JPS62198697A - ジヌクレオチドの安定化組成物及びその方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般に補酵素を安定化する方法及び組成物に
関し、そして特に溶液中のＮＡＤＨを安定化する方法及
び組成物に関する。

（従来の技術） 生化学的反応は、はとんど例外なく酵素により触媒化さ
れる。それぞれの酵素は、基質における非常に特異的な
化学的変化を促進するたん白である。

多くの種層の酵素が機能するために、補酵素と呼ばれろ
成る型の低分子量分子の参与が、必要とされる。−最に
、補酵素におけろ化学変化は、反応の所望の産物である
基質における変化と平衡する。例えば、補酵素は、基質
から水素イオンを受は取るか又は水素イオンを基質に供
与する。

多くの臨床の診断アッセイは、酸化還元反応を含む。こ
れらの診断上の反応の中で、ジヌクレオチドが補酵素と
して働くものがある。このようなジヌクレオチドの例は
、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）　
、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド２′−ホスフ
ェート（ＮＡＤＰ）及びフラビンアデニンジヌクレオチ
ド（ＦＡＤ）を含む。

ジヌクレオチドはホスフェート橋かけにより結合された
モノヌクレオチドである。モノヌクレオチドは含窒素塩
基及び糖のりん酸エステルである。

ＮＡＤ及びＮＡＤＰでは、第一のモノヌクレオチドは塩
基アデニン及び糖リボースから形成されろヌクレオチド
のりん酸エステルであり、一方第二のモノヌクレオチド
は塩基ニコチンアミド及びリボースから形成されるヌク
レオチドのりん酸エステルである。ＦＡＤにおいて、ア
デニン及びリボースのりん酸エステルから形成されろ第
一のモノヌクレオチドは、塩基７．８−ジメチル−イソ
アロキサジン及び糖アルコールＤ−リビトールのりん酸
エステルから形成される第二のモノヌクレオチドに結合
きれろ。

ＮＡＤ又はＮＡＤＰの何れかは、会合された電子により
水素を受容することにより還元された基質（Ｓ「）から
の電子受容体として働くか、又は可逆反応において酸化
された基＊（Ｓｏ）への電子供与体として働き、即ち （ｉ）ＮＡＤ”＋５ｒ−Ｈ＝ＮＡＤＨ＋Ｓｏ＋Ｈ”（２
１ＮＡＤＰ”＋５ｒ−Ｈ２＝ＮＡＤＰＨ＋Ｓｏ＋Ｈ”と
なる。これらの反応の有用な特徴は、これらのジヌクレ
オチドの還元された形（即ち、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ
）は、３４０　ｎｍの波長で光を吸収するが、酸化され
た形（即ちＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ”）はそうではない。

それ故、既知の量の酵素について反応速度の較正曲線を
プロットした後に、これらの反応の一つを触媒化する未
知の量の酵素が、成る量の基質、酵素に関する既知の活
性及び３４Ｏｎ＠における光学密度の観察された変化速
度から得られよう。同様に、これらの反応の一つを触媒
化する酵素の基質の量は、較正曲線、既知の活性の成る
量の酵素及び３４０ｎ■におけ、る光学密度の測定され
た変化速度から求められよう。

診断アッセイにおいて重要であるが、ＮＡＤＨは、他の
還元されたジヌクレオチドと同じく、水溶液では非常に
不安定である。これは、それが一層安定した形の乾燥粉
末でＮＡＤＨを処理するのよりも、ＮＡＤＨの水溶液を
処理する乙とが極めて容易、安価そして正確である限り
、診断アッセィキットの製造者及び使用者にとり特別な
問題を提供する。

ＮＡＤＨ溶液を安定化する一つのやり方は、できる限り
水を除去するための有機溶媒との混合を含む。

米国特許第４．１５３．５１１号明細書において、不活
性且つ吸湿性の剤及び有機溶媒が用いられて０．５％よ
り少ない水を含むＮＡＤＨ溶液を得ている。しかし、利
用しうろ非水性の溶媒中のＮＡＤＨ溶液は、正確且つ精
密に処理するには困難な点まで粘稠になり勝ちである。

