JPS6236494B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血液製剤中に含まれている血圧降下
作用物質および／または血液凝固促進作用を有す
る物質を除去し、これら物質を含まない血液製剤
を製造する方法に関する。

血液中の各種蛋白質をアルコール分画法、硫安
分画法またはイオン交換体吸着法等により純化
し、それらの蛋白を必要とする患者に投与するこ
とは、純化しない血液をそのまま投与するよりも
副作用が少なく、かつそのものの有する臨床効果
も高くなることは広く知られている。

このようなことからアルブミン、グロブリン、
フイブリノゲン、ハプトグロビリン、トランスフ
エリンまたはコリンエステラーゼなどの血液中の
蛋白質が各種の方法で精製され、血液製剤として
臨床に用いられている。

他方これらの血液製剤は精製されてはいるもの
の、通常は血圧降下作用物質や血液凝固促進作用
を有する物質を微量ながら含んでいるため投与さ
れる患者の一部においては血圧降下や血液凝固促
進等の副作用を呈することがある。

従つてこれらの血液製剤から微量に含まれてい
る血圧降下作用物質や血液凝固促進物質を完全に
除去することは、より安全な血液製剤を得るため
極めて重要な課題である。

血液製剤中の血圧降下作用物質としてはカリク
レイン、プレカリクレイン、プレカリクレインア
クチベーター等のキニン系の酵素が知られてい
る。また血液凝固促進作用を有する物質としては
トロンボプラスチンや血液凝固第、、XIなど
の諸因子が知られている他、キニン系物質も凝固
因子を活性化して血液凝固促進に関与する。

ところで、血圧降下作用物質および血液凝固促
進作用を有する物質は医薬品として有用であり、
これを分離する方法としては、イオン交換体吸着
法、塩析法などが知られている。しかしこれらの
方法における分離の対象とされる出発原料は血
漿、血清、胎盤抽出液、尿などの多量の血圧降下
作用物質、血液凝固促進作用を有する物質を含む
ものであり、これら方法は血液製剤中に微量に含
まれているこれら物質を完全に除去する方法とし
ては不適当である。その理由は除去の対象とされ
る血圧降下作用物質や血液凝固促進物質の量が他
の蛋白質に比べ極めて微量である場合は、他の蛋
白質の影響をうけてイオン交換体への吸着が不十
分となつたり、または塩析法などで分離するとき
に他の蛋白質に抱き込まれて回収が不十分となる
ためである。

従つて本発明の目的は、血圧降下作用物質や血
液凝固促進作用を有する物質を含む血液製剤から
これら物質を回収・除去することによる血液製剤
の製造法、特に血液製剤の夾雑物としてこれら物
質が微量に混在しているものから、これらの物質
を完全に除去することによつて、より安全な血液
製剤を製造する方法を提供することにある。

本発明者らは、血圧降下作用物質および／また
は血液凝固促進作用を有する物質を含有する血液
製剤と、水不溶性アンテイトロンビン−とを接
触させると、これら物質が効率よくアンテイトロ
ンビン−に吸着されて血液製剤から完全に除去
しうること、しかも血液製剤中のこれら物質の含
量が微量であつても同様の結果が得られることを
見出し本発明を完成した。

本発明は血圧降下作用物質および／または血液
凝固促進作用を有する物質を夾雑する血液製剤を
水不溶性アンテイトロンビン−と接触させ、血
圧降下作用物質及び／又は血液凝固促進作用を有
する物質を水不溶性アンテイトロンビン−に吸
着させて除去することによる血圧降下作用物質及
び血液凝固促進作用を有する物質を含まない血液
製剤の製造方法によつて構成されるものである。

本発明でいう血液製剤とは、たとえば血液中に
含まれる蛋白質その他の血液成分をいい、これら
は血液から分画されたもののみならず、たとえば
尿中などから分離されうるものをも含むものであ
る。具体的には、たとえばアルブミン、グロブリ
ン、フイブリノゲン、ハプトグロビン、トランス
フエリン、コリンエステラーゼ、プラスミノゲン
などの血液中に含まれる蛋白質などがあげられ
る。

本発明における出発原料は、血圧降下作用物質
および／または血液凝固促進作用を有する物質を
夾雑する血液製剤である。而して、本発明の方法
によれば、従来のイオン交換体吸着法、塩析法な
どでは除去できなかつたような微量のこれら物質
を夾雑する血液製剤からも効率よくこれら物質を
除去しうるものである。従つて、本発明の方法は
かかる微量の血圧降下作用物質、血液凝固促進作
用を有する物質を夾雑する血液製剤に対して適用
することに特に意義がある。

