JPS62171678A - 細胞培養方法及び培養器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞を培養させるための方法及び培養器に関す
るものである。さらに詳しくは、効率的に細胞の高＠度
培養を行うに適した中仝糸型細胞培養器に関するもので
ある。

〔従来技術〕

近年、動物細胞の産生する生理活性物・負、例えはイン
ターフェロン、ウロキナーゼ、モノクローナル抗体、リ
ンホカインなど付加価値の商い蛋白質やペプチド性の生
理活性物質を工菜的規模で得るために、動物細胞の大量
培養技術が１賛な開発テーマになっている。

これまでに動物細胞を培養する方法については抛々の′
：）ｊ法が知らｆている。実験呈的規模ではシャーレあ
るいは培養瓶などの方法がある。

一方、大量に細胞を培養する方法として原則的に細胞の
付着面積を増大せしめる方向でマイクロキャリヤー法や
中空糸型培＊ａを用いる方法などが開発されて来た。特
にＫｎａ　ｚ　ｅ　ｋらによる中空糸膜表面に細胞を付
着させ、中空糸の中空部に培養液をｍ１ｋしてＩＩｋ膜
を介して細胞に栄養成分を供給する方法（特開昭４９−
４１５７９号公報）は、効率的に細胞を培養できる方法
として注目された。さらに栄養分、老廃物、気体物質の
交換を効率よ（行うための改良法がいくつか提案されて
いる（％開昭５０−３６６８４号公報、Ｉ！＃開昭５１
−９８３８２号公報１％開昭５６−４２５８４号公報、
特開昭５９−１７５８７８号公報）。例えばｔ＃開昭５
６−４２５８４号公報では。

浮遊性細胞について、中空糸がシェルに横われ、該中空
糸の両端部がシェル外管に開口された細胞培養器におい
て、中空部分に培＊ｍ１に流しシェルと中空糸の間で培
養する方法が開示されている。また特開昭５９−１７５
８７８号公報では培養液中の成分は透過するが、細胞の
産生する所望の生産物は透過させない半透膜の片側に細
胞を閉じこめ、その反対側に培養液を連続的に供給する
方法が開示されている。

中空糸製培養器の利点は、中空糸のｍ農を介して細胞を
培養するので、細胞を為密度に培養できる点である。す
なわち、細胞を培養してその産生ずる生理活性物質を大
意に生産することを目的とした場合には、できるだけ細
胞な＾密度に培養することが装置の小型化が可能となり
。

また、政生物濃度を高め、ａ艮を容易ならしめるなどの
点で極めて有効な方法である。このためＫは、培養糸に
おいて絶えず細胞増殖に適した生理的環境に保つことが
８会とされ、そのためＫａ胞の増殖に必要な栄養成分の
補給と、−万で増殖の過程で産生される細胞増殖を阻害
する因子の除去を連続的に行うことが必要と考えられて
いる。この点で中空糸膜な介して細胞を培養する方法は
、高蜜度培養に適した条件を備えており、かつ攪拌培養
の場合はどの剪断力を受けない点で細胞の大量培養法と
して極めて有用な方法になり得るものと期待できる。

しかしながら、これまでの先行技術をもってしても細胞
の大量培液技術が十分に確立しているとは云い離いのが
現状である。

すなわち、中！糸の場合には、通常、ｍ胞を中空糸の片
側に静置して培養するため攪拌培養のように均一分散状
態をとりにくいこと、および栄養成分の供給、細胞の産
生する老廃物などの増殖比ＶＩ成分の除去が壁膜を通し
て透析あるいはＣ過の原理によって行なわれるため、ｍ
胞の膜との位置関係１例えば培養液の容器の人口と出口
、あるいは膜からの距離によって細胞の増殖するための
値小環境が異なり是細胞に対して均一な微小環境を維持
することが姐かしい。

こり偵小ｋＭ境を均一にするためにはできるだけ各中空
糸が均一に分散していることが望ましい。

一般に中空糸束を容器に固定する場合、どうしても中空
糸ど５しが長さ方向ＫＧつて密着することは避けられな
い。中空糸どうしが密着すると、例えば細胞を中空糸分
散間隙部で培ＩＪ１−ｆる場合、細胞の均一分散がさま
たげられる。かといって密着を防ぐために中を糸の数を
減らすと膜面積の減少をきたすＱ〕みでなく過大な中空
糸分散間隙を生ずる結果となりよくない。また、中空糸
中空部で細胞を培養する場合、中空糸の密着があると培
養液が中空糸の周りを均等に流れにく（なり細胞への栄
養分の分配が不均一になる。従来の方法では、細胞場慣
のための微小環境づくりが不十分なため細胞を高密度に
１例えば１ｘ　１０’　ｃａｌｌｓ　／ＩＬｔ以上に維
持培養するには不十分であり、中空茶屋培養器の利点が
十分圧活用されていないのが現状である。

