JPS6152294A - 植物ゲノムへの外来性ｄｎａの導入方法 - Google Patents
植物ゲノムへの外来性ｄｎａの導入方法Info
- Publication number
- JPS6152294A JPS6152294A JP60118982A JP11898285A JPS6152294A JP S6152294 A JPS6152294 A JP S6152294A JP 60118982 A JP60118982 A JP 60118982A JP 11898285 A JP11898285 A JP 11898285A JP S6152294 A JPS6152294 A JP S6152294A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- agrobacterium
- plasmid
- regions
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）
のＴｉ（腫瘍誘発）−及びＲｉ （根誘発）−プラスミ
ドのＴ−領域は高等植物の細胞に自然に移行し、ここで
このＤＮＡはゲノムに導入され、そして発現される。こ
のＴ−領域又は任意の人工的Ｔ−領領域移行はまた、前
記細菌中でＶｉｒ−領域に本質的ビルシラス（ｖｉｒｕ
ｌｅｎｃｅ ）遺伝子を含有するプラスミドに近接した
別のプラスミド上に前記領域が存在する場合にも生ずる
（いわゆる２連ベクター系、オランダ特許出願Ａ ８３
００６９８ ：及び単子葉植物の遺伝的操作についての
オランダ特許出願遥８４０１０４８）。ここに記載する
驚くべき新規な発明はこの２連ベクター系の延長上に基
礎を置いておυ、この方法においては無傷のＴ−領域又
は人工的Ｔ−領領域トランスポゾン（Ｔｎ１８８２）の
部分としてアグロバクテリウムの染色体に導入され、そ
してＶｉｒ−領域が補助プラスミド上に存在す２、。
のＴｉ（腫瘍誘発）−及びＲｉ （根誘発）−プラスミ
ドのＴ−領域は高等植物の細胞に自然に移行し、ここで
このＤＮＡはゲノムに導入され、そして発現される。こ
のＴ−領域又は任意の人工的Ｔ−領領域移行はまた、前
記細菌中でＶｉｒ−領域に本質的ビルシラス（ｖｉｒｕ
ｌｅｎｃｅ ）遺伝子を含有するプラスミドに近接した
別のプラスミド上に前記領域が存在する場合にも生ずる
（いわゆる２連ベクター系、オランダ特許出願Ａ ８３
００６９８ ：及び単子葉植物の遺伝的操作についての
オランダ特許出願遥８４０１０４８）。ここに記載する
驚くべき新規な発明はこの２連ベクター系の延長上に基
礎を置いておυ、この方法においては無傷のＴ−領域又
は人工的Ｔ−領領域トランスポゾン（Ｔｎ１８８２）の
部分としてアグロバクテリウムの染色体に導入され、そ
してＶｉｒ−領域が補助プラスミド上に存在す２、。
この方法によって細菌染色体中に導入されたＴ−領域は
植物細胞に効果的に移行し、ここで植物り゛ツムに組み
込まれそして発現されるようである。
植物細胞に効果的に移行し、ここで植物り゛ツムに組み
込まれそして発現されるようである。
この発明は壕だ、Ｖｉｒ−領域がアグロバクテリウムの
細菌染色体に導入されそしてＴ−領域がプラスミド上に
存在するか、又はＶｉｒ−領域及びＴ −領域がアグロ
バクテリウムの細菌染色体に導入されていれば、やはり
２連系を使用することができることを記録する。この新
規な発明を用いて、双子葉植物及び単子葉植物の細胞の
遺伝的操作のフ仁めの新規な方法を開発することができ
る。外米性ＤＮＡを双子葉植物又は単子葉植物の細胞に
導入で１−る新規な可能性；成分の１方又は両方が細菌
中にもはやルーズなレプリコンとして存在しない、アグ
ロバクテリウムにおいて使用することができン）２連ベ
クター系が提供される。
細菌染色体に導入されそしてＴ−領域がプラスミド上に
存在するか、又はＶｉｒ−領域及びＴ −領域がアグロ
バクテリウムの細菌染色体に導入されていれば、やはり
２連系を使用することができることを記録する。この新
規な発明を用いて、双子葉植物及び単子葉植物の細胞の
遺伝的操作のフ仁めの新規な方法を開発することができ
る。外米性ＤＮＡを双子葉植物又は単子葉植物の細胞に
導入で１−る新規な可能性；成分の１方又は両方が細菌
中にもはやルーズなレプリコンとして存在しない、アグ
ロバクテリウムにおいて使用することができン）２連ベ
クター系が提供される。
この発明は、高等植物の細胞の遺伝的操作のノにめに適
切なアグロバクテリウム系統の改良に関する。
切なアグロバクテリウム系統の改良に関する。
（３）−、−
アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｒｎｅｆａｃｉｅｎｓ ）の腫
瘍形成株中に自然に存在する大プラスミド（Ｔｉ−プラ
スミド）は、双子葉植物上での腫瘍形成を担当する〔フ
ァンラレペック等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ ）
（ロンドン）２５２．１６９−１７０（１９７４）：ザ
エネン等、Ｆ１モルビオロ、（Ｆ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ
ｌ、 ） ８６ 、１０９−］ ２７（１９７４）：）
。Ｔ−領域と称されるＴｉ−シラスミドの特異的部分が
細菌により植物細胞に移行し、そしてコアＤＮＡ ［組
み込まれる〔チルトン等、セル（Ｃｅ１ｌ）１１ 、’
２６３−２７１ （１９７７））。
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｒｎｅｆａｃｉｅｎｓ ）の腫
瘍形成株中に自然に存在する大プラスミド（Ｔｉ−プラ
スミド）は、双子葉植物上での腫瘍形成を担当する〔フ
ァンラレペック等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ ）
（ロンドン）２５２．１６９−１７０（１９７４）：ザ
エネン等、Ｆ１モルビオロ、（Ｆ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ
ｌ、 ） ８６ 、１０９−］ ２７（１９７４）：）
。Ｔ−領域と称されるＴｉ−シラスミドの特異的部分が
細菌により植物細胞に移行し、そしてコアＤＮＡ ［組
み込まれる〔チルトン等、セル（Ｃｅ１ｌ）１１ 、’
２６３−２７１ （１９７７））。
組み込まれたＤＮＡは発現され〔ウイルミッチェル等、
モレキュラー・アンド・ゼネラルゼネティクス（Ｍｏ１
．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 ） １８２ 、２５５−２６
２（１９８１）、そしてこの発現が植物病クラウンゴー
ル（Ｃｒｏｗｎ Ｇａ１ｌ）の分子的基礎を形成する。
モレキュラー・アンド・ゼネラルゼネティクス（Ｍｏ１
．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 ） １８２ 、２５５−２６
２（１９８１）、そしてこの発現が植物病クラウンゴー
ル（Ｃｒｏｗｎ Ｇａ１ｌ）の分子的基礎を形成する。
生成した腫瘍細胞は、正常な植物細胞と異Ｑ１植物ホル
モンであるオーキシン及びサイトカイニンを添加するこ
となく合成培地上で増殖することができる〔ユブラウム
、プロシーデインダス・オプ・ザ・ナシュナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンシス（Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、）４４．３４４：３４９（１９５８）］。
モンであるオーキシン及びサイトカイニンを添加するこ
となく合成培地上で増殖することができる〔ユブラウム
、プロシーデインダス・オプ・ザ・ナシュナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンシス（Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、）４４．３４４：３４９（１９５８）］。
腫腫細胞はさらに、オパインと称される特異的化合物を
含有し、このオパインは正常細胞中には存在せずそして
