JPS6222A - ボツリヌス毒素の中和剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ボツリヌス中毒症の予防および治療に有効な
、ボツリヌス毒素中和剤に関するものである。

従来の技術 ボツリヌス毒素はボツリヌス菌が菌体外に産生する蛋白
質性末梢神経毒素であるが、分子サイズ等の相違する複
数種類のものが知られており、その中の主としてＡ型、
Ｅ型およびＥ型のものが、経口的に人体内に摂取される
といわゆるポツリヌス中毒を起三す。この中毒症は、特
有の麻痺症状を伴うものであって、ボツリヌス毒素が消
化管内で吸収されたのち副交感神経支配の神経筋接合部
に作用し、神経終末からのアセチルコリンの遊離を阻害
するために起こることが確認されている。そしてその場
合のボツリヌス毒素の作用機構については、神経膜に存
在するガングリオシドＧＴ１ｂが該毒素のレセプターに
なると考える説が最も有力である。〃ングリオシドＧＱ
１ｂ、同ＧＤ１ｂ等もボッリヌス毒素との結合能を持つ
が、それらの結合能はガングリオシドＧＴ１ｂのそれに
比べて弱いので、ボツリヌス毒素の作用との関係は少な
いと考えられている。

ボッリヌス中毒の治療は妾わめて困難であって、現状で
は、発症した場合は対症療法しかないといってよい。上
述のようなボツリヌス毒素の作用機構に鑑み、〃ングリ
オシドＧＴ１ｂをレセプター拮抗物質として経口投与し
、これをボッリヌス毒素と結合させることにより毒性発
揮を阻止する方法も考えられるが、使用可能なガングリ
オシドＧＴ１ｂとしては牛脳由来のものしかなく著しく
高価であるため、上記中毒症防止法が実際に行われるこ
とはほとんどなかった。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上述のような現状に鑑み、上記拮抗法
に用いることのできる安価なボツリヌス毒素中和剤を提
供し、ボツリヌス毒素による中毒症の予防と治療を容易
にすることにある。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、獣乳から採取した脂肪球皮膜について研
究中、それが強力なボツリヌス毒素中和能を有すること
を見いだした。

本発明は上記の知見に基づいて完成されたものであって
、獣乳の脂肪球皮膜の熱処理物からなるボツリヌス毒素
中和剤（以下、第一発明の中和剤という）、および獣乳
の脂肪球皮膜より分離された酸性糖脂質からなるボツリ
ヌス毒素中和剤（以下、第二発明の中和剤という）を提
供するものである。

獣乳の脂肪球皮膜は、獣乳中の脂肪球を覆っている皮膜
であって、牛乳の場合、脂肪球直径は１〜１０μ、皮膜
厚さは約１０ｎｍである。この皮膜は、獣乳の脂肪が乳
糖で分泌されると同時に形成され、その組成は乳糖細胞
の原形質膜と似ている。脂肪球皮膜を構成する主要成分
は、リン脂質、酵素、蛋白質、糖蛋白質、トリグリセラ
イド、コレステロールなどであるが、蛋白質と脂質だけ
で９０％以上を占め、そのうちの約５５％が脂質であり
、約４５％が蛋白質である。脂質からは現在までのとこ
ろ６種類のガングリオシドが確認されて始り、総量で、
蛋白質１＋ａｇ当り約６ｎｍｏｌ　（但しシアル酸換算
値）が含まれている。最も多量に存在するのはがングリ
オシドＧＤ３であり、池に同ＧＭ２、ＧＭ３なども見い
だされるが、前述のようにボツリヌス毒素のレセプター
となることが知られている〃ングリオシドＧＴ１ｂは検
出されない。

次に本発明によるボツリヌス毒素中和剤の製造法につい
て詳述する。

脂肪球皮膜は、常法によるバター製造工程において、獣
乳を遠心分離して得られるクリームをチャーンで処理し
、生じたバター粒を分離した後に残るいわゆるバターミ
ルク中に濃縮されているから、本発明のボツリヌス毒素
中和剤の原料としてもこの獣乳画分を利用するのが最も
有利であるが、これに限られるものではなく、たとえば
クリームに水を混合したのち遠心分離することにより洗
浄する処理をあらかじめ施してからチャーニングして得
られるバターミルク相当物を用いてもよい。

バターミルクまたはこれと同様の組成を持つ獣乳画分は
、そのままでは乳蛋白、乳糖等の乳成分が多くて毒素中
和剤として利用するのに適当ではないから、通常はこれ
を透析、硫安分画、デル濾過、等電点沈殿などの方法に
より精製することが望ましい。また脂肪球皮膜は多くの
酵素を含むので、加熱処理してこれを失活させることが
必要である。そのための熱処理条件としては、たとえば
６２℃で３０分間以上の加熱、または１００℃以上の高
温で短時間の熱処理を行ういわゆるＵＨＴ滅菌処理に相
当する加熱が適当である。