他のやり方では、補酵素例えばＮＡＤ及びＮＡＤＰは、
酸性ｐＨで有機溶媒好ましくは液体ポリオール例えばグ
リセロール又はプロピレングリコールの存在下安定化さ
れろ。モドロビッチ（Ｍｏｄ−ｒｏｖｉｅｈ）の米国特
許第４．１５３．５１１号明細書参照。しかし、このよ
うな溶液は、比較的不安定であり、そしてほぼ１００％
の還元された補酵素の安定性が要求される自動化アッセ
イについて特に適さない。

（発明の概要） 本発明による安定化された補酵素組成物は、塩基性水溶
液；水溶液中の第一の濃度の還元されたジヌクレオチド
好ましくはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ；水溶液中のポリヒ
ドロキシルアルキル溶媒最も好ましくはプロピレングリ
コール；そして水溶液中の第二の濃度のボレートシス−
ヒドロキシル結合化合物量も好ましはくほう酸又はその
塩を含み、第二の濃度は第一の濃度にほぼ等しいか又は
それより高い。

本発明による現在好ましい安定化された補酵素組成物は
、約８〜約１１の間のｐＨの水溶液；約１０＋ｍＭから
約５００＋ａＭまでの範囲内の濃度のビシン（Ｂｉｃｉ
ｎｅ）バッフ７　　　（Ｎ、Ｎ−ビス［２−ヒドロキシ
エチルグリシン］）；約０．００１鳳Ｍから約５０ｍＭ
までの範囲内の濃度のＮＡＤＩ（、ＮＡＤＨの濃度に少
な（とも等しい濃度でしかも約１０ａ＋Ｍから約５００
ｍＭまでの範囲内の濃度のほう酸；及び水溶液の約２０
％ｖ／ｖから約９０％Ｖ／Ｖまでの範囲内の濃度のプロ
ピレングリコールを含む。最も好ましい補酵素組成物は
、ＮＡＤＨが１０ｍＭの濃度、ほう酸が５０ｍＭの濃度
、プロピレングリコールが５０％Ｖ／Ｖの濃度モしてビ
シン・バッファーが２００ｍＭの濃度であり約ｐＨＩＱ
、Ｑへ調節されたものである。

本発明による還元されたジヌクレオチドの溶液を安定化
する方法は、第一の濃度の還元されたジヌクレオチドを
塩基性水溶液に溶解し；水溶液を約８．０〜約１１．０
の間のｐ）（へ緩衝し；第一の濃度にほぼ等しいか又は
それより高い第二の濃度で還元されたジヌクレオチドを
ボレートシス−ヒドロキシル結合化合物に接触させ；そ
して水溶液をポリヒドロキシルアルキル溶媒中で約２０
％ｖ／ｖから約９０％ｖ／ｖへすることにより還元され
たジヌクレオチドの水との接触を低下させる工程を含む
。

第１図は、種々のｐＨ値における、未混入のプロピレン
グリコール中のＮＡＤＨの安定性と金属混入プロピレン
グリコール中のＮＡＤＨの安定性の比較のグラフである
。

第２図は、種々の精製工程をうけたプロピレングリコー
ル溶液中のＮ　Ａ　Ｄ　Ｈの安定性のグラフである。

第３図は、種々のｐＨ値における、純粋なプロピレング
リコール中のＮＡＤＨの安定性と５０％ｖ／ｖプロピレ
ングリコール／水中の安定性との比較のグラフである。

第４図は、本発明による安定化されたジヌクレオチド溶
液に関する最適ｐＨの決定の結果を示すグラフである。

ＮＡＤＨは、臨床化学に広く用いられている補酵素であ
る。現在の処方は、通常乾燥充填又は凍結乾燥され、そ
して再溶解すると不安定である。

乾燥処方は、観客による混合中に試薬をａ％費し勝ちで
ある。その上、乾燥処方の製造者は、凍結乾燥及び乾燥
混合の費用がかさむ。又、観客が適切に試薬を再溶解す
るのに依存すべきときに、製造者による品質管理の損失
がある。

本発明は、非常に安定な水性ＮＡＤＨ溶液の製造及び使
用を含む。現在入手しうろ液体ＮＡＤＨ処方は、実質的
に無水であると記載されておりそしてピペットに吸うこ
とが困難である。本発明と比べて、これらの処方は、一
層高価であ抄そしてそれらの製造には一層人手がかかる
。

