JP2938937B2 - 細胞培養方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は適当な培地中でインキュベートする細胞培養
方法、及びかかる方法における円筒状シースの使用に係
る。

工業規模の細胞培養は、特に食品産業において既に何
世紀も前から行なわれている。しかしながら、そこで使
用される細胞は主として、細菌及び酵母のごとく培養条
件のかなりの変化に対して寛容な微生物である。

より感受性の細胞種、例えば、医学的な目的に使用さ
れ得るサイトカイニン、プラスミノーゲン活性化物質ま
たはモノクローナル抗体のごとき物質を産生する哺乳類
細胞の培養の歴史はもっと新しい。これらの細胞種の感
受性が強い理由は特に、（細菌及び酵母では原形質膜を
包囲している）丈夫な細胞壁が欠如していること、及
び、処理条件に対する寛容性小さいことにある。

細胞壁を有していない細胞は、例えば培養容器中で細
胞を撹拌する際または培養物に（酸素富化）気体混合物
を通気する際に生じる機械的な力に影響され易い。

更に、多くの哺乳類細胞は何らかの表面に付着したと
きに始めて増殖する。

前記のごとき感受性細胞種を工業規模で培養するため
に種々の培養方法が開発された。これらの方法はいくつ
かの問題を解決しているが夫々の欠点を残している。例
えばこの種の細胞を、中空繊維を用いるかまたは顕微鏡
レベルの微小球（微粒子担体）を用いて培養する方法が
開発されている。

中空繊維の束を使用する培養系の場合には、数百本の
比較的長い半透性チューブに栄養素含有培地を流し、こ
れらのチューブの外部で細胞を増殖させる。膜の孔径に
対する分子寸法次第では、細胞によって分泌される産生
物が、チューブの内腔に逆拡散するか及び／または細胞
を包囲する流体中に堆積する。

この種の培養系の大規模化は技術的に難しい。

顕微鏡レベルの微小球を用いた細胞培養方法が注目さ
れる理由は、細菌及び酵母透に使用され栄養素供給に関
してほぼ最適な従来の培養容器を使用し得るからであ
る。しかしながら、この培養方法の欠点は細胞が損傷さ
れ易いことである。微小球の表面に細胞を配置したと
き、強力な撹拌の際及び培養物に気泡を通す強制通気の
際に生じる機械的な力があまりにも大きいと細胞が損傷
されるであろう。多くの哺乳類細胞はこの種の微粒子担
体上で三次元的に増殖する、即ち、球の表面に複数細胞
層を形成する傾向があり、細胞塊または遊離細胞が時間
の経過に伴って球の表面から剥落する。更に、大規模で
潅流培養する場合、通常は微粒子担体の沈降速度が遅い
のに（所望の産生物を含有する）回収すべき流体流の量
が多い。その結果として、この種の微粒子担体を沈降に
よって分離するのが難しい。

上記のごとき欠点が解消された培養方法がここに知見
された。

本発明方法の特徴は、全長にわたって培地と接触して
おり且つ両端の少なくとも１つを介して培地と自由に接
触する内部空腔を有する実質的に円筒状（好ましくは毛
細管状の）シース（鞘）に細胞を内包させることであ
る。両端が開口したシースを使用してもよい。

この方法では一般に、長さ対直径比1:2〜100:1、好ま
しくは1:1〜25:1の円筒状シースを使用する。

シースは、例えば直径約0.01〜1mmを有しており、哺
乳類細胞に使用するときは直径0.1〜1mmが好ましい。

表面依存性細胞の良好な培養結果を得るためには、細
胞が小円筒に付着することが重要である。シースの製造
材料の組成次第では、担体材料に例えばコラーゲンもし
くはゼラチンの被膜を設けるかまたは担体材料を化学的
に修飾することが必要であろう。後者の場合には、例え
ば正または負の帯電基を導入する。

本発明の培養方法において、培養容器は撹拌型または
非撹拌型のいずれでもよい。その結果、シースの製造材
料の種類及び特性をかなり自由に選択できる。非撹拌培
養条件の場合には、シースの強度及び堅牢性に関する要
件が厳密でなくまたシースの壁圧に関する要件も厳密で
ない。更に、シースの比重も変更できる。固定床及び流
動床及び撹拌系のいずれにおいても、現在常用の微粒子
担体に比較してより重い粒子が好ましい。流動床系では
より重い粒子を使用することによって、より高い流体循
環速度及びより高速の反応器を使用し得る。

