JPS62248479A - 細胞のミスト培養 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細胞の培養、特に無菌条件下における組織増殖
および生成物の回収に関する。

代謝産物および他の産物を得るための細胞培養が、これ
らの産物の実験室での製造が経済的に実行不可能または
技術的に不可能になるにつれて急速に重要になっている
。更に組換体ＤＮＡ技術および関連する技術はこれまで
に知られていなかった量でより多くの生成物を製造する
ことができる細胞系の生成を可能にした。したがって、
多数の製造企業は細胞の培養および高収率の達成を第１
の目的にしている。

従来の植物組織培養法は、ミネラル、生長調節剤および
炭素源（通常は蔗糖）のような成分を寒天凝固ｒル中に
入れて植物組織に供給することＫより行われている。植
物組織はｒルの表面上に置かれそして栄養源がｒルから
摂取される。この培養法はいくつかの固有の問題を有し
゛ており、その全てが植物組織の最適な生長をもたらさ
ない。多くの初めの移植片およびある種のカルス培養に
おいては、細胞分裂の速度を遅くするかまたは組織を殺
すことＫよって植物組織の生長を抑制する化合物が生成
されそれが培地中に導入される。そのような拡散に伴っ
て組織をたびたび新しい培地に移すことが必要になリ、
それは培地を余分に使用すること、培地の調製および労
力を必要とする。植物組織は必らず培地と密に接触する
ことによって生長するので酸素の最大摂取可能性はカル
スまたは組織の上方部分に限られる。このことはカルス
の下方部分の呼吸速度を制限し、そしてこの部分の生長
をしばしば低下させる。植物組織は分化しているものも
分化していないものも揮発性の生長調節剤、特にエチレ
ン、を産成し、それが組織の形態および生長速度に影響
を及ぼす。慣用の培養容器、しばしばペトリ皿または他
のプラスチックまたはガラス容器中でこれらの揮発性化
合物が生成されて組織の効率のよい生長を妨害する。植
物組織の生成にとっての栄養素、生長調節剤および炭素
源の全てがグル化培地全体に拡散しなければならないの
で、組織の生長速度はこの拡散の割合によって制限され
る。

浮遊細胞培養が植物培養における上記の問題のいくつか
を軽減するのに採用されてきておりそして多くの種類の
細胞の培養において広く採用されている。浮遊培養によ
る植物細胞培養では培地の生長調節成分を操作すること
により胚の生成がもたらされる。浮遊培養では規則的な
継代培養が必要であり、そしてもし定期的に移植が行わ
れないならば培地中の栄養分の消耗または有毒化合物の
生成を生じうる。これらの培養では通常培養容器の攪拌
によって通気が行われ、従ってエチレンのような水溶液
の揮発性気体に対してはわずかじか制御できない。浮遊
法による全ての種類の細胞の培養において通気が主要な
問題として残る。

他の培養法にはマルチプルプレート浮遊増殖、ガラスピ
ーズ増殖および管状スパイラルフィルムがある。マルチ
プルプレート増殖は液体浮遊物内に複数の支持層を備え
ている。この方法は他の浮遊培養と同じ欠点、特に浮遊
系内における気体の拡散の不足および有害な生成物の蓄
積を伴う０ガラスピーズ増殖は細胞でコートされたガラ
スピーズな備えている。これらビーズは細胞を付着させ
るための増大した表面積を提供する。この方法は気体の
拡散が制限されるという問題の解決にならないばかりで
なく細胞に大きな機械的な応力を及ぼして細胞の消失を
引き起こし、それに伴って低収率化をもたらす。管状ス
フ２イラルフイルムまたは中空の透過性繊維を使用する
際には、気体透過性の管の内側に細胞が入れられる。管
の内側を通して液体栄養分が流される。この試みはまた
拡散の問題を有しており、管の内壁に接する細胞よりも
内側に位置する細胞はどより低い量の拡散気体に曝され
る。

したがって、本発明の目的は細胞および組織の培養方法
および装置を提供することにある。

それに関連する目的は無菌状態における細胞の培養を提
供することである。

本発明の目的は更に培養された細胞に対してこれまで実
現されていなかったような高い量で気体を摂取可能にす
ることであり、そして溶解した栄養分を制限されないで
供給することである。

