JPS6156095A - 基質または酵素活性の定量法 - Google Patents
基質または酵素活性の定量法Info
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- JPS6156095A JPS6156095A JP17804984A JP17804984A JPS6156095A JP S6156095 A JPS6156095 A JP S6156095A JP 17804984 A JP17804984 A JP 17804984A JP 17804984 A JP17804984 A JP 17804984A JP S6156095 A JPS6156095 A JP S6156095A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
一１１上五五里差互一
本発明はアンモニアを含有する試料中の基質あるいは１
５ＨＢ活性をアンモニアを生成する反応系を利用して定
量する際に試料中のアンモニアを予め消去しておいてか
ら目的の基質あるいは酵素活性を測定する方法に関し、
より正確な定ｍができる。
５ＨＢ活性をアンモニアを生成する反応系を利用して定
量する際に試料中のアンモニアを予め消去しておいてか
ら目的の基質あるいは酵素活性を測定する方法に関し、
より正確な定ｍができる。
従来の技術
従来、アンモニアを含をする試料においてアンモニアを
反応生成物とする反応系を利用して基質または酵素活性
をアンモニアの生成量で定量する際に、試料中に存在す
るアンモニアを含めた形で測定され、正確な定量値を得
ることができない。
反応生成物とする反応系を利用して基質または酵素活性
をアンモニアの生成量で定量する際に、試料中に存在す
るアンモニアを含めた形で測定され、正確な定量値を得
ることができない。
発■が う る間“点
試料中のアンモニアを反応生成物とする反応系を利用し
て酵素または基質をアンモニアの生成量で定量する場合
、試料中に存在するアンモニアが妨害になる。本発明方
法はかかるアンモニアを予め消去した後目的とする物質
を定量することによって問題を解決したものである。
て酵素または基質をアンモニアの生成量で定量する場合
、試料中に存在するアンモニアが妨害になる。本発明方
法はかかるアンモニアを予め消去した後目的とする物質
を定量することによって問題を解決したものである。
問題点を ′ るための 段
本発明によれば試料中の基質もしくは！Ｉ酵素活性アン
モニアを生成する反応を利用して測定するに際し、試料
中のアンモニアを酵素を利用して分解し、次いで定量さ
れるべき基質もしくは酵素活性の分析に必要な試薬を加
えてアンモニアを生成させこれを定量することにより極
めて精度よく基質もしくは酵素活性を測定できる。
モニアを生成する反応を利用して測定するに際し、試料
中のアンモニアを酵素を利用して分解し、次いで定量さ
れるべき基質もしくは酵素活性の分析に必要な試薬を加
えてアンモニアを生成させこれを定量することにより極
めて精度よく基質もしくは酵素活性を測定できる。
アンモニア消去のために用いられる酵素としてはＮＡＤ
非共役系でアンモニアを消費する酵素であればいずれも
用いることができる。例えば以下に示されるような酵素
が用いられ、その反応を行わせるに際してはアンモニア
を消費する１ｉｌｉ並びに反応に必要な基質等を試料に
加える。
非共役系でアンモニアを消費する酵素であればいずれも
用いることができる。例えば以下に示されるような酵素
が用いられ、その反応を行わせるに際してはアンモニア
を消費する１ｉｌｉ並びに反応に必要な基質等を試料に
加える。
ＣＭＰ合成ＩＶ崇
ＸＭＰ ＋ ＮＨ，＋ ＡＴＰ −１６ＭＰ ＋
ＡＭＰ ＋ ＰＰ１−ブ訛ヱエヱ澄感ｙ週− し−グルタメート ＋ ＮＨ，’ ＋ ＡＴＰ
