JPS62679B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、試料中のポリアミン及びそのアセチ
ル体を酵素学的に直接測定する方法に関する。 ポリアミンは、非蛋白質性低分子量の脂肪族塩
基性化合物で各種生理活性アミンの１種であり、
生体組織や微生物に広く分布して生体反応と深く
かかわつている。そして、ヒトをはじめ哺乳動物
の体液中には主にプトレシン、カタベリン、スペ
ルミジン、スペルミンとこれらの抱合型（アセチ
ル体）が存在している。 ところで、近来、体液中の総ポリアミンはヒト
の癌の有用な指標であることが知られている。即
ち、癌患者の尿、胃液、血液、腹水、胸水などの
体液中の総ポリアミンは、正常者と比べて明らか
に増加が見られ、患部摘出や物理的・化学的療法
を施こすと減少するため、癌の診断や治療効果の
判定、予後の経過観察に応用できるものと考えら
れている。しかも、これら体液中の総ポリアミン
の増加は特定の癌に限定されないため、迅速・簡
易かつ正確に測定できれば、癌のスクリーニング
テストとして大いに期待できる。 従来知られている生体試料中の総ポリアミンの
測定方法は、試料中の各種抱合型ポリアミンを強
酸性下で６時間程度100℃にて加熱分解して遊離
型ポリアミンとなし（試料が血清の場合、その前
に除蛋白操作が必要）、更に有機溶媒で抽出して
その抽出物を電気泳動法、ダンシル誘導体―薄層
クロマトグラフイー法、ガスクロマトグラフイー
法、アミノ酸アナライザー法、或は高速液体クロ
マトグラフイー法等で分析するものである。しか
し、これらの方法はいずれも検体の前処理の手技
が複雑で長時間を要し、更に分析においても特殊
な装置や熟練した技術を必要とするため、日常の
臨床検査として実用されるに至つていない。 このような欠点を是正するために、本発明者は
研究の結果、総ポリアミンを酵素学的に測定する
技術を開発した（特公昭56−36918）。この方法
は、発芽大豆から抽出したポリアミンオキシダー
ゼ及びパーオキシダーゼを用いるものであり、先
ず検体を従来と同様に酸・熱加水分解して抱合型
ポリアミンを遊離型に変え、次に検体中に共存す
るアスコルビン酸などの還元物質を除くため陽イ
オン交換カラムに通し、カラム中に吸着されたポ
リアミンを酸で溶出して中和後、これにポリアミ
ンオキシダーゼとパーオキシダーゼ及び色原体を
添加し、比色又は蛍光法により総ポリアミンを測
定する。この方法でもやはり加水分解処理や陽イ
オン交換カラムによる夾雑物の除去などの検体の
前処理のため不便であり、実際の臨床検査として
は有用性に乏しい。しかも、共存物の除去処理は
時間と手間がかかるだけでなく、ポリアミンの分
離・溶出が完全に行なわれがたく、誤差の原因に
なる欠点もある。 本発明はこのような現状にかんがみてなされた
ものであり、迅速・簡易にしかも特殊な技術や設
備を要せずに、癌のスクリーニングテストとして
充分な程度に精確な体液中総ポリアミンの測定方
法を提供することを目的とする。 この目的を達成するために本発明者らは鋭意研
究を重ねた結果、現在判明している動物や細菌か
ら抽出したポリアミンオキシダーゼは、特定の遊
離型ポリアミンのみを酸化するが、ある種の植物
例えば豆科植物より抽出したポリアミンオキシダ
ーゼは、各種の遊離型ポリアミンだけでなく抱合
型ポリアミンをも酸化することを見い出し、これ
らを用いると抱合型ポリアミンを遊離型にするた
めの加水分解処理が不要になると考えた。しか
し、豆科植物から抽出したポリアミンオキシダー
ゼにおいて抱合型ポリアミンを基質とする場合の
Km値（ミカエルス定数）が遊離型のそれに比して
きわめて大きいため、加水分解処理を除いた場
合、特公昭56−36918号に見られる酵素学的分析
法におけるより大量（高活性単位）の当該ポリア
ミンオキシダーゼを使用するか、長い反応時間が
必要であることが判つた。そこで更に研究を続
け、アスコルビン酸オキシダーゼで試料中に共存
する妨害物質たるアスコルビン酸を酸化分解し、
遊離型及び抱合型（アセチル体）のポリアミンの
両方を酸化して過酸化水素を生成する作用を有す
る酵素により遊離型及び抱合型のポリアミンを酸
化し、該生成した過酸化水素を基質とするパーオ
キシダーゼ様活性を有する酵素系の作用により色
原体を酸化し、得られた発色物質あるいは蛍光物
質を比色法あるいは蛍光法によつて測定する総ポ
リアミンの測定方法を完成させた。 この方法によれば、遊離型及び抱合型ポリアミ
ンを同時に酸化できるため検体を加水分解処理す
る必要がなく、またアスコルビン酸オキシダーゼ
で共存する還元物質であるアスコルビン酸を過酸
化水素の発生を伴なわず酸化分解するため陽イオ
ン交換カラムを使用することもないので、極めて
迅速・簡易に総ポリアミンを実用的に測定でき
る。したがつて、癌の診断、治療効果の判定、転
移・再発の発見及び予後の観察などを目的とする
臨床検査に有用である。 本発明による総ポリアミン測定法には、アスコ
ルビン酸オキシダーゼ、遊離型及び抱合型ポリア
ミンの両方を酸化する酵素、パーオキシダーゼ様
活性を示す酵素系、色原体、PH緩衝剤などを使用
する。更に必要に応じて防腐剤、安定化剤、反応
抑制剤、反応促進剤などの各種添加剤を加えるこ
ともできる。 アスコルビン酸オキシダーゼはアスコルビン酸
を酸化してデヒドロアスコルビン酸に変える作用
を有する酵素であれば何んでもよく、きゆうり
（Cucumis sp）やかぼちや（Cucurbitaceae
sp）を起源とするものが具体的に挙げられる。
遊離型及び抱合型ポリアミンの両方を酸化する酵
素は、主にプトレシン、カタベリン、スペルミジ
ン、スペルミンとこれらのアセチル体を酸化して
過酸化水素を生成するものであれば何んでもよ
く、例えば発芽大豆やアルフアルフア又はクロー
バーなどを起源とするものが挙げられる。しかし
特開昭55−96093号、特開昭56−92787号あるいは
特開昭56−92788号に見られるような微生物を起
源とするポリアミンオキシダーゼは、遊離型のス
ペルミジンとスペルミンだけを酸化する作用を有
するので、本発明には使用できない。 発芽大豆を起源とするものの製法を次に述べ
る。 発芽大豆に生理食塩水（0.9％NaCl水溶液）を
加えてホモジネートし、遠沈あるいは濾過して得
た濾液に、硫安を加え塩析し、沈殿を採取し、こ
の沈殿に0.1M―リン酸緩衝液（PH7.8）を加え
て、沈殿し、この溶液を0.1M―リン酸緩衝液
（PH7.8）で透析し、得られた透析後液を用いる。 本例で得られたポリアミンオキシダーゼと特開
昭57−50887号に記載されたポリアミンオキシダ
ーゼＭとは表―８〜表―12に示す通りその性質も
異なるまつたく別のものである。