〔発明の目的〕

かかる状況に鑑み、中空糸型細胞培養器の特性を活かし
、細胞に対してよりよい微小環境を提供して、効率的に
かつ高密度に増殖を図り、もって大量培養に寄与するこ
とを目的として鋭意研究を行ない本発明を完成するに散
った。

〔発明の構成〕

即ち本発明は、 細胞の場慣ｗＢ費な栄養分に対しては透過性を有するが
、細胞に対しては透過性を有しない壁膜を有する中空糸
分散束を用いる細胞培養方法において、該中空糸の大部
分に、その外周部において長手方向ＩＣ延長されたフィ
ンを有した異形中空糸を用い、該中空糸の壁膜で隔てら
れた２つの領域の片側で細胞を培養することを特徴とす
る細胞培養方法、及び 細胞の増殖に会費な栄養分圧対しては透過性を有するが
、ａ胞に対しては透過性を有しない壁膜を有する中空糸
分散束の両端が容器外部に開口するように隔壁により鋏
容器両端部に固定され、かつ該中空糸両端部で開口した
中空部に連通する導管と、該中空糸分散間隙部に連通す
る少なくとも２つの導管が付設されてなる細胞培養器に
おいて、該中空糸の大部分がその外周部におい【長手方
向に延長されたフィンを有した異形中空糸であり、Ｖ中
空糸の壁膜で隔てられた２つの領域の片側で細胞を培養
することを特徴とする中空糸ｆｊ１１Ｉ［ｌ胞培養器、
を提供するものである。

第１図に本発明に係る中空糸型細胞培養器の実施態様の
基本的構成を示す。多数本からなる中空糸ｌの分散束の
両末端が容器２の両端部の隔１１３ａ、３ｂに固定され
ている。さらに中９糸の両末端は該隔壁の外面に開口し
ていて端部室４ｍ＋４ｂに連通し、かつ端部導管５ａ＋
５ｂへつながる。また、中空糸分散間隙部６に連通する
少な（とも２つの導管７ａ＋７ｂが容器１に付設されて
いる。中空糸は細胞に必要な栄養分に対してをま透過性
を有するが、細胞に対しては透過性を有しない壁膜を有
しており、かつその外周部において長手方向圧延長され
たフィンを有した異形中空糸である７、細胞は中空分散
間隙部６に播種され、導管５ａ＋５ｂを通して中空糸中
空部に培養液が流される。または細胞は中空糸中空部に
播種さｔ、導管７ａ＋７ｂを通して中空糸分散間隙部に
培養液が流される。

本発明は、中空糸においてその外周部において長手方向
に延長されたフィンを有した異形中空糸を用いる点が大
きな特色となっている。このため、中空糸どうしの密着
を生ずることな（中空糸膜面全体を有効に機能させ、か
つ細胞増殖のための微小環境を均一化することができる
。

第２図に本発明に有用な異形中空糸の拡大断面の１例を
示す。フィンの数は少な（とも１条であるが１５条以上
になるとフィン根元部による有効膜面積の減少が顕著と
なり、培地供給性能が著しく低下するとともに有効な中
空糸分散間隙部が減少し実用的でない。一般にフィンの
数は１〜１４条が好ましく、更に好ましくは２〜ＩＯ条
であり、時に有効な範囲は３〜７条である。

本発明における異形中空糸のその他の形状。

寸法は％に限定されるものではないが、外径（ｄｌとし
ては１００〜１，０００μ、好ましくは２００〜８００
μ、フィンのない部分の膜厚（んとしては５〜１００μ
、好ましくは１０〜８０μ、フィンの高さくＨ）として
は５〜２００μ、フィンの高さ／外径（Ｈ／ｄ）比とし
ては０．０１〜０．８、さらには０．０３〜０．３が好
ましい。また。

フィンの根元の巾（Ｗ）は１５〜８０μ、好ましくは２
０〜６０μのものが適当である。

中空糸の断面形状は円形に限定されるものではな（楕円
形であってもよい。また、中空糸外周部のフィンは螺旋
状に形成されていてもよい。

なお、１本の中空糸に複数条のフィンを有する場合には
、各々のフィンの高さくＨ）や巾（Ｗ）が同一でも異な
っていてもよい。また、２本以上の中空糸がフィンを介
してつなかつていてもよいが、その場合には中空糸２本
が好ましい。更に単一な異形中空糸だけでなく、数種の
異なる異形中空糸を混合して用いてもよい。また該異形
中空糸は捲縮が施こさすｌたもσ〕で）・つてもよい。

