JPS63139194A - ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラ−ゼ遺伝子の変異を同定するための特異的プロ−ブ - Google Patents
ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラ−ゼ遺伝子の変異を同定するための特異的プロ−ブInfo
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- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
要 約
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子にある変異の
検出法を記している。この方法はＰＫＵ（フェニルケト
ン尿症）に罹患しているか、ＰＫＵの異形接合体をもっ
ているか、あるいは正常かを検出するために使われる。
検出法を記している。この方法はＰＫＵ（フェニルケト
ン尿症）に罹患しているか、ＰＫＵの異形接合体をもっ
ているか、あるいは正常かを検出するために使われる。
ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子にみら
れる最初の変異を検出するために合成されるオリゴヌク
レオチドについても示されている。この合成プローブは
正常と変異のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子
の診断を可能にするため染色体ＤＮＡに塩基対の不適合
をもっている予めＰＫＵについての家族の経歴を得るこ
となくても遺伝的形質であるＰＫＵを検出できる簡単な
方法を提供している。
れる最初の変異を検出するために合成されるオリゴヌク
レオチドについても示されている。この合成プローブは
正常と変異のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子
の診断を可能にするため染色体ＤＮＡに塩基対の不適合
をもっている予めＰＫＵについての家族の経歴を得るこ
となくても遺伝的形質であるＰＫＵを検出できる簡単な
方法を提供している。
見匪■實員
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）はもし早期に診断でみつ
からず治療されないと非常に重いハンディキャップをも
った疾患となる。ＰＫＵは芳香族＝２４− アミノ酸代謝における先天性のエラーによって起こるヒ
トの遺伝子疾患である。このような状態の患者が尿の過
剰のフェニルピルビン酸を含むことは約５０年前にはじ
めてみつけられた（Ａ。
からず治療されないと非常に重いハンディキャップをも
った疾患となる。ＰＫＵは芳香族＝２４− アミノ酸代謝における先天性のエラーによって起こるヒ
トの遺伝子疾患である。このような状態の患者が尿の過
剰のフェニルピルビン酸を含むことは約５０年前にはじ
めてみつけられた（Ａ。
フォーリング、１９３４年、ノルディスク・メゾイカ・
チズクリフト第８巻１０５４−１０５９頁；Ａオフォリ
ング、１９３４年Ｂ、チトシュリヒト・フィジオロジ力
・ケミカ第２２７巻、１６９−１７６頁、１９３４年）
。
チズクリフト第８巻１０５４−１０５９頁；Ａオフォリ
ング、１９３４年Ｂ、チトシュリヒト・フィジオロジ力
・ケミカ第２２７巻、１６９−１７６頁、１９３４年）
。
その後、そのような患者の肝臓はフェニルアラニンの主
要な代謝経路であるチロシンに変えることができないこ
とが見つけられた（Ｇ、Ａ、ジェルヴイス：ジャナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第１６９巻、６
５１−６５６頁、１９４７年）。臨床的には、治療され
ないＰＫＵ患者は精神薄弱、色素の褪色、過運動症、小
頭症、てんかん活性などを提示する。しかし、集団によ
る新生児検診プログラム（グトリー及びスージ、ペディ
アート、第３２巻、３３−３４頁、１９６３年）の確立
や早期の食事治療（Ｈ，ピッケル等、アクタ・ペデアト
リクス・オブ：スカンジナビア第４３巻、６４−７７頁
、＝２６− １９５４年）の制定によって、欧米諸国では古典的な臨
床的症例は医学的には稀になっている。
要な代謝経路であるチロシンに変えることができないこ
とが見つけられた（Ｇ、Ａ、ジェルヴイス：ジャナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第１６９巻、６
５１−６５６頁、１９４７年）。臨床的には、治療され
ないＰＫＵ患者は精神薄弱、色素の褪色、過運動症、小
頭症、てんかん活性などを提示する。しかし、集団によ
る新生児検診プログラム（グトリー及びスージ、ペディ
アート、第３２巻、３３−３４頁、１９６３年）の確立
や早期の食事治療（Ｈ，ピッケル等、アクタ・ペデアト
リクス・オブ：スカンジナビア第４３巻、６４−７７頁
、＝２６− １９５４年）の制定によって、欧米諸国では古典的な臨
床的症例は医学的には稀になっている。
集団検−診は影響をうけている子共をしばしば見逃すこ
とがあるので、新生児のフォローアツプ検査は重要であ
る。本人やＰＫＵの血縁をもった家族を遺伝的にみた相
談をうけることを含めた異形接合子を検出することは家
族の中で将来の子供がこれらのフォローアツプ検査をう
けることを保証すべきである。
とがあるので、新生児のフォローアツプ検査は重要であ
る。本人やＰＫＵの血縁をもった家族を遺伝的にみた相
談をうけることを含めた異形接合子を検出することは家
族の中で将来の子供がこれらのフォローアツプ検査をう
けることを保証すべきである。
古典的なＰＫＵは肝臓にフェニルアラニンヒドロキシラ
ーゼ活性を欠いていることで特徴づけられている。この
酵素活性が欠けていることは必ずフェニルアラニン尿症
となり、その結果フェニルアラニンのマイナーな代謝経
路が過剰に利用されるようになることになる。フェニル
アラニンやその誘導体が高濃度になると有毒でチロシン
とトリプトファンの代謝に異常がおきる。
ーゼ活性を欠いていることで特徴づけられている。この
酵素活性が欠けていることは必ずフェニルアラニン尿症
となり、その結果フェニルアラニンのマイナーな代謝経
路が過剰に利用されるようになることになる。フェニル
アラニンやその誘導体が高濃度になると有毒でチロシン
とトリプトファンの代謝に異常がおきる。
カテコールアミンやメラニン、セロトニンなどの形成が
減少することがフェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損
の患者では典型的である。さらに、神経の軸索のまわり
のメラニン鞘が未処理のＰＫＵ患者の脳には適切に作ら
れず、上に述べたように臨床上の症状が不可逆的となる
。
減少することがフェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損
の患者では典型的である。さらに、神経の軸索のまわり
のメラニン鞘が未処理のＰＫＵ患者の脳には適切に作ら
れず、上に述べたように臨床上の症状が不可逆的となる
。
フェニルケトン尿症患者はその塩化第二鉄との反応によ
って容易に検出される尿水のフェニルピルビン酸を多量
に分泌する。この反応は１９５０年代にＰＫＵの子供の
診断のスクリーニングテストに使われた。１９６２年に
は、しかし、新生児の血液の少量のサンプルでフェニル
アラニンを半定量的定量する簡単な集団検診法がグトリ
ー及びスーツによって開発された（ペディアトリＬ囚第
３２巻、３３−３４３頁、１９６３年）。しかし古典的
なＰＫＵと診断され治療された患者は必ずしも正常な１
．Ｑ、をもっていない、誕生後すぐの食事治療の開始は
ライフスタイルを大きく破壊し、患者の家族に多大の精
神的、社会的なかかわりをもつことになる。
って容易に検出される尿水のフェニルピルビン酸を多量
に分泌する。この反応は１９５０年代にＰＫＵの子供の
診断のスクリーニングテストに使われた。１９６２年に
は、しかし、新生児の血液の少量のサンプルでフェニル
アラニンを半定量的定量する簡単な集団検診法がグトリ
ー及びスーツによって開発された（ペディアトリＬ囚第
３２巻、３３−３４３頁、１９６３年）。しかし古典的
なＰＫＵと診断され治療された患者は必ずしも正常な１
．Ｑ、をもっていない、誕生後すぐの食事治療の開始は
ライフスタイルを大きく破壊し、患者の家族に多大の精
神的、社会的なかかわりをもつことになる。
食事制限は、効果を出すべく長期間関係をもたねばなら
ず、最初の１０年間の中頃に治療をやめることは明らか
に１．Ｑ、値にわずかであるが有意の減少をもたらす。
ず、最初の１０年間の中頃に治療をやめることは明らか
に１．Ｑ、値にわずかであるが有意の減少をもたらす。
この治療を管理することはむづかしく、そのような食養
生に経験をつんだセンターでのみ実施できる。
生に経験をつんだセンターでのみ実施できる。
フェニルアラニンヒドロキシラーゼの欠損は表現型の変
異の関係なく、常染色体の劣性として受けつがれる。５
００万Å以上の新生児の集団検診によって、コーカサス
地方の古典的なフェニルケトン尿症の発生率は１１５，
０００から１／１６，０００にあることが示されている
。西欧やアメリカ合衆国での全体の頻度は大兄１／８，
０００で人口の２％がＰＫＵ特性の異型キャリアである
ことになる。
異の関係なく、常染色体の劣性として受けつがれる。５
００万Å以上の新生児の集団検診によって、コーカサス
地方の古典的なフェニルケトン尿症の発生率は１１５，
０００から１／１６，０００にあることが示されている
。西欧やアメリカ合衆国での全体の頻度は大兄１／８，
０００で人口の２％がＰＫＵ特性の異型キャリアである
ことになる。
多くの研究者はこの異型接合子をテストする必要性を認
めている。これらの検査法はフェニルアラニンを経口負
荷するテスト、早朝絶食時の血液サンプル、昼間の半絶
食時のサンプルを使って行ういくつかに方法、及び異型
と正常型の間の差を精密に統計的方法を用いて行う方法
などがある。いずれも１００％の精度をもった方法はな
い。どのテスト法も異型接合子と同型接金子正常型の者
の間でいくらかのオーバーラツプが見られる。主な問題
点は血中のフェニルアラニンの測定が二次的な現象を測
定することにある。欠損している酵素、フェニルアラニ
ンヒドロキシラーゼは肝臓にしか存在しない。ごくわず
かの人がその遺伝的な構成を定量するために肝生検をし
ようとしているにすぎない。安定同位元素はこの酵素活
性を間接的に測するためのもう一つの方法である。フェ
ニルアラニンを非放射性の１３０または２Ｈで標識し、
そしてフェニルアラニンとその代謝物を質量分析によっ
て測定する。これもまた、この方法がフェニルアラニン
からチロシンへの反応と変換ばかりでなく、全身でのフ
ェニルアラニンとチロシンの交換、輸送も測定するので
直接的なものでない。
めている。これらの検査法はフェニルアラニンを経口負
荷するテスト、早朝絶食時の血液サンプル、昼間の半絶
食時のサンプルを使って行ういくつかに方法、及び異型
と正常型の間の差を精密に統計的方法を用いて行う方法
などがある。いずれも１００％の精度をもった方法はな
い。どのテスト法も異型接合子と同型接金子正常型の者
の間でいくらかのオーバーラツプが見られる。主な問題
点は血中のフェニルアラニンの測定が二次的な現象を測
定することにある。欠損している酵素、フェニルアラニ
ンヒドロキシラーゼは肝臓にしか存在しない。ごくわず
かの人がその遺伝的な構成を定量するために肝生検をし
ようとしているにすぎない。安定同位元素はこの酵素活
性を間接的に測するためのもう一つの方法である。フェ
ニルアラニンを非放射性の１３０または２Ｈで標識し、
そしてフェニルアラニンとその代謝物を質量分析によっ
て測定する。これもまた、この方法がフェニルアラニン
からチロシンへの反応と変換ばかりでなく、全身でのフ
ェニルアラニンとチロシンの交換、輸送も測定するので
直接的なものでない。
分子生物学の技術の出現とともに、フェニルアラニンヒ
ドロキシラーゼ欠損に関与する遺伝子を測定し、対象者
の異型接合子すなわち遺伝形質を決めらることに新しい
方法が利用できるようになった（ウー等、ネイチャー、
第３０６巻、１５１−１５５頁、１９８３年、リドスキ
ー等、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒユーマン・ジ
ェネティク困、第３７巻、６１９−６３４頁、１９８５
年、特許出願番号４８４，８１６及びその継続出願番号
６００，２５４）。これら異型接合子の検出法は該当者
を通して家系を確めることを要する。さらにそれらはフ
ェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）遺伝子座の
制限酵素断片の長さのボリモルフイズム（ＲＦＬＰ）を
もったＰＫＵ対立遺伝子の分離を確めるために家系の追
跡を必要としている。家系の調査をもってさえも、ヒト
のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子座に同定さ
れる長いＲＦＬＰはなお異形性の検出法あるいはＰＫＵ
を生前検診するための方法なしにはいくつかの家系を見
とおすことになる。本発明はＰＡＨ座における実際の変
異を測定するための新しい改良された分子生物学上の技
術に向けられている。
ドロキシラーゼ欠損に関与する遺伝子を測定し、対象者
の異型接合子すなわち遺伝形質を決めらることに新しい
方法が利用できるようになった（ウー等、ネイチャー、
第３０６巻、１５１−１５５頁、１９８３年、リドスキ
ー等、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒユーマン・ジ
ェネティク困、第３７巻、６１９−６３４頁、１９８５
年、特許出願番号４８４，８１６及びその継続出願番号
６００，２５４）。これら異型接合子の検出法は該当者
を通して家系を確めることを要する。さらにそれらはフ
ェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）遺伝子座の
制限酵素断片の長さのボリモルフイズム（ＲＦＬＰ）を
もったＰＫＵ対立遺伝子の分離を確めるために家系の追
跡を必要としている。家系の調査をもってさえも、ヒト
のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子座に同定さ
れる長いＲＦＬＰはなお異形性の検出法あるいはＰＫＵ
を生前検診するための方法なしにはいくつかの家系を見
とおすことになる。本発明はＰＡＨ座における実際の変
異を測定するための新しい改良された分子生物学上の技
術に向けられている。
フェニルアラニンのチロシンへの水酸化は直接的に少く
とも２つの酵素と数多くの補酵素が関与する複雑な酵素
系が関与している。何年間もの経験がその欠損が古典的
なＰＫＵ状態より以上のところにあることを教えてきた
。表現型の間やヒドロキシラーゼ欠損には多くの異型接
合子が存在する。これらにはフェニルアラニン過剰血症
やジヒドロプテリジンリダクターゼの酵素で特に酵素の
コファクターが欠損していることやその他の酵素の補欠
因子の欠損などが含まれる。しかしこれらのタイプの典
型的なフェニルケトン尿症は観察できるＰＫＵ患者のほ
んの小分部のパーセンテージを占めるにすぎない。大多
数のＰＫ［Ｉ患者は肝臓の酵素であるフェニルアラニン
ヒドロキシラーゼの欠損によっている。
とも２つの酵素と数多くの補酵素が関与する複雑な酵素
系が関与している。何年間もの経験がその欠損が古典的
なＰＫＵ状態より以上のところにあることを教えてきた
。表現型の間やヒドロキシラーゼ欠損には多くの異型接
合子が存在する。これらにはフェニルアラニン過剰血症
やジヒドロプテリジンリダクターゼの酵素で特に酵素の
コファクターが欠損していることやその他の酵素の補欠
因子の欠損などが含まれる。しかしこれらのタイプの典
型的なフェニルケトン尿症は観察できるＰＫＵ患者のほ
んの小分部のパーセンテージを占めるにすぎない。大多
数のＰＫ［Ｉ患者は肝臓の酵素であるフェニルアラニン
ヒドロキシラーゼの欠損によっている。
しかしながら、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損
それ自体は非常に多様性があり、重篤な古典的ＰＫＵか
ら穏和なフェニルアラニン過血症までの範囲の病気があ
る。
それ自体は非常に多様性があり、重篤な古典的ＰＫＵか
ら穏和なフェニルアラニン過血症までの範囲の病気があ
る。
この酵素は単離され、特徴を調べられている。
はぼ５０，０００ダルトンのサブユニット分子量をもつ
多量体の酵素である。最近の証拠ではそのサブユニット
は同一のものか、あるいはお互いに＝３１− 前駆体一生産物の関係にあるものであることが示されて
いる（レドリー等、サイエンス、第２２８巻、７７−７
９頁、１９８５年）。古典的なＰＫＵ患者ではＰＡＷは
正常の１％以下の活性をもった構造的に変化した状態で
存在することがみつけられ（パーツローム等、ペデアト
リク・リサーチ、第９巻、８９９−９０３頁、１９７５
年）、ＰＫＵがＰＡＨ遺伝子それ自体の変異の直接的な
結果であることを示唆している。さらに、フェニルアラ
ニン過血症の人の肝生検試料のＰＡＲ活性を分析すると
、２〜３５％の範囲である正常な活性レベルの約５％し
かその酵素が含まれないことを示した。その証拠はフェ
ニルアラニン過血症の人の低い酵素活性は正常酵素の５
％が存在することによるのではなく正常酵素や古典的な
ＰＫＵの患者からの酵素とは別の動力学的性質の変性し
たＦＡＩ（が存在することによるのではないかというこ
とを示している。
多量体の酵素である。最近の証拠ではそのサブユニット
は同一のものか、あるいはお互いに＝３１− 前駆体一生産物の関係にあるものであることが示されて
いる（レドリー等、サイエンス、第２２８巻、７７−７
９頁、１９８５年）。古典的なＰＫＵ患者ではＰＡＷは
正常の１％以下の活性をもった構造的に変化した状態で
存在することがみつけられ（パーツローム等、ペデアト
リク・リサーチ、第９巻、８９９−９０３頁、１９７５
年）、ＰＫＵがＰＡＨ遺伝子それ自体の変異の直接的な
結果であることを示唆している。さらに、フェニルアラ
ニン過血症の人の肝生検試料のＰＡＲ活性を分析すると
、２〜３５％の範囲である正常な活性レベルの約５％し
かその酵素が含まれないことを示した。その証拠はフェ
ニルアラニン過血症の人の低い酵素活性は正常酵素の５
％が存在することによるのではなく正常酵素や古典的な
ＰＫＵの患者からの酵素とは別の動力学的性質の変性し
たＦＡＩ（が存在することによるのではないかというこ
