JPS62289200A - 酵素標識測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 （産業上の利用分野） 本発明は酵素標識測定法に関するものであるが、更に詳
細には、ムターゼ反応を有効に利用した酵素反応に基礎
をおく全く新規にして有用な超微量分析方法に関する。

本方法は、免疫分析を中心とする診断等医療の技術分野
のみならず、細胞組織学を中心とする生化学の技術分野
、及び酵素化学に基礎をおく酵素産業ないし発酵工業の
技術分野で重用されるものである。

（従来の技術） 標識物質を用いて生体物質を定量又は定性分析する方法
としては、免疫測定法のほか、ラジオアイソトープ、酵
素、蛍光物質を標識物質として抗原や抗体に結合せしめ
て、目的とする物質を抗原抗体反応を利用して測定する
方法（ＲＩＡ、　ＣＩＡ、蛍光抗体法）等が広く用いら
れている。

酵素免疫測定法（ＥＩＡ）において、抗原や抗体といっ
た測定対象物質含量が非常に少ない検体を測定する場合
、通常の酵素を使用したときの測定限界はｌｎｇ／ｍ１
程度といわれている。したがって、これよりも含量の少
ない検体を測定するには、反応時間を極端に延長するか
、酵素反応によって蛍光を発する物質を更に結合したり
するといった処理が不可避である。現在、ＥＩＡにおい
て使用されているｕ　ｌｔ３としては、例えば、βガラ
クトシダーゼ（ＥＣ３，２，１，２３）、パーオキシダ
ーゼ（ＥＣ１，１１゜１．７）、アルカリホスファター
ゼ（ＥＣ３，１，３，１）、グルコース６リン酸脱水素
酵累（ｌＥＣ１，１，１，４９）などが主として用いら
れているにすぎない（大原　達ほか著ｒ現代免疫学」朝
倉（昭５２−１ｌ−５）　ｐ１５（１−１５３）。

このように、酵素として１１ターゼの反応を利用して、
検体中にごく？Ｉｉ量存在する測定対象物質を箭甲、な
操作で検出、測定する方法は全く知られていないという
のが現状である。

（発明の目的） 本発明は、このような技術の現状に鑑みてなされたもの
であって、検体中にごく微量しか存在しておらず、しか
も従来の酵素櫃識法では測定不可ないしは極めて困難で
あった測定対象物質を、酵素反応を利用して確実、迅速
に測定できる方法を開発する目的でなされたものである
。

（発明の構成及び効果） このような現状に鑑みて本発明はなされたものである。

そこで本発明者は、ホスホグルコキナーゼの反応により
グルコース１リン酸（Ｇ−１−Ｐ）から生成するグルコ
ース１，６ニリン酸（Ｇ−１、６−ｄｉＰ）を、Ｇ−１
−Ｐ　とホスホグルコムターゼとを用いてグルコース６
リン酸（Ｇ−６−Ｐ）とＧ−１，６−ｄｉＰに変換し、
生成したＧ−６−ＰをＮＡＤ（Ｐ）とＧ−６−Ｐ脱水素
酵素を用いてＮＡＤ（Ｐ）ＩＩと６ホスホグルコン酸へ
と変換させる反応に着目し、上記により生成したＮＡＤ
（Ｐ）ＩＩに由来する３４０ｎｍにおける吸光度の増大
によってホスホグルコキナーゼ活性を測定できるという
ことを発見した。

しかしながら、この方法では、ホスホグルコキナーゼの
反応生成物であるＧ−１、６−ｄｉＰは、ホスホグルコ
ムターゼの触媒として働くために、ホスホグルコキナー
ゼの酵素活性は、１分間当りの吸光度の変化量からの単
純な比例計算では算出することができないという障害に
遭遇した。

しかしながら、更に検討を加えた結果、このｍ位時間当
りの吸光度の変化量を更に時間に対して微分したところ
、この微分値が酵素活性に比例するという新知見を得、
この関係式を用いることによって従来のＰＫ−ＬＤＩ＋
を共役系として用いる方法により１００倍程度も低い酵
素活性も検出、　ｉｌｌ’ｌ定可能であることも発見し
た。この新知見を基礎にして更に検討の結果、本発明の
完成に到ったのである。