その遺伝情報は移行したＴ −ＤＮＡ上にコードされて
いる〔ボムホフ等、モレキュラー・アンド・ゼネラルゼ
ネティクス（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ）１４５
．１７７：１８１（１９７６）：シュレーダー等。
含有し、このオパインは正常細胞中には存在せずそして
その遺伝情報は移行したＴ −ＤＮＡ上にコードされて
いる〔ボムホフ等、モレキュラー・アンド・ゼネラルゼ
ネティクス（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ）１４５
．１７７：１８１（１９７６）：シュレーダー等。
ＦＥＢＳレター（ＦＥＢＳＬｅｔｔ）１２９．１６６−
１６８（１９８１）：）。
１６８（１９８１）：）。
植物細胞中に見出されるＴ−領域のほかに、Ｔ−プラス
ミドは細菌の毒性（ｖｌｒｕｌｅｎｃａ ｑｕａｌｉｔ
ｙ）に必須である第２領域を含有する〔オムス等、ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、）１４４．８２−９１ （１９８０）ニガーフィ
ンケル等。
ミドは細菌の毒性（ｖｌｒｕｌｅｎｃａ ｑｕａｌｉｔ
ｙ）に必須である第２領域を含有する〔オムス等、ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、）１４４．８２−９１ （１９８０）ニガーフィ
ンケル等。
ジャーナル・オプ・バクテリオロジ−（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） １４４．７３２−７４３ （
１９８０）］。この領域は腫瘍細胞中には見出されてお
らず、そして遺伝的分析により、この領域の変異（非常
に弱い毒性又は完全な無毒化を導く）はクローン又はＲ
プライムプラスミド上に存在する野性形遺伝子により補
完され得るインドランス（Ｉｎｔｒａｎｓ ）であるこ
とが示された〔）・イル等、プラスミド・（Ｐｌａｓｍ
ｉｄ）７ 、１９７１１８（１９８２）：クレー等。
１９８０）］。この領域は腫瘍細胞中には見出されてお
らず、そして遺伝的分析により、この領域の変異（非常
に弱い毒性又は完全な無毒化を導く）はクローン又はＲ
プライムプラスミド上に存在する野性形遺伝子により補
完され得るインドランス（Ｉｎｔｒａｎｓ ）であるこ
とが示された〔）・イル等、プラスミド・（Ｐｌａｓｍ
ｉｄ）７ 、１９７１１８（１９８２）：クレー等。
ジャーナル・オブ・ノ々クテリオロジー（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）１５０．３２７−３３１ ）］
。このＶｉｒ（毒性）領域中には７個の遺伝子座、すな
わちＶｉｒＡ、Ｂ、Ｃ，ＤＳＥＳＦ、及びＧが存在する
〔クレー等、ジャーナル・オブ・ｉＺクチ１ノオロジ−
（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） １５０．３２７−３
３１ （１９８２） ：ハイル等、プラスミド（Ｐｌａ
ｓｍｉｄ） ７ 、１０７−１．１８（１９８２）；ホ
ーイカース等、印刷中〕。
。このＶｉｒ（毒性）領域中には７個の遺伝子座、すな
わちＶｉｒＡ、Ｂ、Ｃ，ＤＳＥＳＦ、及びＧが存在する
〔クレー等、ジャーナル・オブ・ｉＺクチ１ノオロジ−
（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） １５０．３２７−３
３１ （１９８２） ：ハイル等、プラスミド（Ｐｌａ
ｓｍｉｄ） ７ 、１０７−１．１８（１９８２）；ホ
ーイカース等、印刷中〕。
Ｖｉｒ−領域及びＴ−領域は、２つの適合性プラスミド
上に相互に物理的に分離されていてもよく、これによっ
てＴ−領域又は人工的Ｔ−領領域植物細胞に導入するア
グロバクテリウムの能力に対して負の影響はなんら与え
られない〔ヘケマ等、ネイチーアー（Ｎａｔｕｒｅ）
（ロンドン） ３０３，１７９−１８０（１９８３）〕
。この発明を基礎にする２連ベクター系は、植物細胞の
遺伝的操作のために使用することかできる。（オランダ
特許出願扁８３００６９８及びヨーロッ・ぐ特許出願＆
、 ８４２００２３９６、並びにオランダ特許出願扁８
４０１０４８に記載されている）。
上に相互に物理的に分離されていてもよく、これによっ
てＴ−領域又は人工的Ｔ−領領域植物細胞に導入するア
グロバクテリウムの能力に対して負の影響はなんら与え
られない〔ヘケマ等、ネイチーアー（Ｎａｔｕｒｅ）
（ロンドン） ３０３，１７９−１８０（１９８３）〕
。この発明を基礎にする２連ベクター系は、植物細胞の
遺伝的操作のために使用することかできる。（オランダ
特許出願扁８３００６９８及びヨーロッ・ぐ特許出願＆
、 ８４２００２３９６、並びにオランダ特許出願扁８
４０１０４８に記載されている）。
ここに記載する結果は２連系の成分がプラスミド上に存
在することが必須要件では々いことを示す。成分（Ｔ−
又はＶｉｒ−領域）は別々に又は両者ともアグロバクテ
リウムの染色体中に組み込まれることができ、これによ
って、Ｔ−領域又は人工的Ｔ−領領域植物細胞に移行し
そして次に植物ゲノムに組み込まれることに対する負の
効果が生じ々い。この発明は、細菌がＤＮＡを植物細胞
に移行させることを可能にする分子的操作に強力な光を
投するのみならず、２連系によりもたらされる高等植物
の遺伝的操作の可能性の明らかな拡大を意味する。
在することが必須要件では々いことを示す。成分（Ｔ−
又はＶｉｒ−領域）は別々に又は両者ともアグロバクテ
リウムの染色体中に組み込まれることができ、これによ
って、Ｔ−領域又は人工的Ｔ−領領域植物細胞に移行し
そして次に植物ゲノムに組み込まれることに対する負の
効果が生じ々い。この発明は、細菌がＤＮＡを植物細胞
に移行させることを可能にする分子的操作に強力な光を
投するのみならず、２連系によりもたらされる高等植物
の遺伝的操作の可能性の明らかな拡大を意味する。
Ｔｉ−プラスミドのＴ−領域を異る位置においてアグロ
バクテリウムのｒツムに挿入する目的で、その上に完全
なＴ−領域が存在するトランスポゾンＴｎ１８８２をイ
ン−ビトロ造成した。−緒になって完全なＴ−領域を構
成する３種の制限酵素断片、すなわちＥｃｏＲＩ断片］
Ｏａ、 ＢａｍＨＩ断片１７ａ及びＫｐｎＩ断片９を
別々にクローニングし、そしてトランスポゾンＴｎ３
（Δ５−６５）中の後記の無傷のＴ−領域を構成するだ
めの３段階クローニングにおいて使用した。使用された
このトランス接合体〔コストリケン等、プロシーデイン
ダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ７８．４０４１−４０４５ ）は、トランス接合
体の移動又はそのアンピシリン耐性のために必須でない
位置にＩ ｃ ｏＲＩ部位が導入されたＴｎ３の誘導体
である。次に、このトランスポゾンを、ＥｃｏＲＩ部位
を含有しないＥ、コリベクタープラスミドｐＴＲ２６２
［、ロバート等、ジーン（Ｇｅｎｅ）１２．１２３−１
２７（１９８０）］に挿入した。
バクテリウムのｒツムに挿入する目的で、その上に完全
なＴ−領域が存在するトランスポゾンＴｎ１８８２をイ
ン−ビトロ造成した。−緒になって完全なＴ−領域を構
成する３種の制限酵素断片、すなわちＥｃｏＲＩ断片］
Ｏａ、 ＢａｍＨＩ断片１７ａ及びＫｐｎＩ断片９を
別々にクローニングし、そしてトランスポゾンＴｎ３
（Δ５−６５）中の後記の無傷のＴ−領域を構成するだ
めの３段階クローニングにおいて使用した。使用された
このトランス接合体〔コストリケン等、プロシーデイン
ダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ７８．４０４１−４０４５ ）は、トランス接合
体の移動又はそのアンピシリン耐性のために必須でない
位置にＩ ｃ ｏＲＩ部位が導入されたＴｎ３の誘導体
である。次に、このトランスポゾンを、ＥｃｏＲＩ部位
を含有しないＥ、コリベクタープラスミドｐＴＲ２６２
［、ロバート等、ジーン（Ｇｅｎｅ）１２．１２３−１
２７（１９８０）］に挿入した。
得られたプラスミドＩ）ＲＡＬ３１０３のユ＝−りＥｃ
ｏＲＩ部位にｐＴｉＢ６のＥ ｃ ｏ ＲＩ断片をクロ
