JPS62194458A - 免疫学的測定法とその測定法に用いる免疫学的測定器具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫学的測定方法とその測定方法に使用する
測定器具に関する。

し従来の技術１ 第一抗体または第二抗体をガラス等の微粉末に固相化し
て用いる酵素免疫測定法等の測定系では、８７Ｆ分離に
遠心操作が必要なため１本ずつの試験管を用いて測定操
作を行わなければならず、マイクロタイタープレートの
ような９６穴（ウェル）が１つのプレート面についてい
るような場合には使用ができず、そのため大量処理には
むいていなかった。また、プレートを用いる場合は、不
溶化抗体及び第二抗体を用いることが出来ないため、抗
体または第二抗体をそのままプレートのウェルに吸着固
定化しなければならない。しかし、この吸着を一定に行
うには、その条件設定・大組作成がむずかしく、また測
定時の洗浄も手間がかかるという難点がある。

［発明が解決しようとする問題点コ ブレートによる測定法は、その酵素反応生成物の測定の
迅速性から、大量の検体処理には向いているが、その抗
体または第二抗体の吸着固定化が煩雑である。また、抗
体のガラス等の微粉末への固相化は大量作成が容易であ
るが、プレートでは使用が不ｐＪ能なため、手間のかか
る試験管での使用しかできない。そのため、本発明はプ
レートの各ウェルに蛋白を吸着しない濾過材を固定し、
その上または中に不溶化第−抗体または第二抗体の重層
または吸着固定を容易することであり、その目的は酵素
免疫測定法等によく迅速簡便かつ大量検体の処理方法を
提供することにある。

Ｌ問題点を解決するための手段］ 」−配回的を達成するため、本発明の第１は、マイクロ
タイタープレート形の器具にお【ノる各ウェルの底部を
開［」さぜ、該開口部に蛋白を吸着しない濾過材を固定
した免疫学的測定用器具を用い、この濾過材を利用して
Ｂ／１：分離を行うことを特徴とするものであり、また
第２番目の発明は上記マイクロタイター形容器において
、各ウェルにあけた開Ｌ］部に蛋白を吸着しない濾過材
を固定してなることを特徴する免疫学的測定用器具に係
るものである。

更に詳しく述べると、本発明では濾過材上の被検液に標
識抗体及び担体に結合又は吸着させて調製した不溶化抗
体を加えて、イキュベートした後、反応液を濾過材を介
して底面より吸引除去し、更に洗浄を行って得られた濾
過残渣中の標識物質の量を測定することを基本とする。

また、本発明に反応液中の不溶化抗体を前記濾過材にて
吸着固定することに限らず、濾過材上に予め担体に結合
又は吸着させて調製した不溶化抗体を重層しておくこと
もできる。その場合には、担体と濾過材の重層部の上に
被検液と標識抗原または標識抗体との混合物を加えて、
抗原−抗体反応を行なわせた後、反応液を濾過材を介し
て底面より吸収除去し、更に洗浄を行って、得られた濾
過残渣中の標識物質の量を測定するものである。

また、標識物質としては、酵素、補酵素、蛍光性物質、
発光性物質、放射性物質から成る群より選択されたもの
が用いられる。

ウェル底に装着する濾過材は、孔径０，０１〜２．０μ
糟のテフロン、ポリごニリデンフルオライド製などのメ
ンブレンや粒径０．４μｍ以上の微粒子を通さないガラ
ス濾過器であり、通常は溶液を通さないが、底部から減
圧吸引することにより浸透性となり溶液を通すものであ
る。一方、この濾過材は不溶化第−抗体および第二抗体
は微粉子のため、この濾過材に対する透過性はない。反
応液のＢ／Ｆ分離は穴底部から溶液部分を減圧吸引する
ことにより容易に可能となる。また同様に、Ｂ／Ｆ分離
後の洗浄も、洗浄液の減圧吸引により行われる。これら
の操作は、９６ウエルを一度に行える装置を用いること
により、迅速簡便かつ大量検体を処理することが可能と
なる。

次に図面に基づいて本発明の免疫学的測定器具を具体的
に説明する。第４図は測定器具の１例を示すもので、透
明シラスチック製プレート１に多数（例えば９６ケ）の
ウェル２を形成させると共に、各ウェルの底に開口部３
を設ける。開口部３の下面は、例えば孔径０．０１〜２
．０μｍをもつメンブレンまたはそのような濾過材４を
貼着しておくものである。このメンブレンなどの濾過材
４は、ウェル１内の反応液が常圧ではもれず、下面の減
圧吸引により蛋白を吸着せずに濾過させるものである。