とを示している。
この結果は明らかに、ＰＡＨ欠損の多様な表現型かつ存
在することを示しており、おそらく、ＰＡ■１遺伝子座
のいろいろな位置で変異が起っていることによると思わ
れる。
在することを示しており、おそらく、ＰＡ■１遺伝子座
のいろいろな位置で変異が起っていることによると思わ
れる。
フェニルアラニンヒドロキシラーゼのｃＤＮＡクローン
はラットとヒトの肝臓のｃＤＮＡライブラリーから分離
された。我々が出した初期の特許出願番号ＮＯ，４８４
，８］ＩＮＯ，６００，２５４、ｔｌ、びネイチに、第
３０６巻、 １５１−１５５頁（１９８３年）の報文は
ヒトのＰＨＡ遺伝子座にあるＲＦＬＰを同定するために
ＰＡＨのメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３′半分
を表わすヒトのＰＡＨｃＤＮＡクローンを使うことを明
らかにしている。その多型性は制限酵素Ｍｓｐ Ｉ、Ｓ
ｐｈ Ｉ 、ＨｉｎｄｌｌＩを使ってみつけられ、１人
またはそれ以上の影響をうけた子供をもったＰＫＵ家系
における変異したＰＡＨ遺伝子の変化を追跡するのに適
用してきた。これらの結果は変異したＰＡＨ遺伝子が病
気の症状とはっきりとわけて考えられことを示している
。部分的なｃＤＮＡクローンによって検出されるＰＡＨ
遺伝子における制限部位の多型性の頻度は理想的な条件
下でも、人口中の７０％のＰＫＵ家系が遺伝的解析の恩
恵をうけることができるという程度のものである。後の
研究で例えば特許出願番号６００．２５４、フォック等
、バイオケミストリー、第２４巻、５５６−５６１頁、
１９８５年、リドスキー等、（アメリカン・ジャーナル
・ヒユーマン・ジェネテイクス、第３７巻、６１９−６
３４頁、１９８５年）は完全な長さのヒトのＰＡＨｃＤ
ＮＡクローンのヌクレオチド配列を使用することが述べ
られている。この有異なＲＦＬＰの数がこれで有意に増
加するけれど、ある家系はなお、この種の遺伝子解析を
利用することができない。
はラットとヒトの肝臓のｃＤＮＡライブラリーから分離
された。我々が出した初期の特許出願番号ＮＯ，４８４
，８］ＩＮＯ，６００，２５４、ｔｌ、びネイチに、第
３０６巻、 １５１−１５５頁（１９８３年）の報文は
ヒトのＰＨＡ遺伝子座にあるＲＦＬＰを同定するために
ＰＡＨのメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３′半分
を表わすヒトのＰＡＨｃＤＮＡクローンを使うことを明
らかにしている。その多型性は制限酵素Ｍｓｐ Ｉ、Ｓ
ｐｈ Ｉ 、ＨｉｎｄｌｌＩを使ってみつけられ、１人
またはそれ以上の影響をうけた子供をもったＰＫＵ家系
における変異したＰＡＨ遺伝子の変化を追跡するのに適
用してきた。これらの結果は変異したＰＡＨ遺伝子が病
気の症状とはっきりとわけて考えられことを示している
。部分的なｃＤＮＡクローンによって検出されるＰＡＨ
遺伝子における制限部位の多型性の頻度は理想的な条件
下でも、人口中の７０％のＰＫＵ家系が遺伝的解析の恩
恵をうけることができるという程度のものである。後の
研究で例えば特許出願番号６００．２５４、フォック等
、バイオケミストリー、第２４巻、５５６−５６１頁、
１９８５年、リドスキー等、（アメリカン・ジャーナル
・ヒユーマン・ジェネテイクス、第３７巻、６１９−６
３４頁、１９８５年）は完全な長さのヒトのＰＡＨｃＤ
ＮＡクローンのヌクレオチド配列を使用することが述べ
られている。この有異なＲＦＬＰの数がこれで有意に増
加するけれど、ある家系はなお、この種の遺伝子解析を
利用することができない。
新しい完全な長さをもったｃＤＮＡプローブ（検出子）
は我々がこれまで３’−ＰＡＨｃＤＮＡプローブでは検
出できなかった６種のＲＦＬＰを検出する。これらは五
速Ｒ１，ガＪ、Ｕ、ハ四Ｉ、五速ＲＶ、ハ坐■（ａ）、
ハ世ＩＩ （ｂ）を表わす付加的な多型性がマツピング
されており、ＰＡＨ遺伝子の中かそのすぐ側の染色体上
の配列に存在している（デイジタ等、バイオケミストリ
ー、第２５巻、７４３−７４９頁、１９８６頁）。ＰＡ
Ｈ遺伝子座における８つの多型性をもった制限酵素部位
を少くとも１人のＰＫＵの子供を含む３３人のデンマー
クの家族について分析した。デンマークの全人口につい
ての研究によれば、ハプロタイプの数に多くの変異がみ
られ１２種がみつけられた。しかしこのことは理論値で
ある１９３６のハプロタイプに比べると少数である。か
くしてここに遺伝子それ自体の中のＲＦＬＰがすぐ近く
に結合していて、結合が不安定であることがあるという
証拠になっている。完全な長さのｃＤＮＡと制限エンド
ヌクレアーゼをもったデンマーク人の全体にみられる８
７％に増加した変異の量をもって（ディシャー等、ラン
セット、Ｉ、２２９−２３２頁、１９８６年）、この遺
伝的な技術を利用することのできない家系がなお存在し
ている。さらに、この技術はその家系がこの方法を利用
できる前にＰＫＵの遺伝形質をもった最初の人を確める
必要があるという不利がある。これらの問題を克服する
ために特殊な変異を同定し、変化したＰＡＨ遺伝子をも
たらす特殊な変異を検出する方法を開発する研究が設定
された。
は我々がこれまで３’−ＰＡＨｃＤＮＡプローブでは検
出できなかった６種のＲＦＬＰを検出する。これらは五
速Ｒ１，ガＪ、Ｕ、ハ四Ｉ、五速ＲＶ、ハ坐■（ａ）、
ハ世ＩＩ （ｂ）を表わす付加的な多型性がマツピング
されており、ＰＡＨ遺伝子の中かそのすぐ側の染色体上
の配列に存在している（デイジタ等、バイオケミストリ
ー、第２５巻、７４３−７４９頁、１９８６頁）。ＰＡ
Ｈ遺伝子座における８つの多型性をもった制限酵素部位
を少くとも１人のＰＫＵの子供を含む３３人のデンマー
クの家族について分析した。デンマークの全人口につい
ての研究によれば、ハプロタイプの数に多くの変異がみ
られ１２種がみつけられた。しかしこのことは理論値で
ある１９３６のハプロタイプに比べると少数である。か
くしてここに遺伝子それ自体の中のＲＦＬＰがすぐ近く
に結合していて、結合が不安定であることがあるという
証拠になっている。完全な長さのｃＤＮＡと制限エンド
ヌクレアーゼをもったデンマーク人の全体にみられる８
７％に増加した変異の量をもって（ディシャー等、ラン
セット、Ｉ、２２９−２３２頁、１９８６年）、この遺
伝的な技術を利用することのできない家系がなお存在し
ている。さらに、この技術はその家系がこの方法を利用
できる前にＰＫＵの遺伝形質をもった最初の人を確める
必要があるという不利がある。これらの問題を克服する
ために特殊な変異を同定し、変化したＰＡＨ遺伝子をも
たらす特殊な変異を検出する方法を開発する研究が設定
された。
発明の目的
従って本発明はＰＡＨ座に起こった変異に特異−３５＝
的なプローブを設計し合成することを向けられている。
好ましいことにこの発明は以前の家系の経歴を必要とせ
ずに遺伝的性質を検出するための簡単な方法を提供して
いる。オリゴヌクレオチドの合成法とこれらのオリゴヌ
クレオチドプローブをヒトの遺伝的症患であるＰＫＵの
出生前検診とＰＡ）Ｉ欠損形質の保持者の検出に使うこ
とにも向けられている。このオリゴヌクレオチドプロー
ブはヒトの染色体ＤＮＡを解析する方法を開発するハイ
ブリダイゼーションプローブとして使われている。この
方法はイントロン／エクソンの１２ジヤンクシヨンでＧ
（グアニン）がＡ（アデニン）に置換していることを検
出する。デンマーク人全体で調査したところではＰＫＵ
は限られた数の変異によって起されており、ＰＫＵ変異
の大多数はＦＡＩ（遺伝子における４つの共通なＲＦＬ
Ｐハプロタイプと関連しているということが示されてい
る。全般的な集団での変異の場所を直接分析するための
方法を開発するため、そして従ってＰＫＵを出生前に検
出し変異形質発生者を確認することなしにＰＫＵのキャ
リアーを検出するためのモデルとしてデンマーク人の集
団が使われよう。
ずに遺伝的性質を検出するための簡単な方法を提供して
いる。オリゴヌクレオチドの合成法とこれらのオリゴヌ
クレオチドプローブをヒトの遺伝的症患であるＰＫＵの
出生前検診とＰＡ）Ｉ欠損形質の保持者の検出に使うこ
とにも向けられている。このオリゴヌクレオチドプロー
ブはヒトの染色体ＤＮＡを解析する方法を開発するハイ
ブリダイゼーションプローブとして使われている。この
方法はイントロン／エクソンの１２ジヤンクシヨンでＧ
（グアニン）がＡ（アデニン）に置換していることを検
出する。デンマーク人全体で調査したところではＰＫＵ
は限られた数の変異によって起されており、ＰＫＵ変異
の大多数はＦＡＩ（遺伝子における４つの共通なＲＦＬ
Ｐハプロタイプと関連しているということが示されてい
る。全般的な集団での変異の場所を直接分析するための
方法を開発するため、そして従ってＰＫＵを出生前に検
出し変異形質発生者を確認することなしにＰＫＵのキャ
リアーを検出するためのモデルとしてデンマーク人の集
団が使われよう。
以下はデンマーク人の集団の優性のＰＫＵハプロタイプ
、すなわちハプロタイプ３、に相当する変異したＰＡＩ
（遺伝子の単離を示している。配列を解析した結果はＰ
ＡＨ遺伝子に一つの塩素置換が起こっておりイントロン
１２の５′供与体のつなぎ目部位でＧＴ（グアニン、チ
ミン）がＡＴ（アデニン、チミン）に交換していること
を示していた。オリゴヌクレオチドプローブを使って変
異がデンマーク人の集団のＰＫＵ形質の約４０％を含ん
でいるハプロタイプ３と強く関係していることを示して
いる。その他の民族的人種的グループにおける変異を検
出することによってＰＫＵ変異とハプロタイプの発生、
起源に目を向けさせることになろう。
、すなわちハプロタイプ３、に相当する変異したＰＡＩ
（遺伝子の単離を示している。配列を解析した結果はＰ
ＡＨ遺伝子に一つの塩素置換が起こっておりイントロン
１２の５′供与体のつなぎ目部位でＧＴ（グアニン、チ
ミン）がＡＴ（アデニン、チミン）に交換していること
を示していた。オリゴヌクレオチドプローブを使って変
異がデンマーク人の集団のＰＫＵ形質の約４０％を含ん
でいるハプロタイプ３と強く関係していることを示して
いる。その他の民族的人種的グループにおける変異を検
出することによってＰＫＵ変異とハプロタイプの発生、
起源に目を向けさせることになろう。
この変異は正常のＰＡ）Ｉ遺伝子で先に確立されたＲＦ
ＬＰのパターンに変化をもたらすことはなかったので、
オリゴヌクレオチド法は、特異的な変異を検出するため
に染色体ＤＮＡについて分子生物学的な方法を使用する
ことに向けられている。
ＬＰのパターンに変化をもたらすことはなかったので、
オリゴヌクレオチド法は、特異的な変異を検出するため
に染色体ＤＮＡについて分子生物学的な方法を使用する
ことに向けられている。
これが本発明の目的であり、それはＰＡＨにおける遺伝
的変異に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使い、
個々人の異型接合子の状態を知るための方法に向けられ
ている。さらにこれはＰＫＵを出生前に診断し、検出す
ることに使うことができる。
的変異に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使い、
個々人の異型接合子の状態を知るための方法に向けられ
ている。さらにこれはＰＫＵを出生前に診断し、検出す
ることに使うことができる。
本発明の目的はさらに、ＰＡＨ座のハプロタイプと特異
的な変異をテストするのに使われる診断用キットに向け
られている。
的な変異をテストするのに使われる診断用キットに向け
られている。
好ましいことに、この発明は全般的な集団における変異
したＰＡＨを検出することに使われ、それが本発明の目
的であるがそれはまたある家系にこの方法を利用すると
きにその形質発生者に左右されることがない。
したＰＡＨを検出することに使われ、それが本発明の目
的であるがそれはまたある家系にこの方法を利用すると
きにその形質発生者に左右されることがない。
ある家系にこの方法を利用するのにその形質発生者をま
ず確認することなしにＰＫＵを患った胎児及びＰＫＵ形
質の保持者を同定することが本発明の別の目的であり、
それに向けられている。
ず確認することなしにＰＫＵを患った胎児及びＰＫＵ形
質の保持者を同定することが本発明の別の目的であり、
それに向けられている。
異なる人種的及び民俗的集団でＰＫＵ遺伝子のハプロタ
イプに変異を検出する方法を提供することが本発明のも
う一つの目的であり、それを目指している。この方法は
ヒトにおいてＰＡＨ遺伝子座の起源を同定し、その発生
を追跡するために使われる。この方法の適用はＰＫＵが
いろいろな集団のもつ背景に関わりなく起こる創始者の
影響あるいは複数のＰＫＵ変異によって人種全体に広が
る限られた数の変異をひきおこすかどうかを明らかにす
るだろう。
イプに変異を検出する方法を提供することが本発明のも
う一つの目的であり、それを目指している。この方法は
ヒトにおいてＰＡＨ遺伝子座の起源を同定し、その発生
を追跡するために使われる。この方法の適用はＰＫＵが
いろいろな集団のもつ背景に関わりなく起こる創始者の
影響あるいは複数のＰＫＵ変異によって人種全体に広が
る限られた数の変異をひきおこすかどうかを明らかにす
るだろう。
ＰＫＵを起こすＰＡＨ遺伝子にある変異の発生を分子に
おける変異の起源を明らかにすることが本発明のもう一
つの目的でありそれを目指している。
おける変異の起源を明らかにすることが本発明のもう一
つの目的でありそれを目指している。
さらに適当な被験者を遺伝的に調査することで予備的な
ものとしてＰＫＵの異形接合子とＰＫＵに罹患した人を
同定することを目指す方法を提供することが本発明の目
的である。
ものとしてＰＫＵの異形接合子とＰＫＵに罹患した人を
同定することを目指す方法を提供することが本発明の目
的である。
これまでの家族の履歴を調べることなしに遺伝的形質を
簡単に検出する方法を提供することがもう一つの発明目
的である。
簡単に検出する方法を提供することがもう一つの発明目
的である。
好ましいことに標準的な分子生物学的ＤＮＡ技術が使わ
れプラスミドなどのような成分で市場に容易に利用でき
る、そのような方法を提供することが本発明の別の目的
である。
れプラスミドなどのような成分で市場に容易に利用でき
る、そのような方法を提供することが本発明の別の目的
である。
さらにその他の目的、特徴、利点は発明の目的について
与えられた本発明の実施例を添付した図面と一緒にみれ
ば以下の記載で明らかであろう。
与えられた本発明の実施例を添付した図面と一緒にみれ
ば以下の記載で明らかであろう。
選択された実施例の記載
緒 論
下記の微生物がアメリカ微生物標増株集積所（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ、 １２３０１番地パークローン ドライブ、メ
リーランド州ロックヴイル、２０８５２、Ｕ、Ｓ、Ａ、
）の永久保存株から利用できる。
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ、 １２３０１番地パークローン ドライブ、メ
リーランド州ロックヴイル、２０８５２、Ｕ、Ｓ、Ａ、
）の永久保存株から利用できる。
（以下余白）
＝４１−
４Ｏ−
ＡＴＣＣ３９６４４Ｅ、ｃｏｌｉ ＲＲＩ株（ｐｈ
ＰＡＲ２４７）ＡＴＣＣ３９６６０Ｅ、ｃｏｌｉ Ｅ
Ｄ８７６７（ｃｈ ＰＡＨ１５）ＡＴＣＣ３９６５９Ｅ
、ｃｏｌｉ ＥＤ８７６７（ａｈ ＰＡＨ１０）ＡＴ
ＣＣ３９６６１Ｅ、ｃｏｌｉ ＥＤ８７６７（ｃｈ
ＰＡＲ１４）ＡＴＣＣ３９６５８Ｂ、ｃｏｌｉ ＥＤ
８７６７（ｃｈ ＰＡＨ２５）ＡＴＣＣ６７１３３Ｅ、
ｃｏｌｉ ＥＤ８７６７（ｃ ＰＫＬＩ ２３）
ＡＴＣＣ６７１３２Ｅ、ｃｏｌｉ ＥＤ８７６７（ｃ
ＰＫＵ １）寄託菌はそれらをみつけた申請者
であるハヮード・ヒユーズ・メディカルインスティチュ
ートの保有する特許権にもとづいて一般に利用できる。
ＰＡＲ２４７）ＡＴＣＣ３９６６０Ｅ、ｃｏｌｉ Ｅ
Ｄ８７６７（ｃｈ ＰＡＨ１５）ＡＴＣＣ３９６５９Ｅ
、ｃｏｌｉ ＥＤ８７６７（ａｈ ＰＡＨ１０）ＡＴ
ＣＣ３９６６１Ｅ、ｃｏｌｉ ＥＤ８７６７（ｃｈ
ＰＡＲ１４）ＡＴＣＣ３９６５８Ｂ、ｃｏｌｉ ＥＤ
８７６７（ｃｈ ＰＡＨ２５）ＡＴＣＣ６７１３３Ｅ、
ｃｏｌｉ ＥＤ８７６７（ｃ ＰＫＬＩ ２３）
ＡＴＣＣ６７１３２Ｅ、ｃｏｌｉ ＥＤ８７６７（ｃ
ＰＫＵ １）寄託菌はそれらをみつけた申請者
であるハヮード・ヒユーズ・メディカルインスティチュ
ートの保有する特許権にもとづいて一般に利用できる。
しかしながら寄託菌を利用することは政府の働きで認め
られた特許権が減損する状態で当該の発明を実施するた
めのライセンスを制定したものではないと心得るべきで
ある。
られた特許権が減損する状態で当該の発明を実施するた
めのライセンスを制定したものではないと心得るべきで
ある。
制限酵素断片の長さのポリモルフイズム（ＲＦＬＰ）は
遺伝子型のレベルにおいてヒトに変化があることを解析
した例である。これらの多形性は表現型の多形性すなわ
ち全集団の中や間での異質性を述べぬための蛋白の電気
泳動上の変異＝４２− のようによく用いることができる。ＲＦＬＰと未知の場
所との間の結合を分析したあるしはＲＦＬＰを同定する
ために使われるプローブのごく近くに存在したりしっか
りと結合していたりする形質を十分に解析したりするこ
とがこの例になる。
遺伝子型のレベルにおいてヒトに変化があることを解析
した例である。これらの多形性は表現型の多形性すなわ
ち全集団の中や間での異質性を述べぬための蛋白の電気
泳動上の変異＝４２− のようによく用いることができる。ＲＦＬＰと未知の場
所との間の結合を分析したあるしはＲＦＬＰを同定する
ために使われるプローブのごく近くに存在したりしっか
りと結合していたりする形質を十分に解析したりするこ
とがこの例になる。
我々はハイブリダイゼーションプローブとして完全な長
さのｃＤＮＡを使うことによってフェニルアラニンヒド
ロキシラーゼ座における多くのＲＦＬＰをみつけた。こ
の多形性は頻度が高く、高濃度の異形接合子を示唆して
いる。
さのｃＤＮＡを使うことによってフェニルアラニンヒド
ロキシラーゼ座における多くのＲＦＬＰをみつけた。こ
の多形性は頻度が高く、高濃度の異形接合子を示唆して
いる。
ＰＡ）ｌ座でＲＦＬＰを同定し位置を決めるためのヒト
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ｃＤＮＡ
プローブを使うと理論的に全部で１９３６のハプロタイ
プを同定できるはずである。しかしながら、デンマーク
の全人口でフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の研究で、我
