JPS6296497A - リボオリゴヌクレオチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は抗ウィルス剤、制癌剤等の医薬中間体及び目的
遺伝子を単離するためのプルーブとしても使用される遺
伝工学用試薬として有用なりボオリゴヌクレオチドの新
規製造方法に関し、詳しくは固相担体上でヌクレオチド
のＣ−３−末端のリン酸ジエステルの保護基である芳香
族アミド基を選択的に除去して縮合することによりＣ−
５−がらＣ−３′方向に鎖長を伸長するリボオリゴヌク
レオチドの製造方法に関する。

死ｌ悲±乳 所定の配列をもつりボオリゴヌクレオブドを合成する場
合、ウリジン、Ｎ４−保護−シチジン、Ｎ６−保護−ア
デノシンやＮ２−保護−グアノシンなどを所定の配列順
序になるようにリボシドのＣ−５−の水酸基とＣ−３−
の水酸基とをリン酸を介して順次結合せしめ、保護基を
除去するが、その際にＣ−２′″の水酸基にも保護基を
導入しておく必要がある。

現在、実用的な２′″−水酸基の保１３Ｂとしては、タ
ーシャリ−ブチルジメチルシリル１Ａ（ＴＭＤＭＳ）、
テトラヒドロフラニルｇｚＴｈｒ＞などが利用されてい
る。前者はフッ素イＡンにより選択的に脱保護できるが
、１５鎖長以上のオリゴヌクレオチドからの完全な脱保
護を行なうには長時間を要する難点があり、後者は酸性
条ｆ１下にづることにより容易に除去することができる
。

一方、近年オリゴヌクレオチドの微量かつ迅速な合成法
として開発された固相法は、固相担体上で担体に結合し
たヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチド）に予め導入
しておいたジメ１へ：１−シ１ヘリチル基、モノメトキ
シ１〜リチル基などの保護基を酸性条件下で除去するこ
とにより５′−水酸基を露出させ、これを３−−リン酸
を活＋１化さＵたヌクレオチド（５５−水Ｍ　１４がジ
メトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基などで保
護されたもの）と縮合脱水せしめてヌクレオチドを結合
し、以下この操作を繰り返１ことによりヌクレオチド鎖
を順次延長することを特徴どじでいる。

ＲｎＪｌが解決しようとする問題点 従来の固相法によると、２′−水１１！２基の保護基ど
しで鎖長延長後に一号いて脱保護が容易なテトラヒドロ
フラニル基を使用すると、鎖長伸長工程中に５′−水酸
基の保護基であるジメトキシトリデル基又はモノメトキ
シ１〜リチル基を酸性条件下でテトラヒドロフラニル基
に影響を与えずに）π択的に除去することが困Ｍ　’ｒ
あるという問題があった。

問題点を解決するための手段 本発明名亦は、上記の問題点を解決すべく鋭意研究した
結果、固相担体上に予め結合しておいたヌクレオチドの
３−−リン酸ジエステルの芳香族アミド基を、２−一水
酸基の保護基であるテトラヒト［１フラニル基が安定な
条件て除去することにＪ、リン酸ジエステル体にラヘき
、これを活性化して次のヌクレオチド（又はヌクレオシ
ド）の５−一水酸基と縮合させ、鎖長をのばすことがで
きるリボオリゴヌクレオチドの製造方法を見出した。

すなわち、本発明は、保護されたヌクレオチド又はヌク
レオシドを固相担体上で縮合せしめてリボオリゴヌクレ
オチドを製造する方法において、固相担体上に結合され
たヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのＣ−３−末端
にリン酸ジエステルの保護基として芳香族アミド基を含
有し、この芳香族アミド基を選択的に脱保護してＣ−３
”末端にリン酸ジエステルを生成せしめ、これを活性化
して次のヌクレオチド又はヌクレオシドと脱水縮合せし
めることによりＣ−５′からＣ−３′方向に鎖長を伸長
することを特徴とするりボオリゴヌクレオチドの製造方
法である。

リン酸ジエステルの保護基である芳香族アミド基として
は、パラーアニシド基、オルトーアニシド基、アニリド
基などが挙げられ、その脱保護はたとえばピリジン−酢
酸混合溶媒中で亜硝酸アミルで処理することにより容易
にかつ選択的に行なうことができる。この場合、ピリジ
ン−酢酸混合溶媒の好ましい組成は、はず等量ずつ混ぜ
合ねぼたものである。この脱アミド化工程の条件では、
２−一水酸基に導入された酸に不安定な保護基であるｒ
　ｈラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、メ
トキシピラニル基などがきわめて安定であることが本発
明の大きな特徴となっている。

