JPH0343072A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は適当な培地中でインキュベートする細胞培養方
法、及びかかる方法における円筒状シースの使用にｆ系
る。

工業規模の細胞培葺は、特に食品産業において既に何叶
紀も前から行なわれている。しがしながら、そこで使用
される細胞は主として、細菌及び酔母のごとく培養条件
のかなりの変化に対して寛容な微生物である。

より感受性の細胞種、例えば、医学的な目的に使用され
得るサイトカイニン、プラスミノーゲン活性化物質また
はモノクローナル抗体のごとき物質を産生ずる哺乳類細
胞の培養の歴史はもつと新しい、これらの細胞種の感受
性が強い理由は特に、（細菌及び酵母では原形質膜を包
囲している）丈夫な細胞壁が欠如していること、及び、
処理条件に対する寛容性が小さいことにある。

細胞壁を有していない細胞は、例えば培養容器中で細胞
を攪拌する際または培養物に（酸素富化）気体混合物を
通気する際に生じる機械的な力に影響され易い。

更に、多くの哺乳類細胞は何らかの表面に付着したとき
に始めて増殖する。

前記のごとき感受性細胞種を工業規模で培養するために
種々の培養方法が開発された。これらの方法はいくつか
の問題を解決しているが夫々の欠点を残している４例え
ばこの種の細胞を、中空繊維を用いるかまたは顕微鏡レ
ベルの微小球（微粒子担体）を用いて培養する方法が開
発されている。

中空繊維の束を使用する培養系の場合には、数百本の比
較的長い半透性チューブに栄養素含有培地を流し、これ
らのチューブの外部で細胞を増殖させる０Ｍの孔径に対
する分子寸法次第では、細胞によって分泌される産生物
が、チューブの内腔に逆拡散するか及び／または細胞を
包囲する流体中に堆積する。

この種の培養系の大規模化は技術的に難しい。

顕微鏡レベルの微小球を用いた細胞培養方法が注目され
る理由は、細菌及び酵母等に使用され栄養素供給に関し
てほぼ最適な従来の培養容器を使用し得るからである。

しかしながら、この培養方法の欠点は細胞が損傷され易
いことである。微小球の表面に細胞を配置したとき、強
力な攪拌の際及び培養物に気泡を通す強制通気の際に生
じる機械的な力があまりにも大きいと細胞が損傷される
であろう、多くの哺乳類細胞はこの種の微粒子担体上で
三次元的に増殖する、即ち、球の表面に複数細胞層を形
成する傾向があり、細胞塊または遊離細胞が時間の経過
に伴って球の表面から剥落する。更に、大規模で潅流培
養する場合、通常は微粒子担体の沈降速度が遅いのに（
所望の産生物を含有する）回収すべき流体流の量が多い
。その結果として、この種の微粒子担体を沈降によって
分離するのが難しい。

上記のごとき欠点が解消された培養方法がここに知見さ
れた。

本発明方法の特徴は、全長にわたって培地と接触してお
り且つ両端の少なくとも１つを介して培地と自由に接触
する内部空、り空を有する実質的に円筒状（好ましくは
電相管状の）シースに細胞を内包させることである０両
端が開口したシースを使用してもよい。

この方法では一般に、長さ対直径比１：２〜１００：１
、好ましくは１：１〜２５：１の円筒状シースを使用す
る。

シースは、例えば直径的０．０１〜１１を有しており、
哺乳類細胞に使用するときは直径０，１〜ＩＩが好まし
い。

表面依存性細胞の良好な培養結果を得るためには、細胞
が小円筒に付着することが重要である。

シースの製造材料の組成次第では、担体材料に例えばコ
ラーゲンもしくはゼラチンの被膜を設けるかまたは担体
材料をｆヒ学的に修飾することが必要であろう、　７１
者の場合には、例えば正または負の帯電基を導入する。

本発明の培養方法において、培養容器は攪拌型または非
攪拌型のいずれでもよい。その結果、シースの製造材料
の種類及び特性をがなり自由に選択できる。非攪拌培養
条件の場合には、シースの強度及び堅牢性に関する要件
が厳密でなくまたシースの壁厚に関する要件も厳密でな
い。更に、シ−スの比重も変更できる。固定床及び流動
床及び撹拌系のいずれにおいても、現在常用の微粒子担
体に比較してより重い粒子が好ましい。流動床系ではよ
り重い粒子を使用することによって、より高い流体循環
速度及びより高速の反応器を使用し得る。

