JPS6317689A - 植物組織及び細胞培養のための方法及び培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細胞分化及びその細胞によって産出される第二
生成物の量を増加する植物組織及び細胞培養法に関する
。

植物細胞が合成培地中でその植物の外で生長した場合、
カルス形成と呼ばれる非分化細胞増殖が認められる。ま
たその細胞は植物細胞分化を胚又は植物の１又は数箇所
、一般に根又は苗条の培養で生長と共に受ける。

植物組織培養の分化は農業に於て重要である。

そこでは組織培養の急速植物増殖が種子入手可能性及び
生長する季節に依存しない。組織培養で産出された植物
は一様な特長を有し、ウィルスを含まない。

細胞分化に依存する植物組織培養の他の適用は高価な化
学物質の産出である。従って細胞組織培養で植物細胞分
化を高める方法を、この様な化学生成物を得るだめの改
良方法としても使用することができる。

植物組織培養が増殖する培地は炭水化物成分を主な栄養
素として含有する。炭水化物は常に培地の固体成分８０
〜９０重量％を有する。この目的に好ましい炭水化物は
ショ糖又はグルコースを有している。場合により当業者
はマルトース、ラクトース、又は他の単糖類を使用する
。

今や本発明者は、マルトースとグルコースとの特有の組
み合せを培地の炭水化物成分全部又は一部として使用し
た場合、細胞組織培養の改良された細胞分化が認められ
ることを見い出しだ。これは根及び苗条の産出を高める
ばかりでなく、その細胞による第二化学物質の産出を増
加する。

本発明は植物体から切り取られた一片の組織又は植物体
から切り取られた組織の培養によって得られた細胞を合
成基部植物組織培養培地中で培養し、その培地は炭水化
物及び上記細胞組織の成長に必要とされる他の栄養素を
含有し、その際炭水化物は約２０〜約９０重量％マルト
ース及び少なくとも約１０重量％グルコースから成る細
胞組織培養で細胞分化を増加する改良方法を提供する。

更に本発明は細胞組織培養の増殖用培地を提供する。そ
の際この培地の炭水化物はマルトース約２０重量％〜約
９０重量％及びグルコース少なくとも約１０重量％から
成る。

本発明によれば植物組織及び細胞を培地を使用して培養
する。その際この培地中の炭水化物はマルトース約２０
重量％〜約９０重量％及びグルコース少なくとも約１０
重量％から成る。

培養液及び培地を調製するた°めの処理法は通常の植物
組織培養を構成するのに使用されるものと同一である。

したがって無機塩、微量栄養素、ビタミン及びホルモン
を含有する公知の合成培地を、培地ベースとして使用す
ることができる。

このベース中炭水化物は前記炭水化物混合物に代えられ
る。

本発明の実施にあたり使用される炭水化物成分は種々の
方法で得られる。デキストロース及びマルトースの所望
の量を組み合せて、所望の組織物との混合物が得られる
。選択的にデキストロース及びマルトースの適する組み
合せ物を含有する一定のでんぷん水解物を使用すること
ができる。ＣＰＣＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｃ
、　　のコーンプロダクツ部門から市場で入手できるこ
の様なでんぷん水解物は商品名ＧＬＯＢＥ■１６３２　
　である。この水解物はほぼ３５％デキストロース及ヒ
３０％マルトースを含有し、残りは比較的多くのオリゴ
糖である。本発明に於て使用に適する炭水化物混合物は
種々の量のデキストロース及びマルトースとでんぷん水
解物とを混合し、所望の量のこれらの糖を有する混合物
を生じることによっても得られる。

本発明に従って基部培地に加えられるマルトース及びデ
キストロースを含有する炭水化物混合物の量は、培地ｌ
あたり約１０ｇ〜約５０ｇ１好ましくは約１５ｇ〜約３
０ｇの範囲にあることができる。炭水化物が添加された
培地をそれ自体培養に使用する。通常の培地に於ける様
に更に分化を促進する剤、たとえば植物ホルモンを培地
中に特別の目的に従って導入してもよい。

培養されうる植物組織は単一植物体から取り出された組
織であり、特に茎頂、形成層、実生胚軸等々の様な部分
が好ましい。植物中で生長した非分化細胞、たとえばカ
ルス細胞を培養することもできる。継代培養から生じる
組織又は細胞を使用してもよい。

植物組織を本発明による炭水化物混合物を含有する培地
中で培養する場合、分化の促進が認められるので、植物
体、茎、葉又は根をカルスから生長することができる。

細胞塊及び生長した体又は部分を得ることができあるい
は実生として分化された植物体を移植することができる
。

得られた細胞から有用な物質を抽出することもできる。

前述の様に、本発明による方法は植物組織又は細胞の有
効な培養を、適当な炭水化物混合物の培地への添加によ
りその増殖及び分化を増加することによって可能にする
。この方法によって培養された植物又は細胞それ自体を
得ることができる又はこれらから有用な物質を抽出する
ことができる。それによって均一な実生培養が得られ、
特別の植物種を繁殖する。

