JPS62171698A - テストステロンの免疫学的測定方法および試薬、モノクロナ−ル抗体およびその製造方法、ハイブリド−マ細胞系統 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明に、テストステロンの免疫的測定方法および試薬
、モノクロ匁叛体およびその製造方法、およびバイブＩ
Ｊ　Ｆ−マ細胞系統に関する。

従来の技術 テストステロンの測定は、診断法において重要性が増大
している。男性の場合には、内分泌的畢丸機能の障害全
診断するためにテストステロンを測定する。女性におい
ては、卵巣または副腎のアンドロデン形成の増大を証拠
型てる症候のある場合にテストステロンの測定を行う。

テストステロンは極めて重要なアンドロゲンである。す
べてのアンドロゲンの構造的特徴９工、Ｃ１９のステロ
イド骨格である。人体におけるテストステロンの合Ｆｆ
ｔニ脳下垂体に工って９４節される。脳下垂体のゴナド
トロピンＬＩ（（ＬＨ＝黄体黄体水底ホルモンライジツ
ヒ細胞においてテストステロンの合成を刺戟し、このテ
ストステロンがさらに負のフィードバック機Ｗｔ−介し
てゴナドトロピンの分泌を調節する。−日につき男性の
場合にはテストステロン約７．２＋＋ｖ。

女性の場合にを工約０．２〜が虫取される。

テストステロンの機能は、生前および生後の発育の間の
男性生殖器の形成お工び思春期の第二次性徴の形故にあ
る。成人男性の身体では、精子の成熟、就中生殖器官の
補助線（前立腺、精腺）の活動にとって、連続的に起こ
るホルモン生皮が重要である。テストステロンは物質代
謝で同化作用を有する。テストステロンは作用部位で還
元されて５α−ジヒドロ−テストステロン（ＤＨＴ　）
になる。これは、５倍宣いＤＨＴの活性によって少なく
とも前立腺に関しては固有の作用形式であると考えられ
る。

血漿中のテストステロンの生理学的一度は、通常法の範
囲（ｎｇ／ｄ血漿）Ｋある：男性：思春期前　　　　　
　０．２〜０．８α人く４０才　　　　４〜１２ 成人＞４１１才　　　　６〜８ 女性：思春期前　　　　　　０．１〜０．５取入　　　
　　　　　０．２〜０．８ 低血漿値は、男性の場合例えばアンドロケ１ン欠落症状
〔例えばひげ発生の減少、前立腺アトロフィー（Ｐｒｏ
ｓｔａｔａ　ａｄｒｏｐｈｉｅ　）等〕＼翠丸アトロフ
ィー（Ｈｏｄｅｎａｄｒｏｐｈｉｅ）および発育不全症
（脳下垂体−視床下部領域における病的機転に関連）、
男子更年期リビドーおよび性交能力の喪失、生殖不能、
晩発思春期、発育障害、潜伏華丸、畢丸機能低下を伴う
先天性症候群、クリネフエルテル症候群の際に見出され
る。早発思春期の場合には、例えばまれなライゾツヒ細
胞の腫瘍に基いて高められたテストステロン値が測定さ
れる。−次生殖腺機能減退（器質的損傷に基く畢丸機能
障害）と二次生殖腺機能減退（脳下垂体の機能不全）１
−区別するためには、低下されたテストステロン値でさ
らにＬＨの測定が行われる。

女性の場合には、昼テストステロン値は多毛早熟症、副
腎生殖器症候群、スタイン・レベンタール症候群、卵巣
または副腎皮質のアンドロデン形成腫瘍、例えばクツシ
ング症候群の場合の二りな副腎皮質増殖の際に測定され
る。またエストロデン治療の後、妊娠の間および甲状腺
機能増進の際にもテストステロン濃度は高められている
。

過度のアルコール、ストレス、激しい作？の際や若干の
薬剤の場合には、血漿中のテストステロン濃度は低下し
ている。

テストステロンの測定の場合には、就中、抗原としての
テストステロンを同抗原に対して適合する抗体を用いて
測定することから成る免疫学的試験法が適している。こ
の工うな免疫学的測定方法の場合には、テストステロン
にできるだけ特異的に適合する抗体が必要である。特に
女性の血清中のテストステロンの測定は、高特異性抗血
清の使用を必要とする、それというのもこの場合アンド
ロダン物質代謝の化合物は、テストステロンの濃度と匹
敵しつるかまたはこの濃度を越えさえしている濃度で存
在するからである。男性の場合にはテストステロンの測
定に関する濃度関係は少し有利になる。この場合にはア
ンドロデン物質代謝の化合物は、大体テストステロンの
濃度を下回るオーダーの濃度で代表されている。

