틸렌글리콜의 최종농도가 5% 되도록 시료에 PEG에 함유하는 염수용액을 가하고 약간 와동한 후 길온에서 5분간 방치시키고, 12,000rpm에서 1,2,3,5,7,15분으로 원심분리 시간을 변화시키면서 원심분리한 침강물 및 상징액 중의 바이러스 DNA를 전기방법과 같이 고상화 한 후 DNA 프로우브와 하이브리드 형성시켜 니트로셀루로즈막의 방사선양을 측정했다. 얻어진 결과를 하기 표 3에 나타낸다. 표 3에서 명백한 바와 같이 원심분리 시간이 5분이상에서부터 상징액에서 바이러스 DNA는 검출되지 않았다.

[표 3]

4. 니트로샐루로즈막애외 부착율의 결정.

32개의 시료를 사용하여 본 발명의 방법에 따라 바이러스 유전자를 분리하여 시료용액을 얻고 6×SSC에 의해 포화된 니트로셀루로즈막이 2매 중첩되게 장착된 96-웰 석션기에 의해 흡인하고, 전기 방법과 동일하게 바이러스 유전자를 니트로셀루로즈막에 부착시키기 위해 DNA 프로우브와 하이브리드 형성후, 전기 2매의 니트로셀루로즈막의 방사선량을 측정하면 제 2니트로셀루로즈막에서도 방사선이 검출되었다. 그러나 양성대조군에 대해서 동일 조작을 행한 바, 제 2니트로셀루로즈막에서는 방사선이 검출되지 않았다.

이것은 양성대조군은 다른 물질의 오염이 없고 DNA만이 존재하기 때문에 다른 물질과 부착 경쟁을 하지않고 제 1니트로셀루로즈막에 완전히 부착되었으나, 시료에는 다른 물질이 함유되어 있으며, 바이러스 DNA가 다른 물질과 부착경쟁에 의해 제 1니트로셀루로즈막에 완전히 부착되지 않고 빠져나간다. 따라서, 혈청중에 존재하는 바이러스 유전자의 참값을 구하기 위하여는 시료에 존재하는 바이러스 유전자의 부착율을 구하지 않으면 안된다.

본 발명에서는 부착율을 다음과 같이 실시하여 구하였다.

바이러스 유전자를 DNA 폴리머라제 I 2U와 100μ M dATP, dTTP, dTTP,32p-dCTP 100μ Ci 및 40pg DNAse I를 섞어 실온에서 30분간 반응시킨 후 방사성 동위원소로 표지된 바이러스 유전자를 분리하고 PEG 수용액 또는 PEG를 함유하는 염수용액을 이용한 본 발명의 방법에 의해 분리된 추출물에 5μℓ씩 가하여 전술한 방법과 동일하게 고정상에 부착시킨 후 β-카운팅하여 제 1니트로셀루로즈막에서의 방사능 양과 전체 방사능 양을 비교하여 부착율을 구하였다.

100개의 시료에 대하여 상기 조작을 행하고 하기 표 4에 나타난 결과를 얻었다.

표 4에서 명백한 바와 같이 시료에 따라 약간의 차이는 있으나 평균 25%의 바이러스 입자가 제 1니트로셀루로즈막에 부착된 것이 확인되었다.

최대 부착율은 50%, 최소부착율은 17%이었다.

위의 사실로부터 시료내에 존재하는 바이러스 유전자의 양을 최대치, 최소치, 평균치 값으로 정량할 수 있다.

즉, 하이브리드 형성 반응된 니트로셀루로즈막에서 시료 유전자가 부착된 부위를 칼로 자르고 체렌코브(Cerenkov) 카운팅하여 측정 값에 인자 4,2,6를 곱하여 양성대조군과 비교하여 시료의 평균값, 최소값, 최대값을 구할 수 있다.

[표 4]

5. PEG를 사용하는 방법과 프로티나제 K 직접 사용한 방법과 초고속 원심분리방법의 비교.

동일한 시료를 사용하여 3가지 방법으로 비교실험한 결과를 하기 표 5에 나타냈다.

