JPS6317841B2 - - Google Patents

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JPS6317841B2
JPS6317841B2 JP52057512A JP5751277A JPS6317841B2 JP S6317841 B2 JPS6317841 B2 JP S6317841B2 JP 52057512 A JP52057512 A JP 52057512A JP 5751277 A JP5751277 A JP 5751277A JP S6317841 B2 JPS6317841 B2 JP S6317841B2
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biologically active
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JP52057512A
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Biipuritsuheru Kurisutofu
Ruuche Ryuudeigaa
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MATSUKUSU PURANKU G TSUA FUERUDERUNKU DERU UITSUSENSHAFUTEN EE FUAU
Original Assignee
MATSUKUSU PURANKU G TSUA FUERUDERUNKU DERU UITSUSENSHAFUTEN EE FUAU
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Filing date
Publication date
Application filed by MATSUKUSU PURANKU G TSUA FUERUDERUNKU DERU UITSUSENSHAFUTEN EE FUAU filed Critical MATSUKUSU PURANKU G TSUA FUERUDERUNKU DERU UITSUSENSHAFUTEN EE FUAU
Publication of JPS52140588A publication Critical patent/JPS52140588A/ja
Publication of JPS6317841B2 publication Critical patent/JPS6317841B2/ja
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    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的活性物質と共有結合し得る担
持材又はマトリツクス物質の製法に関する。本発
明はその上生物学的活性物質、特に酸素と結合し
得る少なくとも１個の反応性基を有する担持材物
質及び又担持材物質と結合している生物学的活性
物質を含有するエイジエントにも関する。
本明細書中に使用されるいくつかの用語の定義
は以下の様である： “担持材”は反応体例えばセルロース、アガロ
ース、デキストラン等である。実際に担持材は、
少なくとも１個の遊離NH2又はOH基を含有す
る。しかし担持材がこれらの基を含有しない場合
には予備反応においてこれらを付与することが出
来る。
“結合剤”は直接又は間接に担持材との結合を
形成し得る物質で、生物学的活性物質が担持材に
結合する様な仕方で生物学的活性物質と結合する
ことも出来る。結合剤と生物学的活性物質との間
の結合は縮合反応によつて形成することが出来
る。
“カツプリング剤”は常に担持材との直接結合
を形成する物質である。従つてこれは“結合剤”
であり得る。通常結合剤とカツプリング剤のいず
れかが２個の反応性基を有することが出来る。
“スペーサー”は一般に反応可能の基を２個又
は数個含有する化合物で、一方でカツプリング剤
又は担持材との結合を、又他方で結合剤との結合
を形成することが出来る。スペーサーの役割は担
持材と結合剤との間の距離を増し、それによつて
立体障害を防止することである。
“担持材物質”は少なくとも１個の担持材と１
個の結合剤を含有する鎖を表わす。しかし同鎖は
又スペーサー、又はカツプリング剤とスペーサー
とを含有することも出来る。この様な形式で形成
される鎖中で反応可能の基のそれぞれが結合剤、
カツプリング剤又はスペーサーの反応性基と反応
して鎖を形成する。
“反応可能の基”は求核性試薬、特にヒドロキ
シル基又はアミノ基である。“反応性”基は反応
可能の基と容易に付加反応又は縮合反応し得る物
質の反応基である。
“生物学的活性”物質は生物学的物質自体又は
生物学的物質と相互作用し得る物質のことであ
る。例えば蛋白質、酵素等であることも出来る
し、又は酵素の基質を構成する有機又は無機物質
であることも出来る。
“エイジエント”は生物学的活性物質を含有す
る担持材物質のことである。
ヒドロキシル基を含有する担持材、特に多糖類
例えばセルロース又はデキストラン及びアガロー
スが、アミノ基又はヒドロキシル基を含有する生
物学的活性物質と結合し得るように活性化される
ことは公知である。例えばアガロ−スゲルはアル
カリの存在下で臭化シアンで活性化され得て蛋白
質及び別の生物学的物質と結合出来る様になる。
しかしその結合効果は十分安定でない。安定度が
様々に異なる多くの結合系が開発されている。担