ーン化した。
ｏＲＩ部位にｐＴｉＢ６のＥ ｃ ｏ ＲＩ断片をクロ
ーン化した。
次の段階において、ＥｃｏＲＩ断片１． Ｏａと部分的
にオーバーラツプするＢａｍＨＩ断片１７ａを天然Ｂａ
ｍＨ１部位［パーカー等、プラント・モレキュラー・バ
イオロジー（Ｐｌａｎｔ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ） ２
、３３５−３５０（１９８３）による位置１３．７７
４：］に配置した。この目的のために、旦ｃｏＲＩ断片
を有するＴＴ１３由来トランスポゾンを、イン−ビトロ
除去によりＢａｍＴ（Ｉ部位が除去されたプラスミドで
あるｐＲＡＬ３１０２に伝達した。これに達するため、
プラスミドｐＲＡＬ３１０２をｐＡＬ］１５５ （Ｒ７
７Ｚ： Ｔｎ１８８０）が存在するＥ、コリ株に形質転
換した。得られた株を空のＥ、コリ系統への交差導入（
ｃｒｏｓｓ−ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ）における
供与体として使用した。ｐＡ、Ｌｌｌ、５５によるｐＲ
ＡＬ３１０２の変性についての選択により、２つのタイ
プのトランス接合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）
が得られた。Ｔｎ１８８０がｐＲＡＬ３１０２に移行し
たトランス接合体を、プラスミドＤＮＡを単離しそして
ｐＲＡＬ３１０２及びＴｎ１８８０のマーカーのために
空のＥ、コリを再び形質転換するためにこのＤＮＡを使
用することにより精製した。こうして、トランスホゾｙ
Ｔｎ１８８０が存在するｐＲＡＬ３９５５を得た。シラ
スミド３９５５上のＴｎ１８８０のユニークシ皿部位中
にＢａｍＨｌ［断片１７ａを正しい位置にクローン化し
た（第１図）。こうして得られたプラスミドｐＲＡＬ３
９５６は今やＴ−領域遺伝子３．６ａ、６ｂ及び遺伝子
４の右側部分を、移転因子上に存在する中断されていな
いＤＮＡ片として含有する。次に、ＫｐｎＩ断片９をｐ
ＲＡＬ３９５６のユニークＫｐｎＩ部位中の自然の位置
（位置９８３４）に正しい方向にクローン化した。こう
して得られたプラスミドｐＲＡＬ３５９７はＴｉＢ６プ
ラスミドの無傷のＴ−領域を含んで成るトランスポゾン
Ｔｎ１８８２を含有する。
にオーバーラツプするＢａｍＨＩ断片１７ａを天然Ｂａ
ｍＨ１部位［パーカー等、プラント・モレキュラー・バ
イオロジー（Ｐｌａｎｔ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ） ２
、３３５−３５０（１９８３）による位置１３．７７
４：］に配置した。この目的のために、旦ｃｏＲＩ断片
を有するＴＴ１３由来トランスポゾンを、イン−ビトロ
除去によりＢａｍＴ（Ｉ部位が除去されたプラスミドで
あるｐＲＡＬ３１０２に伝達した。これに達するため、
プラスミドｐＲＡＬ３１０２をｐＡＬ］１５５ （Ｒ７
７Ｚ： Ｔｎ１８８０）が存在するＥ、コリ株に形質転
換した。得られた株を空のＥ、コリ系統への交差導入（
ｃｒｏｓｓ−ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ）における
供与体として使用した。ｐＡ、Ｌｌｌ、５５によるｐＲ
ＡＬ３１０２の変性についての選択により、２つのタイ
プのトランス接合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）
が得られた。Ｔｎ１８８０がｐＲＡＬ３１０２に移行し
たトランス接合体を、プラスミドＤＮＡを単離しそして
ｐＲＡＬ３１０２及びＴｎ１８８０のマーカーのために
空のＥ、コリを再び形質転換するためにこのＤＮＡを使
用することにより精製した。こうして、トランスホゾｙ
Ｔｎ１８８０が存在するｐＲＡＬ３９５５を得た。シラ
スミド３９５５上のＴｎ１８８０のユニークシ皿部位中
にＢａｍＨｌ［断片１７ａを正しい位置にクローン化し
た（第１図）。こうして得られたプラスミドｐＲＡＬ３
９５６は今やＴ−領域遺伝子３．６ａ、６ｂ及び遺伝子
４の右側部分を、移転因子上に存在する中断されていな
いＤＮＡ片として含有する。次に、ＫｐｎＩ断片９をｐ
ＲＡＬ３９５６のユニークＫｐｎＩ部位中の自然の位置
（位置９８３４）に正しい方向にクローン化した。こう
して得られたプラスミドｐＲＡＬ３５９７はＴｉＢ６プ
ラスミドの無傷のＴ−領域を含んで成るトランスポゾン
Ｔｎ１８８２を含有する。
Ｔｎ１８８２が確かに機能的Ｔ−領領域含有するか否か
を点検するため、ビルシラスプラスミドｐＡＬ４４０４
及びこれと適合性の、Ｔｎ１８８２が存在するシラスミ
ドを含有するアグロバクテリウムを造成した。このため
、Ｔｎ１８８２をプラスミドＲ７７２に挿入した。プラ
スミドＲ７７２を、ｐＲＡＬを含有するＥ、コリ中に交
差導入した。Ｔｎ１８８２のＡｐ の伝達についての
選択を伴う空の細菌への交差導入は２種辺のトランス接
合体をもたらす。このことは、プラスミドＲ７７２が低
頻度でｐＲＡＬ３９５７と共に移行された表示中にｐＲ
ＡＬが存在する他の表示、又は転移によってＴｎ１８８
２がＲ７７２上に着くことができることから説明される
。２称類のトランス接合体の１つ中にトランスポゾンＲ
７７２が存在することは、制限酵素によシ処理されたプ
ラスミドＤＮＡの電気泳動により確立された。Ｔｎ１８
８２を有するＲ７７２プラスミドをｐＡＴ、１１５７と
称する。次に、プラスミドｐＡＬ１１５７を接合により
ＬＢＡ４．４０４（ｐＡＬ４４０４）に入れた。ＬＢＡ
４４０４ （Ｐａｌ ４４０４ 。
を点検するため、ビルシラスプラスミドｐＡＬ４４０４
及びこれと適合性の、Ｔｎ１８８２が存在するシラスミ
ドを含有するアグロバクテリウムを造成した。このため
、Ｔｎ１８８２をプラスミドＲ７７２に挿入した。プラ
スミドＲ７７２を、ｐＲＡＬを含有するＥ、コリ中に交
差導入した。Ｔｎ１８８２のＡｐ の伝達についての
選択を伴う空の細菌への交差導入は２種辺のトランス接
合体をもたらす。このことは、プラスミドＲ７７２が低
頻度でｐＲＡＬ３９５７と共に移行された表示中にｐＲ
ＡＬが存在する他の表示、又は転移によってＴｎ１８８
２がＲ７７２上に着くことができることから説明される
。２称類のトランス接合体の１つ中にトランスポゾンＲ
７７２が存在することは、制限酵素によシ処理されたプ
ラスミドＤＮＡの電気泳動により確立された。Ｔｎ１８
８２を有するＲ７７２プラスミドをｐＡＴ、１１５７と
称する。次に、プラスミドｐＡＬ１１５７を接合により
ＬＢＡ４．４０４（ｐＡＬ４４０４）に入れた。ＬＢＡ
４４０４ （Ｐａｌ ４４０４ 。
ｐＬＡ１１５７）の腫瘍原性は、試験されたすべての宿
主植物について野性型Ａ、チュメファシエンス（Ａ。
主植物について野性型Ａ、チュメファシエンス（Ａ。
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） ＬＢＡＩＯＩＯ株のそれと
同じであった。
同じであった。
この結果は、トランスポゾンＴｎ１．８８２が正常に機
能するＴ−領域を含有することを示した。
能するＴ−領域を含有することを示した。
Ｔｎ１８８２をＡ、チュメファシエンスの染色体に挿入
するため、種々の方法が使用された。第１の方法はプラ
スミドｐＲＡＬ３９５８のＥ、 ｊ ＩＪ内での造成を
含む。このプラスミドは、Ａ、チュメファシエンス中で
複製することができない接合プラスミドｐＲＫ２０１３
から誘導された。これは、原理的［”自滅プラスミド”
としてｐＲＡＬ３９５８（ｐＲＫ２０１３ ：Ｔｎｌ
８８２）を使用することができ、そしてＴｎ１８８２は
アグロバクテリウム株のゲノムに転移することによシ保
持されることができ、他方ｐＲＡＬ３９５８それ自体は
消滅することを意味する。これを達成するため、ｐＲＡ
Ｌ３９５８を有する見ヱ」株を、Ｔ＋−プラスミドを含
有しないＡ、チュメファシエンス株ＬＢＡ２８８ ヲ用
いる交差導入において１つの供与体として使用した０ Ｔｎ１８８２の耐性マーカー（ＡｐＲ）はＬＢＡ２８８
中で非常によく発現されるが、Ａｐｎの伝達は見出され
なかった。Ｅ、コリ中でのｐＲＡＬ３９５８の接合伝達
は受容体当υ３０係の頻度で生じ庭。アグロ・ぐクテリ
ウムについて見出された負の結果は、Ｔｎ１８８２がＡ