々はわずか１２のハプロタイプを観察した。この１２の
ハプロタイプは第１表にこれら制限エンドヌクレアーゼ
切断部位によって定義されている。これらのハプロタイ
プの分布と変異をもったプローブと正常プローブの結合
が第２表に示されている。第２表からＰＫＵや正常遺伝
子は全ハプロタイプに分布しているけれども大多数の正
常遺伝子はハプロタイプ１゜４であり、一方、大多数の
ＰＫＵ遺伝子はハプロタイプ１，２，３．４であり中で
も最も大きい群はハプロタイプ３であることが明らかで
ある。
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ｃＤＮＡ
プローブを使うと理論的に全部で１９３６のハプロタイ
プを同定できるはずである。しかしながら、デンマーク
の全人口でフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の研究で、我
々はわずか１２のハプロタイプを観察した。この１２の
ハプロタイプは第１表にこれら制限エンドヌクレアーゼ
切断部位によって定義されている。これらのハプロタイ
プの分布と変異をもったプローブと正常プローブの結合
が第２表に示されている。第２表からＰＫＵや正常遺伝
子は全ハプロタイプに分布しているけれども大多数の正
常遺伝子はハプロタイプ１゜４であり、一方、大多数の
ＰＫＵ遺伝子はハプロタイプ１，２，３．４であり中で
も最も大きい群はハプロタイプ３であることが明らかで
ある。
（以下余白）
’ −４３−
一羽−
１２種だけのハプロタイプをみることで多形性のある部
位の間にある結合の不均衡性が高いことが考えられる。
位の間にある結合の不均衡性が高いことが考えられる。
デンマーク人の集団における明らかなハプロタイプのＰ
ＫＬＩ遺伝子座の中の強い関連は欠陥のあるＰＡＮを解
析するために変異している遺伝子を選択するのに使われ
た。この特許申請において我々はＰＫＵに冒されたハプ
ロタイプの大多数を表わすハプロタイプ２と３及び同時
に少数の正常な対立遺伝子を選択した。
ＫＬＩ遺伝子座の中の強い関連は欠陥のあるＰＡＮを解
析するために変異している遺伝子を選択するのに使われ
た。この特許申請において我々はＰＫＵに冒されたハプ
ロタイプの大多数を表わすハプロタイプ２と３及び同時
に少数の正常な対立遺伝子を選択した。
デンマーク人のＰＫＵ遺伝子の大多数は４つの共通のハ
プロタイプに限られ、その中の２つの正常な遺伝子のハ
プロタイプによく表われるということは興味深い。例え
ば正常なＰＡＨ遺伝子の約７５％がハプロタイプ１と４
に限られている（第２表）。ＰＫＵ対立形質の多くもこ
れら２つのハプロタイプに関連しており、ＰＫＵ変異が
共通のハプロタイプの背景から生じていることを示唆し
ている。デンマーク人のＰＫＵ対立形質の約６０％は２
つのハプロタイプ、すなわちハプロタイプ２と３によっ
て代表される（第２表）。
プロタイプに限られ、その中の２つの正常な遺伝子のハ
プロタイプによく表われるということは興味深い。例え
ば正常なＰＡＨ遺伝子の約７５％がハプロタイプ１と４
に限られている（第２表）。ＰＫＵ対立形質の多くもこ
れら２つのハプロタイプに関連しており、ＰＫＵ変異が
共通のハプロタイプの背景から生じていることを示唆し
ている。デンマーク人のＰＫＵ対立形質の約６０％は２
つのハプロタイプ、すなわちハプロタイプ２と３によっ
て代表される（第２表）。
＝４６−
ハプロタイプ１と４と関連したＰＫＵ対立形質と反対に
、ハプロタイプ２と３は殆ん正常の対立形質を含まない
。これらのハプロタイプの背景に起ったＰＫＵにみられ
る変異が創始者効果によってデンマーク人全体に広がっ
ている。
、ハプロタイプ２と３は殆ん正常の対立形質を含まない
。これらのハプロタイプの背景に起ったＰＫＵにみられ
る変異が創始者効果によってデンマーク人全体に広がっ
ている。
（以下余白）
従って我々は数の多いＰＫＵハプロタイプ２及び３の変
異にしているＰＡＨ遺伝子を分子的にクローニングした
ことを述べる。ハプロタイプ２遺伝子の配列解析によっ
て遺伝子中の変異部位はエクソン１２においてヌクレオ
チドのシトシン（ｃ）がヌクレオチドのチミン（Ｔ）に
置換された只一つの例外をもっているが正常ＰＡＨ遺伝
子のそれと同一であることが示されている。ハプロタイ
プ３の遺伝子を同様に配列解析し、イントロン１２の５
′末端を与える切断部位にある単一の塩基置換がハプロ
タイプ３における変異に関わっていることを示した。こ
の例ではヌクレオチドのグアニン（Ｇ）がヌクレオチド
のアデニン（Ａ）に置換えられている。遺伝的な置換に
特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使って遺伝子の
ハイブリダイゼーション分析をすると各々の変異がデン
マーク全人口において相当するＰＫＵハプロタイプと絶
対的な関連があることが示された（第２表）。変異して
いるハプロタイプ２プローブはハプロタイプ２のＰＫＵ
変異遺伝子にのみハイブリダイズする。さらに、変異し
ているハプロタイプ３プローブはハプロタイプ３のＰＫ
Ｕ変異遺伝子とのみハイブリダイズするが正常のハプロ
タイプ３プローブは他のハプロタイプの正常、変異によ
らず全てにハイブリダイズする。このハプロタイプと変
異の間にある強い関係はプローブによってＰＫＵ形質を
前向きに同定するのに役立つであろう。
異にしているＰＡＨ遺伝子を分子的にクローニングした
ことを述べる。ハプロタイプ２遺伝子の配列解析によっ
て遺伝子中の変異部位はエクソン１２においてヌクレオ
チドのシトシン（ｃ）がヌクレオチドのチミン（Ｔ）に
置換された只一つの例外をもっているが正常ＰＡＨ遺伝
子のそれと同一であることが示されている。ハプロタイ
プ３の遺伝子を同様に配列解析し、イントロン１２の５
′末端を与える切断部位にある単一の塩基置換がハプロ
タイプ３における変異に関わっていることを示した。こ
の例ではヌクレオチドのグアニン（Ｇ）がヌクレオチド
のアデニン（Ａ）に置換えられている。遺伝的な置換に
特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使って遺伝子の
ハイブリダイゼーション分析をすると各々の変異がデン
マーク全人口において相当するＰＫＵハプロタイプと絶
対的な関連があることが示された（第２表）。変異して
いるハプロタイプ２プローブはハプロタイプ２のＰＫＵ
変異遺伝子にのみハイブリダイズする。さらに、変異し
ているハプロタイプ３プローブはハプロタイプ３のＰＫ
Ｕ変異遺伝子とのみハイブリダイズするが正常のハプロ
タイプ３プローブは他のハプロタイプの正常、変異によ
らず全てにハイブリダイズする。このハプロタイプと変
異の間にある強い関係はプローブによってＰＫＵ形質を
前向きに同定するのに役立つであろう。
デンマーク人のＰＫＵハプロタイプ２及び３での変異に
ついてみると、この特殊な変異のハプロタイプの起源を
説明するのにいくつかの証拠が創始者効果の仮説を支持
している。アイルランドにおいて最も高い遺伝子頻度を
もち北欧や南欧で次第に減少している普及度をもったＰ
ＫＵはコーカサス人の疾患に数多いようである。結局、
ＰＫＵ対立遺伝子はケルト人が起源で、創始原理によっ
てヨーロッパの全人口へ東方に向けて広まった。デンマ
ークで確立された現在のＰＡＨ−ＲＦＬＰハプロタイプ
は欧州やアメリカを通して異なった人種や民族的なグル
ープもみつけられ、そのハプロタイプはヒトの民族が分
散する以前に端を発していることを示している。かくし
てプローブに特異的な変異はいろいろな別の人間集団で
この変異の試験に存在するハプロタイプとの関連に強力
な方法を提供している。ハプロタイプ３に同定される供
与体切断による変異とデンマーク人類のハプロタイプ２
におけるアミノ酸の置換による変異の間に密接に関与し
ていることを分析が示している。さらに研究すると、ス
イス、スコツトランド、アイルランド、イングランド、
イタリー、などの人口集団に限らずその他のコーカサス
人種における変異も同定されている。
ついてみると、この特殊な変異のハプロタイプの起源を
説明するのにいくつかの証拠が創始者効果の仮説を支持
している。アイルランドにおいて最も高い遺伝子頻度を
もち北欧や南欧で次第に減少している普及度をもったＰ
ＫＵはコーカサス人の疾患に数多いようである。結局、
ＰＫＵ対立遺伝子はケルト人が起源で、創始原理によっ
てヨーロッパの全人口へ東方に向けて広まった。デンマ
ークで確立された現在のＰＡＨ−ＲＦＬＰハプロタイプ
は欧州やアメリカを通して異なった人種や民族的なグル
ープもみつけられ、そのハプロタイプはヒトの民族が分
散する以前に端を発していることを示している。かくし
てプローブに特異的な変異はいろいろな別の人間集団で
この変異の試験に存在するハプロタイプとの関連に強力
な方法を提供している。ハプロタイプ３に同定される供
与体切断による変異とデンマーク人類のハプロタイプ２
におけるアミノ酸の置換による変異の間に密接に関与し
ていることを分析が示している。さらに研究すると、ス
イス、スコツトランド、アイルランド、イングランド、
イタリー、などの人口集団に限らずその他のコーカサス
人種における変異も同定されている。
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）は主に肝
にみられるので、しっかりとした特徴づけをすることは
容易でない。その酵素の生化学については多くの疑問が
未解決のままである。
にみられるので、しっかりとした特徴づけをすることは
容易でない。その酵素の生化学については多くの疑問が
未解決のままである。
ＰＫＵは臨床的にはよく特徴づけられているが、ＰＡＨ
における分子的な欠陥はこれまで同定されていない。こ
の生まれながらの代謝疾患の研究のための分子生物学的
アプローチはＦＡＩ（のｃＤＮＡのクローニングで始ま
った。染色体ＰＡＨ遺伝子におけるＲＦＬＰはＰＫＵの
研究にとって有用な道具であることが示された。
における分子的な欠陥はこれまで同定されていない。こ
の生まれながらの代謝疾患の研究のための分子生物学的
アプローチはＦＡＩ（のｃＤＮＡのクローニングで始ま
った。染色体ＰＡＨ遺伝子におけるＲＦＬＰはＰＫＵの
研究にとって有用な道具であることが示された。
本発明では正常なＰＡＨ遺伝子と変異したＰＡＨ遺伝子
を区別できる特異的なオリゴヌクレオチドプローブが同
定されている。変異した遺伝子と正常遺伝子の結合の関
係を決めるためにプローブの存在と家系の研究を必要と
したこれまでの努力とちがって、このオリゴヌクレオチ
ドプローブは一般的な集団においての変異した遺伝子を
検出するのに使われる。変異しているハプロタイプ２と
ハプロタイプ３を区分することは異形接合子（変異した
ＰＫＵ遺伝子と正常遺伝子をもった者）の相当する正常
遺伝子とＰＫＵの遺伝子（２本のＰＫＵ疾患遺伝子をも
った者）かられけることができる。
を区別できる特異的なオリゴヌクレオチドプローブが同
定されている。変異した遺伝子と正常遺伝子の結合の関
係を決めるためにプローブの存在と家系の研究を必要と
したこれまでの努力とちがって、このオリゴヌクレオチ
ドプローブは一般的な集団においての変異した遺伝子を
検出するのに使われる。変異しているハプロタイプ２と
ハプロタイプ３を区分することは異形接合子（変異した
ＰＫＵ遺伝子と正常遺伝子をもった者）の相当する正常
遺伝子とＰＫＵの遺伝子（２本のＰＫＵ疾患遺伝子をも
った者）かられけることができる。
この分析法はテストすべき人のＤＮＡ試料を集めること
を必要とする。染色体のＤＮＡを末梢血白血球から分離
する。分離した染色体ＤＮＡが分−５２〜 折のために標的となるＤＮＡである。同様に、ＤＮＡ分
析のためには胎児のものからも細胞を採取できる。これ
には羊水、胎児の生検試料、漿膜の絨毛などが含まれる
。
を必要とする。染色体のＤＮＡを末梢血白血球から分離
する。分離した染色体ＤＮＡが分−５２〜 折のために標的となるＤＮＡである。同様に、ＤＮＡ分
析のためには胎児のものからも細胞を採取できる。これ
には羊水、胎児の生検試料、漿膜の絨毛などが含まれる
。
コスミド性の染色体ＤＮＡライブラリーをハプロタイプ
２またはハプロタイプ３のいずれかが同形質のＰＫＵの
者から分離した白血球ＤＮＡで作製した。そのライブラ
リーを完全な長さをもったヒトのＰＡＨｃＤＮＡプロー
ブで検索して、いくつかの相応する染色体クローンを分
離した。第１図は約１３５Ｋｂの長さをもつ近接した染
色体ＤＮＡの５つの重なった部分のあるコスミドクロー
ンを含む変異のある遺伝子についてのＥｃｏＲＩ制限地
図を示している。そのデータは正常なＰＡＨ遺伝子をも
つ者からも同様なＥｃｏＲＩ制限地図が作られるので、
ＰＫＵはこの遺伝子の中に明らかな欠損が起こることに
よるものでないことを示している。
２またはハプロタイプ３のいずれかが同形質のＰＫＵの
者から分離した白血球ＤＮＡで作製した。そのライブラ
リーを完全な長さをもったヒトのＰＡＨｃＤＮＡプロー
ブで検索して、いくつかの相応する染色体クローンを分
離した。第１図は約１３５Ｋｂの長さをもつ近接した染
色体ＤＮＡの５つの重なった部分のあるコスミドクロー
ンを含む変異のある遺伝子についてのＥｃｏＲＩ制限地
図を示している。そのデータは正常なＰＡＨ遺伝子をも
つ者からも同様なＥｃｏＲＩ制限地図が作られるので、
ＰＫＵはこの遺伝子の中に明らかな欠損が起こることに
よるものでないことを示している。
その変異を同定するために、変異している遺伝子の領域
を含むエクソンをＭ１３＋ｎｐ１８にサブクローンし、
配列の解析をした。この方法によって変異している遺伝
子にある１３ケのエクソンの詳細な一次構造が明らかと
なった。
を含むエクソンをＭ１３＋ｎｐ１８にサブクローンし、
配列の解析をした。この方法によって変異している遺伝
子にある１３ケのエクソンの詳細な一次構造が明らかと
なった。
第１図（Ｂ）では変異しているハプロタイプ３のパター
ンが例示されている。イントロン１２の５′−を与える
接合部位がエクソン１２とＭ１３ｍｐ１８のＳｍａ１部
位に挿入された下流のイントロンを含むＨａｅｍの制限
エンドヌクレアーゼ断片上に決定された。変異している
ハプロタイプ３遺伝子の配列は正常なＰＡ）Ｉ遺伝子と
同一であったがイントロン１２のイントロン／エクソン
の境界にある５′−供与接合部位にＧがＡに置換してい
る唯一の例外があった。この変化はあるべきＧＴ供与の
ジヌクレオチドをＡＴに変えている。
ンが例示されている。イントロン１２の５′−を与える
接合部位がエクソン１２とＭ１３ｍｐ１８のＳｍａ１部
位に挿入された下流のイントロンを含むＨａｅｍの制限
エンドヌクレアーゼ断片上に決定された。変異している
ハプロタイプ３遺伝子の配列は正常なＰＡ）Ｉ遺伝子と
同一であったがイントロン１２のイントロン／エクソン
の境界にある５′−供与接合部位にＧがＡに置換してい
る唯一の例外があった。この変化はあるべきＧＴ供与の
ジヌクレオチドをＡＴに変えている。
遺伝子を移入し発現させる実験でこの変異が異常なＰＡ
ＨメツセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を産生し、ＰＡ
Ｈ活性を失わしめることが示された。異常なＲＮＡの開
裂が成熟したｍＲＮＡにおいてエクソン１２をとびこえ
る結果となり、細胞内では不安定の不完全な蛋白産物を
翻訳することになる。
ＨメツセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を産生し、ＰＡ
Ｈ活性を失わしめることが示された。異常なＲＮＡの開
裂が成熟したｍＲＮＡにおいてエクソン１２をとびこえ
る結果となり、細胞内では不安定の不完全な蛋白産物を
翻訳することになる。
ハプロタイプ３に対する正常な特異的プローブを正常遺
伝子の意味をもった鎖〔第２図（Ｂ）〕と相補的になる
よう合成し変異遺伝子の変異部分でＣＡ不適合を作って
いる〔第２図（Ｂ）〕。
伝子の意味をもった鎖〔第２図（Ｂ）〕と相補的になる
よう合成し変異遺伝子の変異部分でＣＡ不適合を作って
いる〔第２図（Ｂ）〕。
変異している特異的プローブのために意味をもった鎖（
センス・ストランド）の配列をしたオリゴヌクレオチド
を合成した。変異の部分でこのプローブは正常遺伝子配
列とＣＡ不適合を作っている〔第２図（Ｂ）〕。夫々の
配列を検出するための２つのオリゴヌクレオチドプロー
ブの特異性を次に正常及び変異の染色体ＤＮＡクローン
を使って検査した。正常と変異しているコスミドクロー
ンの両方から分離された１２ＫｂのＥｃｏＲＩ断片をｐ
ＢＲ３２２に挿入した。エクソン１２プラス意味のない
イントロン配列がＰｖｕＩ［で消化した後に２Ｋｂ断片
の中に含まれている。
センス・ストランド）の配列をしたオリゴヌクレオチド
を合成した。変異の部分でこのプローブは正常遺伝子配
列とＣＡ不適合を作っている〔第２図（Ｂ）〕。夫々の
配列を検出するための２つのオリゴヌクレオチドプロー
ブの特異性を次に正常及び変異の染色体ＤＮＡクローン
を使って検査した。正常と変異しているコスミドクロー
ンの両方から分離された１２ＫｂのＥｃｏＲＩ断片をｐ
ＢＲ３２２に挿入した。エクソン１２プラス意味のない
イントロン配列がＰｖｕＩ［で消化した後に２Ｋｂ断片
の中に含まれている。
第２図（Ｂ）は変異の部分をもったヌクレオチド配列と
オリゴヌクレオチド配列を示している。ＧがＡにかわっ
ているのが星印で示されている。一つの塩基対の不適合
が（ＩＮＡ接合体の二一図一 重構造を不安定にするのに十分であるので、オリゴヌク
レオチドプローブはヒトの染色体で変異しているか正常
な対立形質かを区別するのに使うことができる。
オリゴヌクレオチド配列を示している。ＧがＡにかわっ
ているのが星印で示されている。一つの塩基対の不適合
が（ＩＮＡ接合体の二一図一 重構造を不安定にするのに十分であるので、オリゴヌク
レオチドプローブはヒトの染色体で変異しているか正常
な対立形質かを区別するのに使うことができる。
変異しているハプロタイプ３遺伝子のイントロン１２に
おける５′−接合部位のＧからＡへの変換に加えて、コ
ドン２３２（Ｇ１．ｎ）の第３塩基で沈黙したヌクレオ
チド置換（Ａ−）Ｇ）がこの遺伝子にはあることもみつ
けられた。このヌクレオチド置換はエクソン６のイント
ロン１２の接合変異部分から約１３Ｋｂ上流で旦’ｄｅ
ｌ制限エンドヌクレアーゼ部位を創出する。この制限
酵素部位は正常なフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺
伝子には存在しない。もしこのＤｄｅｌ多形性が接合変
異を含む対立形質と結合上不均衡にあるならば、それも