이 표에서 PEG를 사용한 방법이 초고속 원심분리방법에 비해 1.2배정도, 프로티나제 K를 직접 사용한 방법에 비해 4배 정도의 회수율이 증가함을 알 수 있다.

[표 5]

본 발명의 방법을 더욱 효과적으로 간략하게 실시하기 위하여 바이러스 유전자의 정성·정량용 키트를 만들었다.

본 발명의 키트는 88개의 시료를 동시에 검정할 수 있다.

키트의 구성은 다음과 같다.

1) DNA 프로우브 [비방사능(specific activity) 1.2×10⁸cpm/μg DNA]

2) 침전액 : 20∼40%의 폴리에틸렌 글리콜 수용액 또는 PEG를 함유하는 염수용액 10∼40㎖

3) 현탁액 : TE 완충액(pH 8.0)증류수, SDS 수용액 및 폴리에틸렌 옥틸 페닐에테르 수용액으로 구성된 군에서 선택된 1종 15∼60㎖

4) 변성액 : 1N NaOH 5㎖

5) 중화액 : 1M Tris-HCl(pH 7.5) 및 2.5M NaCl 20㎖

6) 하이브리드형성액 15㎖

50% 포름아미드

5×SSC

50mM 인산나트륨

0.2% 폴리비닐 피롤리돈

0.2% BSA

0.2% 피콜(Ficoll : 자당의 비이온성 합성 폴리머)

1mg/㎖ 전단된 연어정자 DNA(sheared salmon sperm DNA)

7) 20×SSC 200㎖

8) 10% SDS 수용액 20㎖

9) 양성대조액

10) 음성대조액

11) 폴리비닐백 1개

12) 니트로셀루로즈막 1개

13) 여과지(Whatman 3MM Paper) 4장

14) 96-웰 플레이트

본 발명의 키트의 사용방법

소형 원심분리 튜브에 혈청 300μℓ를 넣고 추출액 100μℓ를 가하고 와동한다. 실온에서 5분간 정치하고 5분간 12,000rpm으로 원심분리한 후 상징액을 버리고 침강물을 현탁액으로 현탁한 다음 추출물 50μℓ를 96-웰 플레이트에 가하고 각 웰에 50μℓ의 1N NaOH 수용액를 가한 후 실온에서 10분간 방치한다. 각 웰에 중화액 200μℓ를 가하고 6×SSC로 포화된 니트로셀루로즈막이 장치된 96-웰 석션기에 각 시료를 가한 후 흡인기로 10분간 빨아낸다.

니트로셀루로즈막을 꺼내 풍건한 후 80℃ 진공오븐에서 30분간 건조한 후 폴리비닐백에 옮겨 42℃ 수욕에 10분간 방치하고 백에 프로우브를 가하여 42℃에서 20시간 동안 방치하여 하이브리드 형성 반응을 수행한다.

2×SSC, 0.1% SDS의 용액 200㎖가 들어 있는 플라스틱 상자에 니트로셀루로즈막을 옮겨 실온에서 10분간 흔들어 주면서 세척하고 이 조작을 3회 더 반복한다.

65℃로 예열된 1×SSC 0.1% SDS의 용액 500㎖가 들어 있는 플라스틱 상자에 니트로셀루로즈막을 옮겨 65℃ 수욕에서 45분간 정치시킨다. 이 조작을 1회 더 반복한다.

결과 분석은 오토래디오그래피한 후 405nm에서 흡광도를 측정한 후 시료의 흡광도 간에 2,4,6을 각각 곱하여 최소값, 평균값, 최대값을 각각 구한다.

또한 니트로셀루로즈막의 각 웰에 해당하는 부위를 자르고 체렌코브 카운팅한 후 양성대조군의 계측 값과 DNA의 양을 각각 로그(log)값으로 변환시켜 표준곡선을 그린 후 시료의 계측값에 2,4,6을 각각 곱해 최소값, 평균값, 최대값을 각각 구하여 그래프상에서 시료중의 바이러스 유전자의 양을 구한다.