【表】 (1) 阻害剤及び金属イオンの影響

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 パーオキシダーゼ様活性を有する酵素系として
は、過酸化水素を基質としてこれを分解すること
により色原体を酸化することができるなら何んで
もよく、代表的には西洋ワサビや馬鈴署を起源と
する酵素や血色素が挙げられるが、これらの酵素
以外にヨウ化物とモリブデン酸塩、金属ポルフイ
リン、フエロシアン化鉄などの化合物も同様な働
きを有するので使用が可能である。 色原体としてはパーオキシダーゼ様活性を示す
酵素系と過酸化水素により酸化されて光学的検出
が可能な物質及び物質群であれば何れも使用可能
である。この内、光学的検出手段が比色法の場合
は、オルトジアニシジン、２，２―アジノジ（３
エチルベンゾチアゾリン）―６―スルホン酸
（ABTSと略される）、パラジフエニルアミンスル
ホン酸塩、４―アミノアンチピリン（以下４―
AAと略す）とフエノール、オルトトリジン、３
―メチル―２―ベンゾチアゾリンヒドラゾンと
Ｎ，Ｎ―ジメチルアニリン、４―AAとジアゾレ
ツドRC、４―AAと３，５―ジメトキシ―Ｎ―エ
チル―Ｎ（２―ヒドロキシ―３―スルホプロピ
ル）アニリン・ナトリウム塩（DAOSと略す）、
４―AAとＮ―エチル―Ｎ―（２―ヒドロキシ―
３―スルホプロピル）―メタ−トルイジン・ナト
リウム塩（TOOSと略す）などが用いられる。ま
た蛍光法の場合は、チラミン塩酸塩、４―ヒドロ
キシ―３―メトキシフエニル酢酸、ホモワニリン
酸などが用いられる。好適な例としては、４―
AAとTOOS、４―AAとDAOS並びにホモワニリ
ン酸が感度が高い理由で挙げられる。PH緩衝剤と
しては各酵素反応に対して至適なPH条件を与える
ことができるものであれば何でもよく、リン酸緩
衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などが使用で
きる。 しかして、本発明の方法で体液中の総ポリアミ
ンを測定するには、PH緩衝液にアスコルビン酸オ
キシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、色原体を
溶解した溶液に適量の検体を添加し、反応が終了
するまで一定温度に保ち、反応系を光学的（比色
法又は蛍光光度法）に測定し、予め求めておいた
検量線に基づき総ポリアミン量を決定する。但
し、体液の種類によつて測定方法の詳細が異なる
ので、以下に例示的に詳述する。 まず尿中の総ポリアミンを測定する場合、PH
5.5〜7.5、0.02〜0.10MのPH緩衝液0.5〜2.0mlにア
スコルビン酸オキシダーゼ0.1〜50U／mlを溶解
させた溶液に、検体尿0.01〜0.20mlを加えて、３
分間以上一定温度（20〜40℃）で反応させ、尿中
に共存するアスコルビン酸を酸化分解する。次に
PH7.0〜9.0、0.05〜0.2MのPH緩衝液1.0〜4.0mlに
ポリアミンオキシダーゼ20〜50U／ml、パーオキ
シダーゼ0.1〜50U／ml及び適量の色原体（比色
用）を溶解させた溶液を添加して、反応が終了す
るまで（ほぼ30分以上）一定温度（20〜40℃）に
保ち、この反応液を比色測定する。尚、上記の場
合用いるポリアミンオキシダーゼは尿検体１ml当
り100〜5000Uとなるが、200U以上、特に600U以
上用いることが好ましい。 これは、ポリアミンオキシダーゼが遊離型（フ
リー）のポリアミンに対しては低単位でも比較的
短時間（５分程度）で反応を完了させるが、抱合
型（アセチル体）の場合は反応しにくいことによ
