JPS6244176A - 動物細胞の継代方法 - Google Patents
動物細胞の継代方法Info
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- JPS6244176A JPS6244176A JP18183085A JP18183085A JPS6244176A JP S6244176 A JPS6244176 A JP S6244176A JP 18183085 A JP18183085 A JP 18183085A JP 18183085 A JP18183085 A JP 18183085A JP S6244176 A JPS6244176 A JP S6244176A
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- Japan
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- microcarrier
- cells
- cell
- microcarriers
- medium
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はミクロキャリアー法による動物細胞の大鑓培養
に関するものである。さらに詳しくは、ミクロキャリア
ー表面上に付着増殖した細胞を新たなミクロキャリアー
に継代させる方法に関する。
に関するものである。さらに詳しくは、ミクロキャリア
ー表面上に付着増殖した細胞を新たなミクロキャリアー
に継代させる方法に関する。
（従来の技術）
従来、二倍体細胞等の係留依存性細胞の培養方法として
ルー瓶もしくはローラー瓶を用いる単層培養法が広く採
用されているが、繁雑な培養操作を必要とし、また得ら
れる細胞数にも限界がある。ずなわらこの方法において
は、細胞がルー瓶の底面もしくはローラー瓶の内側面に
（１１層に増殖するだけであるため極めて多数のルー瓶
もしくはローラー瓶を吸う必要があり、取り扱いが極め
て煩雑となり、またｐＨや培地中の溶存酸素濃度等の培
養条件を一定に制御することはほとんど不可能と考えら
れるためである。
ルー瓶もしくはローラー瓶を用いる単層培養法が広く採
用されているが、繁雑な培養操作を必要とし、また得ら
れる細胞数にも限界がある。ずなわらこの方法において
は、細胞がルー瓶の底面もしくはローラー瓶の内側面に
（１１層に増殖するだけであるため極めて多数のルー瓶
もしくはローラー瓶を吸う必要があり、取り扱いが極め
て煩雑となり、またｐＨや培地中の溶存酸素濃度等の培
養条件を一定に制御することはほとんど不可能と考えら
れるためである。
そこで、これらの欠点を解消するため同人円板法、多段
平板法、ホローファイバー法、ミクロキャリアー法等の
細胞の大儀培養方法が提案されている。このうち、ミク
ロキャリアー法は正に荷電した化学残塁を有するミクロ
キャリアー、変性コラーゲンをコートしたミクロキャリ
アー、その他細胞を接着させることが出来るミクロキャ
リアーを懸濁させた培地中に種細胞を接種し、懸濁状態
で培養する方法である。通常、直径５０〜１５０ミクロ
ン程度のビーズ、たとえば米国特許第４．１８９，５３
４号に開示されるようなデキストランビーズを培養液中
に多数浮遊させ各ビーズ表面に細胞を静電気的に付着さ
せて培養し、各ミクロキャリアー表面全体に細胞を密生
させる方法で、培養操作が簡単であり、効率よく大量の
細胞を得るための動物細胞培養法としてきわめて適した
ものと考えられる。
平板法、ホローファイバー法、ミクロキャリアー法等の
細胞の大儀培養方法が提案されている。このうち、ミク
ロキャリアー法は正に荷電した化学残塁を有するミクロ
キャリアー、変性コラーゲンをコートしたミクロキャリ
アー、その他細胞を接着させることが出来るミクロキャ
リアーを懸濁させた培地中に種細胞を接種し、懸濁状態
で培養する方法である。通常、直径５０〜１５０ミクロ
