JPS62275696A

JPS62275696A - Ｌ−メチオニンの製造法

Info

Publication number: JPS62275696A
Application number: JP11989686A
Authority: JP
Inventors: Takahiro Ishikawa; 高広石川; Koki Horikoshi; 堀越　弘毅; Yuichiro Koyama; 小山　祐一郎; Hitoshi Kimura; 均木村
Original assignee: Nippon Soda Co Ltd
Current assignee: Nippon Soda Co Ltd
Priority date: 1986-05-24
Filing date: 1986-05-24
Publication date: 1987-11-30

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３、発明の詳細な説明〔産業上の利用分野〕本発明は、Ｎ−カルバミルメチオニンＣＣ１１，ＳＣＩ
！□ＣＨｔＣＨ（ＮｌｌＣＯＮＨｚ）Ｃｏｏｌ　）から
し−メチオニンＣＣｌｌ３ＳＣ１ｌ□ｃＨｚｃＩ（（Ｎ
Ｈｚ）Ｃｏｏｌ　）を製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

Ｌ−アミノ酸の製造法としては、天然蛋白の加水分解液
から抽出する方法、直接醗酵法或は有機化学的合成法に
よりＤＬ−アミノ酸を作ったのち光学分割するいわゆる
合成法等が知られている。

Ｌ−メチオニンの場合、有利な直接醗酵法がないために
専ら化学合成したＤＬ−メチオニンをＮ−アセチル化し
、アシラーゼ酵素を用いてＬ−Ｎ−７セチルメチオニン
のみを選択的に加水分解することにより製造されている
。

また、Ｎ−カルバミル誘導体から微生物によりメチオニ
ンを得る方法が特開昭５１１２５６９２号に記載されて
いる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

アシラーゼ酵素を用いる方法は、アセチル化の工程が必
要であり、また裔価なアシラーゼとコバルトイオンを使
用するため、経済的に不利な点が多い。

また、特開昭５２−１２５６９２号に記載の方法は、加
水分解反応を中性付近（ｐＨ７，６）で行っているが、
これはＮ−カルバミル誘導体の合成および溶解度の面か
ら不利である。

〔発明を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の欠点を改良しより効率のよい方法
を見い出すべく研究した結果、ＤＬ−メチオニンの化学
合成法の過程で生じる中間体であるＮ−カルバミルメチ
オニンを高アルカリ性域において過加水分解して、Ｌ−
メチオニンに変換せしめる能力を有する微生物を見い出
した。

〔作用〕

本発明の方法において使用される微生物は、具体的には
以下のものがある。

バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｎ
ｏ、２６６エ業技（ネｉ院漱生物工業技術研究所微工研菌寄第　８４６５号ビブリオ　エスピー（Ｖｉｂｒｉｏ　３１）、）　Ｎｏ
、２５６エ業技術院微生物工業技術研究所微工研菌寄第　８４６４号これらの微生物の菌学的性質は２菌種ともρ旧Ｏのアル
カリ性培地に３７℃で成育させ、「バーゲイスマニアル
　オブ　デターミぶイティブ　バクテリオロジーＪ　　
（Ｂｅｒｇｅｙｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅむｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅ　ＢａｃＬｅｒｉｏｌｏｇｙ）　（１９７
４）および「ザ　ゲナス　バチルス」（Ｔｈｅ　Ｇｅｎ
ｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（１９７３）に記載の方法に
基いておこなった。その結果は以下の通りである。

細菌　Ｎｏ、２５６（ａ）形態閉形は桿状で大きさく０．６〜１．０）　Ｘ　（２，０
〜３．０）μｍである。細胞はダラム陰性、非抗酸性、
運動性があり、胞子を形成しない。