る。例えば、第１図はある正常者（同一人）の尿
検体（総ポリアミン量は約170n mole/mlに種々
な単位数のポリアミンオキシダーゼを作用させた
場合の吸光度と反応時間の関係を示すものである
が、図から明らかな如く検体量に対する酵素の単
位数が少ない場合には、反応を完全に終了させる
ことができないか、できても長時間を要すること
になる（600Uの場合20分で定常状態となるが
200Uでは60分100Uでは70分以上かかる）。 一方、第２図は複数の被検者の尿検体について
夫々１ml当り600Uの酵素を用いた場合の吸光度
と反応時間の関係を示すもので、正常者（曲線
，）及び癌患者（曲線〜）の場合とも、
総ポリアミン量及びアセチル体の割合に応じて
様々なパターンを描くが、いずれも60分前後でほ
ぼ正常状態となる（吸光度0.35が1000n mole/
mlに相当、第３図参照）。 しかして、本法を癌のスクリーニングテストに
用いる場合、所要時間は短かいほどよく（例えば
30〜60分）、そのためポリアミンオキシダーゼは
なるべく高単位（例えば600U以上）用いるのが
好ましいが経済的制限がある。従つて、約60分で
完全に反応が終了しなくても概ね反応を終らせる
のに必要な100〜200U程度の使用でも実用的には
差しつかえない。ちなみに、本発明に先行する特
公昭56−36918の方法では、尿検体１ml当り0.5〜
10U程度のものを用いた。 次に、血清中の総ポリアミンを定量する場合に
は、血清を前処理して蛋白質を除くこと、及び血
清中の総ポリアミンの濃度が極めて低いので色原
体として蛍光試薬を用いることが特徴である。即
ち、血清を0.1〜１ml採り、１〜５mlの除蛋白剤
を加えて蛋白質を沈殿除去した上澄液0.05〜1.0
mlを検体とし、これを尿の場合と同様に操作し、
最終の反応液の蛍光強度を測定する。ただ血清の
場合総ポリアミンの濃度が尿に比べて数十分の一
であるので、、ポリアミンオキシダーゼも比較的
低単位のものである。例えば検体１ml当り150U
程度以上であれば実用的である。 更に赤血球の総ポリアミンを定量する場合に
は、血液を血漿と赤血球層に分離し、集めた赤血
球層を血清の場合と同様に除蛋白し、色原体とし
てやはり蛍光試薬を用いて測定する。赤血球試料
の場合も尿と同程の総ポリアミンが存在するの
で、ポリアミンオキシダーゼの単位数は尿の場合
と同程度とすることが好ましい。 尚、前記した尿、血清赤血球以外の体液例えば
胃液、腹水、胸水、精液、更には生体組織中の総
ポリアミンも同様に除蛋白処理等の簡単な前処理
の後ポリアミンオキシダーゼとパーオキシダーゼ
を作用させることにより、簡単確実に得られるも
のである。但し、癌のスクリーニングテスト等に
は、簡単に採取できる尿、血液を試料とすること
が望ましいので、以下、尿、血清、赤血球につい
て実施例により更に詳しく本発明を説明する。但
し本実施例によつて本発明の技術的思想や範囲を
何ら制限するものではない。尚前述したもの及び
本実施例に示すもの以外に本発明の技術思想の範
囲内で各種の化合物や薬剤が使用でき、更に防
腐、安定化、反応の制御・促進等の目的で各種添
加剤を加えるとも自由である。 実施例 １ 尿中総ポリアミンの定量 （試薬） 試 薬 アスコルビン酸オキシダーゼ 4U／ml DAOS 0.2mg／ml 0.05M―リン酸緩衝液（PH6.5） 試薬Ｂ ポリアミンオキシダーゼ 30U／ml パーオキシダーゼ 2U／ml ４―AA 0.2mg／ml 0.1M―リン酸緩衝液（PH8.0） 標準液（1000n mole／ml） スペルミジン・３塩酸塩 25.46mg 精製水 全量100ml