尚％本発明σノ中空糸束圧は一部にフィンのない中空糸
が含まれていてもよい。

中空糸を容器に光＃４ゴる場＠には、中空糸を容器にで
とるだけ均一に充填し、中空糸の存在しない空間部ある
いは過大な中空糸分散間隙部がないようにすることが望
ましい。この点、本発明のフィン付異形中空糸の場合に
は、極めて良好に充填できろわけであるが、中を未充填
率で表わすと３０〜６０％であることが望ましい。

ここで中空糸充填率は容器内壁の中を糸束の軸方向に垂
直な断面に対する異形中空糸束全体のフィン部を除外し
た中空糸の外周基準断面の占有率を示す。充填率が低す
ぎると有効膜面積の低下のみならず過大な空間が生じ、
細胞を中空糸分散間隙部に維持するのが難しくなり、細
胞増燗の微小環境の点から好ましくない。また。

充填率が高すぎても中空糸の容器への挿入、充填が口し
いはかりでなく、特に中空糸分散間隙部で＃１胞を培養
する場合には容積が少さくなりすぎ大量培養の点から好
ましくない。

本発明に用いられるフィン付異形中空糸は要すれば複数
個の捲縮を有していてもよい。捲縮の振幅の好ましい範
囲は中空糸の外径（ｄ）の１〜５００％、波長の好まし
い範囲は外径（ｄ）の５〜１０００倍である。

本発明に用いられる中空糸膜の素材としては。

膜自体Ｋｉ胞毒性がなく、かつ滅菌操作または培地によ
って変質分解を受げないものなら何でもよい。例えば高
分子材料から作られるものとしては、セルロース、セル
ロースエステル、アクリル系ポリマー、ポリサルホン書
ポリエーテルサルホン、フッ素系ポリマー、ポリオレフ
ィン系ポリマー、ポリカーボネートおよびこれらの共１
合体、他の物との混合物などである。また、無機材料か
ら作られるものとしては、ガラス、セラミックス等を挙
げることができる。

本発明の細胞珊養器においては、細胞は中空糸分散間隙
部６に播種し、中空糸充填率に培養液を流して培養して
もよいし、それとは逆に中空系中全部に細胞を播種し、
中空糸分散間隙部に培養液を流して培養してもよい。す
なわち。

中空糸の壁膜な介して、−万の側から栄養成分を他方の
側の細胞に供給してｍ胞を培養する。

尚、中空糸分散間隙部の側において細胞を培養した場合
に、中空糸間の密着が少なく培養条件が均一に保ちゃす
く、特に付層細胞の培誉に際しては付看面績を大きくで
きる利点がある。

本発明に用いられる中空糸は、細胞の増殖に必要な栄養
分を透過させるが、細胞を透過させない壁膜を有したも
のである。ここで細胞の増殖に必要な栄養分とは、無機
塩類、アミノ酸類！糖類、脂肪酸類、ビタミン類を袖酵
素類、核酸ｆｆ１ＭＭ　、ホルモン類、フルノミン、ト
ランスフェリン、そのル「の徨々の細胞増？ｔｉ因子、
血清中の成分などを云うが、中空糸膜はこれら低分子量
成分から高分子量物質にわたるすべての必要取分を遭遇
することが本来望ましいわけであるが、２・らずしもす
べての成分を透過しなければならないことを、を床する
わけではない。すなわち会費に応じ壮意の分画分子筬を
１する膜を選択イることができるが、少なくとも細胞の
増殖に必要な大部分の低分子量成分、例えばグリコース
やアミノ酸などを透過できればよい。この場合、Ｍを透
過できない成分があれば細胞側に直接供給すること１こ
より補うことが可能である。

例えば細胞の産生する生理活性物質を得ようとする場合
には、生理活性物質を細胞側にとどめ濃縮することが好
ましい。この場合には生理活性物質を透過させない分−
分子ｋを有する中空糸膜が用いられるため、それＩＣ応
じた細胞の増殖に必要な成分の一部が捲過できない場合
も生ずるが、この成分は直接細胞側に供給し補えばよい
。へイプリドーマを培養し、モノクロナール抗体を得る
場合がその１例であるが、この場合には、いわゆる人工
腎臓として使用されている透析膜でも十分に供し得る。