次に本発明を例によって具体的に示す。その他に明記し
ない限り、すべての割合及び百分率は重量あたりである
。

例ｌ Ｎａ０Ｃ１溶液中で２０分間液浸して表面−滅菌し、蒸
留水で２回洗滌する。外植片が０．５　ｃｍ直径コルク
ポーラ−によって得られ、０．９％寒天で固められたベ
ース培地上で培養する。培地の組成を表■に示す。

表■ ゛−′培ｍ　（ｐＨ５°７）。８Ａ ＮＨ４ＮＯ５１，６５０ ＫＮＯ３１，９００ ＣａＣ１２・２Ｈ２０４４０ Ｍｇ５０４・７Ｈ２０３７０ ＫＨ２ＰＯ４１７Ｏ Ｎａ２ＥＤＴＡ　　　　　　３７．８ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２７，８ Ｈ３ＢＯ３６，２ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ１６，９ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０ｇ、６ ＫＩ　　　　　　　　Ｏ，８３ Ｎａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２００，２５ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０’　　　　　０．０２５ＣｏＣ１
２・６Ｈ２００，０２５ シヨ糖　　　　　　　　　　　ａｏ、ｏｏ。

ｌ−イノシトール　　　　　　　　１００．０ニコチン
酸　　　　　　　　　　　　０．５ピリドキシン拳ＨＣ
１０，５ チアミン・ＨＣＩ　　　　　　　　　　　　０．１α−
ナフタレン酢酸　　　　　　　　　２，０キネチン　　
　　　　　　　　　　　　０．２試験管内で固体培地上
で暗所で２５℃で２ケ月間生長した場合、細胞は力’）
　（Ｃａｌｌｉ）を生じる。

懸濁培養をカリから開始し、液体培地中にカルス組織を
予め分散する。その際回転ドラム上でローラー管を使用
する。次いで懸濁液の一部２〜５ｍｌを新鮮な培地５０
ｍ１を含有するエルレンマイヤーフラスコ２５０ｍ１に
移す。フラスコを暗所に室温でジャイレトリー振盪器（
１００ｒｐｍ）上で放置する。夫々の培養フラスコ３〜
４個を保存する。懸濁培養をほぼ２０日ごとに新鮮な増
殖培地に植えかえる。数ケ月の一連の経過の間、ニコチ
ンは組織培養で見い出されなかった。

ニコチン分析は懸濁培養の一部８−又は１６ｍ１を取り
、これを５ＭＮａＯＨ１０ｍｌと混合し、混合物を水蒸
気蒸留することによって行われる。水蒸気留出物を０．
５ＭＨＣ１５ｍｌ中に集め、留出物のニコチン含量をス
ペクトル光度測定により２３６゜２２、第４８０−４８
３頁（１９５０）に述べられている様なスタンダード法
によって吸光度から計算する。

８ケ月間上記条件下で生長した細胞をショ糖の存在下に
でんぷん水解物を含有する生長培地に移す。このでんぷ
ん水解物は３７％グルコース、２９％マルトース及びよ
り大きいオリゴ糖３４％を含有する。コントロール培養
を炭水化物としてショ糖を使用してこの培地中で行う。

双方の培地を含有する培養をほぼ２０日間隔で二次培養
し、懸濁培養の一部を夫々の採取臼でニコチンを分析す
る。表■に示された結果−これは夫々の場合で培養３〜
４個の平均であるーはグルコースとマルトースとの混合
物を含有するでんぷん水解物しかかなりの量のニコチン
を産出しないことを示す。

表■ ショ糖及びでんぷん水解物上で 増殖したタバコ懸濁培養 １　　　１２．１　　　　　？、１　　　０．２１９　
　０２　　　１１．１　　　１８．１　　　０　　　　
０３　　　６．１　　　　９．５　　　０　　　　０．
２５５４　　　１５．１　　　１６．６　　　（０，０
５０，８４３５７，２５，５６（０，０５０，１７ ６７，１６，８１（０，０５３，２ ７１４，３１２，８００，５３ａ） ８　　　１７．６　　　１１．１　　　０　　　　０．
２８９　　　１６．５　　　１０．８　　　（０，０５
１，４５ａ）培養をこの経過中ジャイレトリー振盪器の
減速によって過度の温度にさらす。

例２ 例１の通常の処理を行う。その際炭水化物は純粋なグル
コース、純粋なマルトース又はこれらの混合物である。

細胞は不完全にマルトース上で生長し、測定できるほど
の量のニコチンを産出しない。グルコース上で生長した
細胞によるニコチンの収量は例１と示したショ糖上で生
長した細胞によって産出されたニコチンの収量に類似す
る。表■に示した結果は次のことを示すニゲルコースと
マルトースとの混合物、及び本発明による範囲内でグル
コースとマルトースとの混合物を含有するでんぷん水解
物を、タバコ組織培養を増殖するのに使用することがで
きる。この培養は驚くべきことに高水準のニコチンを産
出する。