また変異しているフェニルアラニンヒドロキシラーゼの
対立形質のための診断法として使うことができる。この
方法は変異に関連したＲＦＬＰが直接ｃＤＮＡ、染色体
ＤＮＡあるいは合成オリゴヌクレオチドプローブを使っ
て検出できるのでオリゴヌクレオチドプローブを使うこ
とを要しない。
おける５′−接合部位のＧからＡへの変換に加えて、コ
ドン２３２（Ｇ１．ｎ）の第３塩基で沈黙したヌクレオ
チド置換（Ａ−）Ｇ）がこの遺伝子にはあることもみつ
けられた。このヌクレオチド置換はエクソン６のイント
ロン１２の接合変異部分から約１３Ｋｂ上流で旦’ｄｅ
ｌ制限エンドヌクレアーゼ部位を創出する。この制限
酵素部位は正常なフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺
伝子には存在しない。もしこのＤｄｅｌ多形性が接合変
異を含む対立形質と結合上不均衡にあるならば、それも
また変異しているフェニルアラニンヒドロキシラーゼの
対立形質のための診断法として使うことができる。この
方法は変異に関連したＲＦＬＰが直接ｃＤＮＡ、染色体
ＤＮＡあるいは合成オリゴヌクレオチドプローブを使っ
て検出できるのでオリゴヌクレオチドプローブを使うこ
とを要しない。
ごく限られた配列分析が正常なフェニルアラニンヒドロ
キシラーゼ遺伝子と変異したものについて行われたにす
ぎないので、Ｄｄｅｌと同様な多くの多形性が未解決の
領域として遺伝子になお存在している。もしそれらの沈
黙した変異が一つの変異形質で結合上の不均衡にあるな
らばそれらは異形接合子をもったＰＫｔｌの者と正常者
を区別する方法となりうる。
キシラーゼ遺伝子と変異したものについて行われたにす
ぎないので、Ｄｄｅｌと同様な多くの多形性が未解決の
領域として遺伝子になお存在している。もしそれらの沈
黙した変異が一つの変異形質で結合上の不均衡にあるな
らばそれらは異形接合子をもったＰＫｔｌの者と正常者
を区別する方法となりうる。
変異したハプロタイプ２遺伝子配列はエクソン１２で４
０８番目のアミノ酸のコドンでＣがＴに置換している１
ケ所の例外があるが正常のＰＡＨ遺伝子と同一である。
０８番目のアミノ酸のコドンでＣがＴに置換している１
ケ所の例外があるが正常のＰＡＨ遺伝子と同一である。
第３図（Ａ）に示されているような置換はＣＧＧの３コ
ドンをＴＧＧに変える結果となる。このトリプレットに
おける一〇の塩基変化は違ったアミノ酸をコードする結
果となる。正常な配列はアミノ酸のアルギニンをコード
している。変異している配列はトリプトファンをコード
している。変異している遺伝子の意味をもった鎖に相補
的に合成した変異に特異的なプローブは正常な遺伝子の
意味をもった鎖とに合成した。第３図（Ａ）ではこれが
変異遺伝子配列の変異の部位でＣ−Ａ不適合を作ってい
ることがわかる。
ドンをＴＧＧに変える結果となる。このトリプレットに
おける一〇の塩基変化は違ったアミノ酸をコードする結
果となる。正常な配列はアミノ酸のアルギニンをコード
している。変異している配列はトリプトファンをコード
している。変異している遺伝子の意味をもった鎖に相補
的に合成した変異に特異的なプローブは正常な遺伝子の
意味をもった鎖とに合成した。第３図（Ａ）ではこれが
変異遺伝子配列の変異の部位でＣ−Ａ不適合を作ってい
ることがわかる。
変異したプローブと正常プローブの相応する変異及び正
常配列を検出するために忠実なことは夫々の染色体ＤＮ
Ａクローンを使って保証された。正常と変異したＤＮＡ
クローン相方から分離された１ ２ＫｂのＥｃｏＲＩ断
片をｐＢＲ３２２へ挿入した。
常配列を検出するために忠実なことは夫々の染色体ＤＮ
Ａクローンを使って保証された。正常と変異したＤＮＡ
クローン相方から分離された１ ２ＫｂのＥｃｏＲＩ断
片をｐＢＲ３２２へ挿入した。
変異の部位と相応する無意味の配列がＰ ｖｕＩＩ消化
の後に２Ｋｂ断片中に含まれている。
の後に２Ｋｂ断片中に含まれている。
ハプロタイプ３の変異の解析のために使われた正常及び
変異プローブのＡＴ含量が高いために、塩基組成に関係
のないオリゴヌクレオチド：ハイブリダイゼーシミン法
を点変異を解析するのに使用した。このような条件では
正常なプローブは正常遺伝子の２ＫｂのＰｖｕｌｌ断片
と変異遺伝子に特異的にハイブリダイズする変異プロー
ブとのみハイブリダイズした〔ハプロタイプ３について
は第２図（Ａ）、ハプロタイプ２については第３図（Ｂ
）〕。かくして人人口間の中でＰＫＵに冒された人及び
異形接合子ＰＫＵの染色体ＤＮＡにおける変異形質を同
定し、ＰＫＵ血縁における区分はパターンを決めるのに
合成したオリゴヌクレオチドプローブは有用である。
変異プローブのＡＴ含量が高いために、塩基組成に関係
のないオリゴヌクレオチド：ハイブリダイゼーシミン法
を点変異を解析するのに使用した。このような条件では
正常なプローブは正常遺伝子の２ＫｂのＰｖｕｌｌ断片
と変異遺伝子に特異的にハイブリダイズする変異プロー
ブとのみハイブリダイズした〔ハプロタイプ３について
は第２図（Ａ）、ハプロタイプ２については第３図（Ｂ
）〕。かくして人人口間の中でＰＫＵに冒された人及び
異形接合子ＰＫＵの染色体ＤＮＡにおける変異形質を同
定し、ＰＫＵ血縁における区分はパターンを決めるのに
合成したオリゴヌクレオチドプローブは有用である。
変異が正常なハプロタイプ対立遺伝子の構成的部分でな
いことを確めるために、同じ正常と変異したハプロタイ
プ対立遺伝子を持つＰＫＵ家系を分析した。正常と変異
の両方のハプロタイプの対立遺伝子をもつ者は相方のプ
ローブとハイブリダイズし、正常のハプロタイプをもつ
者は正常プローブのみとハイブリダイズし、変異してい
るハプロタイプの者は変異プローブとのみハイブリダイ
ズする。第２表はプローブの特異性を示している。変異
ハプロタイプ２プローブは変異しているハプロタイプ２
対立遺伝子にのみ結合し、変異ハプロタイプ３プローブ
は変異しているハプロタイプ３対立遺伝子とのみ結合し
た。正常プローブはその相応する変異遺伝子ハプロタイ
プ以外の全てのハプロタイプと結合した。正常ハプロタ
イプ３プローブにおけるデータのみが示されているが、
同様な結果は正常ハプロタイププローブでも得られた。
いことを確めるために、同じ正常と変異したハプロタイ
プ対立遺伝子を持つＰＫＵ家系を分析した。正常と変異
の両方のハプロタイプの対立遺伝子をもつ者は相方のプ
ローブとハイブリダイズし、正常のハプロタイプをもつ
者は正常プローブのみとハイブリダイズし、変異してい
るハプロタイプの者は変異プローブとのみハイブリダイ
ズする。第２表はプローブの特異性を示している。変異
ハプロタイプ２プローブは変異しているハプロタイプ２
対立遺伝子にのみ結合し、変異ハプロタイプ３プローブ
は変異しているハプロタイプ３対立遺伝子とのみ結合し
た。正常プローブはその相応する変異遺伝子ハプロタイ
プ以外の全てのハプロタイプと結合した。正常ハプロタ
イプ３プローブにおけるデータのみが示されているが、
同様な結果は正常ハプロタイププローブでも得られた。
かくしてハプロタイプ３の接合部変異とハプロタイプ２
のアミノ酸置換変異ともそれぞれの正常ハプロタイプ対
立遺伝子は構成的部分ではない。同様に、変異プローブ
は他の変異している対立遺伝子を持つＰＫＬＩ家系とハ
イブリダイズした。変異プローブはこれらの人から分離
したＤＮＡとハイブリダイズしなかった。これらのデー
タ（第２表）はハプロタイプ２と３以外の対立遺伝子に
関連したＰＫＵ変異が同じ変異でなく、ＰＫＵ疾患の起
源の多様性の理論と一致していることを示している。そ
の結果はそれぞれのハプロタイプはそれぞれ自分の変異
を含んである。さらに試験することでハプロタイプ２及
び３以外のハプロタイプと関連したこれらの特異な変異
を決めることができよう。
のアミノ酸置換変異ともそれぞれの正常ハプロタイプ対
立遺伝子は構成的部分ではない。同様に、変異プローブ
は他の変異している対立遺伝子を持つＰＫＬＩ家系とハ
イブリダイズした。変異プローブはこれらの人から分離
したＤＮＡとハイブリダイズしなかった。これらのデー
タ（第２表）はハプロタイプ２と３以外の対立遺伝子に
関連したＰＫＵ変異が同じ変異でなく、ＰＫＵ疾患の起
源の多様性の理論と一致していることを示している。そ
の結果はそれぞれのハプロタイプはそれぞれ自分の変異
を含んである。さらに試験することでハプロタイプ２及
び３以外のハプロタイプと関連したこれらの特異な変異
を決めることができよう。
材料と方法
この発明においては具合よく標準的な化学薬品が使われ
た。素材、材料はコスミドベクターｐｃＶ１０７、Ｅ
、 ｃｏｌｉ株（カリフォルニア大学サンフランシス３
校のＹ、Ｆ、ラウとｙ、ｗ、カンの両氏から譲渡された
）、制限エンドヌクレアーゼにューイングランド・バイ
オラプス）、Ｍ１３ｍｐ１８とジデオキシヌクレオチド
配列決定キット用品（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）、ラジ
オヌクレオチド（アマージャム社）、テトラメチルアン
モニウムクロライド（アルドリッチ社）、オートラジオ
グラフ用品（デュポンアントコダック）等を含んでいる
。
た。素材、材料はコスミドベクターｐｃＶ１０７、Ｅ
、 ｃｏｌｉ株（カリフォルニア大学サンフランシス３
校のＹ、Ｆ、ラウとｙ、ｗ、カンの両氏から譲渡された
）、制限エンドヌクレアーゼにューイングランド・バイ
オラプス）、Ｍ１３ｍｐ１８とジデオキシヌクレオチド
配列決定キット用品（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）、ラジ
オヌクレオチド（アマージャム社）、テトラメチルアン
モニウムクロライド（アルドリッチ社）、オートラジオ
グラフ用品（デュポンアントコダック）等を含んでいる
。
組換えコスミドクローン
コスミド染色体ライブラリーはハプロタイプ２及び３に
おいて同形の２人のＰＫＵ患者から分離した白血球ＤＮ
Ａから作った。このライブラリーは正常遺伝子について
先に述べたように完全な長さをもったヒトのＰＡＨｃＤ
ＮＡプローブであるｐｈＰＡＨ２４７で検索され（ディ
レラ等、バイオケミストリー、第２５巻、 ７４３−７
４９頁、 １９８６年）、相応する染色体の配列が多く
のポジティブクローンから分離された。ハプロタイプ３
に対しては、コスミドクローンｃＰＫＵ１７． ｃＰＫ
Ｕ１４． ｃＰＫＬ１３０． ｃＰＫＵ１３． ｃＰＫ
Ｕ２３．はラウ・アンド・カン（プロン２５−５２２９
頁、 １９８３年）の方法に従ってコスミドベクターＰ
ＣＶ１０７を使って作った染色体ＤＮＡライブラリーか
ら同定されたヒトの染色体性ＰＡＨ遺伝子のいろいろな
部分を含んである。サザンハイプリダイゼーシ旦ンによ
ってｃＰＫＵ１７． ｃＰＫＵ１４゜ｃＰＫＵ３０ 、
のクローンは遺伝子の５１−末端部分を、ｃＰＫＵ３０
とｃＰＫＵ１３は中央の部分を、ｃＰＫＵ１３とｃＰＫ
Ｕ２３は３′末端部分を含んでいるｅ５つの重なり部分
のあるコスミドクローンはＰＡＨ座を含む約１３５Ｋｂ
の近接した染色体ＤＮＡである。ハプロタイプ２につい
ては、ｃＰＫＵ１３とｃＰＫＵ １のコスミドクローン
はヒトのＰＡＨ遺伝子の一部分を含んでいる。
おいて同形の２人のＰＫＵ患者から分離した白血球ＤＮ
Ａから作った。このライブラリーは正常遺伝子について
先に述べたように完全な長さをもったヒトのＰＡＨｃＤ
ＮＡプローブであるｐｈＰＡＨ２４７で検索され（ディ
レラ等、バイオケミストリー、第２５巻、 ７４３−７
４９頁、 １９８６年）、相応する染色体の配列が多く
のポジティブクローンから分離された。ハプロタイプ３
に対しては、コスミドクローンｃＰＫＵ１７． ｃＰＫ
Ｕ１４． ｃＰＫＬ１３０． ｃＰＫＵ１３． ｃＰＫ
Ｕ２３．はラウ・アンド・カン（プロン２５−５２２９
頁、 １９８３年）の方法に従ってコスミドベクターＰ
ＣＶ１０７を使って作った染色体ＤＮＡライブラリーか
ら同定されたヒトの染色体性ＰＡＨ遺伝子のいろいろな
部分を含んである。サザンハイプリダイゼーシ旦ンによ
ってｃＰＫＵ１７． ｃＰＫＵ１４゜ｃＰＫＵ３０ 、
のクローンは遺伝子の５１−末端部分を、ｃＰＫＵ３０
とｃＰＫＵ１３は中央の部分を、ｃＰＫＵ１３とｃＰＫ
Ｕ２３は３′末端部分を含んでいるｅ５つの重なり部分
のあるコスミドクローンはＰＡＨ座を含む約１３５Ｋｂ
の近接した染色体ＤＮＡである。ハプロタイプ２につい
ては、ｃＰＫＵ１３とｃＰＫＵ １のコスミドクローン
はヒトのＰＡＨ遺伝子の一部分を含んでいる。
サザンハイプリダイセーションによってｃＰＫＵ １ク
ローンはエクソン８から１３までを含み、一方６ｌ− ｃＰＫＵ１３はエクソン６から１３を含んでいた。
ローンはエクソン８から１３までを含み、一方６ｌ− ｃＰＫＵ１３はエクソン６から１３を含んでいた。
変異している遺伝子と正常遺伝子の配列決定ハプロタイ
プ３について、５つの重複のあるコスミドクローン（ｃ
ＰＫＵ１７． ｃＰＫＵ１４． ｃＰＫＵ３０゜ｃＰＫ
Ｕ１３． ｃＰＫＵ２３）が変異遺伝子を特徴づけるた
めに使われた。特異的なエクソン配列を含むサブクロー
ン化されたＥｃｏＲＩ断片がサンガー等による報告（ハ
組第７４巻、 ５４６３−５４６７、１９７７年）のよ
うにサンガージデオキシヌクレオチド配列分析法に使わ
れた。
プ３について、５つの重複のあるコスミドクローン（ｃ
ＰＫＵ１７． ｃＰＫＵ１４． ｃＰＫＵ３０゜ｃＰＫ
Ｕ１３． ｃＰＫＵ２３）が変異遺伝子を特徴づけるた
めに使われた。特異的なエクソン配列を含むサブクロー
ン化されたＥｃｏＲＩ断片がサンガー等による報告（ハ
組第７４巻、 ５４６３−５４６７、１９７７年）のよ
うにサンガージデオキシヌクレオチド配列分析法に使わ
れた。
直接ゲルハイブリダイゼーション
エクソン９〜１３を含む１２ＫｂのＥａｏＲＩ断片をハ
プロタイプ２または３について正常及び変異しているコ
スミドクローンから分離し、ｐＢ８３２２に挿入された
。サブクローン化したＥｃｏＲＩ断片あるいはヒト染色
体ＤＮＡ全部をＰｖｕＩＩで消化し、１％アガロースゲ
ルで電気泳動にかけられ、エチジウムブロマイドで染色
し、そしてキッド等、ネイチャー、第３０４巻、２３０
−２３４頁、１９８３年に記載されたようにして直接ゲ
ルハイブリダイゼーションで処理された。乾燥したゲル
を正常と変異したＰＡ）！染色体ＤＮＡ配列に特異的な
オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした。
プロタイプ２または３について正常及び変異しているコ
スミドクローンから分離し、ｐＢ８３２２に挿入された
。サブクローン化したＥｃｏＲＩ断片あるいはヒト染色
体ＤＮＡ全部をＰｖｕＩＩで消化し、１％アガロースゲ
ルで電気泳動にかけられ、エチジウムブロマイドで染色
し、そしてキッド等、ネイチャー、第３０４巻、２３０
−２３４頁、１９８３年に記載されたようにして直接ゲ
ルハイブリダイゼーションで処理された。乾燥したゲル
を正常と変異したＰＡ）！染色体ＤＮＡ配列に特異的な
オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした。
エクソン１２プラス意味なしのイントロン配列が２Ｋｂ
のＰｖｕｌｌ断片に含まれている。乾燥したゲルを一晩
３７℃で、ハイブリダイゼーション相溶液１ｍｆｌ中０
．２ｍｇのサケの精子ＤＮＡと２ Ｘ １０’ｃｐｍの
プローブを含む６ ＸＮ’ＥＴ（０，９Ｍ ＮａＣＱ、
６ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．０９Ｍ トリス
、ｐｌ（７，５）中でハイブリダイズする。それからゲ
ルをウッド等のやった方法（胆ハ、第８２巻、１５８５
−１５８８．１９８５年）を次のように修正して洗浄し
た。すなわち、ＴＭＡ（３Ｈテトラメチルアンモニウム
クロライド、２ｍＭＥＤＴＡ、 ５ｍＭトリス、 ｐＨ
８，０）中で○℃、３０分２回洗い、０．２％ＳＤＳを
含むＴＭＡ中で２３℃（３０分間）。
のＰｖｕｌｌ断片に含まれている。乾燥したゲルを一晩
３７℃で、ハイブリダイゼーション相溶液１ｍｆｌ中０
．２ｍｇのサケの精子ＤＮＡと２ Ｘ １０’ｃｐｍの
プローブを含む６ ＸＮ’ＥＴ（０，９Ｍ ＮａＣＱ、
６ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．０９Ｍ トリス
、ｐｌ（７，５）中でハイブリダイズする。それからゲ
ルをウッド等のやった方法（胆ハ、第８２巻、１５８５
−１５８８．１９８５年）を次のように修正して洗浄し
た。すなわち、ＴＭＡ（３Ｈテトラメチルアンモニウム
クロライド、２ｍＭＥＤＴＡ、 ５ｍＭトリス、 ｐＨ
８，０）中で○℃、３０分２回洗い、０．２％ＳＤＳを
含むＴＭＡ中で２３℃（３０分間）。
６０℃（７分間）で各１回そしてＴＭＡ中で２３℃で３
０分間洗った。それからゲルを一８０℃で２枚のクワン
タ■インテンシファイヤースクリーンの間にはさんでオ
ートラジオグラフをとった。
０分間洗った。それからゲルを一８０℃で２枚のクワン
タ■インテンシファイヤースクリーンの間にはさんでオ
ートラジオグラフをとった。
ドツトプロットとスリットプロット分析−図一
ドツトプロットハイブリダイゼーションによる染色体Ｄ
ＮＡ解析はヒトの染色体の中での特殊な配列の同定と定
量を可能にしている。ドツトプロット法では、染色体Ｄ
ＮＡ全体を制限酵素エンドヌクレアーゼで前処理するこ
となくニトロセルロースまたはその他の膜に直接かける
。多数のＤＮＡ試料を膜の上にのせる。消化されたＤＮ
Ａ断片をアガロース電気泳動をしてその泳動されたゲル
からニトロセルロースへＤＮＡをサザン転移することに
よって分離する必要性は軽減されている。
ＮＡ解析はヒトの染色体の中での特殊な配列の同定と定
量を可能にしている。ドツトプロット法では、染色体Ｄ
ＮＡ全体を制限酵素エンドヌクレアーゼで前処理するこ
となくニトロセルロースまたはその他の膜に直接かける
。多数のＤＮＡ試料を膜の上にのせる。消化されたＤＮ
Ａ断片をアガロース電気泳動をしてその泳動されたゲル
からニトロセルロースへＤＮＡをサザン転移することに
よって分離する必要性は軽減されている。
スロットプロット法では、全染色体ＤＮＡ試料をスロッ
ト構造に不動化し核酸が膜の単位面積当り高濃度になる
ようにする。
ト構造に不動化し核酸が膜の単位面積当り高濃度になる
ようにする。
ドツトプロットもスロットプロットでも全染色体ＤＮＡ
は標準法によっては変性している：例えば１０ｍＭ ト
リス、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）を含む５０μ
Ｑで１０分間１００℃に加熱し、氷で急速に冷却し、２
０ Ｘ ＳＳＣで２回稀釈される。サンプルを製造者の