しかしテストステロンに対する十分に高い特異性を有す
る抗体の製造は著しい困難を伴っている。それというの
も類似のステロイドの構造的差異が小さいた°めに他の
ステロイドに対する可取り高い交差反応性が認められる
からである。

特にテストステロンと分解生成物ＤＨＴとの間の構造的
差異が小さいために、テストステロンにとって特異的で
あって、ＤＨＴに対する交差反応の弱い抗血清の製造は
権めて大きな難題を提供する／　［Ｋ、リューデケ（Ｌ
ｕｂｋｅ）等：イムノロヤイツシエ・テステ・フユール
・二一デルモレクラーレ・ビルクシュトツフエ（Ｉｍｏ
ｕｎｏｌｏｇｉｓ−ｃｈｅ　Ｔｅ５ｔｅ　ｆｕｒ　ｎｉ
ｅｄｅｒｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ　Ｗｉｒｋｓｔｏｆｆｅ
′）Ｘシュトットガルト在デオルク・チーズ・フエルラ
ーグ（Ｇｅｏｎｇ　Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ）、１
９７８、ｏｋｌｏｎａｌｅ　Ａｎｔｉｋｏｒｐｅｒ　）
はすでに公知である〔Ｊ、Ｅｎｄｏｃ、１００　（１９
８４）、３６７〜３７６頁；Ｊ。

５ｔｅｒｏｉｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１９　（１９８
３）　、１６０５〜１６１０頁およびＪ、　５ｔｅｒｏ
ｉｄ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２２　（１９８５）、１６
９〜１７５頁参照〕。これらの抗体は公知法で得られる
。この際免疫原としてテストステロンと免疫原担体物質
とから成る複合体が得られ、この際テストステロンと免
疫原との間の結合は３位、１５位または１７位を介して
行われていモノクロＸ抗体はすべて、構造的に極めて類
似のステロイドホルモンとの交差反応性が極めて強く、
従ってテストステロンの選択的測定に関しては適当では
ない。

発明が解決しようとする問題点 本発明の課題に、テストステロンが他のステロイドホル
モンの存在でもそれを用いると特異的に検出されつる新
規の免疫学的方法および試薬に提供することであった。

間ｍｔ−解決するための手段 前記課題は、テストステロンに対して特異的に適合され
ておりかつ他のステロイドホルモンと５％以下が交差反
応する少なくとも１種のモナっヤ ノクロ覧抗体を使用することから成るテストステロンの
免疫学的測定方法お工びこのような測定に適した試薬に
よって解決される。

免疫学的測定方法としては、原則とし℃すべての従来の
免疫検定、例えば放射線免疫検定、酵素免疫検定、螢光
免疫検定等が適当である。

またすべての変法、例えば競争的免疫検定、ＪＥＭＡ法
等も使用することができる。標識のためにはその都度の
測定法で常用の薬剤が適当である。すなわち放射線免疫
検定の場合には、標識のために放射縁向位元素、例えば
”Ｉｋ使用する。酵素免疫検定の場合に４工、同検定に
普通使用されるすべての酵素、例えばペルオキシダーゼ
またはβ−ガラクトシダーゼが適当である。螢光免疫検
定の場合にはマーカーとして常用の螢光発生ｒ＃全使用
することができる。これらの種々の試験法および変法の
詳細に当業者には周知である。

テストステロンの測定のためには、競争的酵素免疫検定
またはＪＥＭＡ原理による方法が特に有利であると判明
した。競争的酵素免疫検定ステロンと競争する。試験法
はまた、被測定テストステロンと担体固定テストステロ
ントカ標識モノクロン抗体の欠けている結合部位に関し
は、モノクロ覧抗体を非標識で使用するようにも変えて
よい。担体固定テストステロンに結合された抗体量は、
抗体のＦｃ部分に対応する標識抗体と一緒に恒温保持し
かつ結合された標識部分を測定することに工って確定す
る。ＪＥＭ加える。テストステロンに結合されなかった
過剰の標識抗体は、ハプテン担体マトリックスを用いて
溶液から除去する。この試験法の種々の変法およびこれ
らの変法全実施するための詳細を工文献に詳記されてい
る。

不発明の本質は、このような免疫学的方法に関して、テ
ストステロンに対して特異的に適合意外にも成功した点
にある。

従ってまた他のステロイドホルモンとの交差に（工、先
づテストステロン全免疫担体物質と結合させる。免疫担
体物質としては、通常この目的のために使用されるすべ
ての物質、例えばウシ血清アルブミンのようなアルブミ
ン、エデスチン等が適当である。テストステロンと担体
物質との結合は、自体公知の方法にエフ行われる。