本発明は、少なくとも約１年間安定である液体ＮＡＤＨ
の溶液を提供する。この溶液は、ＮＡＤＨの酸化が分析
物の濃度の決定に用いられろシステムで使用されよう。

ＮＡＤＨの損失は、３４０ｎｍ領域の吸収の損失、又は
カップルされた比色定量システム中の損失により直接に
；螢光定量的又は電気化学的に決定されよう。水性Ｎ　
Ａ　Ｄ　Ｈ＃［の使用は、以前作成された全有機ｍＰ＆
よりも一層大きなフレキシビリティをもたらす。水を排
除するＮＡＤＨ溶液に対する本発明の一つの利点は、導
電性溶液の存在に依存するＮＡＤＨの滴定を行う能力で
ある。

ＮＡＤＨはボロネート結合基を有するアフィニティクロ
マトグラフィカラムに結合し、ほう酸ナトリウム溶液に
より溶離しそして溶離液はＮＡＤＨの存在について分光
測光法により調べられたが［マエスタス（Ｍａｅｓｔｔ
ｓ）ら「ジエー・クロマトグラ　　（Ｊ、Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒ、）　　Ｊ　　１８９．　２２５−２３１　　
（１９８０）　　］　　、ＮＡＤＨがこのような溶離液
中で特に安定であり、又はこのような溶離液への有機溶
媒の添加は特に安定な補酵素組成物をもたらすというこ
とについて、現在までの所どんな教示もされていない。

一般に、本発明によれば、ＮＡＤＨ又は他の還元された
ジヌクレオチドは、４オングストロームの分子ふるい及
びナトリウムボロヒトリッドによりプロピレングリコー
ルを処理して溶液から少量の酸化物を除（ことにより、
本発明で安定化される。処理されたプロピレングリコー
ルは、ほう酸を含むバッファーと１対１で混合され、そ
してｐＨ１０，０に調節される。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＨ
の還元されたアナローブは、容易に水をペースとする材
料に溶解する。この溶液は、プラスチック又はガラスの
貯蔵装置に少なくとも約１年間貯蔵されうる。ＮＡＤＨ
！液は何回も再使用され、そして容器を開けても同等損
失は生じない。

ボロネート陰イオンは、リボースの２７，３７位で１．
２−＆Ｘジオールへ結合することにより、ジヌクレオチ
ドと結合するものと思われる。この理由のため、ほう酸
及びその塩並びにほう酸のボレート誘導体及びそれらの
塩は、−最にシス−ヒドロキシル結合化合物とされる。

例えば、フルトン（Ｆｕ−Ｈｏｎ）　、ｒボロネート・
リガンズ・イン・バイオケミ力／Ｌ、　・セパレージｗ
”／ズ（Ｂｏｒｏｎａｔｅ　Ｌｉｇａｎｔｓｉｎ　Ｂｉ
ｏｅｈｅｍｉｅａｌ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）　Ｊ　
、アミコン・コーポレーション（人ｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）　、サイエンティフィク・システム
ズ・ディビジョン（Ｓｅｉｅｎ−ｔｉｆｉｃ　５ｙｓｔ
ｅｓａｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）　、ダンバーズ（Ｄａｎ
ｖｅｒｓ）、マサチューセッツ（１９８１）参照。本発
明により有用なほう酸のボレート誘導体は、フェニルボ
ロネート、アルカンボロネート、２−フェニルエタンボ
ロネート、３−アミノベンゼンボロン酸及び他のボロネ
ートエステルを含む。例えば、本明細書において文献と
して引用されろ下記の刊行物参照。

フルトン、同上；ブラッド（Ｇｌａｄ）　　ら「ジェー
・りＣ１？トグラ（Ｊ、Ｃｂｒｏｍａｔｏｇｒ、）　Ｊ
　２００．２５４−２ＢＯ（１９８０）及びブーリオチ
ス（Ｂｏｕｒｉｏｔｉｓ）ら「ジェー・クロマトグラ」
世、　２８７−２７８　（１９８１）。ＮＡＤ（Ｈ）、
ＮＡＤＰ（Ｈ）及びＦ　Ａ　Ｄ　（Ｃ２）における１個
より多い利用可能な１．２−’ｔ　Ｘジオールの存在は
、水素結合及び疎水性効果も又役割をはなすが、ボレー
トとの緊密な結合に寄与する。フルトン、同上。