−グルタミン ＋ 八ＯＰ ＋ ｐＨ７２とｌエヱ金
成Ｍ遇− Ｌ−７スバラテー） ＋ ＮＨ，” ＋ ＾ＴＰ
→ アスパラテート 十 八〇Ｐ ＋ Ｐｉトリプ
トファナーゼ インドール ＋ バイルベー）＋ＮＨ，” → し−
トリ升ファンセリンデヒドラターゼ バイルベート ÷ ＮＨ，’ −〇（シ） −七
リン本モレスティンギスルフヒトラーゼ ２−ｔキソブチし一ト ＋ ＨｉＳ ＋ ＮＨ，。
ＡＭＰ ＋ ＰＰ１−ブ訛ヱエヱ澄感ｙ週− し−グルタメート ＋ ＮＨ，’ ＋ ＡＴＰ
−グルタミン ＋ 八ＯＰ ＋ ｐＨ７２とｌエヱ金
成Ｍ遇− Ｌ−７スバラテー） ＋ ＮＨ，” ＋ ＾ＴＰ
→ アスパラテート 十 八〇Ｐ ＋ Ｐｉトリプ
トファナーゼ インドール ＋ バイルベー）＋ＮＨ，” → し−
トリ升ファンセリンデヒドラターゼ バイルベート ÷ ＮＨ，’ −〇（シ） −七
リン本モレスティンギスルフヒトラーゼ ２−ｔキソブチし一ト ＋ ＨｉＳ ＋ ＮＨ，。
−本量システィン ＋ ＬＯシスタチオンＴ −リア
ーゼ ２−ｔキソブルート＋シーシスティン 十 Ｎ１１．”
→し一シスタチオン 十 ｌｈ。
ーゼ ２−ｔキソブルート＋シーシスティン 十 Ｎ１１．”
→し一シスタチオン 十 ｌｈ。
ｔルニチンシクロデアミナーゼ
し−１ａリン 十 Ｎｌ＋、 ” → し−ｔ
ルニチン１スバルテート アンモニアリアーゼ Ｌ−７２バ＆？−ト ＋ ＮＨｖ ＋ ＡＴＰ −
し−１スバラギント ＋ ＡＴＰ ＋ Ｐｉヒスｆ
ジンアンモニア リアーゼ ウロカネート 十 Ｎ１１４＋ → Ｌ−ヒスチジンフ
Ｉニル７ラニン １ン量二１ リアー（トランス−シン
ナメート 十 Ｎ）１．” −し−７エニル７ラニン
β−７ラニン Ｃｃ＾ ７ンモニ７ リアーぜアクリリ
ール − Ｃｏ＾ ＋ ＮＨ，” →β−１ラニン
Ｃｏ＾エタノールアミン アンモニア づアー・」７セ
ト１ルデヒド ＋ ＮＨ，’ −エタノールアニンｔ
ルニチン シクロデアミナーゼ し−プロリン ＋ １１）１．” −Ｌ−ｔルニチ
ンチ０ンン フェノール リアーゼ フェノール ＋ パイルベート 十 Ｎ）１．’ −
Ｌ−チロシン 十 Ｈフ０これらのアンモニア消費酵素
の中、次の段階における反応に影響を与えないような適
当なアンモニア消去試薬を選択することが好ましいが次
の方法によっても該影響を避けることができる。
ルニチン１スバルテート アンモニアリアーゼ Ｌ−７２バ＆？−ト ＋ ＮＨｖ ＋ ＡＴＰ −
し−１スバラギント ＋ ＡＴＰ ＋ Ｐｉヒスｆ
ジンアンモニア リアーゼ ウロカネート 十 Ｎ１１４＋ → Ｌ−ヒスチジンフ
Ｉニル７ラニン １ン量二１ リアー（トランス−シン
ナメート 十 Ｎ）１．” −し−７エニル７ラニン
β−７ラニン Ｃｃ＾ ７ンモニ７ リアーぜアクリリ
ール − Ｃｏ＾ ＋ ＮＨ，” →β−１ラニン
Ｃｏ＾エタノールアミン アンモニア づアー・」７セ
ト１ルデヒド ＋ ＮＨ，’ −エタノールアニンｔ
ルニチン シクロデアミナーゼ し−プロリン ＋ １１）１．” −Ｌ−ｔルニチ
ンチ０ンン フェノール リアーゼ フェノール ＋ パイルベート 十 Ｎ）１．’ −
Ｌ−チロシン 十 Ｈフ０これらのアンモニア消費酵素
の中、次の段階における反応に影響を与えないような適
当なアンモニア消去試薬を選択することが好ましいが次
の方法によっても該影響を避けることができる。
例えば■反応のｐＨを変える。合成酵素、特にＧ！Ｐ合
成酵素はｐＨ８，０〜９．５付近のアルカリ側で良く反
応し、中性付近では反応速度が遅＜Ｋｍ値も高く、低基
質濃度ではこの酊詣による反応が起きない。
成酵素はｐＨ８，０〜９．５付近のアルカリ側で良く反
応し、中性付近では反応速度が遅＜Ｋｍ値も高く、低基
質濃度ではこの酊詣による反応が起きない。