持材物質は使用直前に製造されなければならな
い。すなわち貯蔵性がない。正確な転化に関する
いくつかの理論が発表されているが、適確な説明
はまだない（メソーズ イン エンチモロギー
（Methods in Enzymology）34巻13〜30頁）。
別の公知法によれば、担持材と生物学的活性物
質との間のカツプリングは２個以上の反応性基を
含有する結合剤を用いて行うことが出来る。例え
ばセルロースは塩化シアヌルにより活性化され、
それにより生成した担持材物質は化学的に活性な
クロライド基を付与され、同基が蛋白質と反応す
ることが出来る。この方法の欠点はシアノクロラ
イドが敏感な生物学的活性物質の変性をもたらす
ことである（ネイチヤー（Nature）1967年216巻
514〜515頁）。
アガロースがジビニルスルホンとカツプリング
出来ることも公知である。生成した担持材物質は
生物学的活性物質例えば蛋白質と温和な条件下に
付加反応が可能で、収率は良好である。しかし結
合は非常に弱く、そのためエイジエントが結合し
た蛋白質を非常に速やかに分離させる（上記のメ
ソーズ イン エンチモロギー）。
アガロースとビスオキシランとの反応で担持材
物質を製造することも公知である。生成した担持
材物質は蛋白質と安定な結合を形成する。しかし
この結合を達成するためにはPH条件は極端でなけ
ればならず、従つて生物学的活性物質の様な敏感
な物質は破壊される危険がある（上記のメソーズ
イン エンチモロギー）。
他の高分子との相互作用を増す目的で高分子を
結合するためには担持材物質からの距離は相互作
用に必要な空間を備えるために十分大きくあるべ
きである。この距離はスペーサーとして定義され
る安定な中間化合物により必要程度に橋かけされ
得ることは公知である。例えばアガロースは臭化
シアンにより活性化され、同生成物がスペーサー
として作用する延長鎖長のジアミンと結合するこ
とは公知である。遊離基はサクシニル化され、カ
ルボキシル基はＮ−ヒドロキシ−サクシニミド及
びジシクロヘキシルカルボジミドにより活性化さ
れる。化学的出費は相当して大きい。反応の間の
調整は困難である。大規模の反応の場合にはそれ
は実際上実行不可能である（ビオケミストリー
（Biocnemistry）1972年11巻2291〜2299頁）。
本発明は生物学的活性物質が他の生物学的物質
とのその相互作用能力を不利に影響されることの
ない様な仕方で不溶性担持材と結合することを可
能ならしめる担持材物質を提供するものである。
詳細に言えば本発明は高率で共有結合された酵素
を含みかつ以下の様な特性を有するエイジエント
を提供するものである： (a) 100℃までの耐熱性 (b) 機械的に安定、耐圧縮荷重性 (c) 低流動抵抗性 (d) 非イオン性 (e) 親水性 生物学的活性物質例えば酵素と担持材との結
合は以下の条件をみたすべきである； (f) ３〜11のPH値範囲において加水分解に対して
非常に安定であること (g) 担持材の性質の影響が出来るだけ少ないこと (h) 非常におだやかな条件（水溶液、中性のPH範
囲）下で達成されること (i) 特定条件で行われること (j) 担持材とのカツプリングにより酵素効果に妨
害がないこと (k) 酵素と高分子基質との間の相互作用が立体的
に障害を受けないこと。
必ずしも上記の特性のすべてが達成されてはい
ないある一定の出願は存在する。しかし実際上す
べての敏感性酵素及び高分子共反応体を有する酵
素にとつて上記(a)〜(k)項に記載の特性が同時にみ
たされることが重要である。
本発明による担持材物質の製法は無水担持材
を、無水溶剤中で強塩基触媒の存在下でイソシア
ナート又は仮装イソシアナートと反応させ、生じ
る担持材物質を単離することを特徴とする。本発
明の根本思想は操作工程を非連続的に行うことで
ある。換言すれば最初に担持材物質を製造し、こ
れを単離する。担持材物質の製造自体も非連続的
に作業が行われる。各工程の後で中間生成物を、
例えば過により、単離する。結合剤のみを使用
する場合には一作業工程のみである。カツプリン
グ剤及びスペーサーと一緒に作業する場合には多
くの作業工程となる。結合剤、カツプリング剤、
スペーサー並びにこれらの物質を種々組合せて使
用するあらゆる可能な作業法において上記物質の
組成をその都度の使用目的に所望される性質に応
じて選び、この観点から所望の担持材物質を工程
毎に製造する可能性が与えられる。
すなわち担持材は上記の(b)及び(c)項の特性を決
定するものである。又結合剤とカツプリング剤と
は大体において(f)、(g)、(h)、(i)及び(j)項の特性を
決定する。スペーサーは大体において(k)項の特性
を決定する。その他の特性は担持材、結合剤、カ
ツプリング剤等の組合せによつて影響を受ける。
従つて生物学的活性物質を直接結合剤を介して担
持材に結合する可能性がある。しかし又立体障害
を防止し、生物学的活性物質が担持材物質に結合
した場合その効果を高めるために、結合剤をスペ
ーサー及びカツプリング剤を介して担持材と結合
させることも可能である。
担持材としては有機天然物質例えばセルロー
ス、アガロース、デキストラン等を使用すること
が出来る。更に合成重合担持材、例えば誘導アク
リルアミドも試みられている。又無機担持材例え
ばガラスも該当する。担持材を選択する場合には
以下の様な変動要因も考慮に入れなければならな
い。重要なことは担持材の肉眼的形状で、例えば
球形、真珠形、繊維形で、例えば綿等として又は
顆粒状物等として使用することが出来る。真珠形
の場合には更に変動要因としての粒径及び有孔度