[실시예 1]

혈청중의 헤파타이티스 비 바이러스의 정량:

1) 프로우브의 제조.

HBsAg 양성혈장을 4℃에서 9000rpm으로 15분간 원심분리하여 부유물질을 제거하고 100,000g에서 3∼4시간 초고속 원심분리하여 댄 입자(Dane particle)와 다른 세포성분을 침전시킨다.

이를 다시 완충용액[10mM Tris-HCI (pH 7.6), 0.1M NaCl, 1mg/㎖ Bovin Serum Albumine]에 조심스럽게 현탁시킨 후 상기의 완충용액으로 만든 30% 자당쿠션 위에 얹고 spinco SW41

로타로 40,000rpm에서 4시간 동안 원심분리한다. 침전물을 상기 용액에 다시 현탁시킨 후 동일한 과정을 반복한다. 이를 소량의 완충용액 [10mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.1M NaCl, 10.5% Nonident-P

(옥틸페닐에틸렌옥시드 축합체) 40, 0.1%-mercaptoethanol]에 녹인 즉시 HBV의 엔도제니우스 DNA 폴리머라제 활성(Endogeneous DNA Polymerase activity)을 이용하여 HBV DNA 이중가닥 중에서 한가닥에 있는 갭(gap)을 채운다. 이때 40mM Tris-HCl(pH 7.6), 16mM MgCl₂, 46mM NH₄Cl, 0.2mM dNTPs로 구성된 반응용액을 사용하며 37℃에서 3-5시간 반응시킨다. 반응이 끝난 용액중의 DNA를 분리해 내기 위해 용액에 0.5% SDS, 5mM EDTA 프로티나제 K(1mg/㎖)를 각각 가하고 2시간 동안 방치시킨 후 페놀/클로로포름(1:1)을 사용하여 단백질을 추출 제거하고 수용액층의 DNA를 에탄올로 침전시켜 완전한 이중가닥의 HBV DNA를 얻었다.

HBV DNA를 제한 효소(restriction enzyme) BamHI으로 절단하고 pBR 322 백터의 BamHI 부위에 T4 DNA 리가제(ligase)로 HBV DNA를 삽입시키고, E. coli HB 101에 형질전환(transformation)시켜 형성된 재조합 균주를 대량 배양한 후 재조합 백터를 분리하였다. 분리된 재조합 DNA를 1μℓ 취해 니크 트랜스레이션(Nick translation)을 수행하였다. 반응용기내에 l0x니크 트렌스레이션 완충용액 5μℓ, 32p-dCTP 100μℓ Ci, DNA 폴리머라제 I 2U, DNase I. 40pg, HBV DNA 1μℓ, 100μM 콜드(cold) dNTPs 4μ를 넣고 증류수로 총량을 50μℓ로 맞추고 16℃에서 1시간 반응시켰다.

이렇게하여 얻은 HBV DNA 프로우브의 비방사능은 1.8x10⁸cpm/μg DNA 이었다.

2) 혈청중의 HBV의 DNA 분리

원심분리 튜브(1.5㎖)에 혈청 300μℓ를 가하고 20% 폴리에틸렌글리콜 염용액 100μℓ를 가하여 10초간 와동한 후 실온에서 5분간 정치하고 12,000rpm으로 원심분리하여 얻은 침전물을 증류수, TE 완충액(pH 8.0), 1% SDS 또는 1% NP4O중에서 선택한 1종의 용해액 200μℓ에 용해시켜 시료로 사용하였다.

3) 니트로셀루로즈막에 시료 바이러스 DNA의 부착

니트로셀루로즈막과 2장의 여과지를 증류수에 담근 상태로 5분간 방치한 후, 니트로셀루로즈막이 위로 오고, 2장의 여과지가 아래로 오도록 96-웰 석션기상에 장착시킨다. 분리된 시료를 96-웰 플레이트에 각각 50μℓ씩 가한 후 1N NaOH 50μℓ를 가하여 10분간 진탕기에서 흔들어준 후 1M Tris-HCl(pH 7.5)+2.5M NaCl의 용액 200μℓ를 가하여 중화시키고 니트로셀루로즈막이 장착된 96-웰 석션기에 가하고 10분간 흡인하여 시료중의 바이러스 유전자를 니트로셀루로즈막에 부착시킨다.