撹拌系においては、より重い小円筒を使用することによ
って分離が有利に行なわれる。小円筒を懸濁維持するた
めに必要でまた最適酸素供給にも有利な高速攪拌によっ
て発生する力は、円筒状シース内部の細胞に対しては不
利な影響を与えない。

本発明のシースは種々の材料から製造され得る。

材料が透明であることは必要絶対条件ではないが、実際
には透明材料の使用が有利である。透明材料の場合には
、経験豊富な使用者が眼で観察するだけで問題の発生に
対する適切な診断を十分に与え得ることも多い。

シースの材料は透過性でも不透過性でもよい。

材料は一般に、合成または生物起源のポリマーであり、
これらのポリマーは化学的に修飾及び／またはｍ覆され
てもされなくてもよい。適当な不透過性材料の例は、ガ
ラス及びプラスチックく例えばナイロン及びポリプロピ
レン）である。適当な不透過性シース材料は例えば、 透析ｊ摸及び限外ｐ過膜として常用の半透膜材料（関え
ばセルロース）、 一微粒子ｐ過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に常
用の多孔質材料（これらの材料は製網（ｎｅｔｔｉｎｇ
）また物理的方法によって微孔質にされる）、 気体透過性材料（例えばポリシラン）、細胞寸法より小
さい範囲のより大きい気孔を有する微粒子ｆ過材料、 生分解性高分子材料（ｆＭえばポリ乳酸）である。

本発明のシースは例えば、長い毛細繊維を適当な長さの
断片に分割することによって製造される。

本発明方法は予想外の利点を多数有しており従って種々
の細胞に適した方法である。細胞は正常細胞、癌細胞ま
たは遺伝子操作によって修飾した細胞のいずれでもよい
０本発明方法はまず、表面依存性細胞例えば多くの種類
の原核細胞に適している０本発明方法はまた、ある種の
哺乳類細胞及び植物細胞のごとく必ずしも付着を要せず
に保護環境（例えばシース）中でしばしばコロニーまた
は細胞塊に成長する細胞に極めて適している。また、か
び、並びに血液細胞及び血液細胞由来のハイブリッド細
胞のような集合性単細胞生物に有利に使用できる。

本発明方法は、特定の有用物質を産生し好ましくは分泌
する細胞の培養に特に適している。本発明方法は更に、
例えば廃水流の浄化処理に用いられる播種材料及び人工
種子として適当な細胞資源（ｃｅｌｌ　ｍａｓｓ）の産
生に使用され得る。

望の細胞を長い毛細繊維に接種し、次いでこれらのｕａ
維を適当な長さの短い断片に分割し、次いでこの断片を
培地に移入する。または、本発明の円筒状シースを配置
した培養容器に所望の細胞を接種する。

前記のごとき固体（紋粒子担体以外にもときどきは、マ
クロポーラスな微粒子担体も細胞培養に使用され得る。

後者は固体微粒子担体に比較して、細胞がマクロ気孔内
部の多少とも保護された環境で増殖できるという利点を
有してはいるが、本発明の中空小円筒に比較すると欠点
が多い。

中空円筒の場合には、細胞を内方増殖させる開口の形状
及び寸法が一定であるが、マクロポーラス担体の場合に
は形状及び寸法が一定しない開口が至る処に存在する。

細胞増殖を容易に眼で追跡できるように中空小円筒は完
全に透明なＮ料から製造できるが、従来めて難しい。

一透過性の壁を有する中空小円筒を使用する場合、原則
としてはこれらの円筒の長さを延長することによって円
筒の内容積を無限に拡大し得る。（結局は球形の）微粒
子担体の場合にはその寸法の増加が、酸素、栄養素及び
廃棄物の拡散によって制約される。

＝（固体及びマクロポーラスな）微粒子担体は、細胞培
養物中で使用した際に架橋形成を生じる。その結果とし
て、粒子が凝集し、不均質な懸濁液が形成される。中空
小円筒はこのような欠点を示さない。

及艶燵 種々の微粒子担体を用いたＣＨＯ，ＦＳＨ細胞の培養以
下の実験は、本発明の円筒状シース内で培養される細胞
に対する剪断応力の影響が、公知の他の微粒子担体（Ｃ
ｙｔｏｄｅｘ　３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びＣｕ１ｔ
ｉ−ｓｐｈｅｒ　Ｇ（Ｐｅｒｅｅｌｌ））の場合よりも
はるかに小さいことを証明する。

この実験のために、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を産生
し得るように組換えＤＮＡ方法を用いて遺伝子的に修飾
したＣＩＯ細胞を使用した。

