JPS62278999A - 新規リゾチ−ム活性測定基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

３、発明の詳細な説明 本発明は、新規リゾチーム活性測定基質、その製造法お
上ブリゾチーム活性測定試薬に関するものである。 血清、尿中のリゾチーム活性の測定は、臨床診断におい
て重要な意ゑをちっており、消４ｚ性に腸炎、ｎＦ疾患
、単球性白血病などの診断に利用されている。 現在、リゾチームの活性測定はミクロフッカス　リゾデ
ィクティカス（Ｍ　１ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｖｓｏｄ
ｃ−ｉｋＬｉｃｕｓ）の乾燥（Ｗ体が基質として用いら
れ、その溶菌作用を利用した比濁法やリゾ−ブレート法
シこよって行なわれている。 しかしこれらの方法は、基質であるミクロコツカス　リ
ゾディクティカスの乾燥菌体の品質が常に一定でないこ
とやリゾチーム活性測定１１！ｒの反応液のイオン強度
やｐＨに大きく彩うされるなど、活性測定値に大きな・
でラツキを１．、　ｊ二ろ欠点がある。 このようなことから、特開昭５６−１３５４９４号、待
ｆｓＭ　Ｎ　５８−１５９９６　Ｖｔ　公ｌｉｔ　ニ、
ｋ　Ｗ　ハ、ｐ−二）口７工／−ルの結合したＮ−アセ
チルキトテＦラオース（ｐ−ニトロフェニル−テトラ−
Ｎ−７４＝チル−β−キトテトラオシド）や、４−７チ
ルウンベリ７エロンの結合したＮ−アセチルキトテトラ
オース（４−メチルウンベリフェリル−テトラ−Ｎ−ア
セチル−β−キトテトラオシド）をリゾチームの基質と
し、リゾチームの作用によって生成したＶ−二トロ７工
／−ルや　４−メチルウンベリフェロンを測定する方法
が発表されている。しかしながら、ｐ−ニトロフェニル
ーテ）ラーＮ−アセチル−β−キトテトラオシドを基質
とした場さ、リゾチームとの反応速度が遅く感度が低い
ため測定に長時間を必要とする欠、αがある。また４−
メチルランベリフェリルーテトラ−Ｎ−アセチル−β−
キトテトラオシドの場合、活性測定に蛍光光度計を用い
るため汎用性に欠けるといった欠、αがある。 本発明者等は、これら従来法の欠点を克服するため種々
研究した結果、ｐ−ニトロフェニル−ペンタ−Ｎ−アセ
チル−β−キトペンタオシドが、リゾチームとの反応に
おいて、高い反応速度を示すことを見い出し本発明を完
成するに至った。 すなわち、本発明は新規ｐ−二トロフェニルーベンター
Ｎ−アセチル−β−キトペンタオシド、その製造法およ
びリゾチーム活性測定試薬に関するものである。 本発明は構造式 ［１ で表される、ｐ−二トロフェニルーベンターＮ−アセチ
ル−β−キトペンタオシドで、以下の物理化学的性質を
有するＭ風化合物である。 分　子　式　　：Ｃ，、）＋？　　。０２６　ト夏　、
　・　２）＋　　２０分子量：　１１９１，１４（理論
値） 分解点＝２０４〜２１０°Ｃ ’ｔＦＪ’Ｆ性：　水に可溶、メタノール、クロロホル
ム等の有機溶ａ：こ不溶 結晶形：無味、無臭の黄白色粉末状結晶本発明化合物で
あるｌ）−二トロフェニルーベンターＮ−アセチル−β
−キトペンタオシドの製造は。 キチンまたはキトサンを加水分解して得たＮ−７七ナル
キトベンＺオースやキトペンタオース塩酸塩を出発原料
とし、これを無水酢酸と反応させベルアセチル講導体と
し、ρ−二）Ｃ７７二／−ルと反応させ、反応生成物を
脱−〇−アセチル化することにより製造できる。 例えば、特開昭６１−２１１０２・−３号の方法−二よ
り、カニ甲殻よ１）調製したキトサンを濃塩酸を用いて
部分加水分解し、分解物を陽イオン交換（］ノ脂カラム
に吸着させた後、塩酸による濃度勾配溶出法でりａマド
グラフィーを行い、キトペンタオース塩酸塩を１）る。 次に、キトペンタオース塩酸塩を無水塩化亜鉛を含む無