本発明出発原料に使用する血液製剤は好ましく
は40％以上、より好ましくは60％以上の純度に精
製されたものである。

本発明の出発物質たる血液製剤は一般には水溶
液の形で本発明方法に供される。

アンテイトロンビン−は血液中に微量に含ま
れる物質であり、トロンビンに対し強い阻害作用
を示すとともに、他の凝固系因子、キニン系酵素
をも阻害するものである。その回収法としては、
ポリエチレングリコール分画法（特開昭52−
151710）、硫酸化炭化水素吸着法（特開昭48−
35017）などがあり、これらに準じた方法によつ
ても回収しうる。

本発明においては水不溶性アンテイトロンビン
−が用いられる。水不溶性アンテイトロンビン
−としては、たとえば水不溶性支持体、とりわ
け水不溶性多糖類とアンテイトロンビン−との
反応生成物などがあげられる。

ところで、水不溶性アンテイトロンビン−
は、一般にアンテイトロンビン−を構成するア
ミノ酸のアミノ基、またはカルボキシル基を介し
て水不溶性支持体と結合しているが、本発明の目
的にはカルボキシル基を介して結合したものが好
ましい。

水不溶性支持体としては、セルロース、アガロ
ース、交叉結合デキストラン（セフアデツクス：
フアルマシア社製）、デンプンなどの多糖類、ナ
イロン、アクリルアミドゲルなどの合成樹脂など
があげられる。

水不溶性支持体とアンテイトロンビン−との
反応生成物は、たとえば蛋白質の固定化法として
一般に知られている方法によつて製造でき、たと
えば水不溶性多糖類をCNBrで活性化した後、ア
ンテイトロンビン−と反応させる方法〔カウト
レカサスP.（ジヤーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー、245(12)、3059、1970年）〕はアンテイト
ロンビン−の変性が少なく、有効な方法であ
る。

特に、カルボキシル基を介して結合したものを
製造する場合には、カルボジイミド試薬を用いる
方法〔N.ウエリキイー、F.S.ブラウン、E.C.ダ
ール；アーチ・バイオケミカル・バイオフイジ
カ、３、１（1969）〕、ウツドワード試薬を用いる
方法〔A.B.パテル、S.N.ペンニングトン、H.D.
ブラウン；バイオケミカ・バイオフイジカ・アク
タ、178、626（1969）〕などに準ずる方法が適用
される。

本発明は、水不溶性アンテイトロンビン−と
血液製剤とりわけその水溶液とを接触させて血圧
降下作用物質や血液凝固促進作用を有する物質を
吸着・除去することによつて行われる。この際、
水不溶性アンテイトロンビン−による吸着をヘ
パリンやデキストラン硫酸などの硫酸多糖類の存
在下に行うことにより水不溶性アンテイトロンビ
ン−の活性は著しく高くなる。なお硫酸多糖類
を血液製剤の中で予め加えた後に水不溶性アンテ
イトロンビン−と接触させることもできるが、
この場合血液製剤の中へ硫酸多糖類が残存するこ
とがあるため、好ましくは水不溶性アンテイトロ
ンビン−を硫酸多糖類で予め前処理して硫酸多
糖類に吸着させた後に、余剰の硫酸多糖類を0.5
〜1.5％の塩化ナトリウム溶液または血液製剤の
溶解液と同一組成の溶液で洗浄しておく。

接触条件は、一般にPHが5.5〜8.5、より好まし
くはPH６±0.2であり、この時のイオン強度は一
般に0.05〜0.3である。接触はバツチ法、カラム
法などによつて行われ、処理後、血液製剤と水不
溶性アンテイトロンビン−を分離し、血液製剤
は医薬品として使用するために回収する。

かくして本方法を実施することにより、血液製
剤中に夾雑する血圧降下作用物質および血液凝固
促進作用を有する物質は完全に陰性となり、その
除去効果は90％以上であり、しかも血液製剤の回
収率も90％以上と高率であり、血液製剤の製造に
おいてきわめて有用な方法を提供するものであ
る。

本発明の特徴を更に実施例をもつて説明する。

なお、実施例にて採用したカリクレイン、プレ
カリクレイン、プレカリクレインアクチベータ
ー、プラスミン等の定量法は〔G.クレーソン、P.
フリバーガー、M.クネス及びE.エリクソン、ヘ
モスタシス、７、76（1978）〕の方法に準じた。
また血液凝固促進作用を有する物質の定性試験は
ウサギ又はヒトの血液と検体とを等量混合した時
の凝固時間を測定し、生理食塩水を対照とした時
の凝固時間と比較することにより行つた。