本発明の目的は更に単一の装置によって植物細胞および
ハイツリドーマをも含めた＃１とんどの種類の細胞の生
長を改良することである。

本発明の他の目的は植物の培養および他のタイプの培養
における労力の必要を減少させることである。更に本発
明の目的は効率のよい低コストの装置および方法によっ
て高度に一慣性を有し再現性のある細胞培養を提供する
ことである。上記に関連する本発明の目的は、生成物の
高い収率な達成するのに最小限の人力で済むような自己
調節可能で且つマイクロプロセッサ−コントロールが可
能な培養システムを提供することである。

上記の目的の達成のために本発明は栄養分のある湿分環
境で細胞の培養を行うための装置を提供する。細胞は容
易に摂取可能な気体状および液体状の供給物を供給され
る。純粋な細胞系の培養を可能にするために無菌状態が
提供される。

本発明の１つの態様によるとミスト放出装置が密閉可能
な室内に配置される。液体栄養分が密閉可能な容器から
ミスト放出装置に供給されてそこでポンプによりまたは
加圧気体によって放出される。ミスト発生装置は、１０
０〜５０００ミクロンのスプレー滴よりもむしろ０．１
〜１０ミクロンのミストを供給するように選ばれる。し
かしながら１０〜１００ミクロン（ｎ）の粒子サイズに
よって成果が得られるが、ミスト法が好ましい。液体が
気体によって放出される際には。

気体は細胞の第１次代謝のための必要物から選ばれるの
が好ましい。好気性菌に対しては気体は酸素を含有し、
一方、嫌気性菌に対しては窒素のような代用気体が用い
られる。

細胞は生物学的に不活性な部材上に支持される。その材
料は腐食（それに伴って汚染物質を導入する）に対して
抵抗性のあるものから選ばれる。したがって、ステンレ
スチールおよび「テフロン町を含むプラスチックが適し
ていることが見出された。１つの態様によると室内で細
胞を支持するのに１つまたはそれより多くのスクリーン
が配置された。

一緒セされた栄養分は支持体を通って流出させられ生成
物と再使用可能な媒体を回収するために液だめ斌に集め
られる。他の態様によると生物学的に不活性な材料の巻
込み状（スノ臂イラル状）のメツシュが動智細胞のよう
な付着生物が生成する大きな表面積を提供する。

本発明の他の点によると、超音波ミスト放出装置が使用
され、それによりミスト放出装置からの放出後に媒体が
泡立つのが防止される。漿液のような多量の蛋白質を含
有する媒体は、例えば慣用のミスト放出装置から放出さ
れると泡立つことが見出された。超音波装置は小さな粒
子範囲内に液体を分散させる音波を出す。

本発明の他の観点によると代謝に利用可能な光源が採用
される。光源はスペースおよび吸収を考慮して室内にま
たは室外に配置するとよい。

本発明の他の観点によるとコンピユータフ４クロプロセ
ツサーおよびそれに組合わせられたハードウェアのよう
なプロセッサーが装置の工程ノぐラメータを監視し且つ
コントロールする。

外部に取りつけ得るソレノイＰおよび圧力調節器が液体
および気体栄養分を個々にコントロールするのに使用さ
れる。プロセッサーは培養すれる個々の生物にとって必
要なミスト放出周期および期間、湿度、温度ならびに他
の工程パラメータを連続的に調整するようにプログラム
可能である。それと関連して細胞支持体は室内で細胞を
移動させるためのコンベアとして備えられる。したがっ
て、上記の培養ノ母うメータに加えて細胞の載置および
積みおろしが自動化可能である。