従ってアンモニア消費の反応をｐ）１８．０〜９．５の
範囲で行い、試料からアンモニアを遊離させる反応及び
アンモニアの定量反応をｐ）１６．５〜７５で行う。
範囲で行い、試料からアンモニアを遊離させる反応及び
アンモニアの定量反応をｐ）１６．５〜７５で行う。
■特異的な阻害側を使用する。アンモニアを消費する酵
素に特異的に作用する阻害剤を第２反応の段階において
添加する。特異的阻害剤として、ＣＭＰ合成酵素、グル
タミン合成酵素、アスパラギン合成酵素の場合はそれぞ
れデコイエン。メチオニンスルフォキサイド、モリブテ
ン酸が用いられる。■アデノンントリフォスファクーゼ
（＾ＴＰアーゼ）を第２反応の段階に添加する。即ち、
過剰のＡＴＰアーゼを第２反応の段階に添加しておけば
基質が分解する為にＡＴＰを基質とする合成酵素は反応
することができないので反応るよって生成するアンモニ
アは作用を受けない。
素に特異的に作用する阻害剤を第２反応の段階において
添加する。特異的阻害剤として、ＣＭＰ合成酵素、グル
タミン合成酵素、アスパラギン合成酵素の場合はそれぞ
れデコイエン。メチオニンスルフォキサイド、モリブテ
ン酸が用いられる。■アデノンントリフォスファクーゼ
（＾ＴＰアーゼ）を第２反応の段階に添加する。即ち、
過剰のＡＴＰアーゼを第２反応の段階に添加しておけば
基質が分解する為にＡＴＰを基質とする合成酵素は反応
することができないので反応るよって生成するアンモニ
アは作用を受けない。
このように試料中にすでに存在しているアンモニアは消
費されアンモニアを反応生成物として生じせしめる酵素
の作用によって生成するアンモニアは直接測定できる吠
態となる。
費されアンモニアを反応生成物として生じせしめる酵素
の作用によって生成するアンモニアは直接測定できる吠
態となる。
試料中のアンモニアを消失させた後、定量すべき基質も
しくは酵素活性を測定するのに必要な酵素あるいは基質
を加えて酵素反応を行わせてアンモニア消費成させ、ア
ンモニア定量ンステムヲ用いてアンモニアを定量し、計
算によって試料中の目的の基質あるいは酵素活性を定量
することができる。
しくは酵素活性を測定するのに必要な酵素あるいは基質
を加えて酵素反応を行わせてアンモニア消費成させ、ア
ンモニア定量ンステムヲ用いてアンモニアを定量し、計
算によって試料中の目的の基質あるいは酵素活性を定量
することができる。
試料中のアンモニアを消去した後第２の反応として測定
すべき基質もしくは酵素活性の測定に必要な試薬を加え
る。
すべき基質もしくは酵素活性の測定に必要な試薬を加え
る。
測定対象となる基質及びこの基質と反応してアンモニア
を生成させる酵素の組み合わせとして例えばクレアチニ
ン、し−アスパラギン１Ｌ−グルタミン、モノカルボキ
シリック酸、Ｎ−カルバミルβアラニン、Ｌ−ウレイド
コハク酸、Ｎ−ホルムイミノ−し−アスパラギン酸、ン
ト／／、アデニン、グアニン、アデノ７ン、／チジン、
＾叶。
を生成させる酵素の組み合わせとして例えばクレアチニ
ン、し−アスパラギン１Ｌ−グルタミン、モノカルボキ
シリック酸、Ｎ−カルバミルβアラニン、Ｌ−ウレイド
コハク酸、Ｎ−ホルムイミノ−し−アスパラギン酸、ン
ト／／、アデニン、グアニン、アデノ７ン、／チジン、
＾叶。
４アミノイミダゾール、ベトリン、デオキシ−ＣＭＰ、
二） ＩＪル、尿素等の物質及び対応する５ｒ素として
クレアチニンデイミナーゼ、アスパラギナーゼ９グルタ
ミナーゼ、アミダーゼ、β−ウレイトプロビオナーゼ１
ウレイトサクンナーゼ、ホルムイミノアスパラギン酸−
デイミナーゼ、グアニンデアミナーゼ、アデノ／ンデア
ミナーゼ、／チジンデアミナーゼ、ＡＤＰデアミナーゼ
、アミノイミダゾラーゼ、ベトリンデアミナーゼ、デオ
キンＣＭＰデアミナーゼ、ニトリラーセ、ウレアーゼが
それぞれ例示される。