【表】 検体、標準、盲検の吸光度をそれぞれ〔Ｓ〕、
〔St〕、〔Bl〕とすると、検体中の総ポリアミン濃
度は、以下の式にて算出される。 総ポリアミン量〔ｎ mole／ml〕 ＝1000×〔Ｓ〕−〔Ｂｌ〕／〔Ｓｔ〕−〔Ｂｌ〕 尚、標準液及びその希釈液の濃度と、それぞれ
の吸光度から盲検の吸光度を差し引いたものとの
関係を第３図に示す。 （再現性テスト） ３人の尿について再現性試験を行つた結果、表
―２に示す通りであつた。

【表】

【表】 （他法との相関） 本願発明者により特公昭56−36918号で明らか
にした方法（以下「加水分解ミニカラム法」と呼
ぶ）と本法との相関を調べた。結果は次のとおり
であつた（表―３及び第４図）。

【表】 相関係数 0.946 回帰直線 ｙ＝1.063＋7.20 実施例 ２ 血清中総ポリアミンの定量 （試薬） 除蛋白試薬（0.33M過塩素酸水溶液） 60％過塩素酸 55.25ｇ 精 製 水 全量1000ml １％水酸化ナトリウム溶液 水酸化ナトリウム １ｇ 精 製 水 全量100ml 発色液 ポリアミンオキシダーゼ 5U／ml アスコルビン酸オキシダーゼ 1U／ml パーオキシダーゼ 0.5U／ml ホモワニリン酸 0.01mg／ml 0.1M―リン酸緩衝液 標準液〔5n mole／ml〕 スペルミジン 1.27mg 精 製 水 全量1000ml （測定操作） 血清0.5mlに除蛋白試薬2.0mlを加え、十分混和
後3000rpmで10分間遠心し、上澄を検体とする。