本発明の他の態様によると気体および液体透過性の容器
を本発明の室内に設置してもよく、それにより細胞は取
扱いが便利なように収容され、追加の生長表面積を与え
る。

本発明の他の点は一緒に添付された図面に示されている
態様から明らかであろう。

図面では、本発明の組織培養装置では代謝生成物および
廃棄生成物を連続的に除去しながら栄養分に富んだ環境
を提供する。

第１図において、装置１０は無菌状態を維持するために
密閉可能な生長室１２を備えている。

室１２はガラスプレクシグラスまたは他の生物学的に不
活性で透明な材料から作られているのが有利である。熱
滅菌が必要な場合にはガラス、Ｉリカーボネート、ポリ
アミＰおよび他の同種の材料が好ましい。生物学的に不
活性な材料のスクリーン１４は良好な排水を可能にする
一方で細胞を支持するメツシュサイズまたは孔径を有し
ている。細胞の投入および回収用の出入口１６がスクリ
ーン１４のすぐ近くに設けられている。清浄用および滅
菌用の出入口１日が室１２の底または下方端に設けられ
ている。

細胞の代謝にとっての必要物は栄養分浮遊物および気体
の形で供給される。気体シリンダー２０およびレギュレ
ーター２２は必要な気体の最大量を供給し、該気体は空
気、高濃度酸素または高濃度二酸化炭素、あるいは嫌気
性菌が培養されている場合には例えば窒素であることが
できる。フィルター２４は他の生物をも含めて汚染物質
を除去する。栄養分溶液または媒体が容器２６に貯蔵さ
れる。適当な蓋２８が容器２６内を無菌状態に維持する
。必要ならば溶液を室１２またはミスト放出装置３２に
搬送するのにポンプ３０を使用してもよい。

ミスト放出装置３２は加圧気体またはポンプによって放
出される溶液のミストな放出する。

好ましい態様においては滴の径は１〜１ｏｏミクロンの
範囲である。栄養分溶液が慣用のミスト放出装置におい
て泡立つ蛋白質物質または他の物質を含有する場合には
、本発明では超音波ミスト放出装置が採用される。それ
によって溶液のスプレーまたは泡立ちが防止されること
が見出された。同様の密閉性によって正の圧力が室内に
もたらされる。はとんどの圧力を逃がすために濾過され
た気体の出口３４が設けられており、しかしながら無菌
状態を保つためＫゎずが々過圧が維持されるのが有利で
ある。気体シリンダー２０は全ての種類の細胞に対して
必要なわけではないが、本発明、の目的のためには使用
するのが有利である。

光源３６が植物細胞の代謝にとって必要ならば設置され
る。光源３６は場合によっては室１２内に取付けてもよ
い。

消費された栄養分液体の流出部の一部としての第２次代
謝産物の堆積が室１２の下方領域内で生ずる。液体が生
成物貯蔵容器３８へと流されて４０で処理される。処理
においては集められた目的生成物が分離され、そして経
済的に実施可能な場合には細胞毒素が除去される。再使
用可能な媒体は管４２を経て貯蔵容器２６に戻される。

第２図には本発明における自己保有装置１００が示され
ている。室１０２は複数の分けられた室１１２内に複数
のミスト放出装置１１０を収容している。室１１２ａは
栄養分貯蔵器２６および気体シリンダー２０ならびに上
記した相当する部材を有する。装置１００は更に栄養分
と気体の供給を遠隔操作するためのマイクロプロセッサ
−のような電気コントローラ１１４を備えている。流出
液収集具１１６は液体を収集容器１１８に集めるように
導ひき、収集容器において各成分が回収され、場合によ
っては処理され、そして好ましくは再使用される。

第６図には禾発明の他の態様が示されている・メツシュ
状のコンベアベルト２０２が不活性な材料から作られ、
そして囲い２０４内を移動する。

モータ２０６およびギヤ径違い継手２０８がベルト２０
２を低速で移動させ、新しい細胞が載置部２１０で加え
られそして積みおろし部２１２で取り去られる。栄養分
の供給が上記のように行われ、ミスト装置放出２１４か
ら放出される。必要に応じて複数の超音波ミスト放出装
置を設けてもよい。