二） ＩＪル、尿素等の物質及び対応する５ｒ素として
クレアチニンデイミナーゼ、アスパラギナーゼ９グルタ
ミナーゼ、アミダーゼ、β−ウレイトプロビオナーゼ１
ウレイトサクンナーゼ、ホルムイミノアスパラギン酸−
デイミナーゼ、グアニンデアミナーゼ、アデノ／ンデア
ミナーゼ、／チジンデアミナーゼ、ＡＤＰデアミナーゼ
、アミノイミダゾラーゼ、ベトリンデアミナーゼ、デオ
キンＣＭＰデアミナーゼ、ニトリラーセ、ウレアーゼが
それぞれ例示される。
例えばクレアチニンは次の反応に従ってアンモニアを生
成しこれを定量することによってクレアチニンを定量で
きる。
成しこれを定量することによってクレアチニンを定量で
きる。
又測定できる酵素活性の対象となる酵素は反応によって
アンモニアを生成する酵素であればいずれもその活性を
測定でき前記のｆｉｌｌが例示ささる。
アンモニアを生成する酵素であればいずれもその活性を
測定でき前記のｆｉｌｌが例示ささる。
測定の目的にそってアンモニアを除去した試料に基質又
は酵素、その他応援に必要な成分を加えて酵素反応を行
わせ、生成するアンモニアを定】すればよ□５Ｎ。
は酵素、その他応援に必要な成分を加えて酵素反応を行
わせ、生成するアンモニアを定】すればよ□５Ｎ。
試料中の６１１１足すべき基質あるいは酊禦を反応させ
て直接アンモニアを生成するよう／ｊ反応系がない場合
には＝’Ａ ＪＪＪ質もしくは酵素を反応させてアンモ
ニアを生成する基質を生成させ、この基質を酵素反応さ
せて生成するアンモニアを定量すればよアンモニア定量
／ステムとしては公知のアンモニアの定量法が適用でき
るが例えばグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）
、α−ケトグルタミン酸（八−ＫＧ）、ＮＡＤ （Ｐ）
Ｈを用いて下記反応式により反応させ、ＮＡＤ （Ｐ）
Ｈの減少１を３４０ｎｍにおける反応液の吸光度の減少
を測定することによって求め、アンモニアを定ｍできる
。
て直接アンモニアを生成するよう／ｊ反応系がない場合
には＝’Ａ ＪＪＪ質もしくは酵素を反応させてアンモ
ニアを生成する基質を生成させ、この基質を酵素反応さ
せて生成するアンモニアを定量すればよアンモニア定量
／ステムとしては公知のアンモニアの定量法が適用でき
るが例えばグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）
、α−ケトグルタミン酸（八−ＫＧ）、ＮＡＤ （Ｐ）
Ｈを用いて下記反応式により反応させ、ＮＡＤ （Ｐ）
Ｈの減少１を３４０ｎｍにおける反応液の吸光度の減少
を測定することによって求め、アンモニアを定ｍできる
。
本発明のアンモニアを反応生成物とする基質もしくは酵
素活性の定量法は、単にエンドポイント法によってもア
ンモニアを含有する試料中のアンモニアを反応生成物と
する基質もしくは酵素活性を定量できるし、また適量な
アンモニアを反応生成物として生じせしめる酵素の量を
選択することによって、レイトアセイ（ｒａｔｅ ｅａ
ｓｓｙ）にて目的を達成できる。
素活性の定量法は、単にエンドポイント法によってもア
ンモニアを含有する試料中のアンモニアを反応生成物と
する基質もしくは酵素活性を定量できるし、また適量な
アンモニアを反応生成物として生じせしめる酵素の量を
選択することによって、レイトアセイ（ｒａｔｅ ｅａ
ｓｓｙ）にて目的を達成できる。
以下に本発明の態様を実施例によって示す。
実施例１゜
ＧＭＰ合成酵素による！！ｃ料中のアンモニアの消去と
試料中のグアナーゼ活性の測定。
試料中のグアナーゼ活性の測定。
試薬Ａ
試薬Ｂ
クアニン塩酸塩 １０ｍ１ｌＧ Ｌ Ｄ
Ｈ１０１ ｃｒ −Ｋ Ｇ ｌＯｍＭＮ
Ａ Ｄ Ｐ ＨＯ，５ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０） ０．１Ｍ１、