が関係してくる。その場合上記の変動要因に応じ
て外表面において多く結合させるか又は物質の内
部においても付加的に結合を生じさせる可能性が
生じる。粒径の大きい場合には被覆密度は一般に
小さい。被覆密度というのは一般にエイジエント
物質の単位容量当りに結合する生物学的活性物質
の量のことである。有孔度は大体において機械的
安定性及び耐圧安定性に影響を及ぼす。この性質
を特に重視する場合には有孔度の小さい又は無孔
物質を担持材として使用するのがよい。担持材物
質の流動抵抗は担持材の肉眼的形状及び粒径に依
存する。
結合剤及び又カツプリング剤を選択する場合担
持材の性質を出来るだけ変化させない様にするこ
とが肝心である。すなわち担持材物質を不利に変
化させ得る副反応の生起が出来るだけ少ない様に
選択を行わなければならない。従つてイソシアナ
ートを用いて作業する場合は担持材が一方では無
水であり又他方では無水状態で作業を行う様に留
意することは自明である。すなわち有機溶剤を使
用する。非プロトン極性溶剤例えば環状エーテル
例えばTHF（テトラヒドロフラン）、ジオキサン
が特に有利であることが実験において確められ
た。非プロトン溶剤としてはアセトニトリル、ジ
メチルホルムアミド、ホルムアミドも非常によく
適する。溶剤の除去のためには、すなわち分離作
業のためには沸点が出来るだけ低い、つまりほぼ
100℃以下の沸点のものが有利である。
カツプリング剤としては有利に芳香族又は脂肪
族ジイソシアナートが使用される。カツプリング
剤は出来るだけ疎水性でないものであるべきであ
る。つまり脂肪族ジイソシアナートは出来るだけ
短鎖のジイソシアナートを選ぶべきで、これは飽
和されていても又は不飽和のものでもよい。芳香
族ジイソシアナートは出来るだけ疎水基の少ない
ものであるべきである。特に適当なジイソシアナ
ートは以下のものである： トルオール−２，４−ジイソシアナート、トル
オール−２，６−ジイソシアナート、トルオール
−２，４−と２，６−ジイソシアナートとの市販
混合物、エチレンジイソシアナート、エチリデン
ジイソシアナート、プロピレン−１，２−ジイソ
シアナート、シクロヘキシレン−１，２−ジイソ
シアナート、シクロヘキシレン−１，４−ジイソ
シアナート、ｍ−フエニレンジイソシアナート。
多くの担持材の反応性基はその反応性が緩慢で
あるから触媒が使用される。これは強塩基、特に
ナトリウムイミダゾリンであることが出来る。又
ポリウレタン化学の有機金属触媒も該当する。被
覆密度は触媒量により調節される。カツプリング
剤又は結合剤は常に過剰量が使用される。５〜10
倍の過剰量を使用することも多い。反応は室温と
その都度の溶剤の沸点の間の温度において行われ
る。例えば担持材として粒径が約10〜50μｍの微
孔性真珠形状物を使用する場合には、被覆密度25
〜200μモル／ml嵩容量が達せられる様に反応を
調節すると良結果が得られる。試薬の過剰分を無
水溶剤、有利には次の反応がその中で行われる溶
剤、で洗出して反応は終了する。
スペーサーとしては少なくとも２個の反応性基
を有する物質が使用される。２個の反応性基を有
するものを使用する場合には直鎖が生成する。反
応性基が２個よりも多い物質を使用する場合には
分枝が生じる。スペーサーとしては特に芳香族又
は脂肪族飽和又は不飽和ジアミン、アミノアルコ
ール又はジオールが適する。スペーサーとして使
用される物質は疎水基を出来るだけ含有すべきで
ないことは自明である。２個の反応性基を有する
短鎖飽和脂肪族化合物は良結果をもたらす。鎖が
延長されるべき場合には低分子量のポリエチレン
グリコールを使用することが必要である。それに
よつて長い脂肪族鎖の疎水作用が避けられる。不
飽和脂肪族又は芳香族ジオール又はジアミンは、
固定しているかないしは撓曲性の殆どないスペー
サー機能を有し、そのため後でそこに添合される
生物学的活性物質が支えを受けずに保持され担持
材物質への添合状態が弛やかであるという特別な
利点を提供する。従つて物質のバツクフオールデ
イングが避けられる。被覆密度を高め得る分枝の
場合にも同様のことが言える。
スペーサーとして特別に適する物質が数多く試
みられた。その中いくつかの有利な例を以下に挙
げる： ジアミン：エチレンジアミン、テトラメチレンジ
アミン、１，５−ジアミノ−３−アザペンタ
ン、ｍ−フエニレンジアミン等。
アミノアルコール：エタノールアミン、１−アミ
ノ−２−ブテン−４−オール（１−アミノ−２
−ブテノール−４）；３−アミノシクロヘキサ
ノール、ｐ−アミノフエノール等。
ジオール：エチレングリコール、グリセリン、ブ
タンジオール−１，４；２−ブテンジオール−
１，４、ヒドロキノン、レゾルシン、フロログ
ルシン等、低分子量のポリエチレングリコール
留分。
スペーサーの１個の反応性基のみがカツプリン
グ剤と反応することを確実にするために、スペー
サー物質は大過剰量で、有利には10倍の量で使用
される。触媒は一般に不要である。しかし弱塩基
例えばトリエチルアミンを使用することも出来
る。溶剤、温度及び反応生成物の精製は上記と同
様に行う。
スペーサーを使用する場合にはこれと生物学的
活性物質との間にやはり結合剤を使用する。結合
剤も２個の反応性基を有するものである。結合剤
としては上記にカツプリング剤の例として挙げた
ものと同じ物質を使用することが出来る。カツプ
リング剤の選択標準と同じことが言える。しかし
スペーサーの反応性基は担持材の反応性基よりも
反応緩慢度がより少ないから触媒の選択によつて
は結合剤をスペーサーとのみ反応させることが出
来る。その様な触媒としては非プロトン弱塩基例