ン程度のビーズ、たとえば米国特許第４．１８９，５３
４号に開示されるようなデキストランビーズを培養液中
に多数浮遊させ各ビーズ表面に細胞を静電気的に付着さ
せて培養し、各ミクロキャリアー表面全体に細胞を密生
させる方法で、培養操作が簡単であり、効率よく大量の
細胞を得るための動物細胞培養法としてきわめて適した
ものと考えられる。
係留依存性細胞の増殖は、一般には細胞付着面をほぼ完
全におおい尽すまで増殖すると増殖速度が著しく低下し
、ついには増殖が停止する。
全におおい尽すまで増殖すると増殖速度が著しく低下し
、ついには増殖が停止する。
したがって更に大量の細胞を得る目的等のために細胞培
養を続けるには、タンパク質分解酵素でいわゆる消化処
理を施し、細胞と細胞付着面との結合および細胞どうし
の結合を切り、単一細胞の懸濁液となし、新たな細胞付
着表面を有する系に再接種する操作、即ち細胞継代操作
を行なうことが必要である。
養を続けるには、タンパク質分解酵素でいわゆる消化処
理を施し、細胞と細胞付着面との結合および細胞どうし
の結合を切り、単一細胞の懸濁液となし、新たな細胞付
着表面を有する系に再接種する操作、即ち細胞継代操作
を行なうことが必要である。
動物細胞の培養においては血清を添加した培地を使用す
るのが一般的であるが、血清中には細胞継代時にミクロ
キャリアーから細胞脱落させるために使用するタンパク
質分解酵素（トリプシン）の作用を阻害する物質が含ま
れているため、細胞継代前に培地を洗浄除去しておく必
要がある。そのための洗浄液として生体と等しい浸透圧
とｐ［−１を有する緩衝液が従来使用されている。たと
えば、ダルベツコ燐酸緩衝液を使用する場合が多いが、
生理食塩水にＨＥＰＥＳと水酸化ナトリウムを添加した
緩衝液等も使用可能である。
るのが一般的であるが、血清中には細胞継代時にミクロ
キャリアーから細胞脱落させるために使用するタンパク
質分解酵素（トリプシン）の作用を阻害する物質が含ま
れているため、細胞継代前に培地を洗浄除去しておく必
要がある。そのための洗浄液として生体と等しい浸透圧
とｐ［−１を有する緩衝液が従来使用されている。たと
えば、ダルベツコ燐酸緩衝液を使用する場合が多いが、
生理食塩水にＨＥＰＥＳと水酸化ナトリウムを添加した
緩衝液等も使用可能である。
しかしながら、大スケール細胞培養する際のトリプシン
処理を行なう前の洗浄において、従来の洗浄液ではミク
ロキャリアーより細胞が脱落してしまい細胞数率が極端
に低いばかりでなく、細胞にもダメージを与えてしまい
、最悪の場合には継代接に培養不可能になる場合があり
、特に大型の培養槽においてこの傾向が顕著である。従
って、ミクロキャリアー培養をスケールアップするのは
きわめて困難であり、また大ｍ培養において小型の培養
槽を多数使用するため設備費や人件費が高くなりミクロ
キャリアー培養のコストアップの原因となっている。
処理を行なう前の洗浄において、従来の洗浄液ではミク
ロキャリアーより細胞が脱落してしまい細胞数率が極端
に低いばかりでなく、細胞にもダメージを与えてしまい
、最悪の場合には継代接に培養不可能になる場合があり
、特に大型の培養槽においてこの傾向が顕著である。従
って、ミクロキャリアー培養をスケールアップするのは
きわめて困難であり、また大ｍ培養において小型の培養
槽を多数使用するため設備費や人件費が高くなりミクロ
キャリアー培養のコストアップの原因となっている。
本発明の目的は、ミクロキャリアーからミクロキャリア
ーへの細胞継代の細胞数率を向上させる方法と細胞継代
時の細胞に対するダメージを減少させる方法を開発する
ことにある。
ーへの細胞継代の細胞数率を向上させる方法と細胞継代
時の細胞に対するダメージを減少させる方法を開発する
ことにある。
上記の本発明の目的は以下の本発明により達成される。
すなわち本発明は、ミクロキャリアー法により培養され
た動物細胞をミクロキャリアーに継代させるに際して、