撹拌系においては、より重い小円筒を使用することに
よって分離が有利に行なわれる。小円筒を懸濁維持する
ために必要でまた最適酸素供給にも有利な高速撹拌によ
って発生する力は、円筒状シース内部の細胞に対しては
不利な影響を与えない。

本発明のシースは種々の材料から製造され得る。材料
が透明であることは必要絶対条件ではないが、実際には
透明材料の使用が有利である。透明材料の場合には、経
験豊富な使用者が眼で観察するだけで問題の発生に対す
る適切な診断を十分に与え得ることも多い。

シースの材料は透過性でも不透過性でもよい。材料は
一般に、合成または生物起源のポリマーであり、これら
のポリマーは化学的に修飾及び／または被覆されてもさ
れなくてもよい。適当な不透過性材料の例は、ガラス及
びプラスチック（例えばナイロン及びポリプロピレン）
である。適当な不透過性シース材料は例えば、 −透析膜及び限外過膜として常用の半透膜材料（例え
ばセルロース）、 −微粒子過（microfiltration）に常用の多孔質材料
（これらの材料は製網（netting）また物理的方法によ
って微孔質にされる）、 −気体透過性材料（例えばポリシラン）、 −細胞寸法より小さい範囲のより大きい気孔を有する微
粒子過材料、 −生分解性高分子材料（例えばポリ乳酸） である。

本発明のシースは例えば、長い毛細繊維を適当な長さ
の断片に分割することによって製造される。

本発明方法は予想外の利点を多数有しており従って種
々の細胞に適した方法である。細胞は正常細胞、癌細胞
または遺伝子操作によって修飾した細胞のいずれでもよ
い。本発明方法はまず、表面依存性細胞例えば多くの種
類の原核細胞に適している。本発明方法はまた、ある種
の哺乳類細胞及び植物細胞のごとく必ずしも付着を要せ
ずに保護環境（例えばシース）中でしばしばコロニーま
たは細胞塊に成長する細胞に極めて適している。また、
かび、並びに血液細胞及び血液細胞由来のハイブリッド
細胞のような集合性単細胞生物に有利に使用できる。

本発明方法は、特定の有用物質を産生し好ましくは分
泌する細胞の培養に特に適している。本発明方法は更
に、例えば廃水流の浄化処理に用いられる播種材料及び
人工種子として適当な細胞資源（cell mass）の産生に
使用され得る。

本発明方法で使用するためには例えば、まず所望の細
胞を長い毛細繊維に接種し、次いでこれらの繊維を適当
な長さの短い断片に分割し、次いでこの断片を培地に移
入する。または、本発明の円筒状シースを配置した培養
容器に所望の細胞を接種する。

前記のごとき固体微粒子担体以外にもときどきは、マ
クロポーラスな微粒子担体も細胞培養に使用され得る。
後者は固体微粒子担体に比較して、細胞がマクロ気孔内
部の多少とも保護された環境で増殖できるという利点を
有してはいるが、本発明の中空小円筒に比較すると欠点
が多い。

−中空円筒の場合には、細胞を内方増殖させる開口の形
状及び寸法が一定であるが、マクロポーラス担体の場合
には形状及び寸法が一定しない開口が至る処に存在す
る。

−細胞増殖を容易に眼で追跡できるように中空小円筒は
完全に透明な材料から製造できるが、従来のマクロポー
ラス担体では個々の細胞の検出が極めて難しい。

−透過性の壁を有する中空小円筒を使用する場合、原則
としてはこれらの円筒の長さを延長することによって円
筒の内容積を無限に拡大し得る。（結局は球形の）微粒
子担体の場合にはその寸法の増加が、酸素、栄養素及び
廃棄物の撹拌によって制約される。

−（固体及びマクロポーラスな）微粒子担体は、細胞培
養物中で使用した際に架橋形成を生じる。その結果とし
て、粒子が凝集し、不均質な懸濁液が形成される。中空
小円筒はこのような欠点を示さない。