、チュメファシエンスのゲノム中に１飛び込ま”′ない
か又はほとんど飛び込１ないことを示す。発明者等はこ
の問題を、Ａ、チュメファシエンスのＤＮＡのゲノム片
をＴｎｌ、８８２のための１自滅パ供与体プラスミドに
適用することによって回避した。
するため、種々の方法が使用された。第１の方法はプラ
スミドｐＲＡＬ３９５８のＥ、 ｊ ＩＪ内での造成を
含む。このプラスミドは、Ａ、チュメファシエンス中で
複製することができない接合プラスミドｐＲＫ２０１３
から誘導された。これは、原理的［”自滅プラスミド”
としてｐＲＡＬ３９５８（ｐＲＫ２０１３ ：Ｔｎｌ
８８２）を使用することができ、そしてＴｎ１８８２は
アグロバクテリウム株のゲノムに転移することによシ保
持されることができ、他方ｐＲＡＬ３９５８それ自体は
消滅することを意味する。これを達成するため、ｐＲＡ
Ｌ３９５８を有する見ヱ」株を、Ｔ＋−プラスミドを含
有しないＡ、チュメファシエンス株ＬＢＡ２８８ ヲ用
いる交差導入において１つの供与体として使用した０ Ｔｎ１８８２の耐性マーカー（ＡｐＲ）はＬＢＡ２８８
中で非常によく発現されるが、Ａｐｎの伝達は見出され
なかった。Ｅ、コリ中でのｐＲＡＬ３９５８の接合伝達
は受容体当υ３０係の頻度で生じ庭。アグロ・ぐクテリ
ウムについて見出された負の結果は、Ｔｎ１８８２がＡ
、チュメファシエンスのゲノム中に１飛び込ま”′ない
か又はほとんど飛び込１ないことを示す。発明者等はこ
の問題を、Ａ、チュメファシエンスのＤＮＡのゲノム片
をＴｎｌ、８８２のための１自滅パ供与体プラスミドに
適用することによって回避した。
この方法は３段階（第２図）から成る。
ｊ） ＬＢＡ２８８から分離したＡ、チュメファシエ
ンスのゲノムＤＮＡをＥ６コリベクターｐＡｃＹｃ１８
４にクローン化し： １１）クローンの１つ、すなわちｐＲＡＬ３３０５にＴ
ｎ１８８２をＥ、コリ中での転移によシ導入し：そして
、 １ｉｉ）こうして作成したプラスミドｐＲＡＬ３９５９
は尤チュメファシエンス中で複製することができず、そ
してそのためにアグロバクテリウム中でＴｎｉ８８２の
ための６自滅”供与体として使用することができる。従
って、ｐＲＡＬ３９５９がＬＢＡ２８８に移行した。
ンスのゲノムＤＮＡをＥ６コリベクターｐＡｃＹｃ１８
４にクローン化し： １１）クローンの１つ、すなわちｐＲＡＬ３３０５にＴ
ｎ１８８２をＥ、コリ中での転移によシ導入し：そして
、 １ｉｉ）こうして作成したプラスミドｐＲＡＬ３９５９
は尤チュメファシエンス中で複製することができず、そ
してそのためにアグロバクテリウム中でＴｎｉ８８２の
ための６自滅”供与体として使用することができる。従
って、ｐＲＡＬ３９５９がＬＢＡ２８８に移行した。
今、Ｔｎ１８８２のＡｐＲは可能な転移によシアゾロバ
クテリウム中に保持され得るのみならず、完全なプラス
ミドがクローン化されたＡ、チュメファシエンスグノム
ＤＮＡ１片との相同組換によりゲノムに入ることもでき
る。ＬＢＡへの移行は受容体当たシ１０ の頻度で生ず
るが、Ｅ、コリでのこのプラスミドの移行は受容体癌フ
１０ の頻度で生じた。
クテリウム中に保持され得るのみならず、完全なプラス
ミドがクローン化されたＡ、チュメファシエンスグノム
ＤＮＡ１片との相同組換によりゲノムに入ることもでき
る。ＬＢＡへの移行は受容体当たシ１０ の頻度で生ず
るが、Ｅ、コリでのこのプラスミドの移行は受容体癌フ
１０ の頻度で生じた。
これらの結果から、ｐＲＡＬ３９５９はＡ、チュメファ
シエンス中で確かに複製し得ないことが明らかである。
シエンス中で確かに複製し得ないことが明らかである。
アグロバクテリウムトランス接合体の１つＬＢＡ１１６
０を詳細に分析して、Ｔｎ１８８２が本当にアグロバク
テリウムの染色体に導入されたか否かを確定した〇 アグロバクテリウム株ＬＢＡ、２８８からクローン化さ
れたゲノムＤＮＡ （ｐＲＡＬ３３０５）の断片はおそ
らく染色体、又はＬＢＡ２８８中に存在する隠れたプラ
スミ１７ ｐＡｔｃ５８から生じたものである。従って
、ＬＢＡ１１６０中でｐＲＡＬ３９５９と染色体及びｐ
ＡｔＣ５８との組換が生ずる可能性がある。ＬＢＡｌ
１６０株を遺伝的に特徴付け（ｉ及び１１）、そしてこ
の株のＤＮＡをサザンブロットハイブリダイゼーション
（１１１）により分析して両可能の間の区別を可能にし
た。
０を詳細に分析して、Ｔｎ１８８２が本当にアグロバク
テリウムの染色体に導入されたか否かを確定した〇 アグロバクテリウム株ＬＢＡ、２８８からクローン化さ
れたゲノムＤＮＡ （ｐＲＡＬ３３０５）の断片はおそ
らく染色体、又はＬＢＡ２８８中に存在する隠れたプラ
スミ１７ ｐＡｔｃ５８から生じたものである。従って
、ＬＢＡ１１６０中でｐＲＡＬ３９５９と染色体及びｐ
ＡｔＣ５８との組換が生ずる可能性がある。ＬＢＡｌ
１６０株を遺伝的に特徴付け（ｉ及び１１）、そしてこ
の株のＤＮＡをサザンブロットハイブリダイゼーション
（１１１）により分析して両可能の間の区別を可能にし
た。
ｉ）ランダムなトランスボゾン変異により隠れたプラス
ミドｐＡｔＣ５８に選択マーカーを付した。
ミドｐＡｔＣ５８に選択マーカーを付した。
この目的のため、リゾビウム・レグミノサルレム（Ｒｈ
ｉｚｏｂｉｕｍ Ｉｅｇｍｉｎｏｓａｒｕｍ）の変異に
ついて［ベーリンカー等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ
） （コント９ン）、２７６．６３３−６３４］に記載
されているようにして、ＬＢＡ２８８のためのＴｎ５供
与体として６自滅″゛プラスミドｐＪＢ４ＪＩを使用し
六〇接合実験により、多くの場合に、Ｔｎ５ばＬＢＡ２
８８中自己伝達性プラスミド上に存在することが証明さ
れた。
ｉｚｏｂｉｕｍ Ｉｅｇｍｉｎｏｓａｒｕｍ）の変異に
ついて［ベーリンカー等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ
） （コント９ン）、２７６．６３３−６３４］に記載
されているようにして、ＬＢＡ２８８のためのＴｎ５供
与体として６自滅″゛プラスミドｐＪＢ４ＪＩを使用し
六〇接合実験により、多くの場合に、Ｔｎ５ばＬＢＡ２
８８中自己伝達性プラスミド上に存在することが証明さ
れた。
このプラスミドがｐＡｔＣ５８であることが明らかにな
った（伝達頻度受容体肖り］０ ）。自己伝達するとい
うｐＡｔＣ５８のこの新しく見出された性質が、Ｔｎ１
８８２がＬＢＡ１１６０中ｐＡｔＣ５中上ＡｔＣ５８上
否かを決定するために使用された。この目的のため、Ｌ
ＢＡ１１６０及びＬＢＡ１２０１（ｐＡｔＣ５８： ：
Ｔｎ５）の両者を、相互比較のためＬＢＡ３８５との交
差導入において供与体として使用した。トランス接合体
ｐＡｔＣ５８： ：Ｔｎ５上での選択の後、予想通り、
受容体当り１０ の頻度をもって移動したことが明らか
となった。しかしながら、Ｔｎ１８８２のＡｐ の伝達
は示されなかった。このことは、供与体株ＬＢＡ１１６
０中の隠れたプラスミドルＡｔＣ５８上に存在しないと
する推定を強く示唆した。
った（伝達頻度受容体肖り］０ ）。自己伝達するとい
うｐＡｔＣ５８のこの新しく見出された性質が、Ｔｎ１
８８２がＬＢＡ１１６０中ｐＡｔＣ５中上ＡｔＣ５８上
否かを決定するために使用された。この目的のため、Ｌ
ＢＡ１１６０及びＬＢＡ１２０１（ｐＡｔＣ５８： ：
Ｔｎ５）の両者を、相互比較のためＬＢＡ３８５との交
差導入において供与体として使用した。トランス接合体
ｐＡｔＣ５８： ：Ｔｎ５上での選択の後、予想通り、
受容体当り１０ の頻度をもって移動したことが明らか
となった。しかしながら、Ｔｎ１８８２のＡｐ の伝達
は示されなかった。このことは、供与体株ＬＢＡ１１６
０中の隠れたプラスミドルＡｔＣ５８上に存在しないと
する推定を強く示唆した。
ｉｉ）選択圧が発揮されなければ１個の細菌細胞中に安
定に保持され得々い複数のプラスミドは同一の不適合ク
ラス（ｉｎｃ、）に属する。従って、フォルティオ！Ｊ
（ｆｏｒｔｉｏｒｉ）はそれ自体と不適合のプラスミ
ドである。Ｔｎ５でマークされたｐＡｔＣ５８（ＫｍＴ
ｌ）がＴｎ１８３１でマークされたｐＡｔｃ５８（Ｓｐ
）を有するＡ、チュメファシエンス株ＦｃＥ４人され
、そして入るプラスミド（Ｋｒｎ” ）が選択されれば