本発明で使用する固相担体とじて、ポリスチレ樹脂、シ
リカゲル、ポリアクリルモルホリド樹脂、コントロール
トポアグラスなどが好適であり、樹脂を使用する場合に
は予めアミン基を導入しておく。５−一末端になるヌク
レオチド又はヌクレオシドの樹脂への結合は、５−一水
Ｍ基をコハク酸などのジカルボン酸のモノエステ１１１
本としておき、遊離のカルボン酸を活性化して樹脂のア
ミノ基とアミド結合を形成することにより行なうことが
できる。

固相担体に結合されたヌクレオチド又はヌクレオシドに
縮合されるヌクレオチドは代表的には一般式（１） （式中、Ｂはウラシル、４−Ｎ−アシルシトシン、２−
Ｎ−アシルグアニン、６−Ｎ−アシルアデニンの残塁を
、Ｒ１はベンゼン、アニソールの残基を、ＲＬ２はオル
トクロロフェニル、パラクロロフェニル、シアノエヂル
基を、Ｒ３はデ１〜ラヒドロフラニル、テトラヒドロピ
ラニル、メトキシピラニル、ターシャリーブヂルジメヂ
ルシリル基を、それぞれ表わす。）で示されるが、これ
に代えて３−一水酸基にリン酸を含有しない一般式（２
）（式中、ＢおよびＲ３は前記と同意義である。）で示
されるヌクレオチドを用いてもよい。ただし、この場合
には、固相担体１−で一般式（３）％式％ （式中、Ｒ１およびＲ２は前記ど同意義である。）で示
されるリン酸化剤を用いてリン酸化づる必要がある。

固相１．ｆ１体上の上記のような完全に保護されたヌク
レオチド（こ対し一〇亜硝酸イソアミル（こより芳香族
アミド基のみを選択的に脱保護し、次いで一般式（１）
又は（２）で示されるヌクレオチド又はヌクレオシドを
例えばメシチレンスルホニル−４−二Ｉ−ローへリアゾ
ールのようなアレーンスルホニルツノシリ１〜系の脱水
縮合剤で縮合することにより３′側に塩基を付加するこ
とができる。このＩＢ２アミド化および縮合（ただし、
一般式（２）で示されるヌクレオシドを用いた場合には
、縮合後前記のようにリン酸化１−る）を繰り返すこと
により固相担体−１−でヌクレオチド鎖を５′から３一
方向に伸長することができる。これにＪ：す、予め定め
られた配列に必要な保護をした塩基を順次縮合すれば、
任意の配列をもつりボオリゴヌクレオヂドを製造するこ
とができる。

鎖長伸長反応の終了した固相担体上の完全に保護された
りボオリゴメクレオヂドは、従来の方法により脱保護お
よび分離精製することによって、リボオリゴヌクレオチ
ドを単離精製することができる。

以上はりボオリゴヌクレオヂシドの合成法について説明
したが、従来のように５−一水酸基にジメトキシシリル
基のような保護基の導入をせず、その鎖長伸長方向を５
−末端から３−末端方向とし、３−末端には保護基とし
てリン酸パラアニシデートのような脱保護時において２
′の保護基に影響を与えない芳香族アミド基を使用した
から、２−の保護基としてテトラヒト日フラニル基以外
の種々の保護基の利用が可能となり、また本発明をデオ
キシオリゴヌクレオチドの合成にも容易に適用できるこ
とが理解される。さらに、３′末端に糖部に修飾された
ヌクレオシド又はヌクレオチドを容易にオリゴマーに導
入できるから、従来合成が困難とされたオリゴヌクレＡ
ヂドの３′末端がリン酸化された化合物も合成すること
ができる。