本発明を実施するには、ホスホグルコキナーゼといった
キナーゼ系酵素を標識酵素として、抗原又は抗体に結合
させた生成物を目的測定物質（抗体又は抗原）と反応さ
せた後、その固体用又は液体相中に、ホスホグルコムタ
ーゼ、Ｇ−６−Ｐ脱水素酵素、Ｇ−１−Ｐ、　ＡＴＰ及
びＮＡＤ（Ｐ）を添加して、ホスホグルコキナーゼ反応
により生成したＧ−１、６−ｄｉＰ　を触媒としてホス
ホグルコムターゼによりＧ−１−ＰをＧ−６−Ｐへと転
換せしめ、更にＧ−６−Ｐ脱水素酵素を共役させること
によりＮＡＤ（Ｐ）ＩＩへと変換せしめ、その際の３４
０ｎｍにおける数位時間当りの吸光度の変化量として、
上記固体用又は液体相中の酵素活性を求め、そして更に
この変化量をさらに時間に対して微分し、得られた値か
ら非常に高感度で目的物質を測定するものである。

このムターゼを用いたＥＩＡによれば従来から用いられ
ているβ−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ等を標
′Ｒ酵素とする従来からのＥＩＡに比べ測定検出限界が
０．１ｎｇ／ｍｌと約１０倍以下の低濃度まで測定する
ことができるという著効が得られる。

本発明によれば、［ＥＩＡに用いる標識酵素に１１タ一
ゼ反応の基質であり、その自身ムターゼ反応の触媒とし
て作用する物質を反応生成物とするところの酵素を標識
酵素として用い、反応生成物が共役酵素として用いるム
ターゼの反応の触媒として作用することにより、目的物
質が非常に低濃度でしか存在しなくてもムターゼ反応を
利用することにより短時間に感度よく検出しうるという
著効が得られる。

本発明において共役系として用いることのできるムター
ゼとしては、グルコース１，６ニリン酸を基質とするホ
スホグルコムターゼに限らず、２−アセトアミド２デオ
キシＤ−グルコース１，６ニリン酸を基質とするアセチ
ルグルコサミンホスホムターゼ（ＥＣ，２，７，５，２
）、グリセリン２，３ニリン酸を基質とするホスホグリ
セロムターゼ（ＥＣ，２，７，５，３）、グルコースを
基質とするホスホグルコムターゼ（グルコース、コファ
クター）（ＥＣ，２，７，５，５）、グルコース１，６
ニリン酸を基質とするホスホペントムターゼ（ＩＥＣ，
２，７，５，６）のようにそれ自身その反応を、触媒す
るような物質を基質とするムターゼであれば。

す入てのものが使用できる。それゆえ、抗原あるいは抗
体に結合させるＦ識酵素としては、ホスホグルコムター
ゼの基質となるグルコース１，６ニリン酸を反応生成物
とするホスホグルコキナーゼや、ホスホグルコキナーゼ
活性を有するホスホフラクトキナーゼ（ＩＥＣ，２，７
゜１．１１）にかぎらず、上記ムターゼの基質であり、
それ自身ムターゼ反応のＭｉ媒として作用する物質を反
応生成物とする酵素であれば、すべてのものが適宜使用
でき、キナーゼ類はその１例である。

本発明方法によれば、従来の方法よりも１０倍も微量の
物質を測定でき、換言すれば感度が１０倍も上昇するの
で、検体の量もごく少量で充分であるし、測定時間も短
くてすみ、吸光度を読みとればよいので測定に失敗や誤
認がなく、不法はきわめてすぐれている。

また、本発明はＥＩＡのほか、酵素を用いる他の分析や
、例えば組織病理学において、癌化した細胞の検出、定
量にも利用できるという極めて顕著な効果も奏する。す
なわち、腫瘍細胞の表面抗原に対する抗体にムターゼ反
応の基質であり、またそれ自身ムターゼ反応を触媒する
物質を反応生成物とする酵素（たとえばホスホグルコキ
ナーゼ）で１：”４　ＴｆｉＬ／た抗体を作用させ、そ
の後、共役系酵素として、ホスホグルコムターゼ、グル
コース６リン酸脱水素酵素を用い、　ＡＴＰ、　ＮＡＤ
（Ｐ）、グルコース１リン酸を作用させ、さらに生じた
ＮＡＤ（Ｐ）、１１　をジアホラーゼあるいはフェナジ
ンメタサルフェート等を用いることによりホルマザンの
産生まで導びくことにより、ホルマザン沈着部位より正
常組繊細胞からガン化した細胞を検出することにも利用
できるのである。

〔実施例〕

＜ＥＩＡによるフェリチンの定量〉 （１）酵素標識抗体の作成 ヒト胎盤由来の精製フェリチンをウサギに免疫し、抗血
清を採取した後、プロティン−Ａセファロースカラムに
よるアフィニティークロマトによりＩにＧ両分を得、さ
らにフェリチン−セファロースカラムによる免疫クロマ
トにより抗フェリチン特異的なＩｇＧ画分（以後フェリ
チン特異抗体と呼ぶ）を得る。このＩ（４Ｇ画分をペプ
シン消化した後セファデックスＧ−１５０によるゲル濾
過により抗フェリチン特異的なＩｇＧのＦ（ａｂ’）　
２画分を得る。