第４図は生長のために支持体に付着するのが必要な生物
にとって有効な培養装置３００の１態様を示している。

ナイロンまたはプリプロピレンのような不活性材料の巻
込み状メツシュ３０１が細胞の支持体となる。メツシュ
は細胞を含有する溶液を通り抜けさせることによって無
害化される。付着を促進するためにポリリジンのような
生物学的な接着剤がメツシュ上にスプレーされる。細胞
は場合によってはセルロース製の支持体に共有的に結合
されてもよい。細胞は、分離を起こさせるノ・イブリド
ーマ用の多数の既知の化合物のいずれか（トリプシンな
ど）を用いてショツキングにより回収または分離される
。

より大きな出入口部６０２が巻込み状メツシュ支持体マ
トリックスの導入および除去を容易にする。ミスト放出
装置３０４は、栄養分を高い分配状態で供給する一方で
メツシュによる妨害を最小限にするように配置される。

光源３０６が室１２内に配される。第４図に示される態
様においてはメツシュ３０１を中央に配置した光源の回
りに巻きつけてもよい。メツシュ３０１の挿入および取
り出しを容易にするために光源を移動可能にしておくの
が好ましい。

本発明によると、有用な生成物を高収率、低コストで製
造すべく細胞および組織が培養される。細胞は高い湿分
および栄養分の富んだ環境中で生長させられる。装置は
無菌状態を与えるために密閉され、それＫよって拮抗物
質および競合から培養物を保護する。

従来技術では植物組織培養物は固体状の栄養分支持体上
で生成させられる。植物細胞は代謝するので毒素が生成
され、それにより媒体は生長に対する適性を失う。本発
明は、堆積した媒体および生成物ならびに毒素の流れを
細胞から取り去るようにしたことによって細胞を新しい
媒体担体上に移植する必要を回避する。したがって細胞
は、望みの状態にまで（例えば苗木が作られるまで）、
移植の繰り返しという労力がかかり不経済な仕事を伴わ
ずに、培養されることができる。

本発明は嫌気性菌をも含めて全ての種類の細胞の培養を
提供する。ノ・イデリＰ−マをも含めて細かカスクリー
ン１４が細胞の付着用におよび細胞の非付着用に使用さ
れることができる。

更に本発明の装置は任意の細胞支持構造物と組合わせて
使用することができる。第５図に示すようにまくら状装
置３３は、細胞の漏れを防止するために密閉されてはい
るが、気体および栄養分の通過を可能にする。

浮遊細胞培養の第１の問題は液体浮遊物と周囲の大気と
の間の酸素移動割合にある。本発明は栄養分が高い飽和
大気で細胞を包囲することによってこの問題を解消した
。本発明の実施においては細胞が栄養分でスプレーされ
ないことが最も重要である。スプレーにより大きな液滴
が形成されて連続した液体接点が生成され、それが酸素
涸渇障壁として作用する。しかしながら本発明では液滴
は種々の場所で形成され、細胞は高い飽和大気中にあり
栄養分でコートされていない。したがって細胞はいつで
も酸素に曝されている。本発明の利点は、更に栄養分が
グル化した固体の支持体を通って拡散する必要がなくそ
れにより細胞は必要なだけ十分な量の栄養分を摂取出来
ることである。

本発明の利点は更に第２次代謝物を容易に除去できるこ
とである。細胞がたまり域１７．１１０．２１６の上方
に支持されているのでたまった流出液は生物の代謝に応
じて全部または部分的に再導入されることができる。

本発明の利点は労力を極端に減らすことである。上記の
ように組織は移植される必要がない。

更に全ての操作／Ｊ？ラメータがマイクロプロセッサ−
コントロールにおいて容易に採用でき、それにより調和
が高められるにも拘わらず労力の投入が減少される。本
発明ではコンベア２０２の一方の端部で細胞接種物が加
えられ他の端部で生成物が取り出されることのみが必要
な装置が提供される。生成物の収率を増加させるために
１つの室２０４内に複数のコンベアを収容してもよい。