（ｂ）培地における生育状態１）肉汁寒天平板培養：（ρ＋１７）　；貧弱な生育（ｐｔｌｌＯ）　；適度な生育１円形１頭状、全縁。

不透明１円滑、白色２）肉汁寒天斜面培養：（ｐＨ７）　：貧弱な生育（ｐｔｌｌｏ）　；適度な生育１糸状３）肉汁液体培養：（ｐＨ７）　；はとんど生育しない（ｐＨ１０）　；菌生育にともない、いくぶん混濁を呈
し、粘稠性のある軟らかい沈澱を生ずる。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：（ｐｔｌＩＯ）　　；液化する（Ｃ）生理学的性質 ■）硝酸塩の還元（ｐＨ１０）　：　　＋２）脱窒反応
（ｐｔｌｌｏ）　：　　十（ガスの発生なし）３）ＭＲ
テスト　（ρ１１６．８）　：　　判定不能（生育不良
のため）４）ＶＰテスト　（ｐＨ１０）　：　　−５）インドー
ルの生成（ｐｔｌＩＯ）　：　　−６）硫化水素の生成
（ｐＨ７，２）　：　　−７）デンプンの加水分解（ｐ
ｔｌＩＯ）　：　＋８）クエン酸の利用：Ｋｏｓｅｒ培地（ｐ）＋１０）　；　　±ＣｈｒｉｓＬ
ｅｎｓｅｎ培地（ｐＨ７）　；判定不能（生育不良のた
め）９）無機窒素源の利用（ｐＨ１０）　：硝酸塩；　± アンモニウム塩；　± １０）色素の生成（ｐｈｌｏ）　　：生成しない１１）
ウレアーゼ（ｐＨ７）　　：　　＋１２）オキシダーゼ
　　：　＋１３）カタラーゼ　　　：　＋１４）生育の範囲　　　：　ｐｌ＋　８〜１１１５）酸
素に対する態度二　通性嫌気性１６）Ｏ−Ｆテスト　　
　：　Ｆ１７）ｉｔ！［から酸およびガスの生成の有無（ｐＨ９
）酸の生成　　ガスの生成し−アラビノース　　　−− 〇−キシロース　　　　千　　　　　　−Ｄ−グルコー
ス　　　　十　　　　　　−Ｄ−マンノース　　　　　
十　　　　　　　−Ｄ−フラクトース　　　＋　　　　
　　−Ｄ−ガラクトース　　　＋　　　　　　−麦芽糖
　　　　　　　　十　　　　　　−ショキ唐　　　　　
　　　　　＋　　　　　　　−乳ネ唐　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−−トレハロース　　　　　十　
　　　　　−Ｄ−ソルビット　　　　−　　　　　　　
−Ｄ−マンニット　　　　　＋　　　　　　　−イノジ
ット　　　　　　±　　　　　　−グリセリン　　　　
　−− デンプン　　　　　　　十　　　　　　−以上の菌学的
性質を前記の文献に基いて検索した結果、本閏はビブリ
オ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属することが明らかとなったが
、ｐＨ８〜１１のアルカリ性域においてのみ生育できる
点において公知の菌種とは明らかに異なる。よって本閏
は公知の菌種とは一致せずビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属
の新菌種として設定するのが適当である。

細菌ＮＯ，２６６〔ａ〕形態画形は環状で大きさく０．６〜１．０）　Ｘ　（２，０
〜３．０）μｍである。細胞はダラム陽性、非抗酸性、
運動性があり、楕円形の胞子を形成する。