えばトリエチルアミンが使用される。反応は高過
剰量の結合剤の存在で実施される。この場合にも
溶剤、温度及び単離に関して上記と同様のことが
言える。過剰分の物質を洗出した後で溶剤を蒸発
除去し、それによつて例えば粉末状態で貯蔵出来
る担持材物質が生成する。つまりこの担持材物質
は通常その末端にイソシアナート基を有する。し
かしこれは必ずしも必要なものではない。又生物
学的活性物質が添合された時末端が再び分離され
ることを可能とする様な不活性化剤を末端として
もよい。
その様な化合物は“仮装イソシアナート”と称
される。その場合不活性化剤は有機溶剤中で使用
される。得られた生成物は同じ様にして単離ない
しは貯蔵することが出来る。
生物学的活性物質とのカツプリングの際に不活
性化剤は生物学的活性物質と交換される。不活性
化剤としてはチオフエノール、フエノール誘導
体、例えば２，４−ジニトロフエノール、ヒドロ
キシルアミン誘導体、例えばＮ−ヒドロキシサク
シニミド、環状アミン、例えばベンズイミダゾー
ル、又は類似の物質が該当する。
イソシアナート及びジイソシアナートの例にお
いて示した作用機構はもちろん他のカツプリング
剤及び結合剤にも及ぼすことが出来る。結合剤又
はカツプリング剤の別の反応性基としてはハロゲ
ン化アシル、活性エステル、イソチオシアナー
ト、スルホクロリド、クロルホルマート等が該当
する。
生物学的活性物質のカツプリングは非常に簡単
に行われる。適当な溶剤中の生物学的活性物質の
溶液中に担持材物質を混入撹拌する。生物学的活
性物質を非プロトン有機溶剤中に溶かした場合特
に高い被覆密度を達成することが出来る。その場
合には副反応は生じない。これはなかんずく抗生
物質の様な物質の場合にあてはまる。酵素及び他
の蛋白質は一般に水溶液中でのみ使用可能であ
る。その場合には副反応としてイソシアナートの
加水分解が生じる。しかしそれにも拘わらず生物
学的活性物質のアミノ基は水よりもずつと速くイ
ソシアナートと反応するから高い被覆密度が達成
される。酵素及び他の蛋白質の水溶液は緩衝され
なければならない。緩衝剤としては反応性基を含
有しないすべての緩衝物質が適する。燐酸塩緩衝
剤、イミダゾール緩衝剤及びグード（good）の
緩衝液を用いた場合良結果が達成された。PH値は
中性〜弱アルカリ性であるべきである。６〜10の
PH範囲内において良結果が達成された。結合反応
は室温又は冷温において行われる。閉じられた結
合は非常に強固である。テストされたあらゆる酵
素において漏れは確認されなかつた。得られた物
質、つまり生物学的活性物質を添合された担持材
物質は付加的なイオン基を含有しない。
約20種の酵素を担持材物質に結合させた。その
中には感度が大きいために従来その固定が不可能
であつたものも含まれた。テストされたすべての
酵素が活性形で担持材物質に結合した。これは本
発明方法が一般に適用可能であることを示すもの
である。
又カツプリング剤として２個の反応性基を有す
る結合剤を使用することが出来、その場合イソシ
アナートが同反応性基の中の１個又は有利には両
方であることが出来る。又はジイソシアナートを
結合剤として又カツプリング剤として用いること
も出来、スペーサーを少なくとも２個の反応可能
の基例えば特にアミノ基及び／又はヒドロキシル
基を有する物質から構成することも出来る。生成
する結合は常に安定である。
その他被覆密度を増すために、結合剤として使
用される２個以上のジイソシアナートを少なくと
も３個の反応可能の基特にアミノ基及び／又はヒ
ドロキシル基を含有する物質を介してカツプリン
グ剤と結合させることも可能である。
本発明方法のある実施形式においては固有の結
合効果を生じさせるために不活性化剤を用いて担
持材物質のイソシアナート基の反応性を減少させ
ることが望ましい。水溶液中で蛋白質又は酵素が
担持材と結合する場合これは特に有利である。そ
れというのもこれによつてイソシアナートの加水
分解速度が著しく減少されるからである。
本発明方法は活性化担持材物質を工業的に製造
される化学薬品を用いて大量生産することを可能
にし、従つて比較的安価である。活性化担持材物
質は無水状態で安定であり、遊離−NH2基又は
−OH基を含有する生物学的活性物質と水中又は
有機溶剤中で共有結合する。物質の生物学的活性
は結合過程の間保持され、又担持材物質が生物学
的活性の立体障害を起す危険はスペーサーの中間
カツプリングにより効果的に避けられる。同共有
結合は化学的に安定である。担持材の性質、特に
その有孔度、移動率及び融点は活性化の方法によ
り影響を受けない。本発明方法は固定酵素を製造
する場合特に有利であり、連続式反応器中で特に
価値のあるエイジエントが生成される。
本発明方法の別の特徴によれば生物学的活性物
質と結合するための１個又は複数個の反応性基を
有し同反応性基の中少なくとも１個がイソシアナ
ート基である担持材及び結合剤を含有する担持材
物質が製造される。
生物学的活性物質、特に酵素、を固定化するた
めの担持材物質の特性は少なくとも１個の反応性
基を有すること及びこの反応性基がイソシアナー
ト基であることである。反応性イソシアナート基
がスペーサーを介して担持材と結合し、スペーサ
ーと担持材との間にカツプリング剤が存在してい
る条件が、後から結合する生物学的活性物質の効
率を最適にするために特に有利である。このカツ
プリング剤は２個の反応性基−有利にこの中の１
個又は２個はイソシアナートである−を有する結
合剤であることが出来る。イソシアナートが反応
可能の基と反応することにより専ら置換ウレタン
又は置換尿素が得られる。