仕様（シュライヒャーアンドシュール社）に従いドツト
プロットあるいはスロットプロット用の多孔濾過器でニ
トロセルロースまたは他の膜にアプライする。ハイブリ
ダイゼーションは乾燥ゲル法と同じである。
は標準法によっては変性している：例えば１０ｍＭ ト
リス、１ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）を含む５０μ
Ｑで１０分間１００℃に加熱し、氷で急速に冷却し、２
０ Ｘ ＳＳＣで２回稀釈される。サンプルを製造者の
仕様（シュライヒャーアンドシュール社）に従いドツト
プロットあるいはスロットプロット用の多孔濾過器でニ
トロセルロースまたは他の膜にアプライする。ハイブリ
ダイゼーションは乾燥ゲル法と同じである。
ポリメラーゼ鎖反応法
遺伝的疾患を起こす一点での変異はポリメラーゼ鎖反応
（ＰＣＲ）法によって検出される（Ｒ，サイキ等、サイ
エンス、第２３０巻、１３５０頁、１９８５年）。
（ＰＣＲ）法によって検出される（Ｒ，サイキ等、サイ
エンス、第２３０巻、１３５０頁、１９８５年）。
この方法では核酸の配列がイン・ヴイトロで指数函数的
に増幅される。ヒトの染色体ＤＮＡは大過剰の２種のオ
リゴヌクレオチドと４種のデオキシリボヌクレオシド三
燐酸塩の存在で変性される。オリゴヌクレオチドは変異
配列に並ぶＤＮＡのセンスストランドと反センスストラ
ンドの相対的な位置で相補的である。これらの条件下で
最初のオリゴヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼで伸延
した産物は第２のオリゴヌクレオチドの鋳型として使え
る。
に増幅される。ヒトの染色体ＤＮＡは大過剰の２種のオ
リゴヌクレオチドと４種のデオキシリボヌクレオシド三
燐酸塩の存在で変性される。オリゴヌクレオチドは変異
配列に並ぶＤＮＡのセンスストランドと反センスストラ
ンドの相対的な位置で相補的である。これらの条件下で
最初のオリゴヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼで伸延
した産物は第２のオリゴヌクレオチドの鋳型として使え
る。
１ｍｇのヒトＤＮＡは夫々の単一なコピー配列５Ｘ １
０−１９モルを含む。ヒトのＰＡＨ遺伝子では、２０−
ｂｂ − サイクルのＰＣＢとするとエクソン１２（１１６ｂＰ）
のレベルが２００，０００倍増加し、Ｏ０１０１モルの
増幅された断片を表わす。１マイクログラムの増幅され
てない染色体ＤＮＡではエクソン１２プラス隣合った配
列は約５０フエントゲラムのＤＮＡを表わしている。同
じ量のＤＮＡがＰＣＲ法で増幅されると、エクソン１２
とそれに隣り合った配列の量は１０ナノグラムに近づく
、この量的な増加はオリゴヌクレオチドプローブをして
十分に少なくしうる。
０−１９モルを含む。ヒトのＰＡＨ遺伝子では、２０−
ｂｂ − サイクルのＰＣＢとするとエクソン１２（１１６ｂＰ）
のレベルが２００，０００倍増加し、Ｏ０１０１モルの
増幅された断片を表わす。１マイクログラムの増幅され
てない染色体ＤＮＡではエクソン１２プラス隣合った配
列は約５０フエントゲラムのＤＮＡを表わしている。同
じ量のＤＮＡがＰＣＲ法で増幅されると、エクソン１２
とそれに隣り合った配列の量は１０ナノグラムに近づく
、この量的な増加はオリゴヌクレオチドプローブをして
十分に少なくしうる。
なぜなら、非特異的な背景の結合は結合の結果を説明す
るのに妨害とならないからである。かくしてプローブが
独特な個人的な配列であることは必要ない。
るのに妨害とならないからである。かくしてプローブが
独特な個人的な配列であることは必要ない。
コドン４０８（ハプロタイプ２の）でエクソン１２の一
点だけの変異（ｃからＴへ）あるいはイントロン１２（
ハプロタイプ３の）の接合部供与変異（ＧをＴへ）を含
む増幅された断片を生産するためにオリゴヌクレオチド
を考案した。ハプロタイプの変異について接合変異のイ
ントロン配列の下流にある意味をもったあるいは反対の
６フー６ 意味のある鎖に相補的なヌクレオチドが利用されている
。最初のオリゴヌクレオチドの産物に相補的に第２のオ
リゴヌクレオチドが作られ、これに接合変異のエクソン
或いはイントロン配列の上流を含ませられる。ハプロタ
イプ２変異に対しては点の変異のエクソン或いはイント
ロン配列の下流の意味をもった、あるいは反意味のある
配列に相補的なオリゴヌクレオチドが利用される。第２
のオリゴヌクレオチドは最初のオリゴヌクレオチドの産
物に相補的に作製され、点のような変異のエクソンまた
はイントロン性の配列の上流を含めることができる。
点だけの変異（ｃからＴへ）あるいはイントロン１２（
ハプロタイプ３の）の接合部供与変異（ＧをＴへ）を含
む増幅された断片を生産するためにオリゴヌクレオチド
を考案した。ハプロタイプの変異について接合変異のイ
ントロン配列の下流にある意味をもったあるいは反対の
６フー６ 意味のある鎖に相補的なヌクレオチドが利用されている
。最初のオリゴヌクレオチドの産物に相補的に第２のオ
リゴヌクレオチドが作られ、これに接合変異のエクソン
或いはイントロン配列の上流を含ませられる。ハプロタ
イプ２変異に対しては点の変異のエクソン或いはイント
ロン配列の下流の意味をもった、あるいは反意味のある
配列に相補的なオリゴヌクレオチドが利用される。第２
のオリゴヌクレオチドは最初のオリゴヌクレオチドの産
物に相補的に作製され、点のような変異のエクソンまた
はイントロン性の配列の上流を含めることができる。
１μｇのヒトのＤＮＡ、１μにの各オリゴヌクレオチド
、１ 、 ５ｍＭの各デオキシヌクレオチド三燐酸を１
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）にとかしたもの、５０
ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムを１０
０℃、５分間加熱してから水浴で冷却した。
、１ 、 ５ｍＭの各デオキシヌクレオチド三燐酸を１
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）にとかしたもの、５０
ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムを１０
０℃、５分間加熱してから水浴で冷却した。
５単位のフレノウ断片を加え、２５℃で２分間反応させ
た。加熱、冷却、酵素添加、反応というサイクルを２０
回くり返した。それから反応物を前述のスロットプロッ
トまたはドツトプロット法でニトロセルロース濾紙また
はその他の膜にのせた。変異のある配列はこの特許での
べられた方法のどれかによって検出される。ＰＣＲ手法
はゲル電気泳動や制限酵素による消化によって一点にお
ける変異を分析する必要がない。さらに特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブはバックグラウンドの上に感度に
おいて２００，０００倍増加できるために非常に短いも
のでよい。
た。加熱、冷却、酵素添加、反応というサイクルを２０
回くり返した。それから反応物を前述のスロットプロッ
トまたはドツトプロット法でニトロセルロース濾紙また
はその他の膜にのせた。変異のある配列はこの特許での
べられた方法のどれかによって検出される。ＰＣＲ手法
はゲル電気泳動や制限酵素による消化によって一点にお
ける変異を分析する必要がない。さらに特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブはバックグラウンドの上に感度に
おいて２００，０００倍増加できるために非常に短いも
のでよい。
この感度の増加は変異を検出するためにどのＤＮＡ鎖を
使うことも可能にしている。一般的には望ましいＤＮＡ
鎖はＣ−Ａの不適合を形成するものである。Ｇ−Ｔ不適
合は若干の相補を示し、従って変異を検出するのにそれ
ほど効果的でない。しかしながら、ＤＮＡ配列の増幅に
よって感度を約２００，０００倍高められる。この条件
下でＧ−Ｔの部分的な相補性は変異の検出を妨げない。
使うことも可能にしている。一般的には望ましいＤＮＡ
鎖はＣ−Ａの不適合を形成するものである。Ｇ−Ｔ不適
合は若干の相補を示し、従って変異を検出するのにそれ
ほど効果的でない。しかしながら、ＤＮＡ配列の増幅に
よって感度を約２００，０００倍高められる。この条件
下でＧ−Ｔの部分的な相補性は変異の検出を妨げない。
Ｇ−Ｔ不適合は感度を上げることで検出は可能である。
特異的なオリゴヌクレオチドを使ったＰＣＲ法とドツト
プロット／スロットプロット法はともに、ＰＫＵキャリ
アーの集団検診を行うのに容易に自動化できる。いろい
ろなステップで現在利用可能な市販の道具を使うことで
自動化をすることが可能である。
プロット／スロットプロット法はともに、ＰＫＵキャリ
アーの集団検診を行うのに容易に自動化できる。いろい
ろなステップで現在利用可能な市販の道具を使うことで
自動化をすることが可能である。
いろいろな器材がＤＮＡ配列を自動的に増幅させるのに
使われる。これらの器材は市販の自動化された配列合成
機と連動されよう。サンプルを自動的に合成機からとり
出し、消化しそしてドツトプロットあるいはスロットプ
ロット検出システムにかけられる。全てのステップで市
販の装置があるので、組み合わせられた系が用意できる
。組合せシステムの主な利点はコストが効率的であるこ
とである。自動化によって個々の一人の分析は相対的に
安価になる。新生児検診のために開発されたものと同様
なレジナ研究室システムが用いられる。すなわち、遺伝
的な疾患を検出するためにプローブが開発されるのでそ
のシステムは拡大させられる。異形接合子の検出が日常
作業になることが予想される。検査される人数や検査さ
れる病気の数が増えるので単位当りのコストは相対的に
安くなるように減少する。個々の検査すべき遺伝的変異
は特異的な配列をもっているだろうから、多数のテスト
が行える。増幅法においては多数の種となる配列が加え
られる。個々の配列をしたＤＮＡは増幅される。個人個
人の染色体を解剖するために特異的なプローブを使うこ
とは簡単なことである。このシステムによっては、多く
の遺伝疾患について一つの試料で分析できる。限定する
わけでないが、例えばこのシステムはのう飽性繊維症、
ハンチントンコレラ症、筋ジストロフィー、フェニルケ
トン尿症、ヘモグロビン欠陥症、テーサックス症その他
の遺伝病を検出できる。
使われる。これらの器材は市販の自動化された配列合成
機と連動されよう。サンプルを自動的に合成機からとり
出し、消化しそしてドツトプロットあるいはスロットプ
ロット検出システムにかけられる。全てのステップで市
販の装置があるので、組み合わせられた系が用意できる
。組合せシステムの主な利点はコストが効率的であるこ
とである。自動化によって個々の一人の分析は相対的に
安価になる。新生児検診のために開発されたものと同様
なレジナ研究室システムが用いられる。すなわち、遺伝
的な疾患を検出するためにプローブが開発されるのでそ
のシステムは拡大させられる。異形接合子の検出が日常
作業になることが予想される。検査される人数や検査さ
れる病気の数が増えるので単位当りのコストは相対的に
安くなるように減少する。個々の検査すべき遺伝的変異
は特異的な配列をもっているだろうから、多数のテスト
が行える。増幅法においては多数の種となる配列が加え
られる。個々の配列をしたＤＮＡは増幅される。個人個
人の染色体を解剖するために特異的なプローブを使うこ
とは簡単なことである。このシステムによっては、多く
の遺伝疾患について一つの試料で分析できる。限定する
わけでないが、例えばこのシステムはのう飽性繊維症、
ハンチントンコレラ症、筋ジストロフィー、フェニルケ
トン尿症、ヘモグロビン欠陥症、テーサックス症その他
の遺伝病を検出できる。
その技術分野に精通する者は一旦プローブが開発されれ
ば、自動的な検診法に容易にくみ入れることができるこ
とを直ちに認識するだろう。
ば、自動的な検診法に容易にくみ入れることができるこ
とを直ちに認識するだろう。
結 果
− ’１０−
デンマークのＰＫＵ家族とコーカサス系の正常者の末梢
血白血球から分離した高分子の染色体性ＤＮＡを多くの
制限酵素で消化した後サザンプロット分析した。多くの
制限酵素があるが我々は次のような酵素を分析に使用し
た：ＢｇＱｍ。
血白血球から分離した高分子の染色体性ＤＮＡを多くの
制限酵素で消化した後サザンプロット分析した。多くの
制限酵素があるが我々は次のような酵素を分析に使用し
た：ＢｇＱｍ。
酵素はこれで全部ということでなくてむしろ容易に利用
できる酵素の例である。
できる酵素の例である。
ＥｃｏＲＶ ： ＥｃｏＲＶ消化によって３つの不変の
断片と４つの３０Ｋｂから２５Ｋｂの対立遺伝子断片が
生じた。３０Ｋｂの断片について同形の者（２つの遺伝
子をもつ）はＥｃｏＲＶ制限部位の多形性を欠いており
、２５Ｋｂ断片について同形の者はそのフェニルアラニ
ンヒドロキシラーゼ遺伝子の各々にＥｃｏＲＶ部位に多
形性を示している。これらの染色体での異形接合子（２
５Ｋｂのの遺伝子１つと３０Ｋｂ断片の遺伝子１つをも
つ）も検出できた。旦力可■：万力色■部位の多形性は
０．２ＫｂＤＮＡ単位の挿入／欠失のために４．４．４
．２．４．ＯＫｂの断片をもつ３つの対立遺伝子型を有
している。
断片と４つの３０Ｋｂから２５Ｋｂの対立遺伝子断片が
生じた。３０Ｋｂの断片について同形の者（２つの遺伝
子をもつ）はＥｃｏＲＶ制限部位の多形性を欠いており
、２５Ｋｂ断片について同形の者はそのフェニルアラニ
ンヒドロキシラーゼ遺伝子の各々にＥｃｏＲＶ部位に多
形性を示している。これらの染色体での異形接合子（２
５Ｋｂのの遺伝子１つと３０Ｋｂ断片の遺伝子１つをも
つ）も検出できた。旦力可■：万力色■部位の多形性は
０．２ＫｂＤＮＡ単位の挿入／欠失のために４．４．４
．２．４．ＯＫｂの断片をもつ３つの対立遺伝子型を有
している。
Ｍｓｐ Ｉ ： ＰＨＡ遺伝子における多形性は２３Ｋ
ｂと１９Ｋｂの２つの対立遺伝子から成っている。
ｂと１９Ｋｂの２つの対立遺伝子から成っている。
Ｘｍｎ Ｉ ： Ｘｍｎ Ｉの多形性を示す制限断片は
６．５Ｋｂと９．４Ｋｂである。
６．５Ｋｂと９．４Ｋｂである。
旦赳Ｒ１旦並ＲＩ分析でＩＩＫ ｂと１７Ｋｂ断片をも
たらす２つの対立遺伝子型の存在が示されている。 “ Ｌ■■：Ｌ■■による消化によって２つの多形性をもっ
たｔ■■制限部位によって作り出さる４つの異なる長さ
をもった断片が示されている。その４つの断片は２つの
対立形質セットに分けられ、夫々（ａ）及び（ｂ）と記
されている。部位（ａ）があることは１９Ｋｂの断片が
その中の６Ｋｂの断片だけがハイブリダイズする２つの
断片に分解することを示している。第２の部位（ｂ）は
１１．５Ｋｂ断片が９．ＩＫｂのハイブリダイズ可能な
断片に分解している結果を示す。１人の人で２セツトの
対立形質の間で全部で１０個のハプロタイプの可能な組
合せがあり得る。
たらす２つの対立遺伝子型の存在が示されている。 “ Ｌ■■：Ｌ■■による消化によって２つの多形性をもっ
たｔ■■制限部位によって作り出さる４つの異なる長さ
をもった断片が示されている。その４つの断片は２つの
対立形質セットに分けられ、夫々（ａ）及び（ｂ）と記
されている。部位（ａ）があることは１９Ｋｂの断片が
その中の６Ｋｂの断片だけがハイブリダイズする２つの
断片に分解することを示している。第２の部位（ｂ）は
１１．５Ｋｂ断片が９．ＩＫｂのハイブリダイズ可能な
断片に分解している結果を示す。１人の人で２セツトの
対立形質の間で全部で１０個のハプロタイプの可能な組
合せがあり得る。
旦１ｌＩＩ：ＰＡＨ遺伝子における１■ＩＩＩの多形性
部位は３．６または１．６Ｋｂの制限酵素断片をもたら
す。
部位は３．６または１．６Ｋｂの制限酵素断片をもたら
す。
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは自動化された固相フォスファイト
トリエステル法（ＳＹＳＴＥＣ社）で合成された。
トリエステル法（ＳＹＳＴＥＣ社）で合成された。
スチュデンキ等（ＤＮＡ、第３巻、７−１５頁、 １９
８４年）のプライマー伸長法によって高比活性のプロー
ブを作った（すなわち１１０１ｏｃｐ／μｇ）。このプ
ローブはハイブリダイズする塩基プライマーを伸長する
ことによって鋳型上に合成された。１５ヌクレオチド程
度の小さいプローブが使われているが望ましい例は２１
ヌクレオチドのプローブである。望ましい実施例では、
正常なハプロタイプ３のプローブが２１塩基の鋳型（５
’−ＴＣＣＡＴＴ ＡＡＣＡＧＴ ＡＡＧ ＴＡＡ Ｔ
ＴＴ−３’ ）の上で９塩基プライマー（３’−ＴＴＣ
ＡＴＴ ＡＡＡ−５’）を伸長することで合成された。
８４年）のプライマー伸長法によって高比活性のプロー
ブを作った（すなわち１１０１ｏｃｐ／μｇ）。このプ
ローブはハイブリダイズする塩基プライマーを伸長する
ことによって鋳型上に合成された。１５ヌクレオチド程
度の小さいプローブが使われているが望ましい例は２１
ヌクレオチドのプローブである。望ましい実施例では、
正常なハプロタイプ３のプローブが２１塩基の鋳型（５
’−ＴＣＣＡＴＴ ＡＡＣＡＧＴ ＡＡＧ ＴＡＡ Ｔ
ＴＴ−３’ ）の上で９塩基プライマー（３’−ＴＴＣ
ＡＴＴ ＡＡＡ−５’）を伸長することで合成された。
変異のあるハプロタイプ３プローブは２１塩基の鋳型（
３’−ＡＧＧＴＡＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＴＴＣＡＴＴ
ＡＡＡ−５’ ）上でハイブリダイズされる９塩基プラ
イマー（５’−ＴＣＣＡＴＴ ＡＡＣ−３’）を伸長す
ることで合成した。ハプロタイプ２のブローブを合成す
るのに同様な塩基プライマーと伸長法が用いられた。少
くとも１５ヌクレオチドのプローブがヒトの染色体ＤＮ
Ａにおける一点での変異を特異的に検出するために必要
とされる。望ましい方法では合成によって正常ハプロタ
イプ３プローブ（３′・・・ＡＧＧＴＡＡ ＴＴＧ Ｔ
ＣＡ ＴＴＣＡＴＴ ＡＡＡ・・・５′）、変異のある
ハプロタイプ３プローブ（５′・・・ＴＣＣＡＴＴ Ａ
ＡＣＡＡＴ ＡＡＧ ＴＡＡＴＴＴ・・・３′）、５′
・・・ＣＡＣＡ ＡＴＡ ＣＣＴ ＣＧＧ ＣＣＣＴＴ
ＣＴＣ・・・３′をもつ正常なハプロタイプ２プローブ
及び３′・・・ＧＴＧＴ ＴＡＴ ＧＧＡ ＡＣＣＧＧ
Ｇ ＡＡＧ ＡＧ・・・５′である変異ハプロタイプ２
プローブが用意された。これらのプローブは検査される
人からとった標的となるＤＮＡとの特異的結合を測定す
るためのハイブリダイゼーション研究に使われた。この
技術分野に通じる者は相補的なプローブが適当なプライ