９ ｇｏ＋ｌの試薬Ａ１．９３ｍ１に０．５ｎ＋Ｍアン
モニア及び種々の濃度のグアナーゼ含有試料２０μ！（
試料Ｎ（ｋｌ グアナーゼ０．１４ｕ／ａ＋ｌ 、
ｋ ２ ０．５６ｕ／ｍｌ。
Ｈ１０１ ｃｒ −Ｋ Ｇ ｌＯｍＭＮ
Ａ Ｄ Ｐ ＨＯ，５ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０） ０．１Ｍ１、
９ ｇｏ＋ｌの試薬Ａ１．９３ｍ１に０．５ｎ＋Ｍアン
モニア及び種々の濃度のグアナーゼ含有試料２０μ！（
試料Ｎ（ｋｌ グアナーゼ０．１４ｕ／ａ＋ｌ 、
ｋ ２ ０．５６ｕ／ｍｌ。
Ｈａ ３１．２ｕ／ｍｌ ）を添加し、それぞれ３０℃
で５分間反応させた。
で５分間反応させた。
次に１１の試薬液Ｂを上記の反応液に添加し３０℃、５
分間反応後、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定した。
分間反応後、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定した。
これを次式により計Ｈした結果、試料中に存在していた
アンモニア０．５ｍＭは完全に消去されており、試料の
グアナーゼ活仲は正確に定量された。
アンモニア０．５ｍＭは完全に消去されており、試料の
グアナーゼ活仲は正確に定量された。
グアナーゼ活性
Δε ：！Ｉ＾叶Ｈ減少による吸光度の減少６．２
：ＮＡＤＡｌＯ２ｍＭ（Ｄ吸光度５ ：反応時間（分） ３．０：全反応液Ｍ ０．０２ ・試＊、１ｆｆｌ なお、別途に試薬Ａに０．５ｍ１４のアンモニアを含有
する試料を添加、反応５分後のアンモニアをＧＬＤｌｌ
を用いて測定した結果、反応Ｎｋ中にアンモニアは検出
されなかった。
：ＮＡＤＡｌＯ２ｍＭ（Ｄ吸光度５ ：反応時間（分） ３．０：全反応液Ｍ ０．０２ ・試＊、１ｆｆｌ なお、別途に試薬Ａに０．５ｍ１４のアンモニアを含有
する試料を添加、反応５分後のアンモニアをＧＬＤｌｌ
を用いて測定した結果、反応Ｎｋ中にアンモニアは検出
されなかった。
実施例２
試２ＭＢ１：ＡＴＰｙ−ゼ１０ＬＩを加えＮへ口ｐＨを
０、０５ｄ用いる他は実施例１と同様に実施して次の結
果を得た。
０、０５ｄ用いる他は実施例１と同様に実施して次の結
果を得た。
実施例３゜
ＧＭＰ合成酵素による試料中のアンモニアの消去とクレ
アチニンデイミナーゼによる試料中のクレアチニンの定
量 試薬Ａ ＸＭＰ １ＱａｌｌＡＴＰ
ＩＯｍＭＧＭＰ合成酵累
ＩＨ トリス塩酸緩衝液（ρ）１８．５） Ｏ，１Ｍ試薬
Ｂ クレアチニン テ′イミナーゼ ｌ０ＵＧ Ｌ Ｄ
Ｈ１００ α−Ｋ Ｇ １ＯｄＮ Ａ
Ｄ Ｐ Ｈ０，５ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０） ０．１＆
１１、９８ｍｌの試薬Δ（１，９８ｍ１ ）に０．５ｍ
１１７７％＝アを含む種々の濃度のクレアチニン含有試
料２０μｍ （試ＬＩＮｃｈ Ｉ ９ し７ チニ７
含’；１０．Ｉ ｍｇ ／ｍｌ 。
アチニンデイミナーゼによる試料中のクレアチニンの定
量 試薬Ａ ＸＭＰ １ＱａｌｌＡＴＰ
ＩＯｍＭＧＭＰ合成酵累
ＩＨ トリス塩酸緩衝液（ρ）１８．５） Ｏ，１Ｍ試薬
Ｂ クレアチニン テ′イミナーゼ ｌ０ＵＧ Ｌ Ｄ
Ｈ１００ α−Ｋ Ｇ １ＯｄＮ Ａ
Ｄ Ｐ Ｈ０，５ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０） ０．１＆
１１、９８ｍｌの試薬Δ（１，９８ｍ１ ）に０．５ｍ
１１７７％＝アを含む種々の濃度のクレアチニン含有試
料２０μｍ （試ＬＩＮｃｈ Ｉ ９ し７ チニ７
含’；１０．Ｉ ｍｇ ／ｍｌ 。
ｋ２ ０．５ｍｇ／ｍｌ。Ｔｈ３ １．０ｍｇ／＋＋１