実施例 種々の微粒子担体を用いたCHO.FSH細胞の培養 以下の実験は、本発明の円筒状シース内で培養される
細胞に対する剪断応力の影響が、公知の他の微粒子担体
（Cytodex3（Pharmacia）及びCultispher G（Percel
l））の場合よりもはるかに小さいことを照明する。

この実験のために、卵胞刺激ホルモン（FSH）を産生
し得るように組替えDNA方式を用いて遺伝子的に修飾し
たCHO細胞を使用した。

この実験で使用した円筒状シースは、平均長さ約500
μｍ、直径200μｍ及び壁厚11μｍ（乾燥状態寸法）で
ある。

シリコーン被覆ローラボトルで細胞培養を行なった。
細胞の接種中及び増殖中には５％FSC（ウシ胎児血清）
を含有するHam's F12/DMEM培地を使用した。

微粒子担体の表面が完全に覆われるまで増殖が進むと
直ちに、無血清培地で培養を継続した。種々の培養物中
で細胞１つあたり等しい量の産生物を形成した。

Cytodex3及びCultispher G微粒子担体を用いた培養物
中では、比較的多数の細胞塊が存在し、種々の微粒子担
体間の細胞を介して架橋形成が生じていた。

セルロース円筒を用いた培養物中では架橋形成は全く
生起せず、細胞塊ははるかに少数であった。

種々の微粒子担体の沈降速度を以下の表１に示す。

ローラボトル培養物から5mlの試料を採取し、10mlの
試験管に入れ、次に2,500rpmの渦流ミキサーを用いて６
分間激しく撹拌した。

上清中の遊離細胞量の増加を測定することによって撹
拌が細胞付着に与える影響を測定した。結果を表２に示
す。

セルロース円筒を用いるとより高い細胞濃度を得るこ
とが可能である。Cultispher Gの最大濃度は5g/であ
りCytodex3の最大濃度は25g/である。これらの限度を
超過すると粘性懸濁液が形成される（ゲル形成）。

セルロース円筒は、40g/まで粘性懸濁液を形成しな
いで使用される得る。

以下の結論が得られる。

−すべての種類の微粒子担体で細胞あたりのFSH産生は
等しい。

−セルロース円筒を用いた培養物では従来の微粒子担体
を用いた培養物よりも遊離細胞及び細胞塊の数がはるか
に少ない。架橋形成は、セルロース円筒間では生じない
がCytodexまたはCultispher微粒子担体間では生じる。

−セルロース円筒の沈降速度は他の微粒子担体の沈降速
度よりもはるかに速いので産生物流からの細胞分離が促
進される。

−強力な撹拌後の剪断応力に対しては、セルロース円筒
内の細胞はCultispher GまたはCytodex3微粒子担体中の
細胞よりもはるかに十分に保護されている。

−セルロース円筒はCultispher GまたはCytodex3よりも
高濃度で使用することが可能である。このような高濃度
は剪断応力に対する細胞の感受性に不利な影響を与えな
い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−234775（ＪＰ，Ａ) 英国公開2203447（ＧＢ，Ａ) 欧州公開183207（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開310911（ＥＰ，Ａ２) 欧州特許21257（ＥＰ，Ｂ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12M 1/00 - 3/10

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】中空で、直径が0.01から1mmであり、長さ
   対直径比が1:2から100:1である実質的に円筒状の鞘内に
   定着した細胞の培養方法であり、該鞘が培養容器内にお
   いて適当な培地中に浮遊し、このことにより、該鞘の中
   空内部が両端の少なくとも一方を介して培地と自由に接
   触しており、培地が撹拌されていることを特徴とする細
   胞の培養方法。
2. 【請求項２】円筒状の鞘の長さ対直径比が1:1から25:1
   であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】円筒状の鞘がセルロースで構成されている
   ことを特徴とする請求項１あるいは２に記載の方法。
4. 【請求項４】所望の産生物を産生する細胞を培養し、こ
   の産生物を細胞培養から単離することを特徴とする請求
   項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】培養および産生物の単離を一連の工程で行
   うことを特徴とする請求項４に記載の方法。