JPS63187157A - 抗原抗体反応の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は抗ｌ抗体反応の測定方法に関する。

（従来の技術と発明が解決しようとする問題点）従来ラ
テックス等の不溶性担体粒子に担持させた抗体または抗
原を抗原または抗体と液体媒体中で反応させ、その反応
の進行に伴う反応混合物の透過上の減少、すなわち吸光
度の増加からその抗原抗体反応の速度を測定し、その速
度から検体中の抗！または抗体の濃度を定量する方法が
知ちれている。（特公昭ｊＪ−／／１７ｊ号公報記載）
この方法により抗原または抗体の濃度を高い精度で迅速
に定置できる。

しかしながら、この方法では感度の点で数ｎｇ／−程度
の濃度までしか信頼しうる測定値を得ることができず、
生長ホルモン、インスリン、ジゴキシン等のさらに高感
度の測定を必要とする項目については必ずしも満足でき
るものではなかった。また従来のラテックス等の不溶性
担体粒子を利用した測定方法においては血清中等の抗原
または抗体を測定する際に反応系中に存在する共存物質
の影響を受けやすいという欠点を有していた。

（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らはより低濃度の抗原又は抗体の測定を
可能にし、反応系の共存物質の影響を受けない測定方法
を見い出すべく鋭意研究を行った結果、本発明に到達し
たものである。

すなわち、本発明の要旨は、固相に担持させた抗体また
は抗原と液体溶媒中に存在する抗Ｉまたは抗体とを反応
させた後に液体溶媒を除去し、ついで、溶出液を添加し
固相に担持している抗体または抗原に反応している抗Ｗ
または抗合物を含有している溶出液全抗原抗体反応に適
したｐｎ条件に調整後、抗体または抗原を担持した不溶
性担体粒子を分注して反応させ、その反応混合物の凝集
の度合を光学的に透過光または散乱光の強度変化あるい
は目視でとらえることを特徴とする抗原抗体反応の測定
方法に存するＱ 以下、本発明の詳細な説明する。本発明方法においては
固相に担持させた抗体または抗原を液体媒体中で対応す
る抗原または抗体と反応させた後に固相と液体溶媒とを
分離し、液体溶媒を除去する。

次いで、溶出液を加え、固相と反応した抗原または抗体
あるいはその混合物を溶出させる。

その後に溶出液から固相を除去する。次にこの溶出液を
抗原抗体反応に適したｐｎに調製後、抗体または抗ｉｔ
担持させた（感作させた）ラテックス等の不溶性担体粒
子と反応させ、反応混合物の凝集の度合を光学的にまた
は目視によって測定する。

本発明に用いられる固相としては、ラテックス、磁性ラ
テックス等の有機高分子物質あるいはガラス、金属、シ
リカ、シリカ−アルミナのような無機酸化物等が挙げら
れる。その形態としては、粒状、板状等が通常採用され
る。

本発明において測定物および反応物となる抗原としては
例えば蛋白質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂
質、花粉等様々のものが挙げられる。また、抗体として
は、例えば上記した抗原に対する抗体である蛋白質が挙
げられる。

固相への抗体または抗Ｗを担持させる方法は常法による
ことができる。

すなわち、被検体中の抗Ｗまたは抗体と反応しうる抗体
または抗原を物理的に吸着させるか、もしくはカップリ
ング剤等を用いて化学的に結合させてもよい。抗体また
は抗ｒｆ　ｋ担持した（感作させた）固相と液体媒体中
の抗原または抗体との反応は、その種類によっても異な
るがよく攪拌させた後、通常約５分〜３０分で行なわれ
る。反応の温度は室温で反応を行なうのが通常であるが
、時間を短縮するために３θ℃〜ψＯ℃程度で反応させ
てもよい。

液体媒体中の抗Ｗまたは抗体と反応した固相と液体媒体
との分離、抗原及び抗体を溶出した後に溶出液中から固
相を除去する方法は、固相の種類によって異なるが、例
えば、固相がラテックスの場合は遠心分離の方法を、又
、磁性ラテックスを用いた場合は磁石を用いて磁性ラテ
ックスを沈降させ分離する方法等、使用する固相に適し
た分離方法全選択しうる。また、粒径が大きく、比重が
大きいものについては固相全自然に沈降させる等、特別
の分離方法を用いず分離をすることが可能である。

固相に担持された抗体または抗原と反応している抗原ま
たは抗体を溶出させる溶出液としては最も一般的にはＯ
，，２Ｍグリシン／ＨＣ１緩衝液（ｐＨｒ、３〜３．０
）が使用される。その他、リン酸−クエン酸（］）Ｈ，
！、Ｊ’　）、／Ｍプロピオン酸、ｊ　Ｍ　Ｎａ５ＯＮ
（ｐＨ７，ｊ　）　　等が利用さレル。溶出液量は、特
に制限されないが、濃縮効果をもたせるためには、測定
する液体媒体の液量よシ少なくするのが好ましい。この
液量は希望する製法 縮倍尤によって〆められる。溶出させる反応時間は通常
約！分〜２ｏ分で平衡に達する。