）を添加し、それぞれ３０℃で５分間反応させた。次に
１１の試薬液Ｂを上記の反応液に添加し３０℃。
）を添加し、それぞれ３０℃で５分間反応させた。次に
１１の試薬液Ｂを上記の反応液に添加し３０℃。
５分間反応後、３４Ｑｎｓの吸光度の減少を測定した。
これを次式により計算した結果、試料中に存在していた
アンモニア０．５ｍＭは完全に消去されており、試料の
クレアチニン含量が正確に定量された。
アンモニア０．５ｍＭは完全に消去されており、試料の
クレアチニン含量が正確に定量された。
クレアチニン逗（Ｍ）（呵／ｍｌ ）
ΔＥ：Ｎ＾１１１１減少による吸光度の減少６．２：Ｎ
Ａ０Ｐ１１のｌｓ＋Ｍの吸光度３．０＝全反応液量 ０．０２ ：試料量 １１３：クレアチニンの分子ｍ なお、別途に試薬Ａに０．５ｓＭのアンモニアを含有さ
せた試料を添加、反応５分後のアンモニアをＧＬＯＨを
用いて測定した結果、反応液中にアンモニアは検出され
なかった。
Ａ０Ｐ１１のｌｓ＋Ｍの吸光度３．０＝全反応液量 ０．０２ ：試料量 １１３：クレアチニンの分子ｍ なお、別途に試薬Ａに０．５ｓＭのアンモニアを含有さ
せた試料を添加、反応５分後のアンモニアをＧＬＯＨを
用いて測定した結果、反応液中にアンモニアは検出され
なかった。
実施例４゜
クレアチニン含有試帳を下記表に示すものを用い、試薬
液ＢにデコイニンｌｚＭを加え、ＮＡ［ｌＰＨを０、０
５ｍＭ用い、トリス塩酸ｖ＆衝液（ｐＨ８，０）を用い
る以外は実施例３と同様に実施して下記の結果を邊だ。
液ＢにデコイニンｌｚＭを加え、ＮＡ［ｌＰＨを０、０
５ｍＭ用い、トリス塩酸ｖ＆衝液（ｐＨ８，０）を用い
る以外は実施例３と同様に実施して下記の結果を邊だ。
実施例６゜
グルタミン合成酵素による試料中のアンモニアの消去で
クレアチニン デイミナーゼによる試料中のクレアチニ
ンの定】 一笠ＩＡ− Ｌ−グルタミン酸 １０１Ｉ１０１ＩＩ
ＩＱｍＭグルタミン酸合成
ｕｓ ｌａｕトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５１
０，１１１試薬Ｂ クレアチニン デイミナーゼ １０１１ＧＬＤＨＩＱ
Ｕ α−ＫＧ １０ａ＋ＭＮ
ＡＤＰＨ０，０５ａＭ メチオニン スルフオキサイド １ｍｊｌトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０） ０．１ Ｍｌ、９８ｍ
１の試薬ＡにＱ、５ａｌｌアンモニアを含ム種々の濃度
を調整したクレアチニン含有試料２０μ！（試料Ｎ１１
ｌ クレアチニン含量 ０．２−ｇ／ｌ、胤２０．４
■、Ｎａ３０．８■／＋ｎｌ ）を添加し、それぞれ３
０℃で５分間反応させた。
クレアチニン デイミナーゼによる試料中のクレアチニ
ンの定】 一笠ＩＡ− Ｌ−グルタミン酸 １０１Ｉ１０１ＩＩ
ＩＱｍＭグルタミン酸合成
ｕｓ ｌａｕトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５１
０，１１１試薬Ｂ クレアチニン デイミナーゼ １０１１ＧＬＤＨＩＱ
Ｕ α−ＫＧ １０ａ＋ＭＮ
ＡＤＰＨ０，０５ａＭ メチオニン スルフオキサイド １ｍｊｌトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０） ０．１ Ｍｌ、９８ｍ
１の試薬ＡにＱ、５ａｌｌアンモニアを含ム種々の濃度
を調整したクレアチニン含有試料２０μ！（試料Ｎ１１
ｌ クレアチニン含量 ０．２−ｇ／ｌ、胤２０．４
■、Ｎａ３０．８■／＋ｎｌ ）を添加し、それぞれ３
０℃で５分間反応させた。
次に１１の試薬液Ｂ（Ｉａ＋Ｉ）を上記の反応液に添加
し、３０℃ ５分間反応後、３４０ｎｌｌｌの吸光度の
減少を測定した。
し、３０℃ ５分間反応後、３４０ｎｌｌｌの吸光度の
減少を測定した。