マーと鋳型となる鎖を出発点として合成することもでき
ることを認識するだろう。
３’−ＡＧＧＴＡＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＴＴＣＡＴＴ
ＡＡＡ−５’ ）上でハイブリダイズされる９塩基プラ
イマー（５’−ＴＣＣＡＴＴ ＡＡＣ−３’）を伸長す
ることで合成した。ハプロタイプ２のブローブを合成す
るのに同様な塩基プライマーと伸長法が用いられた。少
くとも１５ヌクレオチドのプローブがヒトの染色体ＤＮ
Ａにおける一点での変異を特異的に検出するために必要
とされる。望ましい方法では合成によって正常ハプロタ
イプ３プローブ（３′・・・ＡＧＧＴＡＡ ＴＴＧ Ｔ
ＣＡ ＴＴＣＡＴＴ ＡＡＡ・・・５′）、変異のある
ハプロタイプ３プローブ（５′・・・ＴＣＣＡＴＴ Ａ
ＡＣＡＡＴ ＡＡＧ ＴＡＡＴＴＴ・・・３′）、５′
・・・ＣＡＣＡ ＡＴＡ ＣＣＴ ＣＧＧ ＣＣＣＴＴ
ＣＴＣ・・・３′をもつ正常なハプロタイプ２プローブ
及び３′・・・ＧＴＧＴ ＴＡＴ ＧＧＡ ＡＣＣＧＧ
Ｇ ＡＡＧ ＡＧ・・・５′である変異ハプロタイプ２
プローブが用意された。これらのプローブは検査される
人からとった標的となるＤＮＡとの特異的結合を測定す
るためのハイブリダイゼーション研究に使われた。この
技術分野に通じる者は相補的なプローブが適当なプライ
マーと鋳型となる鎖を出発点として合成することもでき
ることを認識するだろう。
変異部分の配列決定
９０ｂｐのエクソン１２と２４ｂｐのその下流のイント
ロンを含む変異しているハプロタイプ３コスミドクロー
ンであるＣＰＫＵ２３から分離した１１４ｋｂのＨａｅ
ｍ断片をＭ１３ｍｐ１８のＳｍａ１部位に挿入した（メ
ッシング。
ロンを含む変異しているハプロタイプ３コスミドクロー
ンであるＣＰＫＵ２３から分離した１１４ｋｂのＨａｅ
ｍ断片をＭ１３ｍｐ１８のＳｍａ１部位に挿入した（メ
ッシング。
メソクズ。イン、エンザイモロジー第１０１巻、 ２０
−７８頁。
−７８頁。
１９８３年）。これらはサンガー等、ＰＮＡＳ、第７４
巻。
巻。
５４６３−５４６７頁、 １９７７年によるジデオキシ
ヌクレオチド鎖端末法で配列を決められた。このイント
ロン／エクソン境界の正常と変異の配列を比較するとＡ
がＧに一つだけ塩基置換は唯一の違いであることが示さ
れている。
ヌクレオチド鎖端末法で配列を決められた。このイント
ロン／エクソン境界の正常と変異の配列を比較するとＡ
がＧに一つだけ塩基置換は唯一の違いであることが示さ
れている。
同様にエクソン１２を含む変異ハプロタイプ２のコスミ
ドクローンＣＰＫＵＩから分離した２ｋｂのＰｖｕ■断
片をＭｌ、３ｍｐ１８のＳｍａｒ部位に挿入した。ジデ
オキシヌクレオチド鎖端未配側決定法はエクソン１２に
並ぶイントロン配列に特異的なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて行われた。ハプロタイプ２についての配
列解析ではエクソン１２におけるアミノ酸４０８に対す
るコドンでＣがＴに置換されていることが示された。こ
の置換は３組のコドンがＣＧＧからＴＧＧに変わってい
ることになる。
ドクローンＣＰＫＵＩから分離した２ｋｂのＰｖｕ■断
片をＭｌ、３ｍｐ１８のＳｍａｒ部位に挿入した。ジデ
オキシヌクレオチド鎖端未配側決定法はエクソン１２に
並ぶイントロン配列に特異的なオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて行われた。ハプロタイプ２についての配
列解析ではエクソン１２におけるアミノ酸４０８に対す
るコドンでＣがＴに置換されていることが示された。こ
の置換は３組のコドンがＣＧＧからＴＧＧに変わってい
ることになる。
以下にのべる例は生前検診すなわち異形接合子検出のた
めに変異している遺伝子の存在を検出するために行われ
る方法の要約である。
めに変異している遺伝子の存在を検出するために行われ
る方法の要約である。
１．サンプルをテストされるべき検体から採取する。
サンプルは静脈血、羊水液、絨毛膜の絨毛１．ヒトの組
織、乾いた血斑などが含まれるがこれに限らない。２．
生体試料の染色体ＤＮＡをＰｖｕｎで完全に消化する
。この消化された染色体ＤＮＡが標的ＤＮＡとなる。こ
の標的ＤＮＡはＰＣＲ法によって増幅されうる。
織、乾いた血斑などが含まれるがこれに限らない。２．
生体試料の染色体ＤＮＡをＰｖｕｎで完全に消化する
。この消化された染色体ＤＮＡが標的ＤＮＡとなる。こ
の標的ＤＮＡはＰＣＲ法によって増幅されうる。
３、 消化をうけた標的ＤＮＡは直接メンプランにかけ
られるか或いは断片をアガロースゲル電気泳動で分離し
てから膜にかけられる。
られるか或いは断片をアガロースゲル電気泳動で分離し
てから膜にかけられる。
４、 消化された標的ＤＮＡを先にのべた正常及び変異
特異的オリゴヌクレオチドプローブを使って乾燥ゲルド
ツトプロットまたはスロットプロットハイブリダイゼー
ション法によって解析する。
特異的オリゴヌクレオチドプローブを使って乾燥ゲルド
ツトプロットまたはスロットプロットハイブリダイゼー
ション法によって解析する。
５、 正常のＰＡＨ遺伝子と変異のある遺伝子を区別す
るためにハイブリダイゼーション断片を同定する。同形
の正常人は正常のオリゴヌクレオチドプローブとのみハ
イブリダイズするだろう。変異のあるハプロタイプ２或
いは３対立遺伝子をもつ異形接合子をもった人は正常の
オリゴヌクレオチドプローブと変異のあるプローブの１
つの相方とハイブリダイズし、どちらかの変異遺伝子が
同形のＰＫＵ患者は夫々の変異のあるオリゴヌクレオチ
ドプローブとのみハイブリダイズするだろう。
るためにハイブリダイゼーション断片を同定する。同形
の正常人は正常のオリゴヌクレオチドプローブとのみハ
イブリダイズするだろう。変異のあるハプロタイプ２或
いは３対立遺伝子をもつ異形接合子をもった人は正常の
オリゴヌクレオチドプローブと変異のあるプローブの１
つの相方とハイブリダイズし、どちらかの変異遺伝子が
同形のＰＫＵ患者は夫々の変異のあるオリゴヌクレオチ
ドプローブとのみハイブリダイズするだろう。
２つの変異遺伝子について異形接合子のＰＫＵ患者は「
複合型異形接合子」であり、相応する正常オリゴヌクレ
オチドと同時に相方の変異のあるオリゴヌクレオチドと
もハイブリダイズするだろう。
複合型異形接合子」であり、相応する正常オリゴヌクレ
オチドと同時に相方の変異のあるオリゴヌクレオチドと
もハイブリダイズするだろう。
ＰＣＲ法を使って増幅されたＤＮＡが、これらのステッ
プで使うことができる。このことは、このシステムを自
動化し、ドツトプロットまたはスロットプロット法をそ
の最高の利点を出せるところで使える機会を提供してい
る。
プで使うことができる。このことは、このシステムを自
動化し、ドツトプロットまたはスロットプロット法をそ
の最高の利点を出せるところで使える機会を提供してい
る。
生きている患者の場合には、望ましい組織は乾かした血
痕または静脈血である。キャリアを検出するために血液
から分離した染色体ＤＮＡを直接解析できる。変異して
いる対立遺伝子を出生前に検出するために、胎児のサン
プルを羊水穿刺して羊水の細胞を集めるか胎児の絨毛膜
の絨毛を標的ＤＮＡの材料として使うことができる。羊
水穿刺法は出生前検診センターをもった大きな病院では
日常作業に使われており、絨毛膜の絨毛を採取する方法
も増加している。この方法はハプロタイプ２または３の
プローブあるいはハプロタイプ２と３プローブ相方を組
み合わせて利用される９筆１ｍ七之」− この発明のオリゴヌクレオチドプローブは正常なオリゴ
ヌクレオチドと変異をもったオリゴヌクレオチドプロー
ブから成る診断用キットの形で使うのが適当である。こ
のプローブがあることでどんな利用可能な方法によって
も検出ができる。これにはオートラジオグラフによる方
法、写真による方法、蛍光□や発色による方法による測
定を含むが、これらに限定はされない。標的ＤＮＡ以外
の材料がキットの内容物に加えられる。このキットには
これまでに固定されたＰＫＵ変異の全ての合成オリゴヌ
クレオチド及びそれに相当する正常オリゴヌクレオチド
が含まれることが望ましい。しかしながら、いろいろな
変更した組合せも効果を示すだろう。
痕または静脈血である。キャリアを検出するために血液
から分離した染色体ＤＮＡを直接解析できる。変異して
いる対立遺伝子を出生前に検出するために、胎児のサン
プルを羊水穿刺して羊水の細胞を集めるか胎児の絨毛膜
の絨毛を標的ＤＮＡの材料として使うことができる。羊
水穿刺法は出生前検診センターをもった大きな病院では
日常作業に使われており、絨毛膜の絨毛を採取する方法
も増加している。この方法はハプロタイプ２または３の
プローブあるいはハプロタイプ２と３プローブ相方を組
み合わせて利用される９筆１ｍ七之」− この発明のオリゴヌクレオチドプローブは正常なオリゴ
ヌクレオチドと変異をもったオリゴヌクレオチドプロー
ブから成る診断用キットの形で使うのが適当である。こ
のプローブがあることでどんな利用可能な方法によって
も検出ができる。これにはオートラジオグラフによる方
法、写真による方法、蛍光□や発色による方法による測
定を含むが、これらに限定はされない。標的ＤＮＡ以外
の材料がキットの内容物に加えられる。このキットには
これまでに固定されたＰＫＵ変異の全ての合成オリゴヌ
クレオチド及びそれに相当する正常オリゴヌクレオチド
が含まれることが望ましい。しかしながら、いろいろな
変更した組合せも効果を示すだろう。
変異は既知の制限酵素認識配列を変えることにはならな
い（デイレラ等、バイオケミストリー、第２５巻、 ７
４３−７４９頁、 １９８６年）。染色体ＤＮＡにおけ
る分子生物学的欠陥が合成されたオリゴヌクレオチドプ
ローブを使って解析された。合成プローブとそれに相補
的な染色体ＤＮＡ配列の間にある一ケ所の塩基対不適合
がＤＮＡハイブリッドの二重構造の不安定性を引き起こ
すのに十分であるので、オリゴヌクレオチドプローブは
ヒトの染色体における正常と変異したＰＡＨ対立遺伝子
を区別するのに用いられる。
い（デイレラ等、バイオケミストリー、第２５巻、 ７
４３−７４９頁、 １９８６年）。染色体ＤＮＡにおけ
る分子生物学的欠陥が合成されたオリゴヌクレオチドプ
ローブを使って解析された。合成プローブとそれに相補
的な染色体ＤＮＡ配列の間にある一ケ所の塩基対不適合
がＤＮＡハイブリッドの二重構造の不安定性を引き起こ
すのに十分であるので、オリゴヌクレオチドプローブは
ヒトの染色体における正常と変異したＰＡＨ対立遺伝子
を区別するのに用いられる。
一点の変異を検出するのに使われる原理に従ってオリゴ
ヌクレオチドプローブを設計した（キッド等。
ヌクレオチドプローブを設計した（キッド等。
ネイチャー、第３０４巻、 ２３０−２３４頁、 １９
８３年）。クローン化した染色体ＤＮＡにあるＰＫＵ変
異を解析するのに使われる合成プローブは第２図（Ｂ）
（ハプロタイプ３）と第３図（Ａ）（ハプロタイプ２）
に示されている。第２表はハプロタイプ３に対する変異
したオリゴヌクレオチドプローブはハプロタイプ３のＰ
ＫＵ変異遺伝子とのみハイブリダイズすることを示して
いる。同様に、ハプロタイプ２のオリゴヌクレオチドプ
ローブはハプロタイプ２ＰＫＵ変異遺伝子にのみハイブ
リダイズする。実施例における変異した特異的プローブ
は変異のある遺伝子の意味をもった鎖の配列で（ハプロ
タイプ３の場合）、または意味のある鎖に相補的（ハプ
ロタイプ２の場合）に合成された２１塩基のオリゴヌク
レオチドである。ハプロタイプ３の変異部位では、変異
のあるプローブは相補的な変異染色体ＤＮＡ配列の対意
味のある鎖と安定なＡ−Ｔ塩基対を作り、また正常な相
補的染色体ＤＮＡ配列とはＣ−Ａ不適合を作る。（第２
図（Ｂ））。ハプロタイプ２の変異部位では、変異のあ
るプローブは変異のある染色体ＤＮＡ配列の意味をもっ
た鎖と安定なＡ−Ｔ塩基対を作り、正常な相補的染色体
ＤＮＡ配列とＣ−Ａ不適合を形成する（第３図（Ａ））
。
８３年）。クローン化した染色体ＤＮＡにあるＰＫＵ変
異を解析するのに使われる合成プローブは第２図（Ｂ）
（ハプロタイプ３）と第３図（Ａ）（ハプロタイプ２）
に示されている。第２表はハプロタイプ３に対する変異
したオリゴヌクレオチドプローブはハプロタイプ３のＰ
ＫＵ変異遺伝子とのみハイブリダイズすることを示して
いる。同様に、ハプロタイプ２のオリゴヌクレオチドプ
ローブはハプロタイプ２ＰＫＵ変異遺伝子にのみハイブ
リダイズする。実施例における変異した特異的プローブ
は変異のある遺伝子の意味をもった鎖の配列で（ハプロ
タイプ３の場合）、または意味のある鎖に相補的（ハプ
ロタイプ２の場合）に合成された２１塩基のオリゴヌク
レオチドである。ハプロタイプ３の変異部位では、変異
のあるプローブは相補的な変異染色体ＤＮＡ配列の対意
味のある鎖と安定なＡ−Ｔ塩基対を作り、また正常な相
補的染色体ＤＮＡ配列とはＣ−Ａ不適合を作る。（第２
図（Ｂ））。ハプロタイプ２の変異部位では、変異のあ
るプローブは変異のある染色体ＤＮＡ配列の意味をもっ
た鎖と安定なＡ−Ｔ塩基対を作り、正常な相補的染色体
ＤＮＡ配列とＣ−Ａ不適合を形成する（第３図（Ａ））
。
他方、正常なハプロタイプ３に特異的なプローブは正常
遺伝子の意味のある鎖に相補的に合成された２１個のヌ
クレオチド鎖である。オリゴヌクレオチドプローブのイ
ントロン／エクソン接合部におけるＣ残基は正常な意味
のある鎖をもった染色体配列と安定なＣ−Ｇ塩基対を形
成する。反対に正常なハプロタイプ３に特異的なオリゴ
ヌクレオチド配列は変異のある意味をもった鎖の染色体
ＤＮＡの変異している部分でＣ−Ａ不適合を形成する。
遺伝子の意味のある鎖に相補的に合成された２１個のヌ
クレオチド鎖である。オリゴヌクレオチドプローブのイ
ントロン／エクソン接合部におけるＣ残基は正常な意味
のある鎖をもった染色体配列と安定なＣ−Ｇ塩基対を形
成する。反対に正常なハプロタイプ３に特異的なオリゴ
ヌクレオチド配列は変異のある意味をもった鎖の染色体
ＤＮＡの変異している部分でＣ−Ａ不適合を形成する。
かくして、用いられる合成プローブと方法によってイン
トロン／エクソン接合部での一個の変異を検出できる。
トロン／エクソン接合部での一個の変異を検出できる。
上記の条件下で、正常なプローブは正常遺伝子の２ｋｂ
の旦■■断片と特異的にハイブリダイズし、変異のある
プローブは変異遺伝子の２ｋｂのＰｖｕｌｌ断片に特異
的にハイブリダイズする。Ｐｖｕｌｌ断片はハプロタイ
プ２とハプロタイプ３における変異の相方を分析するの
に使われるが、これは例示にすぎない。ハプロタイプ２
と３の変異部位をもっているいずれの制限酵素断片もこ
の発明で開発されるプローブで等しく利用できよう。家
族についての研究 ＰＫＵの血縁においてＰＫＵ患者とその家族の変異のあ
る対立遺伝子及び染色体遺伝子を同定するのに合成オリ
ゴヌクレオチドプローブが使われた。これをさらに解析
することによって変異した遺伝断片のメンデル法則によ
る分離が確立された。分析した第一の家族は変異したハ
プロタイプ３対立遺伝子が分離され、調べられたもので
ある。この家族では、両親が変異に特異的なプローブに
ハイブリダイズする変異ハプロタイプ３ＰＡＨ遺伝子を
もっていた。
の旦■■断片と特異的にハイブリダイズし、変異のある
プローブは変異遺伝子の２ｋｂのＰｖｕｌｌ断片に特異
的にハイブリダイズする。Ｐｖｕｌｌ断片はハプロタイ
プ２とハプロタイプ３における変異の相方を分析するの
に使われるが、これは例示にすぎない。ハプロタイプ２
と３の変異部位をもっているいずれの制限酵素断片もこ
の発明で開発されるプローブで等しく利用できよう。家
族についての研究 ＰＫＵの血縁においてＰＫＵ患者とその家族の変異のあ
る対立遺伝子及び染色体遺伝子を同定するのに合成オリ
ゴヌクレオチドプローブが使われた。これをさらに解析
することによって変異した遺伝断片のメンデル法則によ
る分離が確立された。分析した第一の家族は変異したハ
プロタイプ３対立遺伝子が分離され、調べられたもので
ある。この家族では、両親が変異に特異的なプローブに
ハイブリダイズする変異ハプロタイプ３ＰＡＨ遺伝子を
もっていた。
第４図（Ａ）の第１，７列は父親、第２．８列は母親、
３．４，９．１０列は２人のＰＫＵにかかった子供で５
．６，１１゜１２は２人のＰＫＵにかからなかった子供
である。この家族では、両親は変異のあるプローブとハ
イブリダイズする変異ハプロタイプ３遺伝子をもち（第
４図（Ａ）、第１，２列）この家族の両方の変異対立遺
伝子が同じ変異をもつことを示唆している。この疾患は
性質として常染色体劣性であるので両親はＰＫＵ形質の
キャリヤーであり、従って、夫々は正常な遺伝子も持っ
ているはずである。この場合には両親の相方の正常対立
遺伝子はハプロタイプ４に相当し、予想されるように正
常のプローブとハイブリダイズする（第４図（Ａ）、第
７，８列）。この家族には２人の患者がいる。２人とも
変異したハプロタイプ３対立遺伝子について同形であり
変異プローブと強くハイブリダイズしく第４図（Ａ）、
第３，４列）、正常なプローブには全くしない（第９，
１０列）。これらの結果はこの家族の変異のある対立遺
伝子が同じ変異をもっていることを確認させている。こ
の家族の病気の影響をうけていない子孫は正常なハプロ
タイプ４対立遺伝子について同形であり、正常プローブ
とのみハイブリダイズしく第４図（Ａ）、第１１列）、
変異プローブとはしない（第５列）。この家族で変異し
たハプロタイプ３と正常ハプロタイプ４遺伝子について
異形である病気のでてない子孫に変異をもったプローブ
と正常プローブの両方とハイブリダイズする（第４図（
Ａ）、第６，１２列）。すなわち、オリゴヌクレオチド
によるデータは特異的な変異のある染色体ＤＮＡを検出
すると同時にこのＰＫＵ家族にある正常と変異のある対
立遺伝子を兄事に分類できることを示した。
３．４，９．１０列は２人のＰＫＵにかかった子供で５
．６，１１゜１２は２人のＰＫＵにかからなかった子供
である。この家族では、両親は変異のあるプローブとハ
イブリダイズする変異ハプロタイプ３遺伝子をもち（第
４図（Ａ）、第１，２列）この家族の両方の変異対立遺
伝子が同じ変異をもつことを示唆している。この疾患は
性質として常染色体劣性であるので両親はＰＫＵ形質の
キャリヤーであり、従って、夫々は正常な遺伝子も持っ
ているはずである。この場合には両親の相方の正常対立
遺伝子はハプロタイプ４に相当し、予想されるように正
常のプローブとハイブリダイズする（第４図（Ａ）、第
７，８列）。この家族には２人の患者がいる。２人とも
変異したハプロタイプ３対立遺伝子について同形であり