、不適合性により Ｓｐ”マーカーの喪失が生じ、これ
はトランス接合体の最も大きな部分において、すでに存
在したプラスミドが除去されたことを意味する。
定に保持され得々い複数のプラスミドは同一の不適合ク
ラス（ｉｎｃ、）に属する。従って、フォルティオ！Ｊ
（ｆｏｒｔｉｏｒｉ）はそれ自体と不適合のプラスミ
ドである。Ｔｎ５でマークされたｐＡｔＣ５８（ＫｍＴ
ｌ）がＴｎ１８３１でマークされたｐＡｔｃ５８（Ｓｐ
）を有するＡ、チュメファシエンス株ＦｃＥ４人され
、そして入るプラスミド（Ｋｒｎ” ）が選択されれば
、不適合性により Ｓｐ”マーカーの喪失が生じ、これ
はトランス接合体の最も大きな部分において、すでに存
在したプラスミドが除去されたことを意味する。
従って、ＬＢＡ１１６０が、供与体としてのＬＢＡ１２
０１（ｐＡｔＣ５８： ：Ｔｎ５ ）との交差導入にお
ける受容体として使用される。入るプラスミド・ｐＡｔ
Ｃ５８： ：Ｔｎ５がトランス接合体中及びその上で選
択され、Ｔｎ１８８２に由来するＡｐＲが不適合性によ
り失われたか否かがチェックされた。すべてのＫｍ
）ランス接合体がその人ｐＲを保持していることが明ら
かであった。これもまた、Ｔｎ１８８２がＬＢＡ中でｐ
ＡｔＣ５８上に位置していないことを強く示唆した。
０１（ｐＡｔＣ５８： ：Ｔｎ５ ）との交差導入にお
ける受容体として使用される。入るプラスミド・ｐＡｔ
Ｃ５８： ：Ｔｎ５がトランス接合体中及びその上で選
択され、Ｔｎ１８８２に由来するＡｐＲが不適合性によ
り失われたか否かがチェックされた。すべてのＫｍ
）ランス接合体がその人ｐＲを保持していることが明ら
かであった。これもまた、Ｔｎ１８８２がＬＢＡ中でｐ
ＡｔＣ５８上に位置していないことを強く示唆した。
１ｉｉ） Ｔｎ１８８２のＬＢＡ１１６０中での位置
の明確な証明がサザンブロットノ）イブリダイゼーショ
ン実験によって得られた。この実験によｐ ＬＢＡ２２
８、Ｌ、Ｂ１２０１及びＬＢＡ１１６０の材料プラスミ
ド調製物を分析した。原料プラスミド調製物〔カッ上等
、ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー
（Ｊ、 Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ） １１３
、２２９−２４２ （１９７９）に従って単離したもの
〕をアガロースゲル上でその構成成分に分離した。ゲル
中にバンドとして存在する成分をケ°ルから直接ニトロ
セルロースフィルターに移しくいわゆるプロット法）、
そして次に多数の特異的放射性ラベルＤＮＡプローブと
７１イブリダイズさせた。Ｔｎ５でプローブされた対照
はｐＡｔＣ５８： ：Ｔｎ５のいわゆるスーパーコイル
及び線状ＤＮＡバンドとハイブリダイズした。この場合
、組み込まれない染色体ＤＮＡのほかにプロットの組み
込まれないｐＡｔＣ５８： ：Ｔｎ５ ＤＮＡが同様に
存在する。Ｒｎ１８８２のための出発材料であるＴｎ３
を放射性プローブとして使用した場合、ＬＢＡ１１６０
中に存在するｐＡｔＣ５８とのハイブリダイゼーション
は見られなかった。
の明確な証明がサザンブロットノ）イブリダイゼーショ
ン実験によって得られた。この実験によｐ ＬＢＡ２２
８、Ｌ、Ｂ１２０１及びＬＢＡ１１６０の材料プラスミ
ド調製物を分析した。原料プラスミド調製物〔カッ上等
、ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー
（Ｊ、 Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ） １１３
、２２９−２４２ （１９７９）に従って単離したもの
〕をアガロースゲル上でその構成成分に分離した。ゲル
中にバンドとして存在する成分をケ°ルから直接ニトロ
セルロースフィルターに移しくいわゆるプロット法）、
そして次に多数の特異的放射性ラベルＤＮＡプローブと
７１イブリダイズさせた。Ｔｎ５でプローブされた対照
はｐＡｔＣ５８： ：Ｔｎ５のいわゆるスーパーコイル
及び線状ＤＮＡバンドとハイブリダイズした。この場合
、組み込まれない染色体ＤＮＡのほかにプロットの組み
込まれないｐＡｔＣ５８： ：Ｔｎ５ ＤＮＡが同様に
存在する。Ｒｎ１８８２のための出発材料であるＴｎ３
を放射性プローブとして使用した場合、ＬＢＡ１１６０
中に存在するｐＡｔＣ５８とのハイブリダイゼーション
は見られなかった。
従って、発明者等は、上記のことから、Ｔｎ１８８２そ
して従ってｐＴ ｉ Ｂ６の完全Ｔ−領領域ＬＢＡＩ
１６０の染色体中に存在すると結論した。ＬＢＡ１１６
０の全ＤＮＡが存在するプロットを用いて、多数の制限
酵素により断片化され、そしてラベルされたプローブと
してｐＲＡＬ３３０５及びｐｏ’ｒｙｓが使用されたサ
デンブロットハイプリダイゼーションによシ、ＬＢＡ１
１６０へのＴｎ１８８２のＴ−領域の挿入の正しい内部
組織が確認された（第３図に示された構造）。
して従ってｐＴ ｉ Ｂ６の完全Ｔ−領領域ＬＢＡＩ
１６０の染色体中に存在すると結論した。ＬＢＡ１１６
０の全ＤＮＡが存在するプロットを用いて、多数の制限
酵素により断片化され、そしてラベルされたプローブと
してｐＲＡＬ３３０５及びｐｏ’ｒｙｓが使用されたサ
デンブロットハイプリダイゼーションによシ、ＬＢＡ１
１６０へのＴｎ１８８２のＴ−領域の挿入の正しい内部
組織が確認された（第３図に示された構造）。
Ｔｎ１８８２がその上に位置するｐＲＡＬ３９５９のＬ
ＢＡ１１６０の染色体への挿入の安定性を、選択圧を伴
わないで細菌を約１００世代増殖せしめ、そしてｐＲＡ
Ｌ３９５９の耐性マーカー（ＴＣＲ及びＡｐＲ）が維持
されているか否かをチェックすることにより試験した。
ＢＡ１１６０の染色体への挿入の安定性を、選択圧を伴
わないで細菌を約１００世代増殖せしめ、そしてｐＲＡ
Ｌ３９５９の耐性マーカー（ＴＣＲ及びＡｐＲ）が維持
されているか否かをチェックすることにより試験した。
マーカーの喪失は検出されなかった。
従って、ＬＢＡ１１６０は染色体に安定に却み込まれた
Ｔ−領域を含有する。発明者等によって得られた全く新
しい構成物の腫瘍原性を試験することによシ、同様に必
要なビルシラス機能（Ｖｉｒ→頁域）がＲ−プライムプ
ラスミド（ｐＡＬ１８１８及びｐＡＬ１８１９）によＪ
ＬＢＡ１１６０株に導入された。シラスミドｐＡＬ１
．８１８はＶｉｒ遺伝子Ａ、ＢＸＣ，Ｄ、及び０を含有
し、そしてｐＡｌ １８１．９はＡからＦまで及びＯを
含むＶｌｒ遺伝子を含有する。ＬＢＡ１１６０とＲ−プ
ライムを含有する株との接合及びトランス接合体の選択
の後、Ｉ、ＢＡｌ、１６Ｉ Ｃすなわち、ＬＢＡｌ １
６０（ｐＡＬｌ ８１８） ］、及びＬＢＡ］１６２
［すなわち、ＬＢＡ１１６０（ｐＡＬ１８１９） ）が
生成した。これらの株及び親株ＬＢＡ１１６０及びＬＢ
Ａ１８１８（ｐＡＬｌ、８１８）及びＬＢＡ１８１９（
ｐＡＬ１８１９）を多くの異る種類の植物に対するそれ
らの腫瘍誘発能力について試験した。
Ｔ−領域を含有する。発明者等によって得られた全く新
しい構成物の腫瘍原性を試験することによシ、同様に必
要なビルシラス機能（Ｖｉｒ→頁域）がＲ−プライムプ
ラスミド（ｐＡＬ１８１８及びｐＡＬ１８１９）によＪ
ＬＢＡ１１６０株に導入された。シラスミドｐＡＬ１
．８１８はＶｉｒ遺伝子Ａ、ＢＸＣ，Ｄ、及び０を含有
し、そしてｐＡｌ １８１．９はＡからＦまで及びＯを
含むＶｌｒ遺伝子を含有する。ＬＢＡ１１６０とＲ−プ
ライムを含有する株との接合及びトランス接合体の選択
の後、Ｉ、ＢＡｌ、１６Ｉ Ｃすなわち、ＬＢＡｌ １
６０（ｐＡＬｌ ８１８） ］、及びＬＢＡ］１６２
［すなわち、ＬＢＡ１１６０（ｐＡＬ１８１９） ）が
生成した。これらの株及び親株ＬＢＡ１１６０及びＬＢ
Ａ１８１８（ｐＡＬｌ、８１８）及びＬＢＡ１８１９（
ｐＡＬ１８１９）を多くの異る種類の植物に対するそれ
らの腫瘍誘発能力について試験した。
ＬＢＡｉ１６０並びにＩ、ＢＡ１８１８及び１８１９の
みが２連系の構成成分の１方を含有し、そしてそのため
に腫瘍への機会を与えなかった。しかしながら、ＬＢＡ
１１６０株は、ピルシラスプラスミド（Ｒ−プライム）
と共に、処理されたすべての植物上に驚く程腫瘍を生じ
させた。腫瘍の挙動及び大きさは野性形のアグロバクテ