次に実験動物、例えばマウスを、免疫複合体を用いて免
疫化する。免疫化するためには、免疫原を例えばアジュ
バントと組合せて常法で投与する。アジュバントとして
は好ましくは水酸化アルミニウムをボルデテラ・ペルッ
シュ（Ｂｏｒ−ｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｉｓ）ま
たはフロイア　ｐ　（Ｆｒｅｕｎｄ）のアジュバントと
一緒に使用する。免疫化は好ましくは数カ月に亘って４
〜６週の間隔で少なくとも４回の免疫化で行う（腹腔的
注射）。

この工うに免疫化された動物から、永久骨髄肺細胞系統
と融合されるＢ　＋　ＩＪンパ球が得られる。融合は、
ケーラー（Ｋ５ｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ）の公知法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
　２５３、１９７５．４９５〜４９７頁〕により行われ
る。この際形成される雑種細胞の一次培養物を、常法で
例えば商用細胞種の使用下にまたは１制限希釈（Ｉｉｍ
ｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）　１に：つてクロン培
養する。適当な試験法、例えば酵素免疫検定（ＥＬＩＳ
Ａ法）でテストステロンに対しては正反応しかつ他のス
テロイドホルモンとは負反応する、つまυ僅かしか反応
しない培養物をその都度引続き処理する。こうして、本
発明によるモノクロン抗体を生産する幾つかのハイブリ
ドーマ（Ｈｇｂｉｄｏｍａ）細胞系統が得られる。公知
法によりこれらの細胞系統を培養し抗体を単離する。

このようにして得られた細胞系統は例えば次のように記
載される： クロン９７　　（ｇｃＡｃｃ　８５１２１７０２　）ク
ロン１６０　　（ＥＣＡＣＣ８５１２１７０１）細胞系
統は寄託機関Ｅ　ＣＡ　ＣＣ（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ）でその都度の寄託番号下に寄託されている。

ナ−ν このようにして得られたモノクロ＼抗体は、テストステ
ロンに対する極めて高い親和性（１０−’〜１０−１０
１　／　ｍｏｌのオーダーの親和常数）を有し、５％以
下が構造的に類似の他のステロイドホルモンと交差反応
することによって優れている。特に、５α−ジヒドロテ
ストステロンに対しては５％以下の交差反応率ヲ有し、
アンドロステンジオンに対しては３％以下の交差反応性
および他のホルモンに対する交差反応率の測定のために
は、当業界公知の常法全利用する。

ば血清または血漿中でテストステロンを他のステロイｒ
ホルモンの存在で特異的に測定するた的特性を有する該
抗体の断片、例えばＦａｂ断片口鷲抗体」という概念は
、完全な抗体および断片を意味する。

次に実施例によシ本発明を詳述する。

の製造 テストステロン複合体によるマウスの免疫化＝８〜１２
週令のＢａ１ｂ／ｃマウスを、完全フロインドアジュバ
ント中のテストステロン−３−カルポキシメチロキシム
ーエデスチン（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２２２　（１９５７）、７１３〜７２７頁
より製造）１００ＰＩＩを用いて腹腔内的に先づ免疫化
した。

６遁後に引続き３回の免疫化を４週の間隔て実施した。

同時に、水酸化アルミニウムに吸着されたテストステロ
ン−６−カルポキシメチロキシムーエデスチン１００μ
ｆｌ　＋　ｒｋｅルテデラ・ペルツシュ（Ｂｏｒｔｅｂ
ｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｉｓ）　醒ｉ　Ｑ’　ｆ腹腔内
に投与した。融合の４日前および３日前に、テストステ
ロン−６−カルポキシメチロキシムーエデスチン１００
μＩおよび８０ｐＦｔＪ’Ｄいても３１回腹腔内および
静脈内的に免疫化した。