これを実施例３と同様計算して報告、試料中に存在して
いたアンモニア ０．５ｍＭＨは完全に消去されており
、試料中のクレアチニンの含量は正確に定量できた。
いたアンモニア ０．５ｍＭＨは完全に消去されており
、試料中のクレアチニンの含量は正確に定量できた。
実施例７゜
アスパラギン合成酵素による試料中のアンそニアの消去
とクレアチニンデイミナーゼにる試料中のクレアチニン
の定量 一星ＩＡ− Ｌ−アスパラギン酸 ｌＯＩＩＩＭＡＴＰ
ＩＱｌｌＩＭアスパラギン合成
酵素 １０１１トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）
Ｏ，ＩＭ試薬Ｂ クレアチニン デイミナーゼ １０ｕＧＲＤＨＩＯＵ ご−ＫＧ １０巾ＭＮＡＤＰＨ
Ｏリ５ 巾１．ｌ モリブデン酸 ０．４ｍシトリス
塩酸経ｌ！ｉ液（ｐＨ１８，０） ０． ｉ
：Ｊｌ、９８ｍ１の試薬ＡにＱ、５ｄアンモニアを含む
ｌ々の濃度にＦ！整したクレアチニン含を試料２０μ！
（試料に１ クレアチニン含ｇ１０．２ ｇａｇ／ｍｌ
、 Ｎａ２ ０．４ｍｇ／ｍｌ、 ｋ３ ０．８
ｍｇ／ｍｌ）を溶かし、それぞれ３０℃で５分間反応さ
せた。
とクレアチニンデイミナーゼにる試料中のクレアチニン
の定量 一星ＩＡ− Ｌ−アスパラギン酸 ｌＯＩＩＩＭＡＴＰ
ＩＱｌｌＩＭアスパラギン合成
酵素 １０１１トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）
Ｏ，ＩＭ試薬Ｂ クレアチニン デイミナーゼ １０ｕＧＲＤＨＩＯＵ ご−ＫＧ １０巾ＭＮＡＤＰＨ
Ｏリ５ 巾１．ｌ モリブデン酸 ０．４ｍシトリス
塩酸経ｌ！ｉ液（ｐＨ１８，０） ０． ｉ
：Ｊｌ、９８ｍ１の試薬ＡにＱ、５ｄアンモニアを含む
ｌ々の濃度にＦ！整したクレアチニン含を試料２０μ！
（試料に１ クレアチニン含ｇ１０．２ ｇａｇ／ｍｌ
、 Ｎａ２ ０．４ｍｇ／ｍｌ、 ｋ３ ０．８
ｍｇ／ｍｌ）を溶かし、それぞれ３０℃で５分間反応さ
せた。
１Ｉ１１１の試薬液Ｂを上記の反応液に添加し、３０℃
５分間反応後３４Ｑｎｍにおける反応液吸光度の減少
を測定した。
５分間反応後３４Ｑｎｍにおける反応液吸光度の減少
を測定した。
これを実施例３と間様に計算した結果、試料中にすでに
（′ｆ在していたアンモニア０．５ｄは完全に消去され
ており、試料中のクレアチニンの含ｍは正確に定量する
ことができた。
（′ｆ在していたアンモニア０．５ｄは完全に消去され
ており、試料中のクレアチニンの含ｍは正確に定量する
ことができた。
発明の効果
本発明方法によると、アンモニアを含有する試料中のア
ンモニアを酊崇的に消去することにより、アンモニアを
反応生成物とする酵素の活性及びアンモニアを生成物と
する基質を精度良く測定できる。
ンモニアを酊崇的に消去することにより、アンモニアを
反応生成物とする酵素の活性及びアンモニアを生成物と
する基質を精度良く測定できる。
Claims (1)
- アンモニアを含有する試料中の基質または酵素活性をア
ンモニアを生成する反応系を利用して定量する方法にお
いて、試料にアンモニア消去系試薬を加えてアンモニア
を消去した後、測定すべき基質または酵素活性の定量に
必要な試薬を加えてアンモニアを生成させ、該生成アン
モニアを定量することを特徴とする基質または酵素活性
の定量法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17804984A JPS6156095A (ja) | 1984-08-27 | 1984-08-27 | 基質または酵素活性の定量法 |