本発明の細胞培養器はフィン付きの異形中空糸を用いる
ため細胞の増殖にとって極めて好ましい微小環境を提供
するものであるが、細胞の培養に際しては、壁膜を介し
た培養液の流れにより細胞近傍に微小な流れを作るのみ
でな（、細胞側に存在する細胞浮遊液または培養液を積
極的に動か−ｆ７ｉ法、例えば振動を与えたり、回転さ
せたり、あるいは液を循環させたりする方法などを用い
て培養することもできろ。

本発明によって培養される細胞は動物細胞に限らず植物
細胞も含まれるが、動物細胞が好ましく適用されろ。ま
た１人為的あるいは遺伝子操作により変性されたＩｋＩ
Ｉ胞で）１つてもよい。付滑性細胞としては、例えば繊
維芽細胞、腎細胞。

ハムスター卵巣細胞、上皮細胞、内皮細胞などが挙げら
れる。また、浮遊性細胞としては例えばリンパ球細胞、
骨髄腫細胞、白血球細胞、骨髄Ｉｌｋ細胞と他の細胞と
の細胞融合によって得られる雑種細胞（ハイプリドーマ
）などが挙げろハろ。

〔発明の効果〕

本発明の細胞培養器によれば、細胞増殖のための微小環
境を均一化することができ、細胞を効率的に増殖せしめ
、かつ細胞数を高密度に維持することが可能である。同
時に細胞の産生する有用生理活性物質を効率的に産生さ
せることが可能である、 以下実施例を用いて本発明を説明するが１本発明はこれ
らの実施例で限定されろものではない。

実施例１〜３．比較例１ セルロースジアセテート１ｏｏＢＫ対し、ポリエチレン
グリコール（分子量２ｏｏ）を５０部加えたものを混合
し、その混合物を２３０”Ｃで浴融し、フィン付きの中
空糸用口金および通常のフィンのない円環状口金がら紡
出した。次いで、熱水に浸漬してポリエチレングリコー
ルを浴出した後、苛性ソータ水ＩＢ液でケン化反応を行
って、更にグリセリン水溶液に浸ｔＩｔ後熱風乾燥して
表ＩＫ示すフィンを有する形状の円形中空糸およびフィ
ンを有しない形状の円形中空糸を得た。これらの中空糸
はいずれも中空糸の円径は２００μ、フィンのない部分
の膜厚は２５μであった。また、フィンの高さは３５μ
。

巾は３０μであった。膜の分画分子量は約１．５万であ
った。

以上の如くにして得られた中空糸６０００本を集束して
ポリカーボネート製円筒容器に充填し、ウレタン樹脂で
隔壁を鋳型して細胞培養器を組立てた。本培養器を用い
て第３図に示す細胞培養装置を組立てた。培養液槽８に
は３１の培養液（ＧＩＢＣＯのＲＰＭＩ−１６４０培地
９０尾。

牛胎児血清１０％からなる）を入れ、ポンプ９を用いて
、中空糸の中空部［５０１ｕ／−の速度で培％−液を循
環させた。また、中空糸分散間隙部６には、マウス骨髄
腫細胞Ｐ３Ｕ１とマウス抗体産生細胞とを融合して得ら
れた雑株細胞を約５　Ｘ　Ｉ　Ｑ’　ｃｅｌｌｓ／Ｉｕ
となるように上記培養液に懸濁させた液約４０１１ｊを
導管７を通して接種した。装置全体を３７℃の恒温槽中
に設置し、培養ｍ８に、ｋ”！専ｇ！１１を通して空気
”　Ｘ　Ｊ　Ｃ−０２５％の混合ガス、また必要に応じ
散水９５九。

ｃｏ、５ｘの混合ガスを槽内ｖｃ）ＩｉＩ気し、培養液
中の浴存酸累設度を５ｐに維持した。培養罪始後８日目
に増殖した細胞数を測定し、表１の結果を得た。

本発明のフィン付異形中費糸を用いたものはフィンのつ
かない中空糸に比較し、細胞の増殖が極めて良好であっ
た。

表　　　　　１ 実施例４〜５．比較例２ ポリエーテルスルホン２０部をジメチルスルホキシド８
０部に溶解した紡糸原液を、フィン付きの中空糸用口金
および通常のフィンのない円環状口金から水からなる凝
固浴中に紡出し、表２に示すフィンを肩する形状の円形
中空糸およびフィンを有しない形状の円形中空糸を得た
。