融合： 免疫マウスの屏風全、骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ　
　８３７５）Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８−６５３と１：５の割合
で混合し、遠心分離した（４°Ｃ１３００，９，１０分
）。これらの細胞金も５１回Ｂ　Ｓ　Ｓ　（Ｂａ１ａｎ
ｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ＝平衡塩溶液）緩
衝液で洗浄し、５０ゴの尖端管で４００９で遠心分離し
た。上澄みを捨て、細胞沈殿物上離解し、ＰＥＧ　［メ
ルク（Ｍｅｒｃｋ）社、Ｍ　Ｇ　４０００コｉ　ｍＡ！
　ｔ−、ヒペットで２ＪＯえた。１分径水浴中で、Ｆ　
Ｋ　８　［ｆａｔａｌｅｓ　Ｋ１１ｃｌｂｅｒ　ｓｅｒ
ｕｍ　＝胎牛血渭」なしにＲＰＭＩ　　１６４０媒体（
ＲＰＭＩ＝Ｒｏｓｅｗｅｌｌ　Ｐａｒｋｅｒ　Ｍｅｍｏ
ｒｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ）　５　ｔｒｔｌ’を室温で４
〜５分の間隔で滴ＤＯＬ、、混合し、媒体を入れて５０
ｄとし、次に４℃、４００９で１０分間遠心分離を行な
った。沈殿細胞をＲＰＭ　１１６４０媒体＋１０％ＦＫ
Ｓ中に取り、屏風細胞５Ｘ１０’〜ｌＸ１０’または腹
膜滲出細胞全倚飼料細胞°として加えた。

融合から７〜１０日後に多数のクロンが認められる。−
次培養物の上澄みを例２で記載するＥＬＩｓＡ法により
テストした。他のステロイドとの交差反応を僅かしか示
さない一次培養物ｆ　Ｆ　Ａ　ＣＳ　（Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｃｅ　ａｃｉｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌｓｏｒｔ
ｅｒ）に工って９６個の受は細胞培養板でクロン培養し
た。“飼料細胞Ｉとしては“受け（ｗｅｌｌ）　’ごと
ＫＩＸ１０’の腹膜滲出細胞または２Ｘ１０’の屏風細
胞を加えた。このようにして例えば２種類のハイプリド
ーマ細胞系統：ＥＣＡＣＣ８５１２７０２（＝クロン９
７）ＥＣＡＣＣ８５１２１７０１（＝クロン１６０）を
、単離することができた。前記細胞系統は寄託横開ＥＣ
ＡＣＣでそれぞれの寄託番号下で寄託されている。

腹水症の誘導： デリスｓ　ン（Ｐｒ１ｓｔａｎ　）　０．５　ａｔで前
処理した１〜２ｘのマウスに雑種細胞５Ｘ１０’を腹膜
的注入した。それから１〜３週間後に５〜２０ｍｙ／ｙ
ｄのＩｇＧ濃度を有する腹水症が得られた。

これから常法によシ抗体を単離することができに対して
特異的に適合しておりかつ他のステロイドとの交差反応
性は僅かしか示さない。該モおよびＭＡＫ１６０（クロ
ン１６ｏｙ＋）ら）と称する。

例２ テストステロンに対する抗体のスクリーニングテスト： 免疫化したマウスの血清中、雑種細胞の培養上澄み中ま
たは腹水症中のテストステロンに対する抗体の存在およ
び特異性を選別するために、テスト原理としてＥＬＩＳ
Ａ法を用いる：微量標定板に、３７°Ｃで１時間テスト
ステロン−６−カルビキシメチロキシムーＲ３Ａ１μＦ
ｌ／ｍｌ（被覆用緩衝剤＝炭酸ナトリウム／重炭酸ナト
リウム０．２　Ｍ、　ｐ）Ｉ　９−３〜９．５）を被覆
する。次に０．９多塩化ナトリウム溶液および１％アル
ブミン溶液で１０分間後処理する。次いで０．９％塩化
ナトリウム溶液で洗浄する。その後６７℃で１時間試料
１００μｔと共にｔｈ温保持し、再び０．９％塩化ナト
リウム溶液で洗浄する。他のステロイドに対する可能な
交差反応をテストするために、試料溶液に被検ステロイ
ド１００μｇ〜１μ、９／ｄＴｈ２７０える。他のステ
ロイドの存在での測定信号の低下が交差反応を示す。ヒ
ツゾーＦａｂ−アンチ（ａｎｔｉ）　−マウス−Ｆｃｒ
−ペルオキシダーゼ複合体４５０　ｍＵ　／ｒｔｒｌｋ
用いても３１回′亙温保持を行う（３７℃、１時間）。

０．９％塩化ナトリウムを用いる再洗浄段階後にペルオ
キシダーゼ活性全常法で測定する（例えばＡＢＴＳ’に
用いて、室温で６０分吸光度差Δｍｇ全４０５　ｎｍで
読み取る）。