本発明は作用のすべての特別な態様に制限されることを
目的としていないが、ジヌクレオチドのシス−ヒドロキ
シルへのポレートの結合が、隣接する不安定な結合上の
これらのヒドロキシルにょる求核攻撃をブロックするも
のと思われる。このような求核攻撃は、モノヌクレオチ
ドへの分子の劣化を生じさせる。

プロピレングリコールは、本発明により用いられて、水
と還元されたピリジニウム化合物との相互作用を最小に
し、そしてそれにより酸化を最小にさせる。溶液の比誘
電率を低下させることにより、ＮＡＤＨを一層安定にさ
せると思われる。

ビシン・バッファーが、溶液のｐＨｇｈｈ８〜約１１に
保つのに用いられる。ＮＡＤＨは、高いｐ「特にｐＨ８
，０以上で一層安定である。ロウリイ（Ｌｏ−ｗｒｙ）
ら「ジエー・パイオル・ケＡ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｗ）　Ｊ２３６、２７５６〜２７５９　（１９８１
）　；並びにつ（Ｎｕ）　　ら［クリニ・ケＡ　（ＣＩ
ｉｎ、　Ｃｈｅｗ）　４３２．３１４〜３１９（１９８
６）。

高いｐＨは、一般にジヌクレオチドを還元された状態に
保つものと思われ、そしてボレートの損失を防ぐ。ナト
リウムポロにドリドが、１晩約２００ｍ１／ｌでプロピ
レングリコールを処理するのに月いられる。この処理は
、溶液に見出される酸化物を最小にする。反応により、
町０．ほう酸及び町が形成される。ナトリウムポロヒド
リドが現在好ましいが、分解してほう酸を形成する他の
ポロヒドリド塩も又は有用であることが予想される。

４オングストロームの分子ふるいが用いられて、水、酸
化物例えばアルデヒド及びペルオキシ化合物並びに他の
汚染物を引き抜いて、プロピレングリコールを清浄にす
る。

（実施例） 本発明は、下記の実施例において一層詳細に説明される
。実施例１において、金属の混入があると思われる缶入
りのプロピレングリコールを処理して、瓶入りのプロピ
レングリコールの性能に比較したその性能を改善する。

純粋なプロピレングリコール組成物は、又実施例１の水
溶液と比較される。実施例２は、種々のｐＨ値における
本発明によるＮＡＤＨ組成物の比較並びにＮＡＤＨ溶液
の安定性に関する最適なｐＨの測定をもたらす。

実施例３において、本発明の現在好ましい態様の貯蔵寿
命を調べる。実施例４及び５において、それぞれ血中尿
素の窒素（ＢＵＮ）試薬又はトリグリセリドアッセイ試
薬と組み合わされたときの本発明の安定性が記載される
。実施例６は、血中のアンモニアの測定のための材料に
おけろ、本発明による安定化された組成物を用いる混合
された試薬に関する。実施例７において、本発明による
安定化された組成物が、自動化されたＢＵＮアッセイに
おける適合性について調べられろ。実施例８において、
本発明によるジヌクレオチド組成物が、アラエントラン
スアミナーゼアッセイにおける応用について考慮される
。実施例９は、アスパルターゼアミノトランスフェラー
ゼアッセイにおける本発明による安定化された組成物の
使用を記載している。実施例１０は、本発明によるＮＡ
ＤＰＨ溶液の使用に関する。

実施例　１ 種々のｐＨの効果を調べるために、種々の混入物を除去
するように処理されたプロピレングリコールの使用と未
処理プロピレングリコールとを比較するために、そして
「純粋」なプロピレングリコールの使用と水性混合物の
使用とを比較するために、下記の実験を行った。

８Ｉｌｉの異なった実験条件を３Ｎの群に分けた。

第１群、未処理プロピレングリコール；第■群ｐ処理プ
ロピレングリコール；そして第■群、５０％溶液プロピ
レングリコール。

第１群において、４ｍのサンプルがあった。（１）２２
＋ｎｇ／＋ａｊのＮＡＤＨを加えた金属缶からのプロピ
レングリコール、　（２）　２２呵／　＠ｌのＮＡＤＨ
を加えたｐＨ８，４の瓶入りプロピレングリコール；（
３１２２１０）Ｉｇ／１１）のＮＡＤＨの入ったｐ　Ｈ
１０，３の瓶入りのプロピレングリコール；そして（４
）　２２　ｒｒ＠／ｌａｇのＮＡＤＨの入ったｐＨ１１
，８の瓶入りプロピレングリコール。