本発明の更に別の特徴によれば生物学的活性物
質のアミノ基が担持材物質と結合して置換尿素を
形成するように担持材物質と結合している生物学
的活性物質を含有するエイジエントが製造され
る。
本発明の更に別の特徴によれば生物学的活性物
質のヒドロキシル基が担持材物質と結合して置換
ウレタンを形成する様に担持材物質により固定さ
れている生物学的活性物質を含有するエイジエン
トが製造される。
本発明による担持材物質及びエイジエントの例
を次に列記する。
１ 生物学的活性物質を結合することができかつ
イソシアネート基を使用する、担持材と結合剤
とから成る担持材物質の合成例 （1a） 担持材への結合をイソシアネート基
により行なう：担持材例えばセルロースを臭
化シアンで活性化し、フエニレンジアミンと
反応させる。生じる化合物をホスゲンと反応
させてイソシアネートを生ぜしめ、これによ
り生物学的活性物質と反応可能の反応性基が
得られる（第１式参照）。
（1b） 生物学的活性物質と担持材との結合
をイソシアネート基を用いて実現させる：担
持材として使用するアガロースを結合剤（こ
の場合β−イソシアネートプロピオン酸−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル）と反
応させる。この結合剤は２個の反応性基、す
なわちそれぞれ１個のイソシアネート基並び
に活性化エステルを含む。イソシアネート基
は担持材に結合し、活性化エステル基は生物
学的活性物質と縮合可能である反応性基を有
する（第２式参照）。
（1c） 結合剤の双方の反応性基はイソシアネ
ート基である、すなわち結合剤はジイソシア
ネート（この場合トルエン−２，４−ジイソ
シアネート）である（第３式参照）。
（2a） 担持材、カツプリング剤、スペーサ
ー及び結合剤から成る担持材物質の例、 本例において結合剤又はカツプリング剤中
に存在するすべての反応性基はイソシアネー
ト基である。延長された長鎖の親水性化合物
はスペーサーとして作用する。担持材として
のセルロースは強塩基イミダゾリドナトリウ
ムの存在でカツプリン剤としてのトルエンジ
イソシアネートと反応し、生じる化合物にス
ペーサーとしてｎ−ポリエチレングリコール
（ｎ＝３〜10）を付加する。弱塩基トリエチ
ルアミンの存在で結合剤としてのトルエンジ
イソシアネートと更に反応させた場合、結合
剤はスペーサーの１級OH−基とのみ反応
し、担持材の残存する２級ヒドロキシル基は
もはや反応しない。これにより第４式に示し
た物質が生じる。
（2b） ポリアミノ化合物によつて生じる分
枝の例、 （2a）の場合と同様に反応させるが、ス
ペーサーとしてｎ−ポリエチレンイミン（ｎ
＝１〜３）を使用する（第５式参照）。
（3a） イソシアネート基を有する担持材物
質とアミノ基を有する生物学的活性物質との
間の尿素結合の例： 担持材物質、例えば例2aによる反応から
得られるエイジエントをリシンと水性溶液中
で置換尿素の形成下に反応させる（第６式）。
同様にしてリシンを含む酵素を反応させる。
（3b） 遊離イソシアネート基を有する担持
材物質と遊離ヒドロキシル基を有する生物学
的活性物質との間のウレタン結合の例： 例（2a）又は（2b）に記載したような物
質をジオキサン中のクロラムフエニコールの
溶液と反応させると第７式に示した化合物が
生じる。
(4) 脱活性化の例： 遊離イソシアネート基を含む担持材物質を
チオフエノールと有機溶剤中で反応させる
（第８式参照）。
（5a） デキストランゲルからの担持材物質
の製造 乾燥したセフアデクスG50スーパーフアイ
ン（Sephadex G50superfine）
（Pharmacia、微孔網状化デキストランゲ
ル）５ｇを無水テトラヒドロフラン（THF）
100mlに懸濁させる。撹拌下にトルエンジイ
ソシアネート（２，４−及び２，６−異性体
の市販混合物）１ml及び触媒懸濁液0.5mlを
加え、溶液を烈しく撹拌しながら30分間還流
下に加熱する。懸濁液を濾別し、無水THF
で洗浄することによつて過剰の試薬を除去す
る。
真珠形状物を乾燥THF100ml中の２−ブチ
ンジオール−（１，４）２ｇの溶液に懸濁さ
せ、30分間加熱還流させる。物質を吸引濾過
し、慎重に無水THFで洗浄し、真空中で溶
剤を除去し、生成物をアンプルに封入する。
数カ月貯蔵した後の検査で、結合力の減少は
検出されなかつた。
黄色のペレツトは出発物質と同様水中で膨
張し、外視及び流動抵抗も同じである。
イソシアネート含量：250μモル／ｇ 水性溶液中のリシン結合力：4μモル／ｇ 例（5a）による担持材物質への酵素の結
合イー・コリ（E.coli）からのアルカリ性ホ
スフアターゼ（Boehringer社、200μｇ）を
ホスフエート緩衝液（PH8.0）0.2モルに対し
て透析し、酵素溶液の容量を400μにする。
酵素溶液を（5a）による担持材物質10mgと
混合し、溶液を軽く撹拌しながら２時間放置
する。懸濁液100μlをカラム（直径２mm、物
質のベツト容量10μl）に詰める。このカラム
をトリス緩衝液（PH7.5）0.05モルで洗浄し、
次いで基質溶液〔グリシン緩衝液（PH10.5）
0.05モル、ｐ−ニトロフエニルホスフエート
5.5mモル、MgCl20.5mモル〕で内衡化する。
流動速度はカラム容量当り４秒に調整し、連
続的にフラクシヨンを集める。数秒内に反応
は一定の水準に調整される。この水準から活
性度を計算する。エイジエント１ｇは遊離酵
素1.3mgの活性度を有する。集めたフラクシ
ヨンを数時間恒温保持することにより、溶離
した酵素での不純化を判定するが、この不純