したがって、本発明は抗ウィルス剤、制癌剤等の医薬中
間体の合成や目的遺伝子を単離するためのプルーブとし
て使用される遺伝子工学用試薬の合成に有用であると考
えられる。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例 ４−Ｎ−ベンゾイル−２′−０−ｙトラヒドロ７ラニル
シチジンー３−−オルトクロロワ１ニルリン酸−パラア
ニシデート（表１、化合物Ｉ）１゜６４−（］をジジク
ロロタ２９９．２ｍに溶解せしめ、無水コハクＭ３５０
ｍｏ（１，５当量）及び４−ジメチルアミノピリジン４
２０１１１！Ｊ（１，５当量）を加え室温にて２時間半
撹拌した。Ｔ　Ｉ−ＣＴ−原料の消失を確認した後、反
応液は０．５Ｍ　　ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（１）ｌ−１５
，０）で２回、次いで水で２回洗浄し、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥した後溶媒を留去した。残渣はＣ−１８逆相
シリカゲルカラムクロマ１〜グラフイーにより精製し６
０％アセ１ヘン水で溶出される純粋画分を集め、５−一
コハク酸エステル体（化合物Ｕ）１．１２ｑを５９．９
％の収率で得た。

〇二〇 Ｃ’１ 工 ヱ ０＝（Ｌｌ ３　　　。

工 次にこれをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド９゜Ｉｎ＋ｌ
に溶解せしめペンタクロロフェノール３８０１１１ｔ＋
（１，１当量）とＮ、Ｎ−−ジシクロへキシルカルボジ
イミド３００１１１（＋　　＜１．５当量）とを加えて
、室温で撹拌し２０時間後析出した沈澱を濾別し溶媒を
留去した。更に残渣にベンゼンを加えて溶かし不溶物を
濾去し、ベンゼンを留去し、この残渣を少量のクロロホ
ルムに溶解せしめ、ｎ−ヘキサン中に滴下して活性エス
テル体（化合物■）の粉末１．３０ｇ　（１，２２ｕ＋
ｍｏｌ）を９４．２％の収率で得た。

次に、１％架橋アミノメブルボリスヂレン樹脂６００ｍ
ｇ（アミンＮｏ、０６６ｍｍｏｌ）をＮ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミド５ｍｌに懸濁し、活ｆ（エステル体　０．
２１０　　（０，１９８ｍｍｏｌ＞及びトす］ｌチルア
ミン０．０３ｍ１を加え、３０℃で振禰した。

３６時間後反応液を濾去し、樹脂はＮ、Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド　５ｍｌで３回、ジクロロメタン５ｍｌで３
回、メタノール、５１で３回洗浄した後、減圧不乾燥し
た。

次にこの樹脂にピリジン：無水酢酸−３：２（容積化）
１０ｍｌを加えて３０℃で振罎した。１時間後濾過し、
樹脂はＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン
、次にメタノールで順次洗浄した後、減圧不乾燥した。

（す４脂上のアミノ基は、文献（Ａ　ｎａｌｙＮｃａ、
　Ｃｈｉｍｉｃａ、△ｃｔａ、、５８巻。

２４８頁、１９７２年）記載の方法にｊ；り定量し、ヌ
クレオチド（化合物ＩＶ　）の結合端は０，０９　ｎ１
ｍｏｌ／（１と求められた。

次にこのヌクレオチド樹脂５５ｎ＋ｃ＋（ヌクレオチド
結合ｆＮ５ｆｚｍｏｌ）を用い、文献（Ｔ　ｅｔｒａｌ
）ｅｄｒＯｎｌ、第４０巻、４７頁、１９８４年）に記
載の方法Ｃ合成（）た２’−−０−デトラヒドロフラニ
ルウリジン−３′−オル１〜り１］ロフェニルリン酸−
パラアニシデー１〜（ＬＪｐ＞、２−Ｎ−イソブチリル
−２＝　−０−テ］・ジヒドロフラニルグアノシン−３
′″−オルトクロロフ丁ニルリン酸−パラアニシデー１
−（Ｇｐ）、４−Ｎ−ベンゾイル−２−一〇−テ１〜ラ
ヒドロフラニルシヂジン−３−一オルトクロロフ丁ニル
リン酸−パラアニシデー１−（ＣＩ））、６−Ｎ−ベン
ゾイル−２′−〇−テトラヒト。

フラニルアデノシン−３′−オルトクロロフェニルリン
酸−パラアニシデート（Ａｐ　）をＡｐ、Ｇｐ、ＧＦＩ
　、Ｕｒｌ　、Ａｐ　、Ａｐ　、Ｇｐの順に縮合し鎖長
伸長を行ない、最後に文献（Ｃ０１１ｅｃｔ、　Ｃｚｅ
ｃｈ、　Ｃｈｅｍ　、Ｃｏｍｍｕｎ、、　ｌＴ３１巻、
１７８５頁。