リウム株により誘発される腫瘍のそれに相当した。従っ
て、ＴｉプラスミドのＴ−領域はＶｉｒ−領域によって
アグロバクテリウムの染色体から高等植物細胞のゲノム
に正常に導入され得る。
みが２連系の構成成分の１方を含有し、そしてそのため
に腫瘍への機会を与えなかった。しかしながら、ＬＢＡ
１１６０株は、ピルシラスプラスミド（Ｒ−プライム）
と共に、処理されたすべての植物上に驚く程腫瘍を生じ
させた。腫瘍の挙動及び大きさは野性形のアグロバクテ
リウム株により誘発される腫瘍のそれに相当した。従っ
て、ＴｉプラスミドのＴ−領域はＶｉｒ−領域によって
アグロバクテリウムの染色体から高等植物細胞のゲノム
に正常に導入され得る。
上記の観察は、アグロバクテリウムがそのＴ−領域を植
物＃１胞に移行させる機作を理解する上で非常に重要で
ある。Ｔ−領域がアグロバクテリウムの染色体に存在す
る場合でさえ、これが正常に移送されるという驚くべき
発見は、従来予想されていたように、完全なＴｉプラス
ミドが感染中に植物細胞に導入され、そしてそこでＴ
−ＤＮＡの組込みのために「加工」されるということは
ないことを意味する。さらに、これらの結果に基いて、
発明者等は、毒性遺伝子によるＴ −ＤＮＡの認識及び
切り取シは、腫瘍誘発過程の初期段階の１つとして細菌
中で行われると推定する。Ｔ−領域を画するいわゆる境
界配列（ｂｏｒｄｅｒ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ）は認識シ
グナルとして作用し得るかもしれない。
物＃１胞に移行させる機作を理解する上で非常に重要で
ある。Ｔ−領域がアグロバクテリウムの染色体に存在す
る場合でさえ、これが正常に移送されるという驚くべき
発見は、従来予想されていたように、完全なＴｉプラス
ミドが感染中に植物細胞に導入され、そしてそこでＴ
−ＤＮＡの組込みのために「加工」されるということは
ないことを意味する。さらに、これらの結果に基いて、
発明者等は、毒性遺伝子によるＴ −ＤＮＡの認識及び
切り取シは、腫瘍誘発過程の初期段階の１つとして細菌
中で行われると推定する。Ｔ−領域を画するいわゆる境
界配列（ｂｏｒｄｅｒ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ）は認識シ
グナルとして作用し得るかもしれない。
この基本的な科学的重要性とは別に、この新規な発明は
、高等生物の細胞の遺伝的操作のための２個の別々のプ
ラスミド上に分かれて存在するＴ−領域及びＶｉｒ−領
域はなおＴ−領域又は人工的Ｔ−領領域及びこれに挿入
された外米性ＤＮＡ ）を植物細胞に移行せしめること
ができ、ここでこの領域はｒツムに組み込まれ、そして
発現される。
、高等生物の細胞の遺伝的操作のための２個の別々のプ
ラスミド上に分かれて存在するＴ−領域及びＶｉｒ−領
域はなおＴ−領域又は人工的Ｔ−領領域及びこれに挿入
された外米性ＤＮＡ ）を植物細胞に移行せしめること
ができ、ここでこの領域はｒツムに組み込まれ、そして
発現される。
このいわゆる２連ベクター系を用いて、双子葉植物及び
単子葉植物の細胞に新しい遺伝物質を与えることができ
る（第４Ａ図）。
単子葉植物の細胞に新しい遺伝物質を与えることができ
る（第４Ａ図）。
プラスミド上に（第４１３’ｌＸ］）又は染色体中に（
第４Ｃ部）Ｖｉｒ−領域のみ又はＴ−領域のみを含有す
る株は植物細胞を形質転換しない。この新しい発明によ
り、染色体に挿入されたＴ−領域がなお２連系において
植物細胞に正常に移送され、Ｖｉｒ−領域は別のプラス
ミド上に存在する（第４Ｄ図）。この驚くべき発明によ
り、次のように述べることもできる。アグロバクテリウ
ムのＴ−領域もしくはＶｉｒ−領域又は両者が染色体外
レプリコン（プラスミド）上に存在せず染色体に組み込
貫れている場合（第４ｐ、、ＥＪ、ス゛ＦＩＥＪに示す
状態）に、これらはＴ−領域又は人工的Ｔ−領領域効率
的に植物のゲノムに導入し、従って、ヨーロッパ特許出
願８４２００２３９６及び８４０１０４８をこれらの新
しい状態に適用することができる。
第４Ｃ部）Ｖｉｒ−領域のみ又はＴ−領域のみを含有す
る株は植物細胞を形質転換しない。この新しい発明によ
り、染色体に挿入されたＴ−領域がなお２連系において
植物細胞に正常に移送され、Ｖｉｒ−領域は別のプラス
ミド上に存在する（第４Ｄ図）。この驚くべき発明によ
り、次のように述べることもできる。アグロバクテリウ
ムのＴ−領域もしくはＶｉｒ−領域又は両者が染色体外
レプリコン（プラスミド）上に存在せず染色体に組み込
貫れている場合（第４ｐ、、ＥＪ、ス゛ＦＩＥＪに示す
状態）に、これらはＴ−領域又は人工的Ｔ−領領域効率
的に植物のゲノムに導入し、従って、ヨーロッパ特許出
願８４２００２３９６及び８４０１０４８をこれらの新
しい状態に適用することができる。
このようなアグロバクテリウムを双子葉植物及び単子葉
植物の細胞の遺伝的操作のために使用することができる
（オランダ特許出願Ａ ８４０１０４８ ）。
植物の細胞の遺伝的操作のために使用することができる
（オランダ特許出願Ａ ８４０１０４８ ）。
Ｉイ下余白
匡 削 国
一一一一
第１図はプラスミドｐＲＡＬ３９５７の造成を示す系統
図である。 第２図はプラスミドと染色体との交差組換によるＬＢＡ
１１６０洋の造成を示す系統図である。
図である。 第２図はプラスミドと染色体との交差組換によるＬＢＡ
１１６０洋の造成を示す系統図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、植物もしくはその外植体（ｅｘｐｌａｎａｔｅ）に
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を
感染せしめることにより、又は植物プロトプラストをア
グロバクテリウムと共にインキュベートすることにより
外来性ＤＮＡを植物ゲノムに導入する方法であって、ア
グロバクテリウムのＴｉ−プラスミド由来の１もしくは
複数のＴ−領域及びＶｉｒ−領域を遺伝物質中に含有し
、そして／又は人工的Ｔ−領域を含んで成る１もしくは
複数のＴ−領域（この人工的Ｔ−領域は所望の各ＤＮＡ
から成りこのＤＮＡはアグロバクテリウムの野性型Ｔ−
領域中に存在する境界配列又は機能的にこれと類似する
領域を両端に有する）を含有する細菌を使用することを
特徴とする方法。 ２、１もしくは複数のＴ−領域又はＶｉｒ−領域あるい
はこの両者が細菌染色体に導入されているアグロバクテ
リウムを使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ３、Ｔ−領域もしくはＶｉｒ−領域又はその両者が細菌
染色体に導入されていることを特徴とする１又は複数の
Ｔ−領域及びＶｉｒ−領域をそのＤＮＡ中に有するアグ
ロバクテリウム。 ４、１又は複数のＴ−領域及びＶｉｒ−領域をＤＮＡ中
に有し１個のＴ−領域を細菌染色体中に有するアグロバ
クテリウムの製造方法であって、アグロバクター染色体
に安定に取り込まれる性質を有するベクターＤＮＡ分子
中Ｔ−領域を有するエセリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、外来性ＤＮＡをＴ−Ｄ
ＮＡに導入し、そして次にこうして変形されたベクター
ＤＮＡ分子をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌から取り出
し、そしてこれをアグロバクテリウム染色体に組み込む
ことを特徴とする方法。 ５、前記ベクターＤＮＡ分子が、アグロバクテリウム自
体の中では機能することができない（いわゆる自滅プラ
スミドである）がそのゲノムに組み込まれることができ
、そして変形の後、Ｒ−プラスミドに由来するプラスミ
ドの助けによりＥ．コリからアグロバクテリウムに移行
するプラスミドである特許請求の範囲第４項記載の方法
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8401780 | 1984-06-04 | ||