니트로셀루로즈막을 꺼내 풍건한 후 80℃의 진공오븐에서 30분간 건조한 후 폴리비닐 백에 넣어 봉한 후 사용하기전까지 실온에서 보관한다.

4) 하이브리드형성

폴리비닐 백에 유전자가 부착된 니트로셀루로즈막을 넣고 42℃로 예열된 하이브리드형성 용액을 0.1㎖/㎠+1ml 되도록 가한 후 42℃의 수욕에서 10분간 방치시킨 후 HBV DNA 프로우브(비방사능이 1.8x10⁸cpm/μg DNA 임)을 가하여 20시간 동안 반응을 수행한다.

5) 세척 및 고상에 잔존하는 방사성 량의 측정

폴리비닐 백으로부터 니트로셀루로즈막을 꺼내 2×SSC. 0.1% SDS의 용액 200㎖가 들어 있는 플라스틱 상자에 옮겨 실온에서 10분간 진탕시킨 후, 위의 조작을 3회 반복한다. 65℃로 예열된 1×SSC, 0.1% SDS의 용액 500㎖가 들어 있는 플라스틱 상자에서 니트로셀루로즈막을 옳기고 65℃의 수욕에서 45분간 정치한 후 위의 조작을 1회 반복한다. 니트로셀루로즈막을 꺼내 2가지 방법으로 분석하였다.

6) 방사선양의 측정 및 정량 분석방법

6-a) 체렌코브-카운팅에 의한 정량분석

니트로셀루로즈막의 시료 유전자가 부착된 부위를 잘라서 30초간 체렌코브 카운팅을 수행한다. 시료중의 바이러스 유전자의 양은 후술의 방법에 의해 설정한 표준곡선을 이용하여 구한다. 표준곡선은 양성대조군의 DNA 양을 로그값으로 치환하여 X값으로 하고, 각각의 DNA 양에 상응하는 양성대조군의 cpm 값에서 음성대조군의 cpm 값을 뺀 값을 로그값으로 치환, y값으로 하여 직선의 최소 2승법(linear least square method)에 의해 직선식을 표준곡선을 작성한다. 시료의 측정간에 4를 곱하여 평균값을 구하고, 6을 곱하여 최대값을, 2를 곱하여 최소값을 구한 다음 양성대조군의 측정값과 비교하여 정량한다. 시료의 댄 입자의 수는 다음과 같은 공식에 의에 구할 수 있다.

(식중 X는 시료의 측정 값을 양성대조군과 비교하여 얻어진 DNA의 양, 단위는 pg)

6-b) 오토래디오 그래피.

니트로셀루로즈막을 사란랩

(SARAN WRAP)으로 싼후 필터에 붙이고 강화스크린(intensifying screen)이 있는 카세트에 다시 붙이고 X-레이 필름을 넣어 -70℃에서 20시간 방치한 후 현상하여 96-웰 플레이트에 맞게 자른 후 멀티 타이터 택(multi titer tek)으로 405nm에서 흡광도를 측정한다. 표준곡선은 상기의(6-a)에서와 동일한 방법으로 구한다. 이때 양성대조군 값은 25,50,100,200pg의 4개의 값만 사용하여 직선식을 구하게 된다. 시료의 흡광도 간에 각각 4, 6, 2를 곱해 평균값, 최대값, 최소값을 구하고 양성대조군의 흡광도 값에 비교하여 정량한다. 시료의 댄 입자수는 다음의 공식에 의해 구할 수 있다.

(X는 전술한 바와 같다)

실시예 1에 의한 결과를 하기 표 6에 나타낸다.

[표 6]

표지된 프로우브 :

3.3Kb의 HBV DNA를 정제, 비방사능은 1.8×10⁸cpm/μg이다.