第■群では、３種のサンプルがあった。（５１２２ｍｇ
　／　ｍ　ｌのＮＡＤＨの入ったＮａＢＨ４により処理
された上述の第１群の（２１；　（６１２２ｍｇ　／　
１１１のＮＡＤＨの入ったＮａＢＨ，並びにチェレック
ス・レジン（ＣｈｅｌｅｘＲｅｓｉｎ）　５％、／ｖ［
シグマ拳ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｓ＋ａ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、セント’ｉレイス、ミ
ズーリ］により処理された前述の第１群の（２）：そし
て（７）分子ふるい３％ｗ／ｖ、　８〜１２メツシユ［
デビソン・ケミカル・ディビジョン（ＤａｖｉｓｏｎＣ
ｈｅ＋ｍ１ｅａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）　、バルチモア
、メリーランド〕だけで処理された第１群の（２）。

第■群では唯１種のサンプルがあった。（８）　５０％
瓶入りプロピレングリコール、１１００Ｉａビシン並び
に５０ｍＭほう酸、ｐ　Ｈ８，４Ｂ　そして１１ｍｇ／
＋ｍｊのＮＡＤＨを含んだ。

ＮＡＤＨ溶液を、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）ジアホラ
ーゼを含む反応混合物中のサンプルとして用いた。サン
プリングの合間の終わりに残るＮＡＤＩ（の量は、下記
の反応により形成されろホルマザン−ＩＮＴの量に比例
した。

ジアホラーゼ （３１ＮＡＤＨ＋ＩＮＴ　　＝　　ホルマザン−ＩＮＴ
＋ＮＡＤ即ち、テストされる溶液中に一５ＮＡＤＨが存
在すると、一層ホルマザンが結果として存在する。

すべてのＮＡＤＨサンプルは、第１及び２図に示された
日の数に等しいサンプリングの合間に４５℃で貯蔵され
た。

この実験の結果に基づいて、第１及び２図に示された如
く、缶入りのプロピレングリコールのサンプルは非常に
不安定であることが分かった。又ｐＨ８，４の溶液はｐ
Ｈ１０，３の溶液よりもさらに不安定であることが分か
り、後者はｐｉ（１１，８の溶液よりもより不安定であ
ることが分かったが、これらの条件下のＮＡＤＨ溶液は
１４日後ではせいぜい７５％しか安定でなかった。又混
入されたプロピレングリコールについて、安定性の増大
は、ナトリウムボロヒドリド及び分子ふるいにより処理
により得られるが、チ；レックス・レジンは助けになら
ないことが結論された。

実施例　２ 前述の「純粋」なプロピレングリコールに関する結果と
の比較について、実験を行って、種々の値のｐＨにおけ
る水中５０％ｖｌｖＷｌ液のＮＡＤＨの安定性を調べた
。実施例１のアッセイ手順が用いられた。

第３図の上方の３本のラインで示されるように異なった
ｐＨ値における「純粋」なプロピレングリコール組成物
が、ｐＨ８，３以下のとき、第３図の下方の３本のライ
ンにより示されるように、５０％溶液よりも安定である
ことが、第３図に示された結果が示す。

実施例　３ 好ましいジヌクレオチド安定化溶液は、プロピレンクリ
コールを４％Ｗ／Ｖで４オングストロ一ム分子ふるいに
より処理し、そして２　ｍｇ　／　ｍ　ｊでナトリウム
ボロヒドリドを加えることにより作られた。

溶液を１晩又は少なくとも８時間ガス抜き系で貯蔵した
。ｐＨ９の２００ａａＭのビシン及び１００ｍＭのほう
酸の蒸留水溶液を作った。この溶液を１：１でプロピレ
ングリコールと混合して、最終濃度が５０％プロピレン
グリコール、５０＋ｍＭほう酸、１００ｍＭビシンとな
った。ｐＨＩｔＮａＯＨにより１０に調節した。約１１
ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＨを徐々に加えた。

この溶液を以下ジヌクレオチド溶液とした。２〜８℃に
混合されずに貯蔵されるとき、□この溶液は約１年間少
なくとも安定であった。代表的な安定性は次の通りであ
る。−２０℃で約１年、２〜８℃で約１年、室温で２ケ
月、３７℃で１ケ月、４５℃で２週間。この溶液を臨床
上の分析物の測定のために、酵素溶液と混合される。