| NL8401780A NL8401780A (nl) | 1984-06-04 | 1984-06-04 | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van planten. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6152294A true JPS6152294A (ja) | 1986-03-14 |
| JPH0740941B2 JPH0740941B2 (ja) | 1995-05-10 |
Family
ID=19844039
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60118982A Expired - Lifetime JPH0740941B2 (ja) | 1984-06-04 | 1985-06-03 | 植物ゲノムへの外来性ｄｎａの導入方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0176112B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0740941B2 (ja) |
| AT (1) | ATE52803T1 (ja) |
| DE (1) | DE3577724D1 (ja) |
| NL (1) | NL8401780A (ja) |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6664109B2 (en) | 1985-01-17 | 2003-12-16 | Calgene Llc | Transformation system with Ti or Ri plasmid |
| NL8502948A (nl) * | 1985-10-29 | 1987-05-18 | Rijksuniversiteit Leiden En Pr | Werkwijze voor het inbouwen van "vreemd dna" in het genoom van dicotyle planten. |
| US7033627B2 (en) | 1990-03-23 | 2006-04-25 | Syngenta Mogen B.V. | Production of enzymes in seeds and their use |
| US5593963A (en) * | 1990-09-21 | 1997-01-14 | Mogen International | Expression of phytase in plants |
| US5543576A (en) * | 1990-03-23 | 1996-08-06 | Mogen International | Production of enzymes in seeds and their use |
| EP0604662B1 (en) * | 1992-07-07 | 2008-06-18 | Japan Tobacco Inc. | Method of transforming monocotyledon |
| US7060876B2 (en) | 1992-07-07 | 2006-06-13 | Japan Tobacco Inc. | Method for transforming monocotyledons |
| US6350934B1 (en) | 1994-09-02 | 2002-02-26 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid encoding delta-9 desaturase |
| US6586661B1 (en) | 1997-06-12 | 2003-07-01 | North Carolina State University | Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid |
| US6183959B1 (en) | 1997-07-03 | 2001-02-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method for target site selection and discovery |
| US8592663B2 (en) | 2001-11-13 | 2013-11-26 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof |
| US7700851B2 (en) | 2001-11-13 | 2010-04-20 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof |
| US7812227B2 (en) | 2001-11-13 | 2010-10-12 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Cloning of cytochrome p450 genes from nicotiana |
| US10266836B2 (en) | 2001-11-13 | 2019-04-23 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Tobacco nicotine demethylase genomic clone and uses thereof |
| US7700834B2 (en) | 2001-11-13 | 2010-04-20 | U.S. Smokless Tobacco Company | Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof |
| DE60323103D1 (de) | 2002-06-28 | 2008-10-02 | Dow Agrosciences Llc | Pestizid wirksame proteine und polynukleotide, die aus paenibazillus-spezies gewonnen werden können |
| KR20050052541A (ko) | 2002-10-16 | 2005-06-02 | 유.에스.스모크리스 토바코 컴퍼니 | 니코티아나의 시토크롬 피450 유전자의 클로닝 방법 |
| CN1867674B (zh) | 2003-10-16 | 2011-11-09 | 美国无烟烟草有限责任公司 | 从烟草克隆细胞色素p450基因 |
| US8637731B2 (en) | 2003-10-16 | 2014-01-28 | U.S. Smokeless Tobacco Company | Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof |
| EP1751278B1 (en) | 2004-04-29 | 2015-03-18 | U.S. Smokeless Tobacco Company LLC | Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof |
| US8586837B2 (en) | 2004-04-29 | 2013-11-19 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof |
| JP5285906B2 (ja) | 2004-04-30 | 2013-09-11 | ダウ アグロサイエンシズ リミテッド ライアビリティー カンパニー | 除草剤抵抗性遺伝子 |
| ATE530656T1 (de) | 2005-02-23 | 2011-11-15 | Univ North Carolina State | Veränderung des alkaloidgehaltes in tabak durch modifikation spezifischer cytochrome p450 gene. |
| AR056590A1 (es) | 2005-10-28 | 2007-10-10 | Dow Agrosciences Llc | Nuevos genes resistentes a herbicidas |