図中５は、膜、紙などの裏面保持材であるが、使用状況
によって省略することもぐきる。なお、図示を省略した
が、担体を用いる場合は、セファロース、ガラス粉末、
ポリスチレンラテックスなどを各ウェルの底に予め装着
しておくものである。

次に本発明測定法を更に詳細に説明する。なお、本発明
は下記実施例に限定されるものではない。

［実施例１ 実施例１：不溶化抗体を用いた血清中ＴＳＨ（甲状腺刺
激ホルモン）の酵素免疫測定法 （１）蛋白非吸着型メンブレンマイクロタイタープレー
ト（以下メンブレンプレートの略）の作製マイクロタイ
タープレートの底面を蛋白非吸着性のメンブレンフィル
ター（ｏ、ｏｉ〜２．０μｍ）で固定することで作製し
た。

（２）抗ＴＳＩ−１不溶化抗体液の作製抗ＴＳＨ山羊又
は家兎自消を０［Ａ［セルロースによりガンマ−グロブ
リンに精製し、この１１０ｌ１１をＣＮＢｒＮＢｒへイ
テッド・セファ０−ス４Ｂ　ｉｇ（３，５１１１りとカ
ップリングさせ、０．１％８８＾　（子ウシ胎児血清）
を含む０．０５８リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）と１：１
００の比率で混合し稀釈して抗ＴＳＩ−１不溶化抗体液
とした。なお、この場合に、セファロース４Ｂに代えて
ガラス微粉末を用いてもよい。

（３）酵素標識抗体液の作製 抗ＴＳＨ家兎血清をＤＥＡＥセルロースによりガンマ−
グロブリンに精製し、この１０ｎ＋ｇをフェニレンダイ
マレイミド０．７５Ｉｌｌ〜１ｍｌでもってβ−り一ガ
ラクシダーゼ１００μｇと１昼夜結合反応させる。

この反応液を、０．１Ｘ　ＢＳＡ、０．ＩＨＮａＣ１，
１１１８ＭＣＩＣＩ２を含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（
＄１１４７．５　）で膨潤したセファロース４Ｂカラム
（１，５ｘ４０ｃｍ＞に付置し、同一緩衝液で溶出して
溶出液を１１ずつ分取した。

得られた抗体と酵素の結合分画５１を、溶出緩衝液で１
：１００の比率で混合し稀釈して、酵素標識抗体液とし
た。

（４）血清中ＴＳＨ濃度の測定 メンブレンプレートの各穴に、標準ＴＳＨ溶液＝　９− または検体血清を２０μｍがずつ分注する。次いで各穴
に杭ＴＳＨ不溶化抗体液と酵素標識抗体液をそれぞれ１
００μｍずつ加え、室温で一昼夜反応させたのち、反応
液をメンブレンプレート底部より減圧吸引装置を用いて
９６穴同時に吸引除去する。

次いでｒ’ＢＳ　（リン酸緩衝液）を各穴に２００μｍ
ずつ加え同様に吸引除去して洗浄を行なう。この洗浄操
作を３回続けて行う。次いで、０．００２％の４−メチ
ルウンベリフェリルガラクトピラノシドを各穴に２００
μｍずつ加え、３１℃で４５分間インクベートしたのち
、０．１Ｎグリシン−水酸化ナトリウム１５０μｍを加
え酵素反応を停止する。これらの反応終了液を、通常の
マイクロタイタープレートに移しかえ、プレート用蛍光
光度測定器を用いて、励起波長３６５　ｎｍ、測定波長
４ｂＯｎｌで蛍光強度を測定し、第１図の標準曲線を得
、各検体の蛍光強度によりその検体測定値を読みだした
。

＊本実施例１は、検体を血液濾紙４縮ディスクとするこ
とで、新生児甲状腺機能異常の発見に用いられるフレチ
ンＴ　Ｓ　Ｈマススクリーニング検査にも使用できる。

実施例２：不溶化第二抗体を用いた血清中インシュリン
の酵素免疫測定法 （１）蛋白非吸着型メンブレンマイクロタイタープレー
トの作製 実施例１の（１）と全く同様にして作製した。