アミノ酸ビタミン培地、グルコースおよびメチルセルロ
ースを含む緩衝液を用いて細胞の付着したミクロキャリ
アーを洗浄することを特徴とする動物細胞の継代方法に
関するものである。
た動物細胞をミクロキャリアーに継代させるに際して、
アミノ酸ビタミン培地、グルコースおよびメチルセルロ
ースを含む緩衝液を用いて細胞の付着したミクロキャリ
アーを洗浄することを特徴とする動物細胞の継代方法に
関するものである。
本発明では通常のミクロキャリアー法に従って所望の動
物細胞を培養してミクロキャリアーに付着した細胞を得
る。ミクロキャリアーとしては、前述の正に荷電した化
学残基を有するもの、変性コラーゲンをコートしたもの
が一般的に用いられるが、この他合成高分子微小粒体く
例えばポリスチレン微小粒体）、無機質微小粒体（例え
ばガラス微小粒体）、その他細胞と親和性を有する素材
よりなる微小粒体もしくはビーズ等であってもよい。
物細胞を培養してミクロキャリアーに付着した細胞を得
る。ミクロキャリアーとしては、前述の正に荷電した化
学残基を有するもの、変性コラーゲンをコートしたもの
が一般的に用いられるが、この他合成高分子微小粒体く
例えばポリスチレン微小粒体）、無機質微小粒体（例え
ばガラス微小粒体）、その他細胞と親和性を有する素材
よりなる微小粒体もしくはビーズ等であってもよい。
これらのうち、正に荷電した化学残塁を有するミクロキ
ャリアーが好ましく、具体的には、ジエチルアミノエチ
ル化した架橋デキストランビーズ〈たとえばフ７ルマシ
アファインケミカル社ＩＪ ” Ｃｙｔｏｄａｘｌ ”
） 、ジメチルアミノプロピル化したポリアクリルア
ミドビーズ等が挙げられる。
ャリアーが好ましく、具体的には、ジエチルアミノエチ
ル化した架橋デキストランビーズ〈たとえばフ７ルマシ
アファインケミカル社ＩＪ ” Ｃｙｔｏｄａｘｌ ”
） 、ジメチルアミノプロピル化したポリアクリルア
ミドビーズ等が挙げられる。
本発明において使用する動物細胞は特に限定するもので
なく、係留依存性のある細胞であればいずれでもよい。
なく、係留依存性のある細胞であればいずれでもよい。
たとえばヒト新生児包皮由来の線帷芽細胞（ＤＩＲ−２
、ＦＳ）、ヒト子宮癌由来のＨｅＬａ／８３、ハムスタ
ー新生児腎臓由来のＢＨＫ−２１、マウス由来の線維芽
細胞り等の細胞に適用出来る。
、ＦＳ）、ヒト子宮癌由来のＨｅＬａ／８３、ハムスタ
ー新生児腎臓由来のＢＨＫ−２１、マウス由来の線維芽
細胞り等の細胞に適用出来る。
ミクロキャリアーに付着増殖した細胞は、継代操作前に
洗浄液により洗浄される。本発明で使用する洗浄液は、
アミノ酸ビタミン培地、グルコースおよびメチルセルロ
ースを含む緩衝波目。
洗浄液により洗浄される。本発明で使用する洗浄液は、
アミノ酸ビタミン培地、グルコースおよびメチルセルロ
ースを含む緩衝波目。
である。アミノ酸ビタミン培地と動物細胞培養ハ
用の培地のアミノ酸およびビタミンの混合組成物である
。たとえばイーグルＭＥＭ培地、イーグルＢＭＥ培地、
ダルベツコ変法イーグル培地、１９９培地、ハムＦ１２
培地、ＲＰＭｌ １６４０培地、フィッシャーの培地等
のアミノ酸ビタミン混合物である。アミノ酸ビタミン培
地の添加量は、通常０．５ｙ／Ｌ〜１．！Ｍ／Ｌが好ま
しい。
。たとえばイーグルＭＥＭ培地、イーグルＢＭＥ培地、
ダルベツコ変法イーグル培地、１９９培地、ハムＦ１２
培地、ＲＰＭｌ １６４０培地、フィッシャーの培地等
のアミノ酸ビタミン混合物である。アミノ酸ビタミン培
地の添加量は、通常０．５ｙ／Ｌ〜１．！Ｍ／Ｌが好ま
しい。
グルコース濃度は１．Ｏ！？／Ｌ〜２．０ｇ／Ｌの範囲
であれば使用可能である。メチルセルロース濃度は０．
５ｇ／Ｌ〜１．０ｇ／Ｌの範囲で使用可能であるが無菌
濾過の容易性を考慮すると下限濃度０．５ｙ／Ｌが好ま
しい。
であれば使用可能である。メチルセルロース濃度は０．
５ｇ／Ｌ〜１．０ｇ／Ｌの範囲で使用可能であるが無菌
濾過の容易性を考慮すると下限濃度０．５ｙ／Ｌが好ま