水酢酸溶液中にｊ＋　ｒｙ　（−崩プ　　Ｕ＋１＋；　
７！、ｉ　１１？　５ｎ　−６０°ＩＴ　’ｉ’　Ｉ　
−２０、や間擾押し、ペルアセチル化反応を行なう。反
応混合物は炭酸水素ナトリワムで中和し、クロロホルム
−２！タノール溶液で抽出後、溶液を除去し、（１１〕
式のキトペンタオースヘプタデカアセテートを得る。 〔ｌＩ） 得らｔした（［１）式のキトペンタオースへブタデカア
セテートとｐ−ニトロフェノールとの反応は、減圧下、
１８０〜１９０℃で１５分間加熱をおこない、縮合させ
る。反応後、メタノールークロロホルムーノエチルエー
テルから（Ｉ［１１式の１）−二トロフェニルーへキサ
デカアセチルーβ−キトペンタオシドの結晶を得る。 ＣＩＵ） 次に〔■〕式で示される構造の化合物をメタノール中で
ナトリウムメチラート存在丁、１０〜１５時間加熱還流
し、脱−〇−ア七チル化反応を行−・、本発明の〔１〕
式で示されるｐ−ニトロフェニル−ベンターＮ−アセチ
ル−β−キトペンタオシドが得られる。 本発明化合物であるｐ−ニトロフェニル−ペンタ−Ｎ−
アセチル−β−キトペンタオシドは、優れたリゾチーム
の活性測定基質となる７ 本発明は、ｐ−ニトロ７ヱニルーペンターＮ−アセチル
−β−キトペンタオシドをリゾチームの基質として使用
しリゾチームの作用を受けて生成シタ；）−二トロフェ
ニルーＮ−アセチル−β−グルコサミニド：こ、β−Ｎ
−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させて遊離する１
】−二トロフェノールを定量する二とでリゾチーム活性
を測定する方法である。 すなわち本発明は、１）−二トロ７ヱニルーベンターＮ
−アセチル−β−キトペンタオシドを基質成分として含
有し、さらに、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを
２有することを特徴とするりゾナーム活性測定試薬に関
する乙のである。 本発明に使用するβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ
は、植物、動物、微生物などを起源とするものが用いら
れるが、特にナタマメ起源のβ−Ｎ−アセチルヘキソサ
ミニダーゼは１】−二トロフェニルーＮ−アセチル−β
−グルコサミニドには良く作用するが、キトビオシト以
−ヒのグリフシトには作用しない点で好ましい。 また、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの添加は、
リゾチームの作用によって生成したｐ−二トロフェニル
ーＮ−ア七チル−β−グルコサミニドを、非當にはやく
分解する蹟であればよく、

【Ｊ−二）０フェニル−ベン
ターＮ−アセチル−β−キトペンタオシドと同時の添加
でよい。 本発明の測定原理を以下に示す。 （１）　Ｌ）−二トロフェニル−ベンターＮ−７（＝ナ
ル−β−キトペンタオシド ↓　リゾチーム ＩＩ−ニトロ７ヱニルーＮ−アセチル−β−グルコサミ
ニド　＋　テトラ−Ｉ′ｌｌ−アセチルキトテトラオー
ス （２）＋＋−二トロフェニルーＮ−アセチル−β−グル
コサミニド ↓　β−Ｎ−アセチルヘキンサミ ニグーゼ ＩＪ−ニトロ７エ／−ル　十　Ｎ−アセチルグルコサミ
ン 上記の反応で生成する１）−二トロフェノールを、アル
カリ性溶液中で黄色に発色させ光学的に測定することに
よりリゾチームの活性を求めることができる。 本発明の新規リゾチーム活性測定基質は、臨床診断や、
欠削の品質管理において、リゾチーム活性を、きわめて
短時間に、しかも正確に測定できるものである。 次）こ本発明の実施例について更に呉本的に説明するが
、かかる説明によって本発明が何ら成牛べね入り、めで
ｆ、−い７とＣ土切、會でふＬ〔実施例１〕 １０メツシユに粉砕したキトサン８００ｇに１１　、５