（ｂ）培地における生育状態ｌ）肉汁寒天平板培養：（ｐＨ７）；貧弱な生育（ｐＨｉｏ）　：適度な生育１円形１頭状、全♀（。

不透明１円滑、白色２）肉汁寒天斜面培養：（ｐＨ７）　；貧弱な生育（ｐＨｌｏ）　；適度な生育、糸状３）肉汁液体培養：（ｐＨ７）　；はとんど生育しない（ｐＨ１０）　：菌の生育にともない、いくぶん混濁を
呈し、粘稠性のある軟らかい沈澱を生ずる。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：（ｐＨ１ｏ）　：液化する（ｃ）生理学的性質ｌ）硝酸塩の還元（ｐＨｌｏ）　：　　＋２）脱窒反応
（ｐｔｌｌＯ）　　　：　　＋　（ガスの発生なし）３
）ＭＲテスト（ｐＨ６，８）　　：　　判定不能（生育
不良のため）４）ＶＰテスト（ｐＨ１０）　　：　　−５）インドー
ルの生成（ｐＨ１０）　：　　−６）硫化水素の生成（
ｐＨ７，２）　’ニー７）デンプンの加水分解（ｐＨ１
０）　：　　＋８）クエン酸の利用：Ｋｏｓｅｒ培地（ｐＨ１０）　：　　±Ｃｈｒｉｓｔｅ
ｎｓｅｎ培地（ｐｌ＋７）　；判定不能（生育不良のた
め）９）無機窒素源の利用（ｐＨｌｏ）　：硝酸塩；　± アンモニウム塩　：　± １０）色素の生成（ｐＨｌｏ）　：　　生成しない１１
）ウレアーゼ（ｐＨ７）：＋１２）オキシダーゼ　　：＋１３）カタラーゼ　　　：＋１４）生育の範囲　　　：ｐＨ８〜１２１５）酸素に対
する態度（ｐＨ１０）　：　　通性嫌気性１６）〇−Ｆ
テスト（ｐＨ９）　：　　Ｆ１７）糖ｔｆｉから酸およ
びガスの生成の有無（ｐＨ９＞酸の生成　　ガスの生成し−アラビノース　　　−　　　　　　−Ｄ−キシロー
ス　　　　＋　　　　　　−Ｄ−グルコース　　　　＋
　　　　　　−Ｄ−マンノース　　　　　十　　　　　
　　−Ｄ−フラクトース　　　＋　　　　　　−〇−ガ
ラクトース　　　±　　　　　　−麦芽糖　　　　　　
　　十　　　　　　−ショ糖　　　　　　　　　　十　
　　　　　　　−乳糖　　　　　　　　　−− トレハロース　　　　　　十　　　　　　　−Ｄ−ソル
ビット　　　　　−　　　　　　　−Ｄ−マンニット　
　　　　十　　　　　　　−イノジット　　　　　　＋
　　　　　　−グリセリン　　　　　　−− デンプン　　　　　　　＋　　　　　　−以上の菌学的
性質を前記の文献に基いて検索した結果、本閏はバチル
ス（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕｓ）属に屈することが明らかと
なったがｐ１１８〜１２のアルカリ性域においてのみ生
育できる点において公知の菌種とは明らかに異なる。よ
って本閏は公知の菌種とは一致せず、バチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属の新閃種として設定するのが適当である
。

本発明に使用されるＮ−カルバミルメチオニンはＤＬ一
体又はＬ一体のいずれかでも良く又、Ｎ−カルバミルメ
チオニンに本発明の好アルカリ性微生物を作用させる方
法は本微生物をＮ−カルバミルメチオニンを含む培地中
に培養してもよいし、又、これら微生物の菌体又は菌体
の処理物を水溶液中でＮ−カルバミルメチオニンと接触
させて作用させてもよい。

本微生物を培養することによりＮ−カルバミルメチオニ
ンをＬ−メチオニンに変換させる方法は、培養当初から
Ｎ−カルバミルメチオニンを含有する培地に本発明の微
生物を培養してもよいし、又、培養途中にＮ−カルバミ
ルメチオニンを培地に添加してもよい。

本微生物の培養のために用いられる培地は、Ｎ−カルバ
ミルメチオニンを含み、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリ
ウム等を加えて、アルカリ性培地とすることのほかは、
通常の炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培
地である。更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素
を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。

炭素源としてはグルコース、キシロース、シｇ糖。

澱粉の分解物、澱粉、ｖＭ密などの１１！類、酢酸など
の有機酸、アルコール類等資化されるものならば、いず
れも使用できる。窒素源としては、アンモニウム塩、硝
酸塩、尿素、アンモニアガス、アミノ酸等が、無機イオ
ンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イ
オン、カルシウムイオン、カリウムイオン、銅イオン、
マンガンイオンその他が適宜用いられる。培養は、好気
的あるいは嫌気的条件下ｐＨ７ないし１２．温度２０な
いし４５℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ましい結
果が得られる。

かくして１ないし１０日間も培養を行えば、Ｎ−カルバ
ミルメチオニンはＬ−メチオニンのみに変換される。

一方、本微生物の菌体または菌体の処理物を水溶液中に
てＮ−カルバミルメチオニンと接触させて作用させる場
合には、Ｎ−カルバミルメチオニンと菌体又は菌体の処
理物を溶解又はけん濁した水溶液をＩＯないし７０℃の
適当な温度に調節しつつ暫時静置または攪拌すればよい
。

菌体としては、菌体を含む培養液をそのまま用いてもよ
い。又、これを一旦培養液から分離して洗浄又は洗浄せ
ずに使用してもよい。菌体処理物としては機械的摩砕菌
体、超音波にて処理した菌体、凍結乾燥菌体、アセトン
乾燥菌体、リゾチーム等の酵素で処理した菌体界面活性
剤、トルエン等で処理した菌体、菌体の蛋白画分、その
他が適宜用いられる。