하이브리드 반응 :

50% 포름아미드,. 5×SSC, 50mM 인산나트륨, 0.2% 폴리비닐피폴리돈, 0.2% 소혈청 알부민, 0.2% 피콜, 1mg/㎖ 전단열변성된 연어정자 DNA을 함유하는 하이브리드 형성액을 사용하여 온도 42℃에서 20시간 행한다.

세정 :

2×SSC, 0.1% SDS 각각 200㎖에 실온에서 10분간 세정, 4회실시, 1×SSC, 0.1 SDS 500㎖에 65℃에서 45분간 세정, 2회실시.

상기 표 6에서, N은 "검출되지 않음"을 나타태고, -은 "존재하지 않음"을 나타낸다.

[실시예 2]

오줌중의 시토메가로 바이러스[(CMV(cytomegalo virus)]유전자의 정성 :

1) 프로우브의 제조

HCMV AD 169(ATCC)를 인체 폐섬유 아세포(human lung fibroblasts)에서 배양하여 HCMV를 분리하고, HCMV DNA를 제한효소 EcoRl으로 절단하여 pBR 325의 EcoRl 부위에 크로닝(cloning)하고(이하, CMV DNA의 재조합 백터를 pBCMV로 칭함) HCMV 균주간의 교차 반응을 일으키는 재조합 균주를 선별하여 32p-dCTP를 니크 트랜스레이션으로 재조합 백터에 삽입시켜 프로우브로 사용한다.

이렇게하여 얻은 CMV DNA 프로우브의 비방사능은 1.8x10⁸cpm/μg DNA이다.

2) 오줌중의 CMV의 DNA분리

환자의 오줌 1㎖에 40%의 폴리에틸렌 글리콜 염용액 300μℓ를 가하고 간단히 와동한 후 실온에서 5분간 정치한 후 12,000rpm으로 원심분리하여 얻은 침강물을 100μℓ의 물 또는 TE 완충액(pH 8.0), 1% SDS, 10% NP-40 등으로 현탁하여 시료로 사용한다.

3) 니트로셀루로즈막에 시료 바이러스 DNA의 부착 시료 50μℓ를 96 웰-플레이트에 가한 후 50μℓ 1N NaOH를 가하여 10분간 방치한 후 200μℓ 중화액을 가한 후 즉시 96 웰-석션기에 가하여 아스피레이터를 10분간 사용하여 시료중의 바이러스 유전자를 니트로셀루로즈막에 부착시킨다.

니트로셀루로즈 막을 꺼내 공기중에서 방치하고, 80℃의 진공오븐에서 30분간 건조시킨 후 폴리비닐 백에 넣어 실온에서 보관한다.

4) 하이브리드형성

40℃로 예열된 하이브리드형성 용액을 니트로셀루로즈막이 들어있는 폴리비닐 백에 넣고 수욕에서 10분간 방치한후 DNA 프로우부를 가하고 20시간 방치하여 하이브리드 형성반응을 수행한다.

5) 세척

2×SSC, 0.1% SDS의 용액 200㎖가 들어 있는 플라스틱 상자에 하이브리드 형성된 니트로셀루로즈 막을 옮기고 실온에서 10분간 진탕한다. 이 조작을 3회 더 반복한다.

65℃로 예열된 1×SSC, 0.1% SDS의 용액 500㎖가 들어 있는 플라스틱 상자에 니트로셀루로즈 막을 옮겨 65℃에서 45분간 방치하고 이 조작을 1회 더 반복한다.

세척된 니트로셀루로즈 막을 오토래디오 그래피 또는 체렌코브 카운팅하여 결과를 얻을 수 있다.

실시예 2의 결과를 하기 표 7에 나타낸다.

[표 7]

표지된 프로우브

재조합 백터 pBCMV의 EcoRI 단편을 정제

비방사능은 1.8×10⁸cpm/μg

하이브리드 반응 :

표 1참조

세척 :

표 1참조.

[실시예 3]

혈청중의 헤파타이티스 비 바이러스의 정량 :

혈청중의 HBV의 유전자 양을 다음의 키트를 사용하여 정량한다.