実施例 １ ヒトアンテイトロンビン−を生理食塩水に２
単位／ml（単位：１単位とは正常ヒト血漿１ml中
のアンテイトロンビン−活性量に相当する。）
になるように溶解した。セフアロース−4B（フ
アルマシア社）の500mlにブロムシアン25ｇを添
加し、カトレカサスP.の方法に従い活性化を行
い、更にエチレンジアミンを50ml添加することに
よりアミノエチル−セフアロース−4Bを得た。

このものを前記のアンテイトロンビン−溶液
の500mlと混合し、更にカルボジイミドを加え20
℃で20時間反応を行い、水不溶性アンテイトロン
ビン−−セフアロース−4Bを得た。このアン
テイトロンビン−−セフアロース−4Bの500ml
とヘパリンナトリウムの1000国際単位とを混合し
30分間撹拌を行い、ヘパリン吸着アンテイトロン
ビン−−セフアロース−4Bを得た。余剰のヘ
パリンは生理食塩水2000mlで洗浄し除去した。こ
のものを血圧降下作用物質と血液凝技促進作用を
有する物質とが混入していることが判つているロ
ツトのヒト免疫グロブリンの15％溶液20の中へ
加え４℃で１時間ゆるやかに撹拌を行つた後、ろ
紙No.2（東洋科学産業）を用いてろ過を行いろ
液を得た。このヒト免疫グロブリン液を除菌ろ過
し10mlずつ無菌的に分注し製剤とした。このアン
テイトロンビン−−セフアロース−4B処理前
後のヒト免疫グロブリンの回収率は97％以上であ
り、損失は測定誤差範囲以内とにとどまつた。

カリクレイン、プレカリクレインアクチベータ
ー、プラスミンは処理前の混入量を100％として
いずれも10％以下にまで除去された。

また血液凝固促進作用を有する物質は蛋白濃度
２％で測定し、陰性であつた。

実施例 ２ 実施例１で作成したヘパリン吸着アンテイトロ
ンビン−−セフアロース−4Bを生理食塩水で
洗滌したもの50mlずつをとり、血圧降下作用物質
と血液凝固促進作用を有する物質との混在を認め
た25％アルブミン溶液、５％ハプトグロビン溶
液、20単位／mlのコリンエステラーゼ溶液、５％
トランスフエリン溶液のそれぞれ２にこれらを
加え、実施例１と同様に処理して除菌ろ過して無
菌溶液を得た。この処理による蛋白の回収率は95
％以上で最も回収率の低かつたのはコリンエステ
ラーゼで95％であつた。この処理によるカリクレ
インの除去率は99〜92％、プレカリクレインの除
去率は96〜92％、プラスミンの除去率は98〜90％
であつた。凝固促進作用は、これらいずれの蛋白
溶液も、対照の生理食塩液に比べて２〜４倍凝固
時間を短縮させるものであつたが、処理後はいず
れも生理食塩液によつて示される凝固時間とほゞ
同等となつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血圧降下作用物質および／または血液凝固促
   進作用を有する物質を夾雑する血液製剤を水不溶
   性アンテイトロンビン−と接触させ、血圧降下
   作用物質および／または血液凝固促進作用を有す
   る物質を水不溶性アンテイトロンビン−に吸着
   させて除去することを特徴とする血圧降下作用物
   質および血液凝固促進作用を有する物質を含まな
   い血液製剤の製造方法。 ２ 血圧降下作用物質および／または血液凝固促
   進作用を有する物質を夾雑する血液製剤の純度が
   40％以上に精製されている特許請求の範囲第１項
   記載の血液製剤の製造方法。 ３ 水不溶性アンテイトロンビン−による吸着
   を硫酸多糖類の存在下に行うことを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の血液製剤の製造方法。 ４ 硫酸多糖類がヘパリンまたはデキストラン硫
   酸であることを特徴とする特許請求の範囲第３項
   記載の血液製剤の製造方法。 ５ アンテイトロンビン−がその分子内のカル
   ボキシル基を介して水不溶性支持体と結合してい
   る水不溶性アンテイトロンビン−を用いること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の血液製
   剤の製造方法。 ６ 血圧降下作用物質および／または血液凝固促
   進作用を有する物質と水不溶性アンテイトロンビ
   ン−とを接触させる時のPHが5.5〜8.5、イオン
   強度が0.05〜0.3であることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の血液製剤の製造方法。