しい。
本発明のアミノ酸ビタミン培地、グルコースおよびメチ
ルセルロースが添加される緩衝液は、浸透圧が２７０〜
２９０ｍＯｓ ／Ｋｙ、ｐＨが７゜１〜７．５の範囲の
ものが好ましく、またＣａ、Ｍｇ等の二価金属はトリプ
シン処理を阻害するため口れらの二価金属含有射は２５
μｍｏｌ／ｌ未渦のものが好ましい。具体的には、燐１
緩衝液、ＨＥ Ｐ Ｅ Ｓ、ジヒドロオキシエチルグリ
シン等の緩衝液が用いられるが、特にダルベツコ燐酸緩
衝液が好ましく用いられる。
ルセルロースが添加される緩衝液は、浸透圧が２７０〜
２９０ｍＯｓ ／Ｋｙ、ｐＨが７゜１〜７．５の範囲の
ものが好ましく、またＣａ、Ｍｇ等の二価金属はトリプ
シン処理を阻害するため口れらの二価金属含有射は２５
μｍｏｌ／ｌ未渦のものが好ましい。具体的には、燐１
緩衝液、ＨＥ Ｐ Ｅ Ｓ、ジヒドロオキシエチルグリ
シン等の緩衝液が用いられるが、特にダルベツコ燐酸緩
衝液が好ましく用いられる。
次にミクロキャリアーの表面上に増殖した細胞を洗浄す
る方法の例について説明する。
る方法の例について説明する。
まず表面に細胞が付着増殖したミクロキャリアーを沈降
させ上澄培地を吸い取る。この際上澄培地の流れととも
に細胞が付着したミクロキャリアーが流出しないよう注
意が必要である。
させ上澄培地を吸い取る。この際上澄培地の流れととも
に細胞が付着したミクロキャリアーが流出しないよう注
意が必要である。
このために上澄培地を吸い取るラインの吸込口もしくは
ラインの途中に炉材を設けることは効果がある。次に゛ ゛ 〜 ′ ゛ 洗浄液を加えミクロキ
ャリアーを再懸濁させる。かかる操作を必要回数繰返し
て洗浄を行なう。上記の洗浄方法は、細胞の付着したミ
クロキャリアーと培地もしくは洗浄液の分離を沈降分離
法を利用して行なう方法であるが、該分離を濾過法を利
用して行なってもよくまた両法の組合せで行なってもよ
い。
ラインの途中に炉材を設けることは効果がある。次に゛ ゛ 〜 ′ ゛ 洗浄液を加えミクロキ
ャリアーを再懸濁させる。かかる操作を必要回数繰返し
て洗浄を行なう。上記の洗浄方法は、細胞の付着したミ
クロキャリアーと培地もしくは洗浄液の分離を沈降分離
法を利用して行なう方法であるが、該分離を濾過法を利
用して行なってもよくまた両法の組合せで行なってもよ
い。
さらに、上記方法は培地もしくは洗浄液を除いた後に洗
浄液を加えるいわゆる回分法であるが、培地もしくは洗
浄液の除去と洗浄液の供給を並行して行なう連続法であ
ってもよい。
浄液を加えるいわゆる回分法であるが、培地もしくは洗
浄液の除去と洗浄液の供給を並行して行なう連続法であ
ってもよい。
この様に洗浄を行なった細胞は、通常の方法によりトリ
プシン等の酵素を用い継代操作を行なう。
プシン等の酵素を用い継代操作を行なう。
〔発明の効果）
本発明によりミクロキャリアーからミクロキャリアーへ
の細胞継代の収率の向上と細胞のダメージを減少させる
ことが可能である。その結果、実施例から明らかな様に
ミクロキャリアーによる１００Ｌ以上の容量での細胞の
大ｍ培養が可能となり、また、（与られた細胞に超誘発
方法によりインターフェロンを産生させると、産生効率
が改善されることがわかった。
の細胞継代の収率の向上と細胞のダメージを減少させる
ことが可能である。その結果、実施例から明らかな様に
ミクロキャリアーによる１００Ｌ以上の容量での細胞の
大ｍ培養が可能となり、また、（与られた細胞に超誘発
方法によりインターフェロンを産生させると、産生効率
が改善されることがわかった。
以下実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する。
ただし本発明は以下の実施例に限定されるものではない
。
。
実施例１および比較例１
ミクロキャリアー（ファルマシアファインケミカル社製
” Ｃｙｔｏｄｅｘ １”、以下同じ、乾燥重量６００
０Ｒｇ）を常法に従って膨潤させ、５％仔牛血清添加イ