HBV DNA의 정량용 키트

원심분리 튜브에 넣고 혈청 300μℓ를 가한 후 침전액 100μℓ를 가하여 간단히 와동한 후 실온에서 5분간 방치한다. 12,000rpm으로 5분간 원심분리한 후 상징액을 버리고 침전물을 용해액 200μℓ으로 녹여준 후 전술한 방법에 따라 검정한다.

상기의 키트는 88개의 시료를 동시에 검정할 수 있다.

실시예 3의 결과를 하기 표 8에 나타낸다.

[표 8]

표지된 프로우브 :

3.3Kb의 HBV DNA를 정제, 비방사능은 1.8×10⁸

cpm/μg

하이브리드 반응 :

표 1 참조

세척 :

표 1 참조.

[실시예 4]

오줌중의 시토메가로 바이러스의 정성 :

오줌중의 CMV의 유전자 양을 다음의 키트를 사용하여 정성한다.

CMV DNA의 정성용 키트

사용방법은 오줌 1㎖를 원심분리 튜브에 넣고 침전액 300μℓ를 가한 후 약간 와동한 후 실온에서 5분간 방치한다. 12,000rpm으로 15분간 원심분리한 다음 상징액을 버리고 침전물을 TE 완충액 100μℓ에 용해하여 전술한 방법에 따라 검정한다. 실시예 4의 결과를 하기 표 9에 나타낸다.

[표 9]

표지된 프로우브 :

재조합 백터 pBCMV의 EcoRI 단편을 정제, 비방사능은 1.8×10⁸cpm/μg

하이브리드 반응 :

표 1 참조

세척 :

표 1 참조.

Claims (10)

1. 시료중에 존재하는 바이러스 유전자를 정성·정량하는 방법에 있어서, 시료에 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 수용액 또는 염수용액으로된 침전액을 가하고, 와동한 후에 실온에서 방치한 후에 원심분리하여 얻은 침강물을 현탁액으로 현탁하고, DNA 프로우브와 하이브리드 형성시켜 얻어진 결과에 부착율을 곱하여 정성·정량하는 것을 특징으로 하는 바이러스 유전자의 정성·정량방법.
2. 제1항에 있어서, 전기시료가 혈청, 오줌 또는 침인 것이 특징인 방법.
3. 제1항에 있어서, 전기시료에 전기 침전액을 가할 때의 폴리에틸렌 글리콜의 최종농도가 5중량% 이상으로 되게하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 전기 추출액과 시료를 합한 후에 방치한 시간이 10분 이하인 것이 특징인 방법.
5. 제1항에 있어서, 전기 침전액과 시료를 혼합한 후 12,000rpm에서 5분 이상 원심분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 얻어진 계측치에 부착율인 2,4 및 6을 곱하여, 시료중의 바이러스 유전자의 양을 최소치, 평균치 및 최대치로서 정량함을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 계측치로부터 얻어진 바이러스 유전자 량을 하기식에 대입하여 시료중의 댄입자를 구하는 것을 특징으로 하는 방법.

   X÷ (2.7×10^-6)×13 = 입자의 수/㎖

   (식중, X는 시료의 계측된 값을 양성대조군과 비교하여 얻어진 DNA의 양이며, 그 단위는 pg이다)
8. 혈청, 오줌 또는 침에 존재하는 바이러스 유전자를 정성·정량하는 키트에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 수용액 또는 영수용액으로 되고, 시료에 가하여 바이러스 입자를 분리 침강하기 위한 침전액과, 얻어진 분리 침강물을 현탁하는 현탁액을 함유하는 것을 특징으로 하는 바이러스 유전자의 정성·정량용 키트.
9. 제8항에 있어서, 전기 침전액으로서 폴리에틸렌 글리콜의 최종 농도가 5-10% 함유하는 수용액 또는 염수용액을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
10. 제8항에 있어서, 전기 용해액으로서 TE 완충액[10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH 8.0)], 증류수, SDS 수용액 및 폴리에틸렌 옥틸 페닐에테르 수용액으로된 군에서 선택된 1종을 15-l6㎖ 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.