例３ 野生ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ　Ｌ、）の
懸濁培養を例ＩＫ於けるタバコ細胞の懸濁培養に対して
使用しだのと同様な処理を用いて生長させる。使の野生
ニンジン培地である。再び懸濁培養をほぼ２０日ごとに
新鮮な生長培地に植えかえる。

表■ 野生ニンジン培地（ＰＨ５，８） ｍｇ／１ ＫＮＯ３４，００Ｏ ＮＨ４Ｃ１５４゜ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１８５ ＣａＣ１２−２Ｈ２０２２゜ 冊、ｐｏ４６８ Ｎａ２ＰＩ）ＴＡ　　　　　　　　　　　　　　１８．
６Ｆｅ　ＳＯ４・７Ｈ２０１３，６ ＭｎＳＯ４−Ｈ２Ｏ７，０ ＺｎＳＯ４ｅ７Ｈ２０４，０ Ｈ５ＢＯ３２，４ （ＮＨ４）６　Ｍｏ７０７４　”　４Ｈ２００，０１Ｋ
Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，３８ＣｕＳ
Ｏ４”５Ｈ２００，０１５ チアミン・ＨＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　３．
０炭水化物　　　　　　　　　　　　　　２０，０００
２．４−ジクロロフェノキシ酢酸０．５ニンジン細胞に
よって産出されたアンドシアニン顔料を次の分析技術に
よって測定する。懸濁培養の一部５ｍｌを細胞の遠心分
離によって集める前に水２容量で希釈する。細胞を容量
あたり９５％メタノール、４％水及び１％塩酸を含有す
る溶液１０ｍ１で抽出する。抽出を室温で一晩かけて実
施する。この混合物を遠心分離し、明るいピンク溶液の
吸光度を５８０ｎｍで溶剤ブランクに対して測定する。

培地中に種々の炭水化物を使用した結果を表Ｖ中に示す
。種々の細胞培養の相対顔料産出を培養液１００ｍ１あ
たりの吸光度によって示す。これから次のことが明らか
である二本発明に於て特定化されたマルトース及びデキ
ストロースの割合で炭水化物を含有する培養液は、野性
ニンジン細胞の分化を単一炭水化物：ショ糖、グルコー
ス、又はマルトースを含有する培地上で生長した細胞に
よって得られる顔料以上に増加されかつ更に急速な顔料
産出と共に生じる。

表■ 種々の炭水化物上で増殖した野生ニンジン懸濁培養アン
トシアニン顔料 （Ａ５３０　／　１００　ｍＡ　） １　　２．４９　　８．５１　　２．７　　　　７．４
　　　７．２２　　８．２０　　８．５８　　６．５　
　　　８．８　　　９．５ａ）培地のほんの１２ｇ／ｌ
の程度で使用する。

例４ 胚発生野生ニンジン細胞系統の懸濁培養を、２．４−ジ
クロロフェノキシ酢酸を除く以外は表■中に示した培地
上で生長させる。これによって培養は胚を形成すること
ができる。記載した炭水化物を含有する培地上で２回二
次培養した後、胚を培地から分離し、水洗し、乾燥する
。

表■中に示した結果から次のことが明らかである二本発
明に於て特定化された炭水化物のうちテマルトース及び
デキストロースの割合を含有するでんぷん水解物は単一
炭水化物：ショ糖、グルコース又はマルトースを含有す
る培地上で生長した細胞によって得られる胚以上に増加
した胚産出を生じる。

表■ 種々の炭水化物上で増殖した野生ニンジン懸濁培養胚重
量（ｍｇ）ａ） ａ）夫々の値は３つの別々の培養からの平均重量である
。

ｂ）　　３７％グルコース、２９％マルトース、及ヒヨ
リ大きいオリゴ糖３４％を含有する。

かくして本発明によれば改良された植物組織培養用培地
が提供されることは明白である。本発明はその特異的な
□具体例と共に記載したが、多くの変換、変更及び変法
は前記記載を考慮すれば当業者にとって明らかである。

したがって請求範囲に記載した様な変換、変更及び変法
すべてを包含する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）植物体から切り取られた一片の組織又は植物体から
   切り取られた組織の培養によつて得られた細胞を合成基
   部植物組織培養培地中で培養し、その培地は炭水化物及
   び上記細胞組織の成長に必要とされる他の栄養素を含有
   し、その際炭水化物は約２０〜約９０重量％マルトース
   及び少なくとも約１０重量％グルコースから成る細胞組
   織培養で細胞分化を増加する方法。 ２）培養培地は前記培養培地ｌあたり約５ｇ〜約５０ｇ
   炭水化物を含有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）炭水化物はでんぷんの加水分解物である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ４）細胞組織培養はタバコ細胞組織培養である特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ５）組織培養は野性ニンジン組織培養である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ６）培地中の炭水化物が約２０重量％〜約９０重量％マ
   ルトース及び少なくとも１０重量％グルコースから成る
   、細胞組織培養の増殖用培地。 ７）炭水化物は培地１ｌあたり約５ｇ〜約５０ｇである
   、特許請求の範囲第６項記載の培地。 ８）炭水化物はでんぷん水解物である特許請求の範囲第
   ６項記載の培地。