１９６６年）記載の方法で合成した２＝、３′−Ｏ−メ
トキシエチリデンウリジンを縮合させた。

・２ 縮合の１サイクルは表−に示した通り行なった。

表２ 即ち、／１−Ｎ−ベンゾイル−２′−〇−テトラヒト［
１フラニルシヂジン−３−−オルトクロロ）■ニルリン
酸−パラアニシデート５μｍｏｌを結合したポリスヂレ
ン樹脂５５ｍりをグラスフィルターイ（１きの反応容器
に入れ、ピリジン２１で２回洗浄した。次に叶硝酸イソ
アミル０．５ｍｌとピリジン−酢酸（容積比１：１）の
混合液２ｍｌを加え３０°Ｃに加渇し振盪した。１時間
後反応液は濾過（こより樹脂から除いた後、樹脂はピリ
ジン−酢＾グ混合液く容積比１：１）２１て２回、０．
５Ｍｔ−リＬヂルノ７ミンー酊酸のジメチルホルムアミ
ド溶液２ｍ１ｒ３回、ジクロロメタン２ｍｌで３回、エ
チルゴー−プール２ｍｌ？”３回、テトラヒト［］フワ
ラ２２１１３３、次いでピリジン２ｍｌで２回洗浄し１
ζ。次にピリジン０．５ｍｌを加え、減圧下ピリジンを
留去することにより樹脂を乾燥し、６−Ｎ−ヘンシイル
ー２′−０−−ｒｌ〜ｌヒラ［１フラニルアデノシン−
３′″−オル１〜クロロフェニルリン酸−パラアニシデ
−１〜のピリジン溶液（１５ｍａ１０．５＋ｎｌ）を加
え減圧下ピリジンを留去した。次にメシチレンスルホニ
ル−４−ニトロトリアゾールのピリジン溶液（２０１＋
１（］１０．５ｍ１）を加え３０℃に加渇し、３０分間
振振盪た。反応液は一過にＪ：り樹脂から除き、樹脂は
ピリジン２ｎ＋Ｉで洗浄後、１０％メタノールのピリジ
ン溶′ａ５００ｍ　ｌ及びメシチレンスルホニル−３−
二１へロトリアゾール２０ｎｚを加え１０分間振盪後、
反応液は濾過にＪ：り樹脂から除いた。この一連の操作
を繰り返しく但し、保護されたヌクレオシド又はヌクレ
オチドはイれぞれ必要な塩基を加える）鎖長を伸長した
。

目的の９鎖長に達した樹脂は文献（１つｒｏＣ，Ｎａｔ
ｌ　、　Ａｃａｄ　、　３ｃｉ、　ＵＳＡ、　８１巻、
５９５６頁、１９８４年）記載の方法を一部変更し脱保
護を行なった。即ち、縮合終了後の樹脂をジオキサンで
洗浄した後、１Ｍテ１〜ラメヂルグ）７ニジウムビリジ
ンー２−アルドキシメ−１〜のジオキサン溶液Ｑ、９ｍ
ｌ及び水０１１ｍ１を加えて３０℃に加温し、３６時間
振盪した。反応液は濾過し、樹脂は５０％ピリジン水で
洗浄した。この濾液と洗浄液を合わせて、陽イオン交換
樹脂（１）ｏｗｅｘ５０ＷＸ２、ピリジニウム型５■１
）を充１眞したカラムに添加し、３０％ピリジン水１２
０１で溶出した。溶出液は濃縮乾固し、ｊｑられた残漬
をピリジン１ｍｌに溶かし、淵アンモニア水１０ｍ１を
加えて６０℃に加温した。５時間後溶媒を留去し、水−
酢酸エチルで分液し、水層を濃縮乾固させた後トルエン
で共沸した。得られた残漬に０．０１Ｎ塩酸１０ｍ１を
加え、０．１Ｎ塩酸で１１Ｈ２とし室温で撹拌した。３
゜５時間後０．１Ｎアンモニア水で中和し、１Ｍｔ−リ
エチルアミンー炭酸緩衝液ｐＨ７゜５（Ｄ下Ｔ　Ｅ　Ａ
　Ｂ緩衝液と略ｔ）５ｍｌを加え酢酸エチルで洗浄した
。水層は濃縮後、３ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５を充填した
ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（直径１．５ｃｍ、
長さ４００ｍ）で移動相として０．１Ｍ　　ＴＥＡＩ３
ｔｉ衝液を用いて行ない、波長２５４、　ｎｍで吸光度
を測定し最初に溶出されるピークの７ラクシヨンを集め
濃縮乾固した。次いで水で共沸し１−　Ｅ　Ａ　Ｂ緩衝
液を除去した後、陰イオン交換樹脂ＤＦＡ［１〜ヨパー
ル６５０Ｓを充填したカラムクロマトグラフィー（直径
Ｑ、７ｃｍ、長さ９−１８Ｏで、移動相として７Ｍ尿素
存在下０．０２Ｍｔ−リス−塩酸緩衝液ｎ　Ｈ８，Ｏ，
塩化ナトリウムの直線濃度勾配（ＯＭから０．２Ｍ）を
用いて精製し、波長２５４ｎｍでの吸光度測定により塩
化ナトリウム温度０．１４Ｍ付近で溶出された最匙 後のピークのフラクションを集め、前ｌ記載と同一のゲ
ル濾過クロマトグライーを行ない脱塩した。