、＝　ｃｂ　Ｆ　（ａｂ’　）　ｚを還元剤にてＦ　ａ
ｂ’にした後ホスホフラクトキナーゼをマレイミド反応
にて結合させ、抗フェリチン特異的Ｆ　ａｂ’−ホスホ
フラクトキナーヤ結合体（以後ホスホフラクトキナーゼ
標識抗体と呼ぶ）を得る。一方、比較のために同一操作
により作製したＦａｂ’にβ−ガラクトシダーゼを結合
させたβ−ガラクトシダーゼ標識抗体をも調゛整した。

（２）フェリチン抗体の固相化 フェリチン特異抗体を５μＱ／ｍ　Ｑのａ度になるよう
に炭酸、重炭酸バッファー（０，０５Ｍ、　ｐＨ９，６
）にて希釈した溶液をポリスチレンボールに加え、２５
°Ｃにて２時間放置し抗体をポリスチレンボール」二に
吸着させる。そのｉｏ、０５％ｔｗｅｅｎ　２０を含む
リン酸バッファー食塩水にて３回ボールの洗浄操作を行
い、フェリチン抗体固相化ボールを得る。作製した抗体
ボールは０．０５％ｔｗｅｅｎ２０と０．１％ＢＳＡを
含むリン酸バッファー食塩水に浸漬し、使用するまで４
℃で保存する。

（３）免疫反応 各濃度に調整したフェリチン標準液（５００，２５０゜
１００、５０．２５．１０．５．２．５．１．０．５．
０．１　ｎｇ／ｎ＋Ｑ　）２０μＱずつ反応トレイの各
穴に入れる。次にホスホグルコムターゼ標識抗体液ある
いはβ−ガラクトシダーゼ標識抗体液３００μρをトレ
イの各穴に加え、静かに攪拌した後フェリチン抗体同相
化ボールをトレイの各穴にひとつづつ入れ、３７°Ｃに
て３時間インキュベートする。その後反応液を吸引除去
した後ボールを０．０５％ｔｗｅｅｎ　２０を含むリン
酸バーファー食塩水にて５回洗浄した後ボールを酵素反
応用試験管へ移す。

（４）酵素反応 （Ａ）基質液 ホスホフラクＩ−キナーゼ標識抗体の場合１−リニタノ
ールアミンバツファ−〇、ｏ８バ、　　ｐＨ７，６αグ
ルコース−６−リン酸　　　　　　　　　　０．５ｍＭ
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Ｏ，８５ｍＭ塩化マグネシウム　　　　　　　　　　　
　１．６ｍＭＮ　Ａ　Ｄ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｏ，２２ｍＭＡＴＰ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１．０ｍＭＧ−６−ＰＤＨ３，２Ｕ／
ｍＱ α−ホスホグルコムターゼ　　　　　　　　　０．２０
／ｍＱβ−ガラクトシダーゼ標識抗体の場合 リン酸バッファー　　　　　　　　　　　　　０．０５
Ｍ、　　ｐＨ７，８２−メルカプトエタノール　　　　
　　　　　１００ｍＭ（Ｂ）酵素活性測定 上記基質液ＩＩＩＩＱをボールの入った反応用試験管に
加え、３７℃にて１０分間（ホスホフラクトキナーゼ標
識抗体の場合）あるいは１時間（β−ガラクトシダーゼ
標識抗体の場合）インキュベートした後ボールを取り出
し、試験管内の反応液の吸光度を３４０ｒ＋ｍ　（ホス
ホフラクトキナーゼ［２抗体の場合）あるいは４２Ｏｎ
Ｉ１１（β−ガラクトシダーゼ標識抗体の場合）にて測
定する。

こうして得たホスホフラクトキナーゼ標識抗体を用いて
フェリチンをＥＩＡによって定量し、第１図のような結
果を得た。また一方、比較のために、標識酵素として従
来のようにβ−ガラクトシダーゼを用いた場合のＥＩＡ
を行って、第２図のような結果を得た。

これらの結果から明かなように、本発明のようにホスホ
フラクトキナーゼを標識酵素として用いると、従来法の
ようにβ−ガラクトシダーゼを用いた場合の約１／ｌｏ
ｏの濃度までフェリチンを定量することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図はホスホフラクトキナーゼを標識酵素として用い
た場合の、そして第２図はβ−ガラクトシダーゼを用い
た場合のフェリチン量をそれぞれ図示したものである。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 ４２０ｎｍ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ムターゼ反応の基質であり且つそれ自体ムターゼ反応の
   触媒として作用する物質を反応生成物とする酵素を、標
   識物質として使用することを特徴とする酵素標識測定法
   。