変異プローブと強くハイブリダイズしく第４図（Ａ）、
第３，４列）、正常なプローブには全くしない（第９，
１０列）。これらの結果はこの家族の変異のある対立遺
伝子が同じ変異をもっていることを確認させている。こ
の家族の病気の影響をうけていない子孫は正常なハプロ
タイプ４対立遺伝子について同形であり、正常プローブ
とのみハイブリダイズしく第４図（Ａ）、第１１列）、
変異プローブとはしない（第５列）。この家族で変異し
たハプロタイプ３と正常ハプロタイプ４遺伝子について
異形である病気のでてない子孫に変異をもったプローブ
と正常プローブの両方とハイブリダイズする（第４図（
Ａ）、第６，１２列）。すなわち、オリゴヌクレオチド
によるデータは特異的な変異のある染色体ＤＮＡを検出
すると同時にこのＰＫＵ家族にある正常と変異のある対
立遺伝子を兄事に分類できることを示した。
正常と変異のあるハプロタイプ３の対立遺伝子の相方を
もつもう１つのＰＫＵ家族を解析した。第４図（Ｂ）に
おいて第２列、８列が母親であり、第１゜７列は父親、
第３，９列は発端者、第４〜６列と１０〜１２列は３人
の非羅患者である。この家族の父親はハプロタイプ３に
ついて同形であり、ＰＫＵ形質についてキャリアである
。父親に変異プローブとハイブリダイズする変異したハ
プロタイプ３対立遺伝子（第４図（Ｂ）、第１列）と正
常プローブとハイブリダイズする正常ハプロタイプ３対
立遺伝子（第４図（Ｂ）、第７列）をもっている。これ
らの結果は接合の変異が正常なハプロタイプ３対立遺伝
子そのものの構成的部分でないことを結論として示して
いる。
もつもう１つのＰＫＵ家族を解析した。第４図（Ｂ）に
おいて第２列、８列が母親であり、第１゜７列は父親、
第３，９列は発端者、第４〜６列と１０〜１２列は３人
の非羅患者である。この家族の父親はハプロタイプ３に
ついて同形であり、ＰＫＵ形質についてキャリアである
。父親に変異プローブとハイブリダイズする変異したハ
プロタイプ３対立遺伝子（第４図（Ｂ）、第１列）と正
常プローブとハイブリダイズする正常ハプロタイプ３対
立遺伝子（第４図（Ｂ）、第７列）をもっている。これ
らの結果は接合の変異が正常なハプロタイプ３対立遺伝
子そのものの構成的部分でないことを結論として示して
いる。
反対に、母親は正常と変異したハプロタイプ１のＰＡＨ
対立遺伝子をもっていた。変異プローブはこの検体から
分離した標的ＤＮＡとハイブリダイズせず（第４図（Ｂ
）、第２列）、一方正室プローブはハイブリダイズした
（第８列）。このことはハプロタイプ１対立遺伝子に関
連したＰＫＵ変異が変異のあるハプロタイプ３対立遺伝
子にみられる変異と同一でないことを強く示している。
対立遺伝子をもっていた。変異プローブはこの検体から
分離した標的ＤＮＡとハイブリダイズせず（第４図（Ｂ
）、第２列）、一方正室プローブはハイブリダイズした
（第８列）。このことはハプロタイプ１対立遺伝子に関
連したＰＫＵ変異が変異のあるハプロタイプ３対立遺伝
子にみられる変異と同一でないことを強く示している。
父親から受けた変異したハプロタイプ３遺伝子と母親か
らの変異したハプロタイプ１遺伝子をもった発端者は変
異プローブと正常プローブ両方にハイブリダイズした（
第４図（Ｂ）。
らの変異したハプロタイプ１遺伝子をもった発端者は変
異プローブと正常プローブ両方にハイブリダイズした（
第４図（Ｂ）。
第３，９列）。この接合の変異は３つの無関係の検体す
なわち母親と父親（第４図（Ａ））と父親（第４図（Ｂ
）及び５つの別のＰＫＵ家族で解析した観察の中で関連
づけられた。このデータはイントロン／エクソン１２接
合部の変異がハプロタイプ３対立遺伝子と関連があると
いう強い遺伝的証明をもたらした。
なわち母親と父親（第４図（Ａ））と父親（第４図（Ｂ
）及び５つの別のＰＫＵ家族で解析した観察の中で関連
づけられた。このデータはイントロン／エクソン１２接
合部の変異がハプロタイプ３対立遺伝子と関連があると
いう強い遺伝的証明をもたらした。
第２表に示されたもう１つの証明は特異的な変異のある
オリゴヌクレオチドプローブでテストした検体のうち、
ハプロタイプ３の変異をもつものだけがこのプローブと
ハイブリダイズするということを確認した。さらに、非
ハプロタイプ３対立遺伝子に変異をもつＰＫＵ検体はこ
のプローブとはハイブリダイズしない。他方、正常なオ
リゴヌクレオチドは遺伝子座のこの位置が正常な配列を
もつ検体とのみハイブリダイズした。
オリゴヌクレオチドプローブでテストした検体のうち、
ハプロタイプ３の変異をもつものだけがこのプローブと
ハイブリダイズするということを確認した。さらに、非
ハプロタイプ３対立遺伝子に変異をもつＰＫＵ検体はこ
のプローブとはハイブリダイズしない。他方、正常なオ
リゴヌクレオチドは遺伝子座のこの位置が正常な配列を
もつ検体とのみハイブリダイズした。
同じような結果がハプロタイプ２変異プローブを用いて
行われ第３図に示されている。ハプロタイプ２対立遺伝
子をもつＰＫＵ患者（第１．２．３列）は変異プローブ
と結合し、一方ハプロタイプ２対立遺伝子でない変異を
もつＰＫＵ患者（第４．５．６列）は変異プローブとの
結合を示さなかった。
行われ第３図に示されている。ハプロタイプ２対立遺伝
子をもつＰＫＵ患者（第１．２．３列）は変異プローブ
と結合し、一方ハプロタイプ２対立遺伝子でない変異を
もつＰＫＵ患者（第４．５．６列）は変異プローブとの
結合を示さなかった。
これらのデータはＰＫＵがＰＡＨ遺伝子においているい
ろな場所でいろいろな変異があることから起こっている
ことを示している。すなわち、いろいろなハプロタイプ
に関連した変異があることは各々の変異場所に対して特
異的なオリゴヌクレオチドを要求することになる。他の
ハプロタイプのＰＫＵ遺伝子における変異を同定するこ
とは現時点では達成されていないけれど、ハプロタイプ
１及び４のＰＫＵ遺伝子は限られた数の変異している対
立遺伝子の結合の不均衡にあるだろうということが想定
される。
ろな場所でいろいろな変異があることから起こっている
ことを示している。すなわち、いろいろなハプロタイプ
に関連した変異があることは各々の変異場所に対して特
異的なオリゴヌクレオチドを要求することになる。他の
ハプロタイプのＰＫＵ遺伝子における変異を同定するこ
とは現時点では達成されていないけれど、ハプロタイプ
１及び４のＰＫＵ遺伝子は限られた数の変異している対
立遺伝子の結合の不均衡にあるだろうということが想定
される。
これらの変異が一旦確立されると、ここでハプロタイプ
２及び３について述べたようなオリゴヌクレオチドハイ
ブリダイゼーション法によってランダムの検体の染色体
性ＤＮＡで相当する変異を同定しうる。
２及び３について述べたようなオリゴヌクレオチドハイ
ブリダイゼーション法によってランダムの検体の染色体
性ＤＮＡで相当する変異を同定しうる。
もし変異か制限酵素切断部位の変化を伴っていれば、そ
れらはｃＤＮＡプローブあるいは染色体ＤＮＡプローブ
を用いて鎌状赤血球細胞の遺伝子の検出として記載され
たような方法で正規のＲＦＬＰ法によって行うことがで
きる。ハプロタイプの１〜４は北ヨーロッパの先祖のコ
ーカサス系人種のＰＫＬＩに関与する変異対立遺伝子の
９０％を構成するので９０％の精度でこの人達のＰＫＵ
のキャリアを検出することが可能だろう。同一の変異対
立遺伝子が他の人種的背景をもったコーカサス系人でも
みつけられるので、この方法はコーカサス系人種一般に
適用可能である。
れらはｃＤＮＡプローブあるいは染色体ＤＮＡプローブ
を用いて鎌状赤血球細胞の遺伝子の検出として記載され
たような方法で正規のＲＦＬＰ法によって行うことがで
きる。ハプロタイプの１〜４は北ヨーロッパの先祖のコ
ーカサス系人種のＰＫＬＩに関与する変異対立遺伝子の
９０％を構成するので９０％の精度でこの人達のＰＫＵ
のキャリアを検出することが可能だろう。同一の変異対
立遺伝子が他の人種的背景をもったコーカサス系人でも
みつけられるので、この方法はコーカサス系人種一般に
適用可能である。
もっと多くの変異した対立遺伝子が分子レベルで解明さ
れるようになるので、もっと他のプローブがこの人種の
もつ変異の検出に設計されるようになろう。
れるようになるので、もっと他のプローブがこの人種の
もつ変異の検出に設計されるようになろう。
従って、ここに明らかにしたキャリア検出法の精度は将
来増加しつづけるだろう。
来増加しつづけるだろう。
それ故、本発明は、対象について実施しそれに内在して
いるものを含め、ここに述べた目的と利点を得るために
適用される。現在のところ発明の実施例は開示のために
提出されたので、この分野に通じている者が容易に考え
られ、また発明の精神や請求の範囲にある中に含まれる
変更や修正を成すことができる。
いるものを含め、ここに述べた目的と利点を得るために
適用される。現在のところ発明の実施例は開示のために
提出されたので、この分野に通じている者が容易に考え
られ、また発明の精神や請求の範囲にある中に含まれる
変更や修正を成すことができる。
第１図（Ａ）は変異したフェニルアラニン遺伝子の物理
的地図を５′末端から３′−末端へ向けて示したもので
ある。この地図は５つの重複したコスミドクローン（ｃ
ＰＫＩＪ１７．ｃＰＫＩＪ１４．ｃＰＫＵ３０． ｃＰ
ＫＩＪ１３．ｃＰＫＵ２３）を特徴づけられることで構
成されていた。 第１図（Ｂ）は切りはなした変異の位置を示している。 エクソン１２の５′末端を与える切りはなし場所におけ
る配列解析を示している。 第２図（Ａ）は直接ゲルハイブリダイゼーション法によ
ってクローン化されたＤＮＡのＰＫＵ変異を検出するた
めのオリゴヌクレオチド特異性を示している、２ｋｂの
ＰｖｕＩ［断片はエクソン１２と出入りの自由なイント
ロン配列を含んでいる。乾燥したゲルを正常（Ｎ）と変
異した（Ｍ）遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプロ
ーブにハイブリダイズした。 第２図（Ｂ）はフェニールアラニンヒドロキシラーゼの
エクソン／イントロン１２境界と合成したプローブの正
常配列と変異配列を示している。星印は変異している場
所を示し、ハイブリダイゼーションでＣ−Ａの不適合を
示している（Ａ＝アデニン、 Ｔ＝ｆミン、Ｇ＝ニブア
ニンＣ＝シトシン）。 第３図（Ａ）はＰＫＵハプロタイプ２に関連したコドン
の変異の正常配列と変異している配列を示している。こ
れはＰＡＨのエクソン１２においてＣをＴに置換したこ
とに相当していて、蛋白では４０８番目でトリプトファ
ン（Ｔｒｙ）がアルギニン（Ａｒｇ）に変わっている。 星印は変異の場所を表わし、ハイブリダイゼーションで
Ｃ−Ａ不適合を示す。（Ａ、Ｔ、Ｇ。 Ｃは第２図（Ｂ）と同じである）。 第３図（Ｂ）はハプロタイプ２に変異をもったＰＫＵ息
者における変異プローブのハイブリダイゼーションを示
す。第１〜３列は変異をもった人で第４〜６列は変異の
ない人である。適切なＲＦＬＰのハプロタイプが夫々の
オートラジオグラフの先端の位置に示されている。 第４図（Ａ）は変異したハプロタイプ３対立遺伝子を含
むＰＫＵ家系をオリゴヌクレオチド ハイブリダイゼー
ション分析したものを示している。第１列と７列は父親
、２列、８列は母親、３，４，９．１０列は２人の影響
をうけた子供、５ 、６．１１．１２列は２人の影響を
受けていない子供。ＰＫＵ対立遺伝子（☆）と適切なＲ
ＦＬＰハプロタイプの分離が夫々のオートラジオグラフ
の先端の位置に示されている。 ｐｉｇ、 ４（Ａ） 亥胃プローブ２ｋＭａｗ
ｉｍ＠−一 Ｆｉｇ４（Ｂ） 友胃アロー７ｋｂ− 正常アローア′ 優り 工学アローブ ー−ｍ −、ｊｍ’ｍ 昭和６２年９月２４日 ２、発明の名称 ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子の変異
を同定するための特異的プローブ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 ６７０１番地 名 称 ハワード ヒユージス メディカルインステイ
テユート 代表者 ウィリアム ティー、 クイシン４、代理人 ５、補正指令の日付 補正の対象 （１）願書の「特許出願人」の欄 （２）明細書の「図面の簡単な説明」の欄３）委任状及
び同訳文 補正の内容 ■）特許出願人会社の住所及び代表者名を正確に記載し
た願書を提出する。 （２）明細書第９０頁第１１行の次に下記の文章を挿入
する。 「第４図（Ｂ）はいろいろな変異をもった（すなわち、
ハプロタイプ３やハプロタイプ１の対立遺伝子に変異が
ある）ＰＫＵ家族のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーション分析を示している。第２，８列が母親；１゜７
列が父親；３，９列は変異の出た最初の人、ＬＰハプロ
タイプの分離が夫々のオートラジオグラフの先端に示さ
れている。」 （３）委任状及び同訳文を提出する。 ８、添付書類の目録
的地図を５′末端から３′−末端へ向けて示したもので
ある。この地図は５つの重複したコスミドクローン（ｃ
ＰＫＩＪ１７．ｃＰＫＩＪ１４．ｃＰＫＵ３０． ｃＰ
ＫＩＪ１３．ｃＰＫＵ２３）を特徴づけられることで構
成されていた。 第１図（Ｂ）は切りはなした変異の位置を示している。 エクソン１２の５′末端を与える切りはなし場所におけ
る配列解析を示している。 第２図（Ａ）は直接ゲルハイブリダイゼーション法によ
ってクローン化されたＤＮＡのＰＫＵ変異を検出するた
めのオリゴヌクレオチド特異性を示している、２ｋｂの
ＰｖｕＩ［断片はエクソン１２と出入りの自由なイント
ロン配列を含んでいる。乾燥したゲルを正常（Ｎ）と変
異した（Ｍ）遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプロ
ーブにハイブリダイズした。 第２図（Ｂ）はフェニールアラニンヒドロキシラーゼの
エクソン／イントロン１２境界と合成したプローブの正
常配列と変異配列を示している。星印は変異している場
所を示し、ハイブリダイゼーションでＣ−Ａの不適合を
示している（Ａ＝アデニン、 Ｔ＝ｆミン、Ｇ＝ニブア
ニンＣ＝シトシン）。 第３図（Ａ）はＰＫＵハプロタイプ２に関連したコドン
の変異の正常配列と変異している配列を示している。こ
れはＰＡＨのエクソン１２においてＣをＴに置換したこ
とに相当していて、蛋白では４０８番目でトリプトファ
ン（Ｔｒｙ）がアルギニン（Ａｒｇ）に変わっている。 星印は変異の場所を表わし、ハイブリダイゼーションで
Ｃ−Ａ不適合を示す。（Ａ、Ｔ、Ｇ。 Ｃは第２図（Ｂ）と同じである）。 第３図（Ｂ）はハプロタイプ２に変異をもったＰＫＵ息
者における変異プローブのハイブリダイゼーションを示
す。第１〜３列は変異をもった人で第４〜６列は変異の
ない人である。適切なＲＦＬＰのハプロタイプが夫々の
オートラジオグラフの先端の位置に示されている。 第４図（Ａ）は変異したハプロタイプ３対立遺伝子を含
むＰＫＵ家系をオリゴヌクレオチド ハイブリダイゼー
ション分析したものを示している。第１列と７列は父親
、２列、８列は母親、３，４，９．１０列は２人の影響
をうけた子供、５ 、６．１１．１２列は２人の影響を
受けていない子供。ＰＫＵ対立遺伝子（☆）と適切なＲ
ＦＬＰハプロタイプの分離が夫々のオートラジオグラフ
の先端の位置に示されている。 ｐｉｇ、 ４（Ａ） 亥胃プローブ２ｋＭａｗ
ｉｍ＠−一 Ｆｉｇ４（Ｂ） 友胃アロー７ｋｂ− 正常アローア′ 優り 工学アローブ ー−ｍ −、ｊｍ’ｍ 昭和６２年９月２４日 ２、発明の名称 ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子の変異
を同定するための特異的プローブ３、 補正をする者 事件との関係 特許出願人 ６７０１番地 名 称 ハワード ヒユージス メディカルインステイ
テユート 代表者 ウィリアム ティー、 クイシン４、代理人 ５、補正指令の日付 補正の対象 （１）願書の「特許出願人」の欄 （２）明細書の「図面の簡単な説明」の欄３）委任状及
び同訳文 補正の内容 ■）特許出願人会社の住所及び代表者名を正確に記載し
た願書を提出する。 （２）明細書第９０頁第１１行の次に下記の文章を挿入
する。 「第４図（Ｂ）はいろいろな変異をもった（すなわち、
ハプロタイプ３やハプロタイプ１の対立遺伝子に変異が
ある）ＰＫＵ家族のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーション分析を示している。第２，８列が母親；１゜７
列が父親；３，９列は変異の出た最初の人、ＬＰハプロ
タイプの分離が夫々のオートラジオグラフの先端に示さ
れている。」 （３）委任状及び同訳文を提出する。 ８、添付書類の目録
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトの染色体ＤＮＡの中のフェニルアラニンヒドロ
キシラーゼ遺伝子における変異した配列に特異的な合成
オリゴヌクレオチド。 ２、【遺伝子配列があります】 から成る群から選んだ少くとも１つのヌ クレオチド配列を含む特許請求の範囲第１項記載のオリ
ゴヌクレオチド。 ３、（ａ）変異のあるハプロタイプ３対立遺伝子と関連
のある特異的ヌクレオチド配 列、 （ｂ）イントロン１２の５′接合を与える部分にそれに
当てはまる接合を与えるヌク リオチドと隣接した配列を含む配列。 （ｃ）ＧがＡに置換されている（ｂ）の接合供与ヌクレ
オチドで特徴づけられるヒト染 色体ＤＮＡのフェニルアラニンヒドロキシ ラーゼ遺伝子に対する合成オリゴヌク レオチド。 ４、配列が【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド配列である特許請求の範 囲第３項記載のオリゴヌクレオチド。 ５、配列が変異のある遺伝子のセンスストランド（意味
のある配列）である特許請求の範囲第３項記載のオリゴ
ヌクレオチド。 ６、（ａ）変異のあるハプロタイプ３対立遺伝子と関連
のある特異的なヌクレオチド 配列、 （ｂ）イントロン１２の５′接合供与部にそれに当ては
まる接合供与ヌクレオチド及 び隣接する配列を含む配列、 （ｃ）ＣがＴに置換している（ｂ）の接合供与ヌクレオ
チドで特徴づけられるヒト染色 体ＤＮＡの変異しているフェニルアラニン ヒドロキシラーゼ遺伝子に対する合成 オリゴヌクレオチド。 ７、配列が【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド配列を含む特許請求の範 囲第６項記載のオリゴヌクレオチド。 ８、配列が変異している遺伝子のセンスストランドに相
補的な特許請求の範囲第６項記載のオリゴヌクレオチド
。 ９、（ａ）変異しているハプロタイプ２対立遺伝子と関