表１および第６図は、第１図の装置を用いた場合と従来
の寒天プレートを用いた場合との植物組織カルスの細胞
培養の比較により得られた実験結果を示している。本発
明の装置の標準的な調整を、装置を次亜塩素酸溶液、エ
タノールおよび無菌の蒸留水により連続的に洗浄するこ
とにより行った。次にユニットをｊ−流状態下に置き８
時間乾燥した。０．ｌｐｐｍの２．４−’Ｄを含有する
Ｍ＋８媒体の標準貯蔵溶液を製造し、媒体タンクに入れ
、次いで１５１ｂｓの圧力で２０分間オートクレーブ処
理した。均一な人参組織部分を無菌のコルクあなあけ具
を用いて生育中の培養物から切り取った。各々の片を既
知の無菌のＫ）　ＩＪ皿上に個々に置いた。

毎時０．５ｄの割合で１回に５秒かけて媒体を装置中に
導入した。６週間続いた実験の終りにカルスを取り出し
個々に重さをはかり評価のために記録した。表１に重さ
の測定結果を示す。

１６個の人参カルスコアの全部を取り出し個個に重さを
測り、それらが同じ媒体を含有する本発明の装置内に置
かれたものであるかまたは寒天ぺ）　ＩＪ皿上に置かれ
たものであるかを明らかにしておく。コアの重さと相対
的な位置を実験の始めに記録し、それを表１に示す。

表　　　１ ３６５０　８１１　５９７　−ｍ− 平均　６１１　　　　　７７９　　　　６４１　　　　
６８９８Ｄ　３１　１９　２９　４８ 表１は個々のカルスの実際の数値結果および統計的な尺
度を示す。寒天２における２つの空欄は２つのカルスが
不完全なデータを示したためである。単位はｌ１Ｘ１０
　　である。

次に実験の全体の結果を第６図に示す。第６図において
、０１〜Ｃ８は第１図に示される装置な使用して行った
本発明の組織培養の結果を示し、Ａ１〜Ａ８は寒天プレ
ートによる従来技術を示す。

表１および第６図から本発明の装置内で培養したカルス
は平均生長が２８チであるのに対して寒天上に置いた従
来技術の試料は平均生長が８％であることが明らかであ
る。

総括すると、本発明の装置中のカルスは対照カルスの３
．５倍生長した。更に試験の結果２組のカルスの一般的
な外観に明白な違いがあった。

本発明の装置中のカルスは球根状のほぼ球形の新しい組
織の生長を示した。一方、寒天上の培養物はむしろ不規
則なでこぼこの生長ノ譬ターンを示した。

本発明は多くの重要な点で水栽培とは異なっている。米
国特許第４．５３２，１０５号に水栽培型植物培養の典
型例が示されている。水栽培装置は、分化したｍ織（そ
こでは完全な植物体は根や葉を有している）を異なった
やり方で各々処理して調和させるように設計されている
。本発明は、根または他のそのよう々分化した形の組織
が必要な水栽培法によっては培養できない分化していな
い組織を培養する。更に水栽培装置は、本発明によって
もたらされる重要な利益である第２次代謝物の収集をも
たらさない。更に細胞または未分化組織の培養における
その採用を妨げる他の点としては次のようなものがある
。すなわち、従来技術の装置は無菌下での生長、気体の
選択とコントロール、正確な温度制御またはミスト化を
備えておらず、その環境はスプレーまたは重要な液体付
着を備えていない。