ーグルＭＥＭｊ８養液２０００ａｆ’およびヒト包皮由
来二倍体細胞（ＤＩＲ−２）懸濁液（培養液１威当り１
．５Ｘ１０５叫含有）と共に回転子付スピナーフラスコ
に加え、マグネックスクーラー上低速で撹拌しながら３
７℃で培養する。培養開始後、１日目、３日目、５日目
に７０％の培養液を新たなものと交換しながら６日間培
養を行なうと細胞がミクロキャリアー上で密生し、細胞
濃度が１０’個／ｒｄ！に達する。
” Ｃｙｔｏｄｅｘ １”、以下同じ、乾燥重量６００
０Ｒｇ）を常法に従って膨潤させ、５％仔牛血清添加イ
ーグルＭＥＭｊ８養液２０００ａｆ’およびヒト包皮由
来二倍体細胞（ＤＩＲ−２）懸濁液（培養液１威当り１
．５Ｘ１０５叫含有）と共に回転子付スピナーフラスコ
に加え、マグネックスクーラー上低速で撹拌しながら３
７℃で培養する。培養開始後、１日目、３日目、５日目
に７０％の培養液を新たなものと交換しながら６日間培
養を行なうと細胞がミクロキャリアー上で密生し、細胞
濃度が１０’個／ｒｄ！に達する。
ついで、ミクロキャリアー付着細胞を２本の１１スピナ
ーフラスコに１０００ｄ分注する。
ーフラスコに１０００ｄ分注する。
細胞の付着したミクロキャリアーを沈降させた後、上清
を廃棄する。一方の１Ｌスピナーフラスコには洗か液と
してメチルセルロース０．５３／Ｌを添加したダルベツ
コ燐酸緩衝液（浸透圧２８０ｍＯｓ／Ｉ（ｇ、ｐＨ７，
４、二価金属濃度１．３μｍｏｆ／Ｌ以下）を加え弱い
撹拌を行ない洗浄を行なう。ふたたび撹拌を停止し細胞
イ」着ミクロギヤリアーを沈降させ上清を廃棄する。こ
のような洗浄操作を３回行なった後、同じ洗浄液を加え
て１００ｍ１として２０ＯＲＰＭの撹拌回転数で２時間
撹拌を行なった（比較例１）。他方の１１スピナーフラ
スコには洗浄液としてメチルセルロースＯ，！Ｍ／Ｌ、
グルコース１．ｏｇ／Ｌ、イーグルＭＥＭアミノ酸ビタ
ミン培地０．８８ｇ／Ｌを添加したダルベツコ燐酸緩衝
液を用いて３回洗浄を行なった後、同様に２０ＯＲＰＭ
の撹拌回転数で２時間撹拌を１１なった（実施例１）。
を廃棄する。一方の１Ｌスピナーフラスコには洗か液と
してメチルセルロース０．５３／Ｌを添加したダルベツ
コ燐酸緩衝液（浸透圧２８０ｍＯｓ／Ｉ（ｇ、ｐＨ７，
４、二価金属濃度１．３μｍｏｆ／Ｌ以下）を加え弱い
撹拌を行ない洗浄を行なう。ふたたび撹拌を停止し細胞
イ」着ミクロギヤリアーを沈降させ上清を廃棄する。こ
のような洗浄操作を３回行なった後、同じ洗浄液を加え
て１００ｍ１として２０ＯＲＰＭの撹拌回転数で２時間
撹拌を行なった（比較例１）。他方の１１スピナーフラ
スコには洗浄液としてメチルセルロースＯ，！Ｍ／Ｌ、
グルコース１．ｏｇ／Ｌ、イーグルＭＥＭアミノ酸ビタ
ミン培地０．８８ｇ／Ｌを添加したダルベツコ燐酸緩衝
液を用いて３回洗浄を行なった後、同様に２０ＯＲＰＭ
の撹拌回転数で２時間撹拌を１１なった（実施例１）。
各１１−スピナーフラスコより洗浄後の細胞付着ミクロ
ギヤリアーを１５０ｄ分）主し、ミクロキャリアーを沈
降させてから上清を廃棄する。
ギヤリアーを１５０ｄ分）主し、ミクロキャリアーを沈
降させてから上清を廃棄する。
ついでダルベツコ燐！ｉ！２緩衝液に溶解したトリプシ
ン（トリプシン′ａ度２．５ｓ／ｌ ）７．５ｄでミク
ロキャリアー付着細胞を処理づることによりミクロキャ
リアーより細胞を脱落させた。
ン（トリプシン′ａ度２．５ｓ／ｌ ）７．５ｄでミク
ロキャリアー付着細胞を処理づることによりミクロキャ
リアーより細胞を脱落させた。
あらかじめ＃−備したおいた、牛血清５％を含むイーグ
ルＭＥＭ培地１１−に懸濁しておいたミクロキャリアー
く乾燥重量２．５５ｇ）に細胞、ミクロキャリアー混合
スラリーを接種し、３７℃、ｐｉ−１７，２、溶存酸素
濃度２５％（対飽和細胞を接種した翌日に、ミクロキャ
リアーに接着した細胞数を核染色法で測定した。表−１
に細胞継代時の細胞収率を示丈。ここでいう細胞収率と
は接着した細胞数と継代する前の細胞数との比をいう。