化は測定不能なほど僅少である。
グリシン緩衝液（PH10.5）中で室温におい
て１週間放置した後、エイジエントの活性度
は減少していないことが認められた。
リシン結合：標準試験：溶液１ml当り燐酸
カリウム緩衝液0.2モル中のリシン1mモル、
担持材物質50mg。４℃で１時間反応させた後
放射性リシンの固着度を測定する。
他の緩衝液条件を使用した際のリシンの固
着度： 標準条件 100％ ホスフエート（PH8.0）0.02モル 133％ ホスフエート（PH6.7）0.02モル 48％ HEPES（PH7.4）0.05モル 80％ イミダゾール（PH8.0）0.05モル 90％ 生じたエイジエントは中性PH条件でイオン
交換体として作用しない。更に放射性ADP
とリシン物質との結合が測定される。エイジ
エント１ｇはADPを1pモル（10-12モル）よ
りも少なく結合する。
標準条件を使用した場合次の酵素も活性形
で担持材物質に結合する： 大豆からのトリプシン抑制剤（Merck社） 生成物は１ｇ当りトリプシン3.1mgの可逆
的結合力を有する。
豚の筋肉からのラクテートデヒドロゲナーゼ
（Boehringer社） 生成物の活性度は被覆密度を正確に測定す
る（50単位／ｇ）にはあまりにも高すぎる。
ジヤガイモからのアピラーゼ（Sigma社） インゲンマネからのウレアーゼ
（Boehringer社） ジアホラーゼ（Sigma社） 標準条件：担持材物質50mgを0.2モルホス
フエート緩衝液（PH8.0）１ml中の酵素10mg
の溶液と混合し、懸濁液を時折振つて４℃で
２時間恒温保存する。上澄液中に使用した酵
素活性剤の少なくとも2/3が回収され、新た
に結合反応に使用することができる。
（5b） デキストランゲルからの担持材物質
においてスペーサーとしてポリエチレングリ
コールを使用する例 セフアデツクスからの担持材物質を前記の
例におけると全く同様の方法で製造するが、
スペーサーの溶液をTHF200ml中のポリエチ
レングリコール200 20mlの溶液によつて代え
る。
得られた生成物は先のものと極めて類似す
る。しかし計算された結合力は一般に前記例
のものよりも低く、従つてリシン結合力は例
えば5.6μモル／ｇ、また結合されたラクテー
トデヒドロゲナーゼの活性度は１ｇ当り16単
位である。
（6a） 顆粒状セルロースからの担持材物質
の製造 〔薄層クロマトグラフイ用セルロース
（Merck社）、天然、顆粒物〕。
セルロース2.5ｇを真空中で乾燥させ、
THF150ml中のTDI0.5mlの溶液及び触媒懸
濁液0.375mlに懸濁させ、撹拌下に30分間加
熱還流させる。次いで生成物をTHF150ml中
のブチンジオール２ｇの溶液に加え、30分間
加熱還流させる。再度洗浄し、濾過し、この
ケーキをTHF150ml中のTDI2.5ｇ及びトリ
エチルアミン0.25mlの溶液に懸濁させる。物
質を吸引濾過し、無水THFで十分に洗浄し、
真空中で乾燥する。
性質：微細な黄色顆粒物 水性溶液中のリシン結合力：4.5μモル／
ｇ、 例（6a）による担持材物質への酵素の結
合、 結合は標準条件下に上記のようにして行な
う。
トリプシン：エイジエント１ｇは酵素1.8
mgに等しい活性度を有する。
ポリヌクレオチドホスホリラーゼ：イー・
コリからの部分的に濃縮された酵素フラクシ
ヨン。エイジエント１ｇは使用した調剤0.8
mgと同じ活性度を有する。UDPからの高ポ
リマーのポリＵの形成を測定した。半衰期は
連続処理で約14日である、すなわち14日の反
応期間後に、室温で連続操作される流動反応
の生産量は元の価の半分に低下する。この間
に約10000のカラム容量が反応する。操作中
酵素の痕跡量は発見し得ないことから、その
減少は酵素が変質するか又はサブ−ユニツト
に沈殿することに帰因するといえる。
RNA−ポリメラーゼ：イー・コリから部
分的に濃縮された調剤。ポリDATの高分子
マトリツクスでのポリAUの合成を測定し
た。結合した酵素の安定性は遊離酵素のそれ
を何倍も凌駕する。エイジエント１ｇは遊離
酵素0.12mgに等しい活性度を示す。
グアニレートキナーゼ：イー・コリからの
部分的に濃縮された粗フラクシヨン。カラム
はGDP及びGTPの酵素合成に適しており、
放射特性を有するGDP、GTP、IDP及び
ITPの合成に特に有利に使用される。
ヌクレオシドジホスフエートキナーゼ：イ
ー・コリからの部分的に濃縮された蛋白質フ
ラクシヨン。エイジエントはヌクレオシドの
ホスフエート及びデソキシヌクレオシドトリ
ホスフエートに対する好適なラベリング剤と
して使用することができる。
ジホスホキナーゼ及びポリヌクレチオドホ
スホリラーゼ：イー・コリからの部分的に濃
縮された蛋白質フラクシヨンを混合し、次い
で結合する。このエイジエントはヌクレオシ
ドトリホスフエート及びヌクレオシドジホス
フエートの場合特にβ−ホスフエートを、添
加した放射性ホスフエートと交換する。
補欠分子酸性ホスフアターゼ：精液からの
部分的に濃縮された蛋白質フラクシヨン。上
記の固定化粗酵素は、ヌクレイン酸合成用基
質を製造するのに特に使用することができ
る。遊離溶液ではこの粗酵素はその製造に適
していない。それというのも粗酵素中に不純
物として含まれるヌクレアーゼ及び他の分解
酵素はまつたく又は多大の経費を使用した場
合にのみ基質調剤から除去し得るにすぎない
からである。結合された酵素を使用した場
合、この結合酵素が安定に結合されまた反応
器から徐々に洗浄除去されないことを前提と
して汚染問題が派生する。この方法で処理し
た物質の場合、安定性は保証される。