（２不溶化第二抗体液の作製 ガラス微粉末を２％アミノプロピルトリエトキシシラン
−アセトン溶液に４５℃１昼夜浸したのち、アセトンで
洗浄乾燥する。次いで１％ゲルタールアルデヒド溶液に
室温１時間浸し、０．２５８リン酸緩衝液（ｐＨ７，５
）でよく洗浄する。このガラス微粉末を、抗モルモット
ガンマーグロブリン山羊血清の１：１００に上記緩衝液
で稀釈した液に４℃で１昼夜浸し、洗浄後、０．１％Ｂ
Ｓ＾、０．ＩＨＮａｃｌ、１ｍＨＨＯＣ１７を含む、０
．０５８リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で１＝１００（容
量比）に稀釈したものを不溶化第二抗体液とした。

（３）　　インシュリン抗体液の作製 波インシュリン・モルモット血清を（１）の緩衝液とｌ
　：　　１００，０００の比率で混合し稀釈してインシ
ュリン抗体液とした。

（４）　　酵素標識インシュリン液の作製パーオキシダ
ーゼ５ｍｏを０．３８炭酸水素すトリウム液１．０１に
溶解し、１％ジニトロフＩ］ロベンゼンーエタノール溶
液０．１ｍｌを加え混和し、さらに０．０５８過ヨウ素
酸ナトリウム液１．０ｍｌを加え、室温３０分間撹拌の
後、０．２Ｈ工チレングリコール液１０ｍ１を加えた後
、０．０１８炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）で−
昼夜透析する。この溶液に、インシュリン３５０μ０を
加え、室温で３時間撹拌の後、水酸化ナトリウムホウ素
ナトリウム３ｍｇ加え４℃で一昼夜放置する。この反応
液を、０．０５８リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で膨潤し
たＢｉｏ　−Ｇｅｌ　Ｐ６０カラム（ｉ　Ｘ　３０Ｃｍ
）に付置し、同一緩衝液で溶出して溶出液を１ｍｌずつ
分取し７ｊ、得られたインシュリンと酵素の結合分画５
１を、０．１％ＢＳ＾、０．ＩＨＮａＣ１１１１１８Ｍ
ＯＣＩ＋！を含む０．０５８リン酸緩衝液（ｐｌ＋７．
５１で１　：　　ｉ、ｏｏｏの比率で混合稀釈して、酵
素標識インシュリン液とした。

（５）血清中インシュリン濃度の測定 メンブレンプレートの各穴に、インシュリン標準液また
は検体血清を２０μｍずつ分注する。次いで、各穴に酵
素標識インシュリン液とインシュリン抗体液を５０μｍ
ずつ加え一昼夜インキユベートする。次いで不溶化第二
抗体液を１００μｍずつ加え、３時間インキュベートし
た後、反応液をメンブレンプレート底部より減圧吸引装
置を用いて９６穴同時に吸引除去する。次いでＰＢＳを
各、穴に２００μｍずつ加え同様に吸引除去して洗浄を
行う。

この洗浄操作を３回続けて行う。次いで、０．５％チラ
ミン、０．０３％過酸化水素を含む水溶液を１００μｍ
ずつ加え室温で６０分間インキュベートの後、０．６Ｘ
　ＫＣＮ、０．２５Ｎ　ＮａＯＨを含む水溶液２００μ
＋を加え酵素反応を停止する。これらの反応終了液を、
通常のマイクロタイタープレートに移しかえ、プレート
用蛍光光度測定器を用いて、励起波長３２０ｎｉ、測定
波長４０５ｎｉで蛍光強度を測定し、第２図の標準曲線
を得、各検体の蛍光強度によりその検体測定値を読みだ
した。

　１３　一 実施例３．不溶化第二抗体を用いた血清中ＡＦＰ（胎児
性蛋白質）のラジオイムノアッ セイ （１）蛋白非吸着型メンブレンマイクロタイタープレー
トの作製 実施例１の（１）と全く同様にして作製した。

＋２）　　　　ｌ−標識ＡＦＰ液の作製ＡＦＰ１００μ
Ｑを０．５８リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）５０μｍに溶
解し、Ｈａ１２５１１　ｍｃｉとり［１ラミンＴ法によ
り反応させ、得られた　　Ｉ−標識ＡＦＰを０，１％Ｂ
ＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐｌ＋８．０）で約２５０．
０ＯＣｐＨｌ／ｍｌに稀釈し　　Ｉ−標１１ＡＦＰ液と
した。