以上の処理を経て得られる脂肪球皮膜は、脂肪球を包囲
していたときとあまり変らない大きさを持つ部分もある
ため、水に分散させても一部が沈殿し易い。したがって
、通常はこれに超音波処理等を施して微細な皮膜断片と
し、安定な水中懸濁液を形成し得るようにすることが望
ましい。

すべての処理を終わった脂肪球皮膜は、凍結乾燥して保
存することができる。得られた脂肪球皮膜を第一発明の
毒素中和剤として製剤化する方法は任意であり、凍結乾
燥粉末をそのまま中和剤として使用してもよい。

第二発明の中和剤は、上述のようにして得られる第一発
明の中和剤またはその半製品から任意の方法により酸性
糖脂質を抽出し精製することにより製造することができ
る。製法の一例を示すと、クロロホルム−メタノール混
液等を抽出溶剤として脂肪球皮膜より脂質を抽出し、こ
の脂質からデルろ適法により酸性糖脂質をとり出す。得
られた酸性糖脂質画分は、前述したとおりの、種々のガ
ングリオシドの混合物である。

第二発明の中和剤としてこれらのガングリオシドのすべ
てが必須成分なのか一部のガングリオシドのみが有効な
のかは未だ確認されていない。したがって、上述のよう
にして得られた酸性糖脂質を更に分画して用いる場合は
、ボツリヌス毒素中和能の大小に着目した分画を行う。

単なる脱塩のための精製には、透析あるいはイオン交換
樹脂処理が有効である。

本発明によるボツリヌス毒素中和剤の毒素中和能は、原
料の獣乳の種類等によって異なり、一様ではない。した
がって本発明の中和剤の標準的な使用量を一律に示すこ
とはできず、多くの場合、後記実施例で示したような試
験法により個々の中和剤について毒素中和能を確認し、
それに使用条件等を勘案して好適使用量を知ることが望
ましい。しかしながら、ポツリヌス中毒症の治療または
予防の目的で内服する場合についておおよその服用量を
示すと、第一発明の中和剤の場合で約４〜１０００ｍｇ
、第二発明の中和剤の場合で約２〜５００ＩＩｇ　（い
ずれも成人１日当りの量）である。

本発明の中和剤は、経口的に使用するほか、消化管洗浄
液や食品に添加して使用することもできる。また、第二
発明の中和剤の場合は、抗ボツリヌス毒素血清と併用し
て血中に投与することもできる。

作−■ 本発明によるポツリヌス毒素中和剤の毒素中和作用は次
のように考えられている。すなわち、生体内に投与され
た場合は中和剤中のいくつかのガングリオシドがボツリ
ヌス毒素と遭遇したときレセプターとなって該毒素と結
合する。その結果、その毒素は生体の作用部位に結合す
ることなく排せつされる。食品に添加された場合はその
食品中で、ボツリヌス菌が毒素を産生じたとき該毒素と
結合してこれを中和する。

発明の効果 本発明の毒素中和剤は、バター製造工場において大量に
生成する安価なバターミルクを濃縮済み原料として有利
に利用し、これに簡単な精製処理と熱処理を加えるだけ
で製造できるので、従来の牛脳由来のガングリオシド製
剤に比べて大量生産が容易できわめて安価である。しか
も本発明による毒素中和剤は獣乳を原料として化学的処
理を施すことなしに分離処理と熱処理のみによって作ら
れるものであるから、安全性の点では全く問題がない。

したがって本発明によれば、従来対症療法しかなかった
ボツリヌス毒素中毒症の実際的な治療の途がひらけると
ともに、本発明の毒素中和剤を食品等に添加するなどの
方法により該中毒症の予防を行うことも可能になる。

？［［Ｊ 以下、実施例を示して本発明を説明する。

実施例　１ 脂肪分３．３％の牛乳ＩＣを３０００ｒｐｍで１５分間
遠心分離してクリームを得、これに水を加えて全量を４
４０ｍ１にし遠心分離することにより洗浄した。同様の
洗浄処理を更に３回くり返したのち、洗浄ずみクリーム
を４°Ｃで一夜保存し、次いでチャーンで処理してバタ
ーミルクとバター粒とに分離した。得られたバターミル
クに硫安を加えて５０％飽和とした後、−夜保存し、３
００Ｏｒｐｍで３０分間、遠心分離を行なった。この後
、浮上している脂肪球皮膜をとって水に懸濁多せ、蒸留
水に対して４℃で透析後、１０．ＯＯＯｒｐｍで３０分
間遠心分離を行なった。沈殿した脂肪球皮膜をとって凍
結乾燥することにより、乾燥脂肪球皮膜６５０ｍｇを得
た。