ルＭＥＭ培地１１−に懸濁しておいたミクロキャリアー
く乾燥重量２．５５ｇ）に細胞、ミクロキャリアー混合
スラリーを接種し、３７℃、ｐｉ−１７，２、溶存酸素
濃度２５％（対飽和細胞を接種した翌日に、ミクロキャ
リアーに接着した細胞数を核染色法で測定した。表−１
に細胞継代時の細胞収率を示丈。ここでいう細胞収率と
は接着した細胞数と継代する前の細胞数との比をいう。
ゆるり１党拌しながら３７℃、ρ１−（７，２，溶存酸
素濃度２５％（対飽和度）で７日間培養した。途中、１
日目、３日目、５日目に７０％の培地を新しいものと交
換した。
素濃度２５％（対飽和度）で７日間培養した。途中、１
日目、３日目、５日目に７０％の培地を新しいものと交
換した。
到達細胞数は表−１に示す。
次に、低温度のインターフェロン、カルボキシメチルセ
ルロースを含むイーグルＭＥＭ培地でプライミングを行
なった後、ｐｏｔｙ＜ １ ） ：ρＯ１ｙ （Ｃ）
を誘発剤として超誘発（スーパーインダクション）を行
ないメチルセルロースを添加したイーグルＭＥＭ培地中
にインターフェロンを蓄積させた。培地中に産生された
インターフ工〔１ンの吊をＦ Ｌ細胞および本地性口内
炎「フィルスを用いたＣ Ｐ Ｅ １ｎｈｉｂｉｔｉｏ
ｎ法で測定シ、比較例１に対する相対値で表−１に示す
。
ルロースを含むイーグルＭＥＭ培地でプライミングを行
なった後、ｐｏｔｙ＜ １ ） ：ρＯ１ｙ （Ｃ）
を誘発剤として超誘発（スーパーインダクション）を行
ないメチルセルロースを添加したイーグルＭＥＭ培地中
にインターフェロンを蓄積させた。培地中に産生された
インターフ工〔１ンの吊をＦ Ｌ細胞および本地性口内
炎「フィルスを用いたＣ Ｐ Ｅ １ｎｈｉｂｉｔｉｏ
ｎ法で測定シ、比較例１に対する相対値で表−１に示す
。
かなり苛酷な状態においたにもかかわらず実施例１の方
が比較例１より細胞収率、到達細胞数、インターフェロ
ン収Ｍのいずれもが高く、洗浄液の効果が明らかである
。
が比較例１より細胞収率、到達細胞数、インターフェロ
ン収Ｍのいずれもが高く、洗浄液の効果が明らかである
。
表−１
［
実施例２〜３および比較例２〜３
ミクロキャリアー（“ｃｙｔｏｄｅｘｌ ＋＋ 、乾燥
重量４２！７）を常法に従って膨潤させ、５％仔牛血清
添加イーグルＭＥＭ培地１６Ｌとともに培養槽中に入れ
てゆるやかに撹拌しながら３７℃、ｐｉ−１７，２、溶
存酸素濃度２５％（対飽和度）に調整する。
重量４２！７）を常法に従って膨潤させ、５％仔牛血清
添加イーグルＭＥＭ培地１６Ｌとともに培養槽中に入れ
てゆるやかに撹拌しながら３７℃、ｐｉ−１７，２、溶
存酸素濃度２５％（対飽和度）に調整する。
別にミクロキャリアー法で培養したミクロキャリアー（
ミクロキャリアー乾燥重量６９、細胞数約２．０Ｘ１０
’ ）にイ・１石したＤＩＲ−２細胞を０ 、５９ 、
、、／ ｌ、のメチル廿ル「二」−スを添加したダルベ
ラ’ ＲＭ’ｔ 重液で３回洗浄した後、２．５ｙ／Ｉ
−のトリプシン溶液１００ｄを加えミクロキャリアー、
細胞懸濁液を培養槽に加え、低速で撹拌しながら３７℃
、ｐＨ７，２、溶存酸素濃度２５％（対飽和度）″Ｃ培
養する。ｉ８養開始後、１日目、３日目、５日目に７０
％の培養液を新たなものと交換しながら６日間培養を行
なうと細胞がミクロキャリアー上で密生し、細胞′ｆ３
度が１０６個／ ｍ１以上に達した。
ミクロキャリアー乾燥重量６９、細胞数約２．０Ｘ１０
’ ）にイ・１石したＤＩＲ−２細胞を０ 、５９ 、
、、／ ｌ、のメチル廿ル「二」−スを添加したダルベ
ラ’ ＲＭ’ｔ 重液で３回洗浄した後、２．５ｙ／Ｉ
−のトリプシン溶液１００ｄを加えミクロキャリアー、
細胞懸濁液を培養槽に加え、低速で撹拌しながら３７℃
、ｐＨ７，２、溶存酸素濃度２５％（対飽和度）″Ｃ培
養する。ｉ８養開始後、１日目、３日目、５日目に７０
％の培養液を新たなものと交換しながら６日間培養を行
なうと細胞がミクロキャリアー上で密生し、細胞′ｆ３