Ｇ）ＡＦＰ抗体液の作製 抗ＡＦＰ家兎（１）の緩衝液と１　：　　１００，００
０の比率で混合し稀釈してＡＦＰ抗体液とした。

（４）不溶化第二抗体液の作製 抗家兎ガンマーグロブリン山羊血清を叶ＡＥセルロース
によりガンマ−グロブリンに精製し、この１００ｍｇを
ＣＮＢｒＮＢｒへイテッド・セファロース４Ｂ　ｌａと
カップリングさせ、（１）の緩衝液と１：１００の比率
で混合し稀釈して不溶化第二抗体液とした。

（５）　　血清ＡＦＰ濃瓜の測定 メンブレンプレートの各穴に、標準ＡＦＰ溶液または検
体血清を２０μｍずつ分注する。次いで各穴に　　ｌ−
標識ＡＦＰ液とＡＦＰ抗体液をそれぞれ５０μｍずつ加
え、室温で一昼夜インキ１ベートする。次いで、不溶化
第二抗体液を１００μｍずつ加え、３時間インキュベー
トした後、反応液をメンブレンプレート底部より減圧吸
引装置を用いて９６穴同時に吸引除去する。次いでＰＢ
Ｓを各穴に２００μｍずつ加え同様に吸引除去して洗浄
を行う。この洗浄装置を２回続けて行った後、再度Ｐ８
８を３００μｍ加え、このうち２５０μｍを試験管に移
しかえ、溶液の放射能量をガンマ−シンデレージョンカ
ウンターで計測する。これにより、第３図の８５準曲線
を得、各検体の放射能量により、その検体測定値を読み
だした。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明測定法によるＴＳｌ−＋標
準曲線およびインシュリン標準曲線、第３図はＡＦＰ標
準曲線、第４図は免疫学的測定器具の断面図である。 １・・・プレート、２・・・ウェル、３・・・開口部、
４・・・濾過材、５・・・躾、紙などの裏面保持材。 出　　願　　人　　　藤　　村　　　有　　信代　　理
　　人　　　芦　　１）　直　　衛刺駅麺紹 親厭顯側

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　マイクロタイタープレート形の器具における各ウェ
   ルの底部を開口させ、該開口部に蛋白を吸着しない濾過
   材を固定した免疫学的測定用器具を用い、この濾過材を
   利用してＢ／Ｆ分離を行うことを特徴とする免疫学的測
   定法。 ２　濾過材が、孔径０．０１〜２．０μｍのメンブレン
   フィルターである特許請求の範囲第１項記載の免疫学的
   測定法。 ３　濾過材が、粒径０．４μｍ以上の微粒子を通さない
   ガラス濾過器である特許請求の範囲第１項記載の疫学的
   測定法。 ４　濾過材は、それ自体抗体を結合していることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項ないし第３項の何れかの項
   に記載の免疫学的測定法。 ５　濾過材の上または中に予め担体に結合又は吸着させ
   て調製した不溶化抗体を重層しておき、その上に被検液
   と標識抗原との混合物を加えて、抗原−抗体反応を行な
   わせた後、反応液を濾過材を介して底面より吸収除去し
   、更に洗浄を行って得られた濾過残渣中の標識物質の量
   を測定することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載の免疫学的測定法。 ６　濾過材上の被検液に標識抗体及び担体に結合又は吸
   着させて調製した不溶化抗体を加えてインキュベートし
   た後、反応液を濾過材を介して底面より吸引除去し、更
   に洗浄を行って得られた濾過残渣中の標識物質の量を測
   定することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   免疫学的測定法。 ７　濾過材の上または中に予め担体に結合又は吸着させ
   て調製した不溶化抗体を重層しておき、その上に被検液
   と標識抗体を加えてインキュベートした後、反応液を濾
   過材を介して底面より吸引除去し、更に洗浄を行って得
   られた濾過残査中の標識物質の量を測定することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の免疫学的測定法。 ８　担体がセファロース、ガラス粉末、ポリスチレンラ
   テックスからなる群より選択されることを特徴とする特
   許請求の範囲第５項ないし第７項の何れかの項に記載の
   免疫学的測定法。 ９　標識物質が、酵素、補酵素、蛍光性物質、発光性物
   質、放射性物質から成る群より選択されることを特徴と
   する特許請求の範囲第５項ないし第７項の何れかの項に
   記載の免疫学的測定法。 １０　マイクロタイター形の容器において、各ウェルの
   底部に液体が容易に通過しうる開口部を設け、該開口部
   に蛋白を吸着しない濾過材を固定してなることを特徴と
   する免疫学的測定器具。 １１　濾過材の上または中に、更に担体に結合又は吸着
   させて調整した不溶化抗体又は不溶化抗原を重層して成
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１０項に記載の免
   疫学的測定器具。