溶出液は濃縮乾固復水で共沸してＴＦＡＢ緩衝液を除去
した。次にＮ　ｕｃｌｅｏｓｉｌ　　ｓ　Ｃ８を用いた
逆相シリカゲル高速液体クロマトグラフィーを行ない、
移動相として５％から２５％アセトニトリル直線濃度勾
配をかけた０、１Ｍトリエチルアミン−酢′Ｍ緩衝液で
溶出された主ピークを分取し、はぼ純粋な５′側からＣ
，Ａ、Ｇ、Ｇ、Ｕ、Δ、△。

Ｇ、Ｕ、の配列の保護基の完全に除去されたりボオリゴ
ヌクレオチドを３．７８０Ｄユニツト（波長２６０ｎｍ
）得た。尚この塩基配列は、このリボオリゴヌクレオチ
ド０．０５０Ｄユニツ１−を［γ−３”Ｐ］ＡＴＰとボ
リヌクレＡヂドキナーゼで５″末端を３２ｐでリン酸化
し、その試別を文献（Ｐｒｏｃ　　、　　Ｎａｔ、ｌ　
　、　　Ａｃａｄ　　、　　５ｃｉ　　、　　ＵＳＡ、
　　７０巻、１２０９〜１２１３頁、１９７３年）に記
載されている方法に従って行ない、そのオー１〜ラジオ
グラフイーによりＷしいことを確認した。

５を明の効架 ０−１から明らかな如く、本発明はリン酸ジエステルの
保護基である芳香族アミド基の脱保護をＣ−２−の保護
基に影響を７９えずに選択的に行なうことによって、リ
ボオリゴヌクレオチドを迅速かつ容易に合成することが
できる方法を提供するものである。

また、本発明はデＡ４−シオリゴヌクレオヂドの迅速微
呈合成に適用できるばかりでなく、Ｃ−３末端になる最
後に縮合させる塩基をヌクレオチドの形で縮合させるこ
とにＪ、す、従来合成が困難であったＡリゴヌクレオヂ
ドの３−末端がリン酸化された化合物の合成も容易とな
るから、産業上ぎわめて右利である。

特許出願人　　　　味の素株式会社 ＝２１−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）保護されたヌクレオチド又はヌクレオシドを固相担
   体上で縮合せしめてリボオリゴヌクレオチドを製造する
   方法において、固相担体上に結合されたヌクレオチド又
   はオリゴヌクレオチドのＣ−３′末端にリン酸ジエステ
   ルの保護基として芳香族アミド基を含有し、この芳香族
   アミド基を選択的に脱保護してＣ−３′末端にリン酸ジ
   エステルを生成せしめ、これを活性化して次のヌクレオ
   チド又はヌクレオシドと脱水縮合せしめることによりＣ
   −５′からＣ−３′方向に鎖長を伸長することを特徴と
   するリボオリゴヌクレオチドの製造方法。 ２）ヌクレオチド又はヌクレオシドのＣ−３′末端のリ
   ン酸ジエステルの保護基である芳香族アミド基を亜硝酸
   イソアミルにより選択的に脱保護する特許請求の範囲第
   １項記載の方法。