膵臓からのリボヌクレアーゼ：物質は高分
子のポリＵを3′−UMPに完全に分解し、ｔ
RNAを代表的なオリゴヌクレオチド混合
物に分解する。立体障害は観察されない。被
覆密度は高い。
（6b） セルロース綿からの担持材物質の製
造 その製造は例6aと同様にして行なうが、
担持材として外科用生綿２ｇを使用する。
性質：生綿の外観及び外部特性は僅かに黄
色を生じる以外は不変である。水性溶液中の
リシン 結合力：0.75μモル／ｇ。
酵素を例6aに記載したようにして結合す
る。しかし被覆密度は担持材の表面が極めて
小さいことから低い。
担持材物質は高粘性溶液の反応、例えばＤ
ナーゼによる高分子DNAの分解又はポリヌ
クレオチドホスホリラーゼによる高分子のポ
リＡの合成に際して有利に使用される。
(7) アガロースからのビヒクル物質の製造 膨潤アガロースはゲル構造を破壊すること
なしに乾燥することはできない。従つて適当
な溶剤で洗浄することによつて水を除去する
必要がある。
セフアロース4B（Sepharose4B、最大孔４
％の真珠形状アガロースゲル、Pharmacia
社）100ml（沈殿容量）を無水ジオキサンで
十分に洗浄する。最後の痕跡量の水分はジオ
キサン懸濁液をモレキユラーシーブを介して
少なくとも24時間放置することによつて除去
する。懸濁液の容量をジオキサンで150mlに
し、トルエンジイソシアネレート−２，４
２ml及び触媒懸濁液１mlを加える。懸濁液を
室温で30分間徐々に撹拌し、次いで濾過し、
ジオキサンで洗浄する。急速な水の吸引濾過
による物質の乾燥は阻止しなければならな
い。ケーキをジオキサン100mlに懸濁させ、
ブチンジオール−１，４ 10ｇを加える。１
時間撹拌した後、生成物を再度濾過し、洗浄
する。物質をジオキサン100ml中のトルエン
ジイソシアネート10ｇ及びトリエチルアミン
１mlの溶液に加え、室温で30分間穏かに撹拌
する。ゲル真珠形状物を慎重に洗浄し、真空
中で乾燥する。
物質の性質：黄色の真珠状に成形されたペ
レツト膨張力及び孔の大きさは細状化により
低下。機械的硬度及び融解温度は著しく上
昇。65℃でなおゲル構造の変化は認められな
い。ゲル構造は乾燥によつてもほとんど変化
しない。水分を遮断して貯蔵した場合、数カ
月に渡つて結合力の減少は観察されない。
水性溶液中のリシン結合力：10μモル／
ｇ、 ヘモグロビン結合力：230mg／ｇ、 例７による担持材物質への生物学的活性物
質の結合 大豆からのトリプシン抑制剤（Merck社） エイジエント１ｇは特にトリプシン18.6mg
を吸着及び脱着する。この能力はエイジエン
トを繰返し使用しても低下することはない。
高分子ヌクレイン酸の合成を促進する下記
の極めて敏感な酵素は例７の担持材物質を結
合し、流動反応器中で使用するのに適してい
る。
DNA−ポリメラーゼ：イー・コリからの
高度に濃縮された調剤 RNA−ポリメラーゼ：イー・コリからの
均質な調剤 ポリヌクレオチドホスホリラーゼ：イー・
コリからの高度に濃縮された調剤 RNA−レプリカーゼ：フアージQβで汚染
されたイー・コリ細胞からの均質な調剤。固
定化酵素の安定性は溶液中の酵素の安定性を
何倍も凌駕する。
リフアムピシン：抗生物質を最良に有機溶
剤に結合する。例７の担持材物質５ｇを乾燥
ジオキサン100ml中のリフアムピシン50mg及
びトリエチルアミン0.1mlの溶液に懸濁させ
る。室温で１夜徐々に撹拌した後エイジエン
トを吸引濾過し、水で十分に洗浄する。赤褐
色の生成物を水性懸濁液として貯蔵し、何カ
月もの貯蔵の間リフアムピシンは認識し得る
ような量で損失されることはない。エイジエ
ントは特にRNA−ポリメラーゼを吸着する。
（8a） ポリアクリルアミドからの担持材物
質の調剤 ビオゲルP10（BioGel P10）（微孔性真珠
形状物、100〜200メツシユ、BioRad
Laboratories社）10ｇをヒドラジン水和物
100ml中で膨張させ、80℃で３時間加熱する。
その後生成物を水で十分に洗浄し、ゲル真珠
形状物を氷冷した0.5モルHCl100mlに懸濁さ
せ、０℃で0.5モルNaNO2溶液で滴定する
（指示薬：沃素澱粉紙、NaNO2溶液185mlを
必要とした）。ゲルを吸引濾過し、氷冷水で
急速に洗浄する。次いでゲルを10％ポリエチ
レンイミン溶液（水中）100mlに懸濁させ、
１夜放置する。その際ポリエチレンイミンが
表面に結合し、以後の反応に必要な反応可能
の基を生じる。生成物を水で、次いでアルコ
ールで洗浄し、真空中で乾燥する。場合によ
つては生じる塊状物を粉砕して均一な細粉物
を得る。
上記のようにして変性した担持材をジオキ
サン100mlに懸濁させ、トルエンジイソシア
ネート２mlと混合する。生成物を撹拌下に40
℃で30分間加熱し、次いで濾過し、ジオキサ
ンで洗浄する。
得られた物質をジオキサン100ml中のブチ
ンジオール１，４ ２ｇの溶液に懸濁させ、
撹拌下に40℃で30分間加熱する。得られた生
成物を吸引濾過し、ジオキサンで洗浄し、ジ
オキサン100ml中のトルエンジイソシアネー
ト５mlの溶液に懸濁させる。50℃で30分間加
熱した後（触媒の不存在で）、生成物を濾過
し、洗浄し、乾燥する。
性質：微孔性真珠形状物、水中で容易に膨
張、水性溶液中のリシン結合力：17.6μモ
ル／ｇ 緩衝液中のヘモグロビン結合：14.8mg／ｇ （8b） 担持材物質の脱活性化 ポリアクリルアミドからの上記担持材物質
100mgを、ジオキサン２ml中の脱活性化剤10
mgの溶液に懸濁させ、室温で30分間振る。脱
活性化物質を濾別し、ジオキサンで洗浄し、