　Ｊ髭定塩酸６．（Ｌ、（ｌを加え、８０℃の湯浴上で
１時間半加水分解した。 この加水分解物に水６　、Ｏ、Ｑを加えた後、遠心分離
して不溶物を除去した。得ちれた一ヒ清液に活性炭を加
えて脱色後、シロップ状となるまで減圧ン農縮した。こ
のシロ・ンブ１こメタ／−ル３．０りを加え、懸濁液と
して室温で・１時間攪拌した。不溶物を吸引ヨ濾過によ
り除去後、ろ液をシロップ状となるまで減圧濃縮し、７
七トンを加えて−（ダ冷蔵庫に放置した。 生成した不溶物を〕濾過して更め、真空乾燥して、キト
サンオリゴ糖混合物３６０ｇを得た。 この分解物３５０ｇを５゛Ｑのイオン交換カラム（Ｄｏ
＋ｎｅｘ　５０ｕ＋）にｎｕｌｌ　Ｋｌさせ、０がら・
１規定の塩酸）こよる直線）二度勾配を用いて溶出した
。１）−グルコサミン、キトサンオリゴ糖の検出はニン
ヒドリン発色で、５７０旧０の吸光度を測定して行なっ
た。。 本発明の出発原料であるキトベンクオース塩酸塩画分を
渠め、濃縮後乾燥してキトペンタオース塩酸塩２５Ｂを
得た。 キトペンタオース塩酸塩１０．０．を無水塩化亜鉛１５
ｇを含む無水酢酸溶液］　２０　ｒａ交中に徐々に加え
、反応温度５５〜６０℃で１１時間半攪拌してペルアセ
チル化した。 反応混合物を１夏の水に注ぎ込んだ後、過剰の炭酸水素
ナトリウムを加えて中和し、クロロホルム−メタノール
（１：　１　）５００ｍＱ　、続いてクロロホルム２０
０ｎ＋、Ｑで２回、反応物を抽出した。抽出液を脱水し
溶媒除去後、真空乾燥して、キトペンタオースへブタテ
゛カアセテー１１３．５ｇ（理論６ｈの８８％）を１′
１な。 ここでｒｌ−らすしたＡトペンタオースへブタデカアセ
デート６．０ｇと一一二トロフェノール］１．Ｏｇを重
合した後、減圧下、油浴中にて、１８０・−１９０°Ｃ
で１５分間加熱した。 この反応混合物を冷却した後、３０ＩＩｌ！ｌのメタノ
ールを加え、−仮冷蔵庫に放置した。沈澱物を婁め、メ
タノールで洗浄後、この沈澱物をメタノール−クロロホ
ルム＜　Ｉ　：　１　）６００＋ａ−Ｑに）丘解し、活
性炭を加え脱色した。脱色液−二、ジエチルエーテル２
５　Ｉｎ　！Ｊを加え、−夜冷蔵１ｄｊに放置しｒこ。 析出した結晶を災め、シ”エチルエーテルで洗浄後、真
空乾燥し、１どニトロフェニル−へキサデカアセナル−
β−キトペンタオシド１．３０ｇ（Ｊ’ｌ！論値の２０
．７％）を得た。 融点：２６７〜２７０°Ｃ（分解） ｐ−二トロフェニルーへキサデカアセチル−β−キトペ
ンタオシド０．２００ｇを無水メタノール５０【ＩＩＱ
　（こ懸濁後、約１．０Ｍナトリウムメチラートｌ　Ｏ
Ｉａ豆を加え、冷却管を附して、１４時間遠流しｒこ。 析出した結晶を婁め、メタ／−ルで洗浄後、真空乾燥し
、目的物である１）−ニトロフェニル−ペンタ−ｆｉＪ
−アセチル−β−キトペンタオシド０．１３５ｇ（理論
値の９＝１，５％）を得た。 この結晶は、活性炭により脱色し、メタノール−水より
再結晶化して、さらに精製した。 この物質は、高速液体クロマトグラフィーにおいて単一
なピークを示した。 また、この物質の分子式、分子ｉ）、分解点、溶解性、
結晶形の測定値、観察は次の通りであった。 分子量：　Ｃ＝６Ｈ７，，０、ａＮ　６・２ＨｌＯ分子
量、　：　１１９１．１４　ｒＪＩＪｊ論値）分解点：
２０４〜２＋Ｏ’ｃ　（開始点）溶解性：水に可溶、メ
タノール・クロロホルム１等の有機溶媒に下洛 結晶形：無味・ｊ＋Ｈ％　ｒ：４の０ｒ白色粉末状結品
〔実施例２〕 下記溶液を混訃してリゾチーｌ、活性測定試薬とした。 ０．０５％ｐ−ニトロフェニル−ペンタ−Ｎ−アセチル
−β−キトペンタオシド　　　　　　］、ＯＯ＋ａす０
．５Ｍクエン酸ナトリツム緩ｌ！７液（１））［５，０
，３７’Ｃ１Ｏ，３０＋ｎ、０ β−？、Ｊ−アセチルヘキンサミニグーゼ（ナタマメ、