このような菌体を得る方法は、前記の培地及び培養方法
がそのまま採用できる。培地には、Ｎ−カルバミルメチ
オニンを少量添加すればＮ−カルバミルメチオニンをＬ
−メチオニンに変換する活性の高い菌体が得られる場合
がある。又培養時間はこの場合微生物が充分増殖すれば
よいので、６ないし４８時間程度で培養を終えてもよい
。

水溶液には必要に応じ抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、
ヒドロキシルアミン等が添加されると反応収率が向上す
る場合がある。かくして２ないし１００時間も経過すれ
ば、水溶液中には、多量のＬ−メチオニンが生成蓄積さ
れる。

このようにして得られたＬ−メチオニンを培養液又は水
溶液より採取する方法は、本発明の方法によればＤ−メ
チオニンが副生じないのでイオン交換樹脂を用いる方法
、等電点にて沈澱せしめる方法等、通常の方法が採用で
きる。

生成したメチオニンの定量はパイオア・ノセイ法あるい
はアミノ酸分析計及び液体クロマトグラフで測定する方
法を用いた。

光学異性体は、結晶の比旋光度を測定することによって
り、　　Ｌを定めた。

〔実施例１〕グルコース１．Ｏｇ／ｄ！、酵母エキス０．５ｇ／ｄ１
．ポリペプトン０．５ｇ／ｄ！、　ＫＨｚＰＯ４０，１
ｇ／Ｊ、　Ｍｇ５ｏ４・７１１□００．０２ｇノａ、Ｎ
−カルハミ７Ｌ／ＤＬ−メチオニン０．１ｇ／ｄ１．　
Ｐｅ５Ｏａ　−７Ｈｚ０１ｍｇ／ｄ１．　ＭｎＳＯ４・
４〜６１１２０１ｍｇ／ｄｌ。

を含む培地を１２０℃で１５分間滅菌し、別に滅菌して
おいた炭酸ナトリウム０．６ｇ／ｄｌを加えて滅菌済試
験管（１８ΦＸ　１８０ｍｍ）に４ｍβずつ分注した。

これに上記の組成の寒天培地で３７℃にて３０時間培養
した本微生物を１白金耳接種し、３７°Ｃで１６時間培
養した。これらの培養液から菌体を遠心分離により採取
し、５ｍｊ２の０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）で−
回洗浄し菌体を集めた。これらの菌体をＮ−カルバミル
ＤＬ−メチオニン１ｇ／ｄＩを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐ＋＋９．５）（′４！％４Ｘ、８ｍ　１２　）に添
加し、４８時間３７℃に保持反応した。

反応液中に生成するメチオニンはＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ　ＡＴＣＣ８０４２を用
いたバイオアッセイ法にて定量した。

結果を下に示す。

使用菌株間　　生成したＬ−メチオニン　枚重＜Ｑｒ／
ｍ　！！　）　　　　　　　（Ｘ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｓｐ、　Ｎｏ、２６６　　　２．６７　　　　　３４．
４Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ、　Ｎｏ、２５６　　　　１．９
８　　　　　２５．５〔実施例２〕実施例１と同様に調整したＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　
Ｎｏ、２６６の菌体に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
６）０．４ｍ　Ｉｔを添加し超音波にて５分間処理をし
た。この処理物を遠心し、上清液を取得した。この上清
’ｔ＆ｏ、２ａａｐにＮ−カルバミル−ＤＬ−メチオニ
ンＩｇ／Ｌｌ！を含む０．１ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７
，６）　０．２ｍｊ！を添加し、３７°Ｃで２４時間反
応させた。この反応液をバイオアッセイ法にて定ｉｉ　
Ｌ　ｋところ、１．３４ｍｇ／ｍｊ！　（収率３４．４
Ｘ）のＬ−メチオニンが生成していた。

特許出願人（４３０）日本曹達株式会社代　理　人（６
２８６）　　伊藤　晴之（７１２５）　　横巾　吉美手続補正書昭和６１年〃　月１日

Claims

【特許請求の範囲】

Ｎ−カルバミルメチオニンを、Ｌ−メチオニンに変換す
る能力を有するバチルス属又はビブリオ属の微生物をＮ
−カルバミルメチオニンを含む培地で培養し、或は、該
微生物の処理物とＮ−カルバミルメチオニンの水溶液と
を接触せしめ、Ｌ−メチオニンを生成させることを特徴
とするＬ−メチオニンの製造法。