第４図に示した如く、好ましいジヌクレオチド溶液の安
定性テストは、４５℃という高温度で行われて、より低
い温度の長期間の貯蔵の効果をシミュレートした。第４
図に示された結果は、約１０のｐ　Ｈが、使用前に貯蔵
される本発明による溶液にとり最適であることを教示し
ている。

この実施例によるジヌクレオチド溶液に関する現在好ま
しい成分は、以下のものを含む。ビシン［＃Ｂ　−３８
７６、シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス
、ミズーリコ；　ＮＡＤＨ［＄Ｎ　−８１２９、シグマ
・ケミカル・カンパニー］；　ナトリウムボロヒドリド
［＃　Ｓ　−９１２５，シグマ・ケミカル・カンパニー
］：　プロピレングリコール［ｔ　品グレード、ダウ　
ケミカル　カンパニー、ミドランド　ミシガン］及びほ
う酸［ベーカー（Ｂａｋｅｒ）ケミカル　カンパニー］
。

実施例　４ 実施例３のジヌクレオチド溶液を用いて、ｐＨ８，３の
１５ｍＭトリス・バッファー中の０．２■／　ｍ　ｅの
１ルフアケトグルタレートにより１：　８０に稀釈され
た２０Ｕ／＋ｓｊのウレアーゼ及び５Ｕ／ｎ＋ｊのグル
タメートデヒドロゲナーゼの溶液と組合わされたとき、
ＢＵＮのサンプルを測定した。もし溶液が０゜１％のナ
トリウムアジドを含むならば、合わせた試薬は３ケ月以
内のＢＵＮ濃度を測定するのに用いられる。３ヶ月後こ
のような合わせたアッセイ試薬系は１５０ｍｇ／ｊの元
の直線的な値の１５％のみを失っていた。

実施例　５ 実施例３のジヌクレオチド溶液を用いて、１００Ｕ／　
Ｉｌｊリパーゼ、５Ｕ／ｍｌグリセロールキナーゼ、２
Ｕ／ｍｌピルベートキナーゼ、ＩＵ／＋ａｌｔラクテー
トデヒドロゲナーゼ、０５７ｍＭホスフェノールピルベ
ート、０．０５ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐ　、　１０　ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２を含むバッファーされた溶液により１：　８０
で混合されたとき、サンプル中のトリグリセリドの濃度
ｊｅ測測定た。合わせたとき、溶液は用いられて１ケ月
以内のサンプル中のトリグリセリドを測定した。

実施例　６ 血清中のアンモニア測定が、毒性学士重要である。多く
の大病院は、１ケ月に数回のアンモニアテストを行う。

しかし、このテストの要請の間の間隔の長さのために、
比較的安定な試薬を有する必要性がある。実施例３のジ
ヌクレオチド溶液は、ｐＨ８，５のトリス・バッファー
中のＩＯＵ／ｍｊグルタメートデヒドロゲナーゼ及び０
．５■／　ｗｉ、　ｌアルファケトグルタレートを含む
アンモニアのない溶液と１：　８０で混合され、そして
血清中のアンモニア量を測定するのに容易に用いられる
。この溶液は、混合されないとき少なくとも約１年以内
安定である。混合されたときそれは少なくとも１ケ月安
定である。

実施例　７ ＢＵＮは、本明細書において文献として引用される米国
特許第４．４９５．２９１号明細書の主題であるラジエ
ティブ・アテヌエーシアン・アッセイ　（Ｒａｄｉ−ａ
ｔｉｖｅ　Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ　Ａｓ５ａｙ）にお
ける試薬の使用により螢光分析的に測定される。このア
ッセイにおいて、試薬は９個の瓶に分けられろ。試薬は
以下のものから処理される。瓶＃１は、ＮＡＤＨ溶液を
含み、瓶＃２は、ｐＨ７のホスフェート・バッファー中
の１６００　Ｕ／’ｍｌウレアーゼ、１６ＩＲｇ／１ｍ
ｌアルファケトグルタレート及び４００Ｕ／ｍ＃グルタ
メートデヒドロゲナーゼ並びに２５％グリセロール並び
に５　Ｘ　１０−’■／ｌナトリウムフルオレセインを
含み、瓶＃３は、メトラブル−０，５＋ｇ／ｍｌｌ′、
　１０　＠／ｖａｌチアゾイルブルー及びシトレート・
バッファーｐＨ２，５を含む。