乾燥する。脱活性化担持材物質のヘモグロビ
ン結合力は次の通りである： 脱活性化剤なし 100％ ニトロフエノール−４ 114％ ジニトロフエノール−１，４ 116％ チオフエノール−４ 87％ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド 109％ Ｎ−ヒドロキシピペリジン 121％ ベンズイミダゾール 115％ (9) 多孔性ガラスからの担持材物質の製造 コントロールした細孔ガラスペレツト（マ
クロ細孔性真珠形状物、細孔度900Å）４ｇ
をアセトン中のγ−アミノプロピルトリエト
キシシランの１％溶液100mlと混合する。ア
セトンを回転蒸発器中で適当な真空度及び適
度な温度で除去する。残渣を115℃で１夜恒
温保存する。この公知の前反応により以後の
反応で必要な反応可能の基が得られる。生成
物をテトラメチレンジイソシアネートの２％
溶液100mlと混合し、室温で触媒を使用する
ことなく30分間反応させる。生成物を吸引濾
過し、洗浄し、次いでTHF中の無水フロロ
グルシンの５％溶液100mlと反応させる。新
たに濾過し、洗浄し、最後に生成物にTHF
中のトルエンジイソシアネートの５％溶液
100mlを加える。生成物を洗浄し、乾燥する。
酵素又は他の蛋白質（例えば抗体）の結合
は上記の条件下に生じる。
クロマトグラフイ材料の製造に担持材物質を使
用する例： 前記の担持材物質を極性、中性、有機溶剤中の
３−アミノフエニルボロン酸の溶液と反応させ
る。生じる物質は水溶液中の砂糖、ヌクレオシド
及びヌクレオチドのクロマトグラフイ処理に適し
ている。
前記の各例では例えば次のようにして製造され
る触媒が使用される： ナトリウム及びイミダゾールの等量を無水トル
エン中で公知方法により反応させて、ナトリウム
イミダゾリドにする。懸濁液は約１モル／に調
整する。
優れた使用例は以下に記載する： (1) 流動反応器で使用する担持材結合酵素。
担持材として耐熱及び耐圧性に関して好まし
い値を有しかつ酵素を変性しない、変性デキス
トラン又はセルロースを使用する。実験は多数
の酵素を用いて行なつた。すべてのテスト酵素
は、高い流動比に適応する十分な活性度を有し
ていた。固定化酵素の安定性は多くの場合極め
て高かつた。酵素の痕跡量による反応生成物の
不純化は検出し得なかつた。
(2) 酵素の親和性クロマトグラフイに対する担持
材結合蛋白質、オリゴヌクレオチド、アミノ
酸、抗生物質及びその他の生物学的活性物質。
その高い結合力（大きな細孔幅）によりビヒ
クルとしてアガロースを使用することが最適で
ある。それというのもこの物質に対しては高い
流動比及び耐熱性は必要とされないからであ
る。
(3) 例えばイオン交換体又は他のクロマトグラフ
イ材料を製造するため、カラム材料への種種の
化学薬剤の装入。
達成可能な結合力が極めて高いこの物質に対
してはスペーサーは不要である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 出来るだけ多数の遊離−NH2基又は−OH基
    を含有する担持体と、少なくとも２個の反応基を
    有する少なくとも１種の結合剤とから構成され
    る、生物学的活性物質と共有結合可能の担持材物
    質を製造するに当り、無水担持材を、無水溶剤中
    でナトリウムイミダゾリドの存在下でイソシアナ
    ート又は仮装イソシアナートと反応させ、生じる
    担持材物質を単離することを特徴とする生物学的
    活性物質と共有結合し得る担持材物質の製法。 ２ ジイソシアナート又は仮装ジイソシアナート
    を無水非プロトン有機溶剤中で無水担持材と反応
    させる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 結合剤をスペーサー及びカツプリング剤を介
    して担持材と結合させる特許請求の範囲第１項又
    は第２項記載の方法。 ４ スペーサーとして少なくとも２個の反応可能
    の基を有する物質を使用する特許請求の範囲第３
    項記載の方法。 ５ カツプリング剤として２個の反応性基を有す
    る結合剤を使用し、同反応性基の１個又は有利に
    は両方がイソシアナート又は仮装イソシアナート
    である特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ ジイソシアナート及び仮装ジイソシアナート
    が結合剤として及びカツプリング剤として使用さ
    れ、又スペーサーが少なくとも２個の反応可能の
    基、特にアミノ基及び／又はヒドロキシル基、を
    有する物質から構成されている特許請求の範囲第
    ３項から第５項までのいずれか１項記載の方法。 ７ 被覆密度を高めるために、結合剤として使用
    される２個以上のジイソシアナート又は仮装ジイ
    ソシアナートを、少なくとも３個の反応可能の
    基、特にアミノ基及び／又はヒドロキシル基、を
    有する物質によりカツプリング剤に結合させる特
    許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 固有の結合を達成するために、担持材物質の
    イソシアナート基又は仮装イソシアナート基の反
    応性を不活性化剤を用いて減少させる特許請求の
    範囲第１項から第７項までのいずれか１項記載の
    方法。
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