| EP85110679A EP0173276A3 (en) | 1984-08-27 | 1985-08-26 | Method for the determination of substrate or enzyme activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17804984A JPS6156095A (ja) | 1984-08-27 | 1984-08-27 | 基質または酵素活性の定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6156095A true JPS6156095A (ja) | 1986-03-20 |
Family
ID=16041702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17804984A Pending JPS6156095A (ja) | 1984-08-27 | 1984-08-27 | 基質または酵素活性の定量法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0173276A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6156095A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0664056B2 (ja) * | 1987-04-16 | 1994-08-22 | 富士写真フイルム株式会社 | アンモニア生成物質定量用一体型多層分析要素 |
| CN109085160A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-12-25 | 天津市宝坻区人民医院 | 血清中鸟嘌呤的测定方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE27524E (en) * | 1965-10-22 | 1972-11-28 | Enzymatic determination of nitrogen- containing compounds and enzymes reactive therewith | |
| FR2336684A1 (fr) * | 1975-12-24 | 1977-07-22 | Chang Michael Moon Ki | Composition et procede pour doser l'uree |
| IT1137262B (it) * | 1981-06-26 | 1986-09-03 | Erba Farmitalia | Metodo automatico su flusso continuo per il dosaggio della creatinina con creatinina desimidasi immobilizzata |
| DE3271643D1 (en) * | 1981-07-08 | 1986-07-17 | Ici Plc | Method for the purification of urease and glutamate dehydrogenase |
-
1984
- 1984-08-27 JP JP17804984A patent/JPS6156095A/ja active Pending
-
1985
- 1985-08-26 EP EP85110679A patent/EP0173276A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0173276A2 (en) | 1986-03-05 |
| EP0173276A3 (en) | 1988-08-24 |
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