抗原または抗体を溶出した後、固相を前述の分離手段で
溶出液中から除去した後、抗原または抗体を含む溶出液
をたとえばトリスアミノメタン緩衝液によＬｐＨ’に通
常６〜りに調整する。

シ、通常０．０θ／重量％以上、好ましくはＯ６θｌ〜
ノ重量％程度の不溶性担体粒子の懸濁液として用いる。

この不溶性担体粒子に抗体または抗Ｗｔ感作し、これを
上′記のｐｇ　＆〜り程度に調整した溶出液中の抗原ま
たは抗体と凝集反応させる。凝集の度合は光学的に透過
光または散乱光の強度変化として定量的にとらえること
ができる。また、スライド上で溶出液中の抗Ｗまたは抗
体と不溶性担体粒子に担持された抗体または抗ｉｔ反応
させ、その凝集の度合を視覚的にとらえることもできる
。

上記の方法によシ、測定液体媒体よシ目的とする抗原ま
たは抗体を濃縮するとともに測定液体媒体と目的とする
抗原または抗体？分離することによシ、測定液体媒体中
に含まれる共存物質の影響を受けることなく、予め濃度
既知の試料よシ作製した抗原または抗体の検量線を用い
て、測定液体媒体中の抗原または抗体の濃度を精度よく
測定することができる。

（実施例） 以下、実施例によシ本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はその要旨を超えない限ｐ以下の実施例に限定され
るものではない。

実施例１ 血清中の微１ＡＦＰ（アルファ１フエト　プロティン）
の測定 固相として平均粒径θ、７ｍｍの磁性ラテックス（ロー
ヌプーラン社製）を用いた。

まず１％Ｖ、ＡＪ磁性ラテックスに只ｈｙＰ＊ａ作する
。試験管内にＡＦＰ陽性検体２　Ｊ　０１ｉｔと１％Ｖ
／Ｖ　ａ　Ａ　Ｆ　Ｐ　磁性ラテックスグθμｔ２分注
し、約１分間攪拌する。攪拌Ｉ約ｌθ分→尋掌４後試験
管の壁面に磁石を置き、ＡＦＰ　　と凝集反応したラテ
ックスを集める。溶媒とラテックスが完全に分離したの
を確認した後、上清ｔｉｔ　　− 除去する。次に水３θθ−を試験管に加え、攪拌し、再
び磁石によシラテックスを集め、上清を除去し洗浄を行
なう。試験管の壁に残ってい　・る凝集したラテックス
’１ｐＨＪ、Ｊグリシン−ＨｏＩ　緩衝液／ＤＯμｔｔ
加え、よく攪拌、分散させ、ＡＰ’Ｐ　　抗原を溶出さ
せる。溶出し終った磁性ラテックスを磁石によシ集め、
上清／ＤＯμｔｆ反応セルに分注し、緩衝液！０μｔ１
安定化液１ｉｏａｌ（三菱化成工業株式会社、免疫測定
装置”ＬＰＩＡ　／ＤＯ”用ＡＦＰ測定用）を混合し、
その後免疫測定装置”ＬＰＩＡ　１００”（三菱化成製
）ａＡＦＰラテックスμθμｔ２分注し、攪拌して、反
応速度全測定する。図７に反応速度ＶとＡＦＰ濃度との
検量ｆｆ１Ｊを示す〇（発明の効果） 本発明方法によれば現在、ラテックス等の不溶性担体粒
子による免疫測定方法で測定することが不可能であった
検体中の微量の抗原または抗体を測定可能な濃度に濃縮
することにより、これを測定可能にし、また、検体中の
共存物質に影響されない高精度の分析を行うことができ
る。

【図面の簡単な説明】

図７は、実施例１で得られた検量線（反応速度ＶとＡＦ
Ｐ濃度の関係）を示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）固相に担持させた抗体または抗原と液体溶媒中に
   存在する抗原または抗体とを反応させた後に液体溶媒を
   除去し、ついで、溶出液を添加し固相に担持している抗
   体または抗原に反応している抗原または抗体あるいはそ
   の混合物を溶出させ、溶出液と固相とを分離し、溶出し
   た抗原または抗体あるいはその混合物を含有している溶
   出液を抗原抗体反応に適したｐＨ条件に調整後、抗体ま
   たは抗原を担持した不溶性担体粒子を分注して反応させ
   、その反応混合物の凝集の度合を光学的に透過光または
   散乱光の強度変化、あるいは目視でとらえることを特徴
   とする抗原抗体反応の測定方法。
2. （２）固相が、ラテックス、磁性ラテックス、ガラス、
   金属、シリカ及びシリカ−アルミナから選ばれることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）溶出した抗原または抗体あるいはその混合物を含
   有する溶出液をスライド上で抗原抗体反応に適したｐＨ
   条件に調整し、凝集反応をスライド上で行ない視覚的に
   抗原または抗体あるいはその混合物を半定量することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。