例３ 他のステロイドとの交差反応の測定： 例２で記載したようにテストヲ実施する。交差反応全試
験すべき抗原（特定の５α−ジヒドロテストステロンお
よびアンドロステンジオンナーシ 中）をそれぞれ増大する濃度でモノクロ＼抗体にＩＩＯ
える。次に交差反応率全次式により計算する： Ｃ＝最大信号の５０％を得るために必要なＡＫ１６０に
関して得られた数値をまとめである。

ＭＡＫの　　　　　交差反応率釜 名　　称　　　５α−ジヒドロテストステロン　アンド
ロステンジオン例４ 酵素免疫検定によるテストステロンの測定：微量標定板
に、テストステロン−６−カルポキシメチロキシムーＲ
８Ａｌμｇ／ｒＬＩＪＭｆｆｉ緩ｍ剤（炭酸ナトリウム
／重炭酸ナトリウム０．２　Ｍ。

ｐＨ９，３〜９．５）全含有する溶液金、６７°Ｃで１
時間被覆する。０．９％塩化ナトリウム溶液および１％
アルブミン溶液で１０分間後処理する。

次に０，９％塩化ナトリウム溶液で洗浄する。その後試
料１　口ＯｐＬと一緒に３７℃で１時間恒溶液を、本発
明によるモノクロ鷺抗体ＭＡＫ　１６０に５ｐｇ／ｍｌ
の濃度で含有する同じ部の０゜９多塩化ナトリウム溶液
と一緒に室温で６０分間′亙温保持する。再び０．９％
塩化ナトリウム溶液で洗浄する。次にヒツジのＦａｂ−
アンチ−マウス−Ｆｃｒ−ペルオキシダーゼ複合体４５
０ｒｎＵ／ｍｌを共に３７°Ｃで１時間″亙温保持する
。

０．９％塩化す）　ＩＪウムによる再洗浄段階後に、Ａ
ＢＴＳと室温でＲ［１分反応させかつ吸光度差ΔｍＦ’
？４０５ｎｍで読取ることによってペルオキシダーゼ反
応を測定する。

検量線をつくるために、テストステロン全限定された種
々の濃度で含有する溶液を使用すムこのようにして得ら
れた検電線は第１図に図示しである。この検量線により
未知のテストステロン濃度を確定することができる。

【図面の簡単な説明】

図面はテストステロンの検量線図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、テストステロンに対して適合しておりかつ他のステ
   ロイドホルモンと５％以下が交差反応する少なくとも１
   種のモノクロナール抗体を使用するテストステロンの免
   疫学的測定方法。 ２、テストステロンに対して適合しておりかつ５α−ジ
   ヒドロテストステロンとは５％以下の交差反応し、アン
   ドロステンジオンとは３％以下が交差反応する少なくと
   も１種のモノクロナール抗体を使用する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３、テストステロンに対して適合しておりかつ他のステ
   ロイドホルモンと５％以下が交差反応することを特徴と
   する少なくとも１種のモノクロナール抗体を含有するテ
   ストステロンの測定試薬。 ４、テストステロンに対して適合しておりかつ５α−ジ
   ヒドロテストステロンと５％以下が交差反応し、アンド
   ロステンジオンと３％以下が交差反応する少なくとも１
   種のモノクロナール抗体を含有する特許請求の範囲第３
   項記載の試薬。 ５、他のステロイドホルモンと５％以下が交差反応する
   ことを特徴とするテストステロンに対するモノクロナー
   ル抗体。 ６、５α−ジヒドロテストステロンと５％以下が交差反
   応し、アンドロステンジオンと３％以下が交差反応する
   特許請求の範囲第５項記載の抗体。 ７、他のステロイドホルモンと５％以下が交差反応する
   テストステロンに対するモノクロナール抗体を製造する
   に当り、適当な動物をテストステロン−担体の複合体を
   用いて免疫化し、免疫化動物の脾臓からＢ−リンパ球を
   製出し、このものを骨髄腫細胞と融合し、形成されたハ
   イブリドーマ細胞をクロン培養し、テストステロンに対
   して適合された抗体を生産するクロンを選択し、同クロ
   ンによって形成される抗体を得ることを特徴とする前記
   モノクロナール抗体の製造方法。 ８、テストステロンに対して適合されていて、他のステ
   ロイドホルモンと５％以下が交差反応するモノクロナー
   ル抗体を生産することを特徴とするハイブリドーマ細胞
   系統。 ９、テストステロンに対して適合されていて、５α−ジ
   ヒドロテストステロンと５％以下が交差反応し、アンド
   ロステンジオンと３％以下が交差反応するモノクロナー
   ル抗体を生産する特許請求の範囲第８項記載の細胞系統
   。