度が１０６個／ ｍ１以上に達した。
ライでミクロキャリアー（” Ｃｙｔｏｄｅｘｌ”、乾
燥重量２５２ｇ）を常法に従って膨潤させ、５％仔牛血
清添加イーグルＭＥＭ培地１００Ｌとともに培養槽中に
入れてゆるやかに撹拌しながら３７℃、ｐＨ７，２、溶
存酸素濃度２５％（対飽和度）に調整する。細胞継代す
るためメチルセルロース０．５９／Ｌを添加した実施例
１と同じダルベツコｇ４酸綴衝液およびイーグルＭ Ｅ
Ｍアミノ酸ビタミン培地０．８８！７／Ｌ、グル］−
ス１．Ｏｇ、・］−、］メールし′ル［」−ス０４５ｑ
′１−を乙ぺＪｌｉ ｌ、た実施例］１ど［凸１じク
ルベノニ］燐酸緩廟液で３３回の回分洗浄（交換率９
Ｑ Ｏｆ、 ）を培箔槽内′Ｃ：［＜ｊつだ、各洗浄液
で洗浄したミクロキャリアー付着ＤＩＲ−２細胞に２．
５９／Ｌｉ−リブシン溶液８００ｄを作用さぜミク］」
キ１７リアーと細胞を分離し、両者を１００し培養槽に
添加して培養を開始した。１００Ｌ培養槽に細胞を接種
した直後に培養液をサンプリングして遠心分離してから
核染色法で細胞濃度を１１丈 測定し細胞継代にＪ３ける譬率を算出した。低速で撹拌
しながら３７℃、ｐｌ−１７，２、溶存酸素濃度２５％
（対飽和度）で培養する。培養開始（殺、１日目、３日
目、５日目に７０％の培養液を新たなものと交換しなが
ら６日間培養を行なうと細胞がミクロキャリアー上で密
生した。ｉｌ達細胞数を核染色法で測定した。
燥重量２５２ｇ）を常法に従って膨潤させ、５％仔牛血
清添加イーグルＭＥＭ培地１００Ｌとともに培養槽中に
入れてゆるやかに撹拌しながら３７℃、ｐＨ７，２、溶
存酸素濃度２５％（対飽和度）に調整する。細胞継代す
るためメチルセルロース０．５９／Ｌを添加した実施例
１と同じダルベツコｇ４酸綴衝液およびイーグルＭ Ｅ
Ｍアミノ酸ビタミン培地０．８８！７／Ｌ、グル］−
ス１．Ｏｇ、・］−、］メールし′ル［」−ス０４５ｑ
′１−を乙ぺＪｌｉ ｌ、た実施例］１ど［凸１じク
ルベノニ］燐酸緩廟液で３３回の回分洗浄（交換率９
Ｑ Ｏｆ、 ）を培箔槽内′Ｃ：［＜ｊつだ、各洗浄液
で洗浄したミクロキャリアー付着ＤＩＲ−２細胞に２．
５９／Ｌｉ−リブシン溶液８００ｄを作用さぜミク］」
キ１７リアーと細胞を分離し、両者を１００し培養槽に
添加して培養を開始した。１００Ｌ培養槽に細胞を接種
した直後に培養液をサンプリングして遠心分離してから
核染色法で細胞濃度を１１丈 測定し細胞継代にＪ３ける譬率を算出した。低速で撹拌
しながら３７℃、ｐｌ−１７，２、溶存酸素濃度２５％
（対飽和度）で培養する。培養開始（殺、１日目、３日
目、５日目に７０％の培養液を新たなものと交換しなが
ら６日間培養を行なうと細胞がミクロキャリアー上で密
生した。ｉｌ達細胞数を核染色法で測定した。
次に、低濃度のインターフェロンとカルボキシメチルセ
ルロースを含むイーグルＭＥＭ培地でブライミングを行
なった後、ｔｌｏｌｙ（１） ： ＤＯｌｙ （Ｃ）を
誘発剤として超誘発（スーパーインダクション）行ない
メチルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地中にインタ
ーフェロンを蓄積させた。培地中に産生されたインター
フェロンの洛をＦＬＩＯＩ胞および水庖性口内炎ウィル
スを用いたＣ Ｐ Ｅ １ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ法で測定
し、比較例１と比較例２の平均に対する相対値で表−２
に示す。
ルロースを含むイーグルＭＥＭ培地でブライミングを行
なった後、ｔｌｏｌｙ（１） ： ＤＯｌｙ （Ｃ）を
誘発剤として超誘発（スーパーインダクション）行ない
メチルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地中にインタ
ーフェロンを蓄積させた。培地中に産生されたインター
フェロンの洛をＦＬＩＯＩ胞および水庖性口内炎ウィル