５〕’Ｉｔ位／　ｔｏ　ｒｌ　）　　　　　　　　　　
　０．０４＋ａ　、Ｑ蒸留水　　　　　　　　　　　　
　　０．１１＋ａ、Ｑ−上記測定用試薬に卵白リゾチー
ム（１＋ｎＨ／Ｉａβ）０．０５＋ａ−Ｑを加え、３７
°Ｃで反応させた後、１．０Ｍ炭酸ナトリウム１．５ｍ
＋−（ｌを添加し、４０５旧０にす３ける吸范度を測定
した。 なお、基？７１こ０．２％ｌ）−二トロフェニルーテト
ラーＮ−アセチル−β−キトテトラオシドを用いた系、
及び、共役系の酵素であるβ−Ｎ−アセチルへキソサミ
ニグーゼを添加しない系を対照と１−て用いた。その結
果を第１図に示す。 基質（こｐ−ニトロ７１ニルーテトラート１−アセチル
−β−キトテトラオシドを用いた系に比較し、反応速度
は約２０倍となっている。共役系酵素であるβ−Ｎ−ア
セチルヘキソサミニダーゼ無添加では、吸光度はほとん
ど増加していないことがわかる。 また、基質にｐ−ニトロ７ヱニルーテ）クーＮ−アセナ
ル−β−キトテトラオシドを用い共役系酵素であるβ−
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ無添加系では、基′ａ
に１】−ニトロフェニル−ベンターＮ−アセチル−β−
キトペンタオシドを用い、共役系酵素であるβ−Ｎ−ア
セチルヘキゾサミニグーゼ添加系と比較して、その反応
速度は１／４００でしかなかった。 〔実施例３〕 実施例２とほとんど同様であるが、リゾチーム濃度をそ
ｔｔぞれ０．２＋１１１？／＋６−（１、０，４Ｂ／＋
ｎ　Ｑ　、］　、　Ｏｍｙ／ｎ＋−Ｑとし、二へら濃度
のリゾチーム０．０５ｎ＋　Ｑを加えて反応を行なった
。反応液中のリゾチーム量はそれぞれ、ｌＯμｇ１２０
μｇ１５０μｇである。 第２図にその結果を示す。 それぞれのリゾチーム濃度で直線が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明化合物及び対照基質に討するリゾチー
ムの反応を遊離したｐ−二トロフェノールの発色強度に
より測定しだらのを示す。 （ｔ）　ｐ−ニトロフェニル−ペンタ−Ｎ−アセチル−
β−ｑトベンタオシド　＋　β−Ｎ−アセチルへキソサ
ミニグーゼ系 （２）ｐ−ニトロフェニル−テトラ−Ｎ−アセチル−β
−キトテトラオシド　＋　β−Ｎ−アセチルヘキソサミ
ニダーゼ系 ＜３）ｌ）−二トロフェニルーペンターＮ−アセチル−
β−キトベンタオオシ系 第２図は、本発明化合物に対するリゾチーム１：二との
関係を測定したちのを示す。 （１）反応液中のリゾチーム迅、５０μ２（２）反応液
中のリゾチーム量　　　　２０／、ｔｇ（３）反応液中
のリゾチーム量　　　　１０μｇ′Ｖｆ￥′ｒ出願べ　
協業組合　エヌ　エフ　アイ第１図 巳ＩＩ（づカー） 第２図 時間（介）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１） ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる構造式を有するｐ−ニトロフェニル−ペン
   タ−Ｎ−アセチル−β−キトペンタオシド。
2. （２）ペルアセチル−キトペンタオースとｐ−ニトロフ
   ェノールとを反応させｐ−ニトロフェノールをアグリコ
   ンとするペルアセチル−キトペンタオシドを得てそして
   これを脱アセチル化することよりなるｐ−ニトロフェニ
   ル−ペンタ−Ｎ−アセチル−β−キトペンタオシドの製
   造方法。
3. （３）ｐ−ニトロフェニル−ペンタ−Ｎ−アセチル−β
   −キトペンタオシドを基質成分として含有し、さらに、
   β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを含有することを
   特徴とするリゾチーム活性測定試薬。