【表】 検体、検体盲検、標準液、盲検の蛍光強度をそ
れぞれ〔Ｓ〕、〔Ｓ―Bl〕、〔St〕、〔Bl〕とすると、
検体中の総ポリアミン濃度は以下の式にて算出さ
れる。 総ポリアミン量（ｎ mole／ml）＝２．５／０．５×
５× 〔Ｓ〕−〔Ｓ―Ｂｌ〕／〔Ｓｔ〕−〔Ｂｌ〕 （測定結果） 正常人血清10検体を用いて測定したところ0.7
〜1.3n mole／mlの値を得た。

【表】 実施例 ３ 赤血球総ポリアミンの定量 （試薬） ポリアミンオキシダーゼの濃度を1/5とするほ
かは、実施例２と同じ。 （測定操作） 血液をヘパリン入採血管に採取し、十分混和後
3000rpmにて10分間遠心分離する。血漿及び上層
の白血球、血小板をアスピレータで除去した後、
生理食塩水を数ml加え十分混和洗浄し、3000rpm
にて遠心分離したのち、上層を除去する。さらに
２回赤血球を生理食塩水で洗浄し、遠心分離して
上層を除去し赤血球層を得る。この赤血球層より
0.10mlを試験管に採り、除蛋白液2.0mlを加え、
十分混和後3000rpmで10分間遠心した上澄を検体
とする。

【表】

【表】 検体、検体盲検、標準液、盲検の蛍光強度をそ
れぞれ〔Ｓ〕、〔Ｓ―Bl〕、〔St〕、〔Bl〕とすると検
体中の総ポリアミン濃度は、以下の式にて算出さ
れる。 総ポリアミン量（ｎ mole／ml）＝２．０５／１．０
×５× 〔Ｓ〕−〔Ｓ―Ｂｌ〕／〔Ｓｔ〕−〔Ｂｌ〕 （測定結果） 正常人赤血球10検体を用いて測定したところ20
〜40n mole/mlの値を得た。

【表】

【表】 以上詳述したように、本発明は、試料中の総ポ
リアミン量を酵素を用いて測定する方法におい
て、アスコルビン酸オキシダーゼの使用によりア
スコルビン酸を分解させ、且つ遊離型とともに抱
合型のポリアミンをともに酸化させるものである
ところから、分離分析のための特殊な装置や手技
を必要とせず、また試料検体の加水分解処理や共
存する妨害物質の除去のための陽イオン交換カラ
ム処理をすることなく、光学的に簡単に測定でき
るものである。従つて、従来特殊・高度な技能を
必要とした総ポリアミンの測定が簡単な操作で迅
速且つ正確に行なえ、大量の試料の分析も容易に
行なえるので、特に癌の臨床検査分野に多大な貢
献をなすものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は正常者の尿検体１ml当りのポリアミン
オキシダーゼの単位数を変えた場合における反応
時間と吸光度の関係を示すグラフ、第２図は正常
者（曲線，）と癌患者（曲線〜）の尿検
体の発色タイムコースを示すグラフ、第３図はポ
リアミン1000n mole/mlの標準液及びその希釈
液の濃度と吸光度の関係を示すグラフ、第４図は
加水分解―ミニカラム法と本発明方法との測定値
の相関関係を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アスコルビン酸オキシダーゼにより試料中に
   共存するアスコルビン酸を酸化分解し、遊離型及
   び抱合型のポリアミンを酸化して過酸化水素を生
   成させる作用を有する酵素により、遊離型及び抱
   合型のポリアミンを酸化し、生成した過酸化水素
   と色原体をパーオキシダーゼ様活性を有する酵素
   系の作用により反応させ、得られる物質を光学的
   に測定することを特徴とする総ポリアミンの測定
   方法。