この実験で使用した円筒状シースは、平均長さ約５００
μｍ、直径２００μｍ及び壁厚１１μ輪（乾燥状態寸法
）である。

シリコーン被覆ローラボトルで細胞培養を行なった０Ｍ
Ａ胞の接種中及び増殖中には５％ＦＳＣ（ウーシ胎児血
清）を含有するＨａｍ’ｓ　Ｆ１２／ＤＨＥＭ培地を使
用した。

微粒子担体の表面が完全に覆われるまで増殖が進むと直
ち、に、無血清培地で培養を継続した０種々の培養物中
で細胞１つあたり等しい量の産生物を形成した。

Ｃｙｔｏｄｅｘ　３及びＣｕ１ｔｉｓｐｈｅｒ　Ｇ微粒
子担体を用いた培養物中では、比較的多数の細胞塊が存
在し、種々の微粒子担体間の細胞を介して架橋形成が生
じでいた。

セルロース円筒を用いた培養物中では架橋形成は全く生
起せず、細胞塊ははるかに少数であった。

種々の微粒子担体の沈降速度を以下の表１に示す。

ローラボトル培養物から５ｍｌの試料を採取し、１０１
ｔｌの試験管に入れ、次に２，５００ｒｐｒＲの渦流ミ
キサーを用いて６分間激しく攪拌した。

上清中の１ｌｉｔ［泡量の増加を測定することによって
攪拌が細胞付着に与える影響を測定した。結果を表２に
示す。

去じＬ 種々の微粒子担体の外面または内部への細胞の付着に対
する強力な攪拌の影響 ａ、細胞数は攪拌前の微生物担体外面または担体内部に
存在する細胞数のパーセンテージで示す。

セルロース円筒を用いるとより高い細胞濃度を得ること
が可能である。　Ｃｕ１Ｌｉｓｐｈｅｒ　Ｇの最大濃度
は５ｇ／ｆでありＣｙｔｏｄｅｘ　３の最大濃度は２５
ｇ／ｌである。

これらの限度を超過すると粘性懸濁液が形成される（ゲ
ル形成〉。

セルロース円筒は、４０ｇ／ｌまで粘性懸濁液を形成し
ないで使用される得る。

以下の結論が得られる。

−すべての種類の微粒子担体で細胞あたりのＦ　Ｓ　Ｉ
Ｉ産生は等しい。

セルロース円筒を用いた培養物では従来の微粒子担体を
用いた培養物よりも遊離細胞及び細胞塊の数がはるかに
少ない。架橋形成は、セルロース円筒間では生じないが
ＣｙｔｏｄｅｘまたはＣｕ　ｌ　ｔ　１ｓｐｈｅｒ微粒
子担体間では生じる。

セルロース円筒の沈降速度は他の微粒子担体の沈降速度
よりもはるかに速いので産生物流からの細胞分離が促進
される。

一強力な攪拌後の剪断応力に対しては、セルロース円筒
内の細胞はＣｕ１ｔｉｓｐｈｅｒ　ＧまたはＣｙｔｏｄ
ｅｘ　３微粒子担体中の細胞よりもはるかに十分に保護
されている。

セルロース円筒はＣｕ１ｔｉｓｐｈｅｒ　ＧまたはＣｙ
ｔｏｄｅｘ３よりも高濃度で使用することが可能である
。このような高濃度は剪断応力に対する細胞の感受性に
不利な影響を与えない。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）全長にわたって培地と接触し両端の少なくとも１
   つを介して培地と自由に接触する内部空腔を有する実質
   的に円筒状のシースに細胞を内包させることを特徴とす
   る適当な培地中で細胞をインキュベートする細胞培養方
   法。
2. （２）培地を攪拌することを特徴とする請求項１に記載
   の方法。
3. （３）円筒状シースの直径が０．０１〜１ｍｍであるこ
   とを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. （４）円筒状シースの長さ対直径比が１：２〜１００：
   １、特に１：１〜２５：１であることを特徴とする請求
   項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. （５）内部空腔を有し両端の少なくとも１つが開口して
   いる長さ対直径比１：２〜１００：１及び外径０．０１
   〜１ｍｍの円筒状シース。
6. （６）付着細胞の培養における付着基体としての請求項
   ５に記載のシースの使用。
7. （７）所望の産生物を産生する細胞を培養し、前記産生
   物を細胞培養物から単離することを特徴とする請求項１
   に記載の方法。
8. （８）培養及び産生物の単離を連続法で行なうことを特
   徴とする請求項１に記載の方法。（９）細胞を内包して
   いる請求項５に記載の円筒状シース。