連する特異的にヌクレオチド 配列、 （ｂ）アミノ酸４０８番目をコードしているエクソン１
２の３コドンヌクレオチドと隣 接する配列を含む配列。 （ｃ）ＣがＴに置換している（ｂ）の３コドンヌクレオ
チドによって特徴づけられるヒ トの染色体ＤＮＡの変異しているフェニル アラニンヒドロキシラーゼ遺伝子に対 する合成オリゴヌクレオチド。 １０、配列が【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド配列を含む特許請求の 範囲第９項記載のオリゴヌクレオチド。 １１、配列が変異をうけた遺伝子のセンスストランドに
相補的である特許請求の範囲第９項記載のオリゴヌクレ
オチド。 １２、（ａ）変異のあるハプロタイプ２対立遺伝子に関
連のある特異的なヌクレオチド 配列、 （ｂ）アミノ酸４０８番目をコードしているエクソン１
２にある３コドンヌクレオチド とそれに隣接した配列を含む配列、 （ｃ）ＧがＡに置換している（ｂ）の３コドンヌクレオ
チドを特徴とするヒトの染色体Ｄ ＮＡの変異のあるフェニルアラニンヒド ロキシラーゼ遺伝子に対する合成オリ ゴヌクレオチド。 １３、配列がヌクレオチド配列の【遺伝子配列がありま
す】【遺伝子配列があります】を含む特許請求の範囲第
１２項記載のオリゴヌクレオチド。 １４、配列が変異のある遺伝子のセンス・ストランドで
ある特許請求の範囲第１２項記載のオリゴヌクレオチド
。 １５、（ａ）特異的なヌクレオチド配列、 （ｂ）イントロン１２の５′接合供与部位にそれに見合
った接合供与ヌクレオチド及 び隣接する配列を含む配列、及び （ｃ）その供与ヌクレオチドがＧＴの配列を含むことを
特徴とするヒト染色体ＤＮＡの 正常フェニルアラニンヒドロキシラー ゼ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオ チド。 １６、配列が正常の遺伝子のセンスストランドに相補的
である特許請求の範囲第１５項記載のオリゴヌクレオチ
ド。 １７、配列がヌクレオチド配列【遺伝子配列があります
】【遺伝子配列があります】を含んでいる特許請求の範
囲第１５項記載のオリゴヌクレオチド。 １８、（ａ）特異的なヌクレオチド配列で、（ｂ）その
配列がイントロン１２の５′接合供与部位にそれに見合
った接合供与ヌク レオチド及び隣接する配列を含み、 （ｃ）その供与ヌクレオチドがＣＡの配列を含むことを
特徴とするヒト染色体ＤＮＡの 正常フェニルアラニンヒドロキシラー ゼ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオ チド。 １９、その配列が正常遺伝子のセンス・ストランドであ
る特許請求の範囲第１８項記載のオリゴヌクレオチド。 ２０、その配列がヌクレオチド配列【遺伝子配列があり
ます】【遺伝子配列があります】を含んでいる特許請求
の範囲第１８項記載のオリゴヌクレオチド。 ２１、（ａ）特異的なヌクレオチド配列で、（ｂ）その
配列がアミノ酸４０８番目をコードしているエクソン１
２の３コドンヌクレ オチドとそれに隣接する配列を含み、 （ｃ）３コドンヌクレオチドがアルギニン をコードしているＣＧＧであることを特徴 とするヒトの染色体ＤＮＡのフェニルアラ ニンヒドロキシラーゼ遺伝子に対する 合成オリゴヌクレオチド。 ２２、配列が正常遺伝子のセンス・ストランドである特
許請求の範囲第２１項記載のオリゴヌクレオチド。 ２３、配列がヌクレオチド配列の【遺伝子配列がありま
す】【遺伝子配列があります】を含んでいる特許請求の
範囲第２１項記載のオリゴヌクレオチド。 ２４、（ａ）特異的なヌクレオチド配列で、（ｂ）その
配列がアミノ酸４０８番をコードしているエクソン１２
の３コドンヌクレオ チドとそれと隣接する配列を含み、 （ｃ）３コドンヌクレオチドがアルギニン をコードしているＧＣＣであることを特徴 とするヒト染色体ＤＮＡの正常フェニルア ラニンヒドロキシラーゼ遺伝子に対す る合成オリゴヌクレオチド。 ２５、配列が変異のある遺伝子のセンスストランドに相
補的である特許請求の範囲第２４項記載のオリゴヌクレ
オチド。 ２６、配列がヌクレオチド配列の【遺伝子配列がありま
す】【遺伝子配列があります】を含む特許請求の範囲第
２４項記載のオリゴヌクレオチド。 ２７、合成オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を利用
して試料の遺伝子を解析することを含む胎児から成人ま
でのヒトの試料についてＰＫＵに患っているか、ＰＫＵ
の異形接合体か正常かを検出する方法。 ２８、（ａ）ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ
遺伝子の変異している配列に特 異的な合成オリゴヌクレオチドをハイ ブリダイズする、 （ｂ）ヒトのフェニルアラニンヒドロキシ ラーゼ遺伝子の正常な配列に特異的な 合成オリゴヌクレオチドをハイブリダ イズする、 （ｃ）罹患したＰＫＵは変異している配列にハイブリダ
イズし、ＰＫＵの異形接合体（ヘ テロザイゴート）は変異している配列と 正常な配列の両方にハイブリダイズし、 正常人は正常な配列とのみハイブリダ イズし、複合型の異形接合体は２つの 変異している配列と正常な配列とにハ イブリダイズするようにして（ａ）と（ｂ）の合成オリ
ゴヌクレオチドの結合を測 定する、 ことを遺伝子の解析が包含している特許請求の範囲第２
７項記載の方法。 ２９、ヒトの染色体ＤＮＡのフェニルアラニンヒドロキ
シラーゼ遺伝子にある変異した配列に特異的な分離され
たオリゴヌクレオチド。 ３０、配列が【遺伝子配列があります】 から成る群から少くとも１つのヌク レオチド配列を含む特許請求の範囲第２９項記載のオリ
ゴヌクレオチド。 ３１、（ａ）変異しているハプロタイプ３対立遺伝子と
関連のある特異的なヌクレオチ ド配列。 （ｂ）イントロン１２の５′接合供与部位にそれに当て
はまる接合供与ヌクレオチド と隣接した配列を含む配列、 （ｃ）ＧがＡに置換している（ｂ）の接合供与ヌクレオ
チドによって特徴づけられるヒ トの染色体ＤＮＡの変異しているフェニル アラニンヒドロキシラーゼ遺伝子に対 する分離したオリゴヌクレオチド。 ３２、配列がヌクレオチド配列【遺伝子配列があります
】【遺伝子配列があります】を含む特許請求の範囲第３
１項記載のオリゴヌクレオチド。 ３３、配列が変異している遺伝子のセンス・ストランド
である特許請求の範囲第３１項記載のオリゴヌクレオチ
ド。 ３４、（ａ）変異しているハプロタイプ３の対立遺伝子
と関連する特異的なヌクレオチ ド配列、 （ｂ）イントロン１２の５′接合供与部位にそれに当て
はまる接合供与ヌクレオチド と隣接する配列を含む配列、 （ｃ）（ｂ）の接合供与ヌクレオチドがＣかＴに置換さ
れているヌクレオチドである ことを特徴とするヒト染色体ＤＮＡの変異したフェニル
アラニンヒドロキシラーゼ遺伝子に対する分離したオリ
ゴヌクレオチド。 ３５、配列がヌクレオチド配列の【遺伝子配列がありま
す】【遺伝子配列があります】を包含している特許請求
の範囲第３４項記載のオリゴヌクレオチド。 ３６、配列が変異している遺伝子のセンス・ストランド
に相補的である特許請求の範囲第３４項記載のオリゴヌ
クレオチド。 ３７、（ａ）変異しているハプロタイプ２対立遺伝子と
関連する特異的なヌクレオチド 配列、 （ｂ）アミノ酸の４０８番目をコードしているエクソン
１２にある３コドンヌクレオチ ドと隣接した配列を含む配列、 （ｃ）ＣがＴに置換されている（ｂ）の３コドンヌクレ
オチドコードによって特徴とす るヒトの染色体ＤＮＡの変異しているフェ ニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子 に対する分離されたオリゴヌクレオチ ド。 ３８、配列が【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド配列を包含している 特許請求の範囲第３７項記載のオリゴヌクレオチド。 ３９、配列が変異している遺伝子のセンス・ストランド
に相補的である特許請求の範囲第３７項記載のオリゴヌ
クレオチド。 ４０、（ａ）変異しているハプロタイプ２対立遺伝子に
関連する特異的なヌクレオチド 配列で、 （ｂ）アミノ酸４０８番目をコードしているエクソン１
２にある３コドンヌクレオチド と隣接する配列を含む配列で （ｃ）ＧがＡに置換されている（ｂ）の３コドンヌクレ
オチドによって特徴とされるヒ ト染色体ＤＮＡの変異しているフェニルア ラニンヒドロキシラーゼ遺伝子に対す る分離されたオリゴヌクレオチド。 ４１、配列が【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド配列を包含している特 許請求の範囲第４０項記載のオリゴヌクレオチド。 ４２、配列が変異している遺伝子のセンス・ストランド
である特許請求の範囲第４０項記載のオリゴヌクレオチ
ド。 ４３、（ａ）特異的なヌクレオチド配列で、（ｂ）イン
トロン１２の５′接合供与部位にそれにあてはまる接合
供与ヌクレオチドと 隣接する配列を含む配列で、 （ｃ）その接合供与ヌクレオチドがＧＴの配列を含んで
いることを特徴とするヒト 染色体ＤＮＡの正常フェニルアラニンヒド ロキシラーゼ遺伝子の分離されたオリ ゴヌクレオチド。 ４４、配列が正常なセントストランド遺伝子に相補的な
特許請求の範囲第４３項記載のオリゴヌクレオチド。 ４５、配列が【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド配列を包含する特許請求 の範囲第４３項記載のオリゴヌクレオチド。 ４６、（ａ）特異的なヌクレオチド配列で、（ｂ）イン
トロン１２の５′接合供与部位にそれにあてはまる接合
供与ヌクレオチド と隣接する配列を含む配列で、 （ｃ）その供与ヌクレオチドがＣＡの配列を含んでいる ことを特徴とするヒトの染色体ＤＮＡの正常フェニルア
ラニンヒドロキシラーゼ遺伝子に対する分離したオリゴ
ヌクレオチド。 ４７、配列が正常な遺伝子のセンス・ストランドである
特許請求の範囲第４６項記載のオリゴヌクレオチド。 ４８、配列が【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド配列を包含している特許 請求の範囲第４６項記載のオリゴヌクレオチド。 ４９、（ａ）特異的なヌクレオチド配列で、（ｂ）エク
ソン１２にあるアミノ酸４０８番目をコードしている３
コドンヌクレオチド と隣接する配列を含む配列で、 （ｃ）その３コドンがアルギニンをコード するＣＧＧのヌクレオチドであることを特 徴とするヒト染色体ＤＮＡの正常フェニル アラニンヒドロキシラーゼ遺伝子に対 する分離されたオリゴヌクレオチド。 ５０、配列が正常な遺伝子のセンス・ストランドである
特許請求の範囲第４７項記載のオリゴヌクレオチド。 ５１、配列が【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド配列を包含する特許請 求の範囲第４７項記載のオリゴヌクレオチド。 ５２、（ａ）特異的なヌクレオチド配列で、（ｂ）エク
ソン１２にあるアミノ酸４０８番目をコードしている３
コドンヌクレオチド と隣接した配列を含む配列で、 （ｃ）３コドンがアルギニンをコードして いるＧＣＣのヌクレオチドであることを特 徴とするヒトの染色体ＤＮＡの正常なフェ ニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子 に対する分離されたオリゴヌクレオチ ド。 ５３、配列が変異している遺伝子のセンスストランドに
相補的な特許請求の範囲第５２項記載のオリゴヌクレオ
チド。 ５４、配列が【遺伝子配列があります】 のヌクレオチド配列を包含する特許請求 の範囲第５２項記載のオリゴヌクレオチド。 ５５、分離されたオリゴヌクレオチド、またはその誘導
体を使ってサンプルの遺伝子を解析することを包含する
胎児から成人までのヒトの試料についてＰＫＵにかかっ
ているか、ＰＫＵの異形接合子をもつか、正常かを検出
する方法。 ５６、（ａ）ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ
遺伝子の変異している配列に特 異的な分離されたオリゴヌクレオチド をハイブリダイズし、 （ｂ）ヒトのフェニルアラニンヒドロキシ ラーゼ遺伝子の変異した配列に特異的 な分離されたオリゴヌクレオチドをハ イブリダイズし、 （ｃ）ＰＫＵにかかっていれば変異のある配列にハイブ
リダイズし、ＰＫＵの異形接合体なら変異にも正常にも
両方の配列にハイブ リダイズし、また正常なら正常な配列と のみハイブリダイズし、複合型の異形接 合体は２つの変異している配列と正常な 配列とにハイブリダイズするような（ａ）と（ｂ）の分
離したオリゴヌクレオチドについての結合を測定するこ
とを遺伝子解析が 含んでいる特許請求の範囲第５５項記載の 方法。 ５７、（ａ）ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ
遺伝子の正常な配列に特異的か、ヒ トのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ 遺伝子の変異している配列に特異的かそ れらの組み合わせによるものかの群から 選ばれる少くとも１つのオリゴヌクレオ チド、及び （ｂ）変異のあるフェニルアラニンヒドロ キシラーゼ遺伝子の存在の有無を示すた めにキット以外の素材からとった標的ＤＮＡとハイブリ
ダイズさせるときに有効な（ａ）のオリゴヌクレオチド
、 を包含するヒトのフェニルアラニンヒド ロキシラーゼ遺伝子にある変異を検出す る有効な診断用キット。 ５８、標的となるＤＮＡが胎児から成人までの被験者か
ら採ったヒト染色体性物質である特許請求の範囲第５７
項記載の診断用キット。 ５９、（ａ）変異している特異的なオリゴヌクレオチド
配列が【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】、から成る群から選ばれる少
くとも１つのヌクレオチド配 列を含み、 （ｂ）正常な特異的オリゴヌクレオチド配 列が【遺伝子配列があります】、 から成る群から選ばれる（ａ）にある配列に相応する少
くとも１つのヌクレオチド配列を含む 特許請求の範囲第５７項記載の診断用キット。 ６０、（ａ）一対のオリゴヌクレオチド配列で１つが変
異に特異的で他は正常に特異的 な配列を含み、 （ｂ）対になった配列が【遺伝子配列があります】【遺
伝子配列があります】及びこれらの中のいかなる組合せ
から成る群から選択され る 特許請求の範囲第５７項記載の診断用キット。 ６１、（ａ）ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ
ｃＤＮＡプローブをもった染色体ＤＮＡライブラリ−か
らのフェニルアラニン ヒドロキシラーゼクローンを分離し、 （ｂ）フェニルアラニンヒドロキシラーゼ 遺伝子をサブクローン化し、 （ｃ）変異を定義している遺伝子の配列を 決定し、 （ｄ）変異している配列に相補的なオリゴ ヌクレオチドと変異している配列のセ ンス・ストランドのオリゴヌクレオチ ドからなる群から選択されるオリゴヌ クレオチド配列を合成し、 （ｅ）正常な配列に相補的なオリゴヌクレ オチドと変異している配列に相応する 正常配列のセンスストランドのオリゴ ヌクレオチドから成る群から選択され るオリゴヌクレオチド配列を合成し、 （ｆ）標的となるＤＮＡに（ｄ）と（ｅ）の合成したオ
リゴヌクレオチドをハイブリダイズし （ｇ）ステップ（ｆ）のハイブリダイゼーション断片を
同定する ことを包含するヒトの染色体ＤＮＡのフェ ニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子 にある変異を検出する方法。 ６２、（ａ）ヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ
のｃＤＮＡプローブをもった染色体ＤＮＡライブラリー
からのフェニルアラニ ンヒドロキシラーゼクローンを分離し、 （ｂ）フェニルアラニンヒドロキシラーゼ 遺伝子をサブクローン化し、 （ｃ）変異を定義している遺伝子の配列を 決定し、 （ｄ）変異している配列に相補的なオリゴ ヌクレオチドと変異している配列のセ ンス・ストランドのオリゴヌクレオチド から成る群から選択されるオリゴヌク レオチド配列を分離し、 （ｅ）正常な配列に相補的なオリゴヌクレ オチドと変異している配列に相応する正 常配列のオリゴヌクレオチドから成る群 から選択されるオリゴヌクレオチド配列 を分離し、 （ｆ）標的となるＤＮＡに（ｄ）と（ｅ）の分離したオ
リゴヌクレオチドをハイブリダイズ し （ｇ）ステップ（ｆ）のハイブリダイゼー ション断片を同定することを包含する ヒトの染色体ＤＮＡのフェニルアラニンヒ ドロキシラーゼ遺伝子にある変異を検 出する方法。 ６３、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子にある
制限エンドヌクレアーゼ分解部位の結合を検出すること
を包含する胎児から成人までのヒトの検体でＰＫＵに罹
患しているか、ＰＫＵの異形接合体かあるいは正常かを
検出する方法。 ６４、制限エンドヌクレアーゼ分解部位がエクソン６の
コドン２３２にある￥Ｄｄｅ￥ I である特許請求の範
囲第６３項記載の方法。 ６５、寄託承認番号ＡＴＣＣ６７１３３をもつ￥Ｅ．ｃ
ｏｌｉ￥ ＥＤ８７６７（ｃＰＫＵ２３）株。 ６６、寄託承認番号ＡＴＣＣ６７１３２をもつ￥Ｅ．ｃ
ｏｌｉ￥ ＥＤ８７６７（ｃＰＫＵ１）株。 ６７、（ａ）フェニルアラニンヒドロキシラーゼの変異
をｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅させること、（ｂ）増幅した
変異を、正常なフェニルア ラニンヒドロキシラーゼと変異してい るものに対して特異的なオリゴヌクレ オチドプローブでハイブリダイゼーシ ョンをすることによって検出すること、 （ｃ）ＰＫＵに罹患していれば変異のあるプローブとハ
イブリダイズし、ＰＫＵ異形接合 体ならば変異と正常の両方のプローブ とハイブリダイズし、正常なら正常プ ローブのみとハイブリダイズし、複合 型の異形接合体なら２つの変異した配 列と正常な配列とにハイブリダイズす るような特異的なヌクレオチドプロー ブの結合を定量することを包含する胎 児から成人までのヒトの検体でＰＫＵ罹患 か、ＰＫＵ異形接合体か正常かを検出する 自動化された方法。
Applications Claiming Priority (2)
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