次いでこれを水に懸濁させ、超音波処理を行なって皮膜
を破砕し、更に１００℃で３０分間加熱して酵素を失活
させて、第一発明の中和剤を得た。

この中和剤３０ｎ＋ｇをトリス−塩酸緩衝液（０，ＯＩ
Ｍ、ｐＨ７，２）１．５ｍｌに溶解し、精製ボッリヌス
Ａ型毒素２μｇを加えて３７°Ｃで３０分間反応させた
後、マウスを用いるｔｉｍｅｔｏ　ｃｌｅａｔｌ＋法（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ）（ｙ、　Ｖｏｌ、９２＋　
Ｎｏ、５．１５８０）の常法により残存毒素量を測定し
た。その結果、残存毒素量は０．９％以下であり、ボツ
リヌス毒素が中和剤によりほぼ完全に中和されたことが
確認された。

実施例　２ 実施例１と同じ方法で得られた乾燥脂肪球皮膜１．０ｇ
から２０ｍ１のクロロホルム／メタノール（２：　１．
　ｖ／ｖ）及び１０ｍ１のクロロホルム／メタノール（
１：　１．ν／Ｖ）　ヲ用いて総脂質を抽出した。得ら
れた脂質は、セファデックスＡ−２５（アセテート型）
カラムにより中性脂質と酸性糖脂質とに分画した。次い
で後者を弱アルカリで中和し、透析およびイオン交換Ｏ
（脂処理により脱塩してから凍結乾燥することにより、
酸性糖脂質からなる第二発明の中和剤０．８ｍｇを得た
。

上記中和剤４．７１１ｇを実施例１の場合と同様にして
精製Ａ型ボツリヌス毒素と反応させ、残存毒素量を測定
したところ、０．９％以下であった。

比較のため、市販の〃ングリオシド混合物（Ｓ　ｉｇｍ
ａ＋　ＴｙｐｅＩＩ；　Ｇｒ、４１２０％、ＧＤｌａ　
４０％、ＧＤｌｂ　２０％、ＧＴ１ｂ２０％）５０北を
用いて同様の試験を行なったところ、残存毒素量は９．
０％であった。

実施例　３ 脂肪分４．２５％の山羊孔１Ｃを３０００ｒｐｍで遠心
分離し、得られたクリームに水を加えて全量を５７０ｍ
１とし、再度遠心分離することにより、クリーム中の脂
肪球を洗浄した。この洗浄繰作を更に３回くり返した後
、４°Ｃで一夜保存し、次いでチャーンで処理して、バ
ターミルクとバター粒とに分離した。次いでバターミル
クを、１００℃で１０分間加熱したのち、蒸留水に対し
て４℃で透析した。得られた透析内容物を凍結乾燥する
ことにより、乾燥脂肪球皮膜７６０ｍｇを得た。

上記乾燥脂肪球皮膜から、実施例２と同様の方法により
、酸性糖脂質からなる第二発明の中和剤３０２μｇを得
た。

この中和剤４．５北によるボツリヌスＡ型毒素２１１ｇ
の中和能を実施例１の場合と同様にして測定したところ
、残存毒素量は３６％であった。

実施例　４ 実施例２で製造した第二発明の中和剤および市販のバタ
ーミルクから製造した第二発明の中和剤について、Ｂ型
およびＥ型のボツリヌス毒素の中和能を確認した。なお
パターミルりからの中和剤の製造法および試験法は次の
とおりである。

製法：２０ｍ１のクロロホルム／メタノール（２：　１
．　ｖ／ｖ）および１０ｍ１のクロロホルム／メタノー
ル（１：　１．　ｖ／ｖ）を用いて、市販のバターミル
ク（雪印乳業株式会社）１．０ｇから総脂質を抽出した
。得られた脂質は、セファデックスＡ−２５（アセテー
ト型）カラムにより中性脂質と酸性糖脂質とに分画した
１次いで後者を弱アルカリで中和し、透析およびイオン
交換樹脂処理に上り脱塩してから凍結乾燥することによ
り、酸性糖脂質からなる第二発明の中和剤０．２ｍｇを
得た。

試験法：精製ボツリヌス毒素（Ｂ型またはＥ型’）２ｕ
ｇおよび中和剤（１ｌＩｇまたは１０ｕｇ）をトリス−
塩酸緩衝液（０，０１Ｍ、ｐＨ７，２）０．５ｍｌに溶
解し、３７℃で３０分間反応させたのち、残存毒素量を
実施例１の場合と同様にして測定した。

上記試験の結果を表１に示す。

表１

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）獣乳の脂肪球皮膜の熱処理物よりなるボツリヌス
   毒素の中和剤。
2. （２）獣乳の脂肪球皮膜より分離された酸性糖脂質より
   なるボツリヌス毒素の中和剤。