スを用いたＣ Ｐ Ｅ １ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ法で測定
し、比較例１と比較例２の平均に対する相対値で表−２
に示す。
表−２
イーグルＭＥＭアミノ酸ビタミン培地０．８８ ｇ／Ｌ
、グルコース１．０ｇ／Ｌ、メチルセルロース０．５ｇ
／Ｌを添加したダルベツコ燐η 酸緩衝液で洗浄すると、はぼ１００％の細胞≠率が１ｑ
られた。継代後の細胞増殖Ｊ３よびインターフェロン産
生イーグルＭＥＭアミノ酸ビタミン培地等を添加した洗
浄液を使用した方が良好であった。
、グルコース１．０ｇ／Ｌ、メチルセルロース０．５ｇ
／Ｌを添加したダルベツコ燐η 酸緩衝液で洗浄すると、はぼ１００％の細胞≠率が１ｑ
られた。継代後の細胞増殖Ｊ３よびインターフェロン産
生イーグルＭＥＭアミノ酸ビタミン培地等を添加した洗
浄液を使用した方が良好であった。
Claims (1)
- （１）ミクロキャリアー法により培養された動物細胞を
ミクロキャリアーに継代させるに際して、アミノ酸ビタ
ミン培地、グルコースおよびメチルセルロースを含む緩
衝液を用いて細胞の付着したミクロキャリアーを洗浄す
ることを特徴とする動物細胞の継代方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18183085A JPS6244176A (ja) | 1985-08-21 | 1985-08-21 | 動物細胞の継代方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18183085A JPS6244176A (ja) | 1985-08-21 | 1985-08-21 | 動物細胞の継代方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6244176A true JPS6244176A (ja) | 1987-02-26 |
Family
ID=16107563
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18183085A Pending JPS6244176A (ja) | 1985-08-21 | 1985-08-21 | 動物細胞の継代方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6244176A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180048769A (ko) | 2015-08-31 | 2018-05-10 | 고쿠리츠겐큐카이하츠호진 가이죠·고완·고쿠기쥬츠겐큐죠 | 선미 덕트를 가진 선미 형상 및 선박 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS572682A (en) * | 1980-06-06 | 1982-01-08 | Toray Ind Inc | Washing method of cell |
-
1985
- 1985-08-21 JP JP18183085A patent/JPS6244176A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS572682A (en) * | 1980-06-06 | 1982-01-08 | Toray Ind Inc | Washing method of cell |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180048769A (ko) | 2015-08-31 | 2018-05-10 | 고쿠리츠겐큐카이하츠호진 가이죠·고완·고쿠기쥬츠겐큐죠 | 선미 덕트를 가진 선미 형상 및 선박 |
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