瓶１及び２がｐＨ７，５の１００ホスフエート・バッフ
ァーと１：　　１：　４０で混合されろとき、血液サン
プルは加水分解され、生成したアンモニアは、ＮＡＤＨ
における付随した損失とともに、グルタメートに還元的
に同化されろ。第二の反応において、残ったＮＡＤＨは
前記バッファーとの１：４０希釈で瓶＃３と反応して、
触媒的にＭＴＴ−ホルマザンを形成する。生成するＭＴ
Ｔ−ホルマザンの量は、元のサンプルのＢＵＮの量と比
例する。

この試薬系は、概して臨床サンプルと６％以下のＣｖを
生ずる。瓶１，２及び３の組合わせは、少なくとも！ｆ
９１年間サンプル中のＢＵＮを検出するのに用いられる
。

実施例　８ アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）は、又実施例３
のジヌクレオチド溶液、５００ｍＭＬ−アラニン、１５
ｍＭアルファケトゲタレート、０．１ｍＭピリドキサー
ル−５−ホスフェート（任Ｑ）、６００Ｕ／ｌラクテー
トデヒドロゲナーゼを用いて測定されろ。この混合物は
、組合わさったとき少なくとも１ケ月安定でありそして
血清又（よ血漿中のＡＩ、Ｔを定量的に測定するのに用
いられる。

実施例　９ アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が
、２４０ｍＭＬ−アスパルテート、１２ｍＭアルファケ
トグルタレート、０．１０＋＋＋Ｍピリドキサール−５
〜ホスフエート、４２０Ｕ／ｌマレートデヒドロゲナー
ゼ、６００Ｕ／ｌラクテートデヒドロゲナーゼと組合わ
された実施例３のジヌクレオチド溶液を用いろことによ
り測定される。この混合物は、少なくとも１ケ月安定で
あり、そして血清又は血漿中のＡＳＴを定量的に測定す
るのに用いられる。

実施例　１０ 実施例３のジヌクレオチド溶液においてＮＡＤＨはＮＡ
ＤＰ）ｒにより置換される。診断テスト中の成る酵素は
ＮＡＤＩ（の代わりにＮＡＤＰＨを利用する。プロテウ
ス（１’ｒｏｔｅｕｓ）菌から精製されたグルクメート
デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨのみを利用する。この
酵素；よ、ＢＵＮの測定のために、実施例２のグルタメ
ートデヒドロゲナーゼ酵素を置換するのに用いられる。

本発明は好ましい態様について記述されたが、本発明の
改変及び改善は当業者に生ずることは理解される。例え
ば、本発明は主としてＮＡＤ）Ｉの安定化された溶液に
よセ例示されたが、他のジヌクレオチドの溶液は本発明
により安定化される。

例えば、ＮＡＤＰ）（、還元された３−アセチルピリジ
ンアデニンジヌクレオチド、還元された３−１セチルピ
リジンアデニンジヌクレオチドホスフエート、還元され
たチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元さ
れたチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフ
ェート、還元されたニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドも又は本発明により安定化されることが考え
られる。

同様に、ビシン・バッファーが上述の実施例で用いられ
たが、好ましいｐＨ範囲内にジヌクレオチド溶液を保つ
のに充分なｐＫａ及びバッファー能力を有するすべての
バッファーが用いられることが考えられる。例えば、他
の適当なバッファーは次のものを含む。トリス［トリス
（ヒドロキシ−メチル）アミノメタン］；へペス（４−
（２−ヒドロキシルエチル）−１−ピペラジンエタンス
ルホン１０）］　ｉトリエタノールアミン、ＭＯＰＳ　
［４−モルホリンプロパン−スルホンｙｌ］；　ＣＨＥ
Ｓ　［２−（シクロへキシルアミノ）エタンスルホン酸
］；及びＣＡＰＳ　［３−シクロヘキシルアミノ−１−
プロパンスルホン酸］。

本発明による補酵素組成物が有用である他のアッセイは
、ラクティックデヒドロゲナーゼピルペート対ラクテー
ト［即ちＬＤＨ（Ｐ対し）］及び尿酸を含むアッセイを
含む。