これらの中空糸はいずれも中空糸の円径は２３０μ、フ
ィンのない部分の膜厚は５０μであった。

またフィンの高さは３５μ、巾は３０μであった。膜の
分画分子量は約５万であった。

以上の如＜Ｋして得られた中空糸４，０００本を集束し
てポリカーボネート製円筒容器に充填しウレタン樹脂で
隔壁を鋳型して細胞培養器を組立てた。本場ｒＥムを用
いて実施例１〜３と同様な方法により、８日目の増殖し
た細胞数を調犀し、表２の結果を得た。

表　　　２ 実施例６ 実施例２０６条のフィンを有する中空糸からなる細胞培
養器を用いて、第４図の細胞培養装置を組立て長期の培
養を行った。培養器８には３Ｉ！の培養液（ＧＩＢＣ（
ＪのＲＰＭ夏１６４０培地９〇九、午胎児皿＃］０３１
６からなる）を入れ。

中壁糸の中空部は５０就／ｉの速度で培養液をｏａ場さ
せた。また、中空糸分散間隙部６にはマウス骨髄ｋｌａ
１ｍＰ　３　Ｕ　ｌとヒト抗体産生細胞とを融合して得
られたマウス−ヒト雑株細胞をｂＸ　ｌ　Ｏ’　ｃｅｌ
１ｇ／紅となるように上記培養液に懸濁させた液５（Ｉ
Ｕを接極した。中空糸分散間隙部の培養液はポンプ１２
および１３により５紅／−の速度で循環させた。装置全
体を３７℃の恒温糟中に設置した。培養液槽８および循
環数貯槽１４には導管１１，１５を通して空気９５３１
６Ｃｏ、　５％の混合ガス、酸素９５に、ＣＯ，５％の
混合ガスおよびＣへガスを通気し、培養液中の溶存酸素
―度を５−に維持した。また、　ＰＨは７．４以下に維
持した。経時的に中空糸分散間隙部の細胞浮遊液を採取
し、増殖した細胞数を測定した。なお培養液の交換は、
培養液槽８の培養液を全量貯槽１７に抜きとり、新鮮な
培養液３１を貯槽１６より培養液槽８に供給して行った
。培養開始後６日目と９８目ＫＩＯ％血清培地で、］１
１日に５９６血清培地で、その後は原則として血清を加
えないＲＰＭＩ−１６４０培地のみで毎日交換したが、
必要に応じ若干の血清も象加した。表３に細胞数の測定
結果を示す。長期にわたり高＊［Ｋ細胞を維持増殖させ
ることができた。

表　　　３

【図面の簡単な説明】

第１区は本発明の細胞培誉器σ〕断面図σ〕１例である
。第２図は本発明に用いるフィン付！４形中９糸の断面
図の１例である。第３図および第４図は細胞培養の流れ
図である。 １・・・中　空　糸　　　２・・・容　器３・・・隔　
壁　　　　　４・・・端　部　室５・・・端部導管　　
　　　６・・・中空糸分散間隙部７・・・側部導管　　
　　８・・・培養液槽９．１２，１３・・・ポンプ　　
　１０・・・細胞培養器１１．１５・・・導　管　　　
　１４・・・循環数貯槽１６．１７・・・貯　槽 特許出願人　帝人株式会社　°゛ 代理人　弁坤士　　曲　　１）　純　　博　　　　　゛
手続補正書 昭和６１年　３月７日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞の増殖に必要な栄養分に対しては透過性を有
   するが、細胞に対しては透過性を有しない壁膜を有する
   中空糸分散束を用いる細胞培養方法において、該中空糸
   の大部分に、その外周部において長手方向に延長された
   フィンを有した異形中空糸を用い、該中空糸の壁層で隔
   てられた２つの領域の片側で細胞を培養することを特徴
   とする細胞培養方法。
2. （２）該異形中空糸が、１〜１４条のフィンを有したも
   のである特許請求の範囲第１項記載の細胞培養方法。
3. （３）細胞の増殖に必要な栄養分に対しては透過性を有
   するが、細胞に対しては透過性を有しない壁膜を有する
   中空糸分散束の両端が容器外部に開口するように隔壁に
   より該容器両端部に固定され、かつ該中空糸両端部で開
   口した中空部に連通する導管と、該中空糸分散間隙部に
   連通する少なくとも２つの導管が付設されてなる細胞培
   養器において、該中空糸の大部分がその外周部において
   長手方向に延長されたフィンを有した異形中空糸であり
   、該中空糸の壁膜で隔てられた２つの領域の片側で細胞
   を培養するようにしたことを特徴とする中空糸型細胞培
   養器。