図面および明細書中に本発明の種々の態様を記載してき
たが、上記の記載は単なる例であって、本発明の精神お
よび範囲をはずれないようにして稽々の変形を行うこと
が可能であることが理解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の細胞培養装置を示す略図である。 第２図は本発明のマルチプル支持体装置を示す略図であ
る。 第３図はコンベア装置を内蔵する本発明の１つの態様の
装置を示す斜視図である。 第４図は巻込み状メツシュ支持体と内側に光源を備えた
本発明の１つの態様の装置を示す略図である。 第５図は第１図で示される装置のなかに透過性の細胞支
持用まくら状物を備えた本発明の１つの態様の装置を示
す略図である。 第６図は本発明の装置を用いた場合の実験結果および従
来技術を採用した場合の実験結果を示す図である。 １２・・・生長室、１４・・・スクリーン、２６・・・
栄養分容器、３２・・・ミスト放出装置、３６・・・光
源、３８・・・生成物貯蔵容器、１０２・・・室、１１
０・・・ミスト放出装置、１１４・・・電気コントロー
ラ、２０２・・・コンベアベルト、２１４・・・ミスト
放出装置、３０１・・・巻込み状メツシュ、３３・・・
まくら状装置。 特許出願人　　バイオ・ラショナル・チクノロシーズ・
インコーホレイテッド 外２名 ＦＩＧ、　６ 初期重量 手続補正書（方式） ％式％ ■、事件の表示 昭和６２年特許願第３５９４６号 ２、発明の名称 細胞のミスト培養 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 レイテッド ４、代理人 ５、補正命令の日付 ７、補正の内容 願書に最初に添付した図面の浄書・別紙のとおり　（内
容に変更なし） 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）液体栄養分の供給装置、 室、 該室と協働するミスト放出手段、および 該液体栄養分が透過でき、該室内に設置された細胞用支
   持体 を備えている細胞培養装置。 ２）前記ミスト放出手段が超音波を採用したものである
   特許請求の範囲第１項記載の装置。 ３）前記ミスト放出手段が、ミスト放出ノズルおよび該
   ノズルを通して液体を放出させるための加圧気体供給手
   段からなつている特許請求の範囲第１項記載の装置。 ４）前記気体が細胞の第１次代謝にとつての必要物であ
   る特許請求の範囲第３項記載の装置。 ５）前記支持体が生物学的に不活性なスクリーンである
   特許請求の範囲第１項記載の装置。 ６）前記支持体が生物学的に不活性な材料の巻込み状メ
   ッシュである特許請求の範囲第１項記載の装置。 ７）更に代謝に利用可能な光源を備えている特許請求の
   範囲第１項記載の装置。 ８）更に電気プロセッサーコントローラを備え、装置の
   工程パラメータが該プロセッサーによつて監視されコン
   トロールされる特許請求の範囲第１項記載の装置。 ９）更に細胞用の追加の支持体を備えている特許請求の
   範囲第１項記載の装置。 １０）更に前記室内で前記支持体を移動させる手段を備
   えている特許請求の範囲第１項記載の装置。 １１）前記支持体が気体透過性である特許請求の範囲第
   １項記載の装置。 １２）無菌の液体栄養分の供給装置、 複数の密閉可能な開口を有する室、 該室内に直径０．１〜１００ミクロンのミスト粒子を放
   出するように働く少なくとも１つのミスト放出手段、お
   よび 該少なくとも１つのミスト放出手段によつて発生させら
   れたミスト内に細胞を保持するための支持体 を備え、上記室内が無菌状態に保たれるようになつてい
   る細胞培養装置。 １３）前記ミスト放出手段が少なくとも１つのノズルお
   よび該少なくとも１つのノズルを通して液体栄養分を放
   出させるべく作用する加圧気体源からなつている特許請
   求の範囲第１２項記載の装置。 １４）前記ミスト放出手段の各々が少くとも１つの超音
   波ミスト化装置および前記室内にくまなくミストを分配
   する手段を備えている特許請求の範囲第１２項記載の装
   置。 １５）（ａ）液体および気体透過性の部材に細胞を支持
   させ、 （ｂ）それを密閉可能な室内に配置し、そして（ｃ）該
   室内に液体栄養分のミストを施して栄養分のある湿つた
   環境にする 工程からなる細胞培養方法。 １６）更に（ｄ）該密閉可能な室内に気体を導入する工
   程、を含む特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７）更に（ｅ）プロセッサーおよびそれと結合したハ
   ードウェアを用いて気体および栄養分の導入をコントロ
   ールする工程、を含む特許請求の範囲第１６項記載の方
   法。 １８）該工程（ｃ）におけるミスト滴が０．１〜１００
   ミクロンの範囲にある特許請求の範囲第１５項記載の方
   法。 １９）該工程（ａ）における液体および気体透過性の部
   材が生物学的に不活性な材料のスクリーンである特許請
   求の範囲第１５項記載の方法。 ２０）該工程（ａ）における液体および気体透過性の部
   材が生物学的に不活性な材料の巻込み状メッシュである
   特許請求の範囲第１５項記載の方法。