さらに、水と混和しうる他の安定な有機溶媒が、それら
が水素結合による以外で還元されたジヌクレオチドと反
応しない限り、プロピレングリコールの代わりに本発明
で用いられることが考えられる。２〜４個のヒドロキシ
ル基及び２〜１０個の炭素原子を有する液体ポリオール
が好ましい。これらの好ましいポリオールは、グリセロ
ール及び１．２−プロパンジオールを含む。

本発明による補酵素組成物が、濃縮された形で製造され
そして使用に当たって希釈される乙とも考慮に入れろべ
きである。

それ故、本発明は特許請求の範囲に記載された発明の範
囲に入るすべての変化を含むことを目的とする。

【図面の簡単な説明】

第１図は、種々のｐＨ値における、未混入のプロピレン
グリコールのＮＡＤＨの安定性と金属混入プロピレング
リコール中のＮ　Ａ　Ｄ　Ｈの安定性の比較のグラフで
ある。 第２図は、種々の精製工程をうけｔこプロピレングリコ
ール溶液中のＮＡＤＨの安定性のグラフである。 第３図は、種々のｐＨ値における、純粋なプロピレング
リコール中のＮＡＤＨの安定性と５０％ｖ／ｖプロピレ
ングリコール／水中の安定性との比較のグラフである。 第４図は、本発明による安定化されたジヌクレオチド溶
液に関する最適ｐＨの結果を示すグラフである。 特許出願人　　アボット　ラボラトリーズ同　　　　弁
理士　　川　瀬　良　治 −１擾′ Ｆｉｇ、　３ Ｆｉｇ、４

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）塩基性の水溶液； 該水溶液中の第一の濃度の還元されたジヌクレオチド； 該水溶液中のポリヒドロキシルアルキル溶媒；及び該水
   溶液中の第二の濃度のボレートシス−ヒドロキシル結合
   化合物（前記の第二の濃度は前記の第一の濃度にほぼ等
   しいか又はそれより高い）よりなる安定化補酵素組成物
   。
2. （２）該ポリヒドロキシルアルキル溶媒が該水溶液の約
   ２０％ｖ／ｖ〜約９０％ｖ／ｖの範囲内の濃度である特
   許請求の範囲第１項記載の補酵素組成物。
3. （３）該水溶液が８．０より大きいｐＨに該水溶液を保
   つのに有効なバッファーよりなる特許請求の範囲第２項
   記載の補酵素組成物。
4. （４）該ボレートシス−ヒドロキシル結合化合物が、ほ
   う酸；ほう酸の塩；ほう酸のボレート誘導体；及びほう
   酸のボレート誘導体の塩よりなる群から選ばれる特許請
   求の範囲第３項記載の補酵素組成物。
5. （５）該ポリヒドロキシルアルキル溶媒がプロピレング
   リコールである特許請求の範囲第４項記載の組成物。
6. （６）該水溶液の該ｐＨが約８と約１１との間である特
   許請求の範囲第５項記載の組成物。
7. （７）前記の第二の濃度が約１０ｍＭと約５０ｍＭとの
   間である特許請求の範囲第６項記載の組成物。
8. （８）該ポリヒドロキシルアルキル溶媒の該濃度が該水
   溶液の５０％ｖ／ｖにほぼ等しい特許請求の範囲第７項
   記載の組成物。
9. （９）前記の還元されたジヌクレオチドが、還元された
   ピリジンジヌクレオチド及び還元されたピリジンジヌク
   レオチドホスフエートよりなる群から選ばれる特許請求
   の範囲第８項記載の補酵素組成物。
10. （１０）前記の還元されたジヌクレオチドがＮＡＤＨで
    ありそして前記の第一の濃度が約０．００１ｍＭ〜約５
    ０ｍＭの範囲内である特許請求の範囲第９項記載の補酵
    素組成物。
11. （１１）第一の濃度の還元されたジヌクレオチドを塩基
    性水溶液に溶解し； この水溶液をｐＨ約８．０と約１１．０との間に緩衝し
    ； 第一の濃度にほぼ等しいか又はそれより高い第二の濃度
    で還元されたジヌクレオチドをボレートシス−ヒドロキ
    シル結合化合物と接触させ；そして この水溶液をポリヒドロキシルアルキル溶媒中約２０％
    ｖ／ｖ〜約９０％ｖ／ｖへすることにより、還元された
    ジヌクレオチドの水との接触を低下させる工程よりなる
    還元されたジヌクレオチドの溶液を安定化する方法。