| US8319011B2 (en) | 2006-12-15 | 2012-11-27 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity |
| US11332753B2 (en) | 2006-12-15 | 2022-05-17 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Tobacco plants having reduced nicotine demethylase activity |
| JP5907657B2 (ja) | 2007-05-09 | 2016-04-26 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | 新規な除草剤抵抗性遺伝子 |
| WO2008150150A2 (es) | 2007-06-08 | 2008-12-11 | Universidad Nacional Autónoma de México | Supresión de resistencia en insectos hacia las toxinas cry de bacillus thuringiensis utilizando toxinas que no requieren al receptor caderina. |
| CN101939431B (zh) | 2007-11-12 | 2015-01-28 | 北卡罗来纳州立大学 | 通过修饰特定细胞色素p450基因改变烟草生物碱含量 |
| ES2623610T3 (es) | 2009-03-19 | 2017-07-11 | Dsm Ip Assets B.V. | Moléculas de ácido nucleico de ácido graso poliinsaturado sintasas, y polipéptidos, composiciones y métodos de preparación y usos de los mismos |
| HUE025156T2 (en) | 2009-04-17 | 2016-03-29 | Dow Agrosciences Llc | Insecticide DIG-3 CRY toxins |
| BR112012017565A2 (pt) | 2010-01-15 | 2015-09-01 | Univ North Carolina State | "planta ou parte da planta de tabaco, semente, produto do tabaco, métodos para reduzir o potencial carcinogênico de um produto do tabaco, para reduzir o nível de nornicotina, ou reduzir a taxa de conversão de nicotina em nornicotina, em uma planta ou parte de planta de tabaco e para identificar uma planta de tabaco com baixos níveis de nornicotina, polinucleotídeo isolado, polipeptídeo isolado e mutação em um gene que codifique uma cyp82e10 nicotina demetilase". |
| AU2011242490B2 (en) | 2010-04-23 | 2014-11-06 | Dow Agrosciences Llc | Combinations including Cry3Aa and Cry6Aa proteins to prevent development of resistance in corn rootworms (Diabrotica spp.) |
| US9234208B1 (en) | 2010-05-10 | 2016-01-12 | Dow Agrosciences Llc | DIG-13 insecticidal cry toxins |
| US9617551B2 (en) | 2010-07-29 | 2017-04-11 | Dow Agrosciences Llc | Method of increasing plant transformation frequency using modified strains of Agrobacteria |
| CA2809644C (en) | 2010-08-30 | 2020-06-30 | Agrigenetics, Inc. | Activation tagging platform for maize, and resultant tagged populations and plants |
| CN103562393A (zh) | 2011-02-28 | 2014-02-05 | 奥驰亚客户服务公司 | 烟草近交植物albex1f和albex1ms |
| CN103687480A (zh) | 2011-02-28 | 2014-03-26 | 北卡罗莱纳州立大学 | 烟草近交植物ncbex1f、ncbex1ms和nc ex90 |
| UY34014A (es) | 2011-04-15 | 2012-11-30 | Dow Agrosciences Llc | Genes sintéticos para expresar proteínas en células de maíz, construcciones, plantas transgénicas, métodos para controlar pestes y composiciones |
| BR112014026203A2 (pt) | 2012-04-23 | 2017-07-18 | Bayer Cropscience Nv | engenharia do genoma direcionado nas plantas |
| WO2014028295A2 (en) | 2012-08-17 | 2014-02-20 | Dow Agrosciences Llc | Use of a maize untranslated region for transgene expression in plants |
| TWI670004B (zh) | 2012-09-07 | 2019-09-01 | 美商陶氏農業科學公司 | 用來產生植物之螢光激活細胞分選富增技術 |
| US9603335B2 (en) | 2013-01-11 | 2017-03-28 | North Carolina State University | Tobacco inbred plants K326 SRC, CMS K326 SRC, K346 SRC, CMS K346 SRC, NC1562-1 SRC, NCTG-61 SRC, CMS NCTG-61 SRC and hybrid NC196 SRC |
| EP2964016A1 (en) | 2013-03-05 | 2016-01-13 | North Carolina State University | Tobacco inbred and hybrid plants and uses thereof |
| WO2015134438A1 (en) | 2014-03-03 | 2015-09-11 | North Carolina State University | Tobacco inbred and hybrid plants and tobacco products made thereof |
| JP2017508462A (ja) | 2014-03-03 | 2017-03-30 | ノース カロライナ ステイト ユニヴァーシティ | タバコ近交系植物およびハイブリッド植物ならびにそれらから作られたタバコ製品 |
| WO2015134423A1 (en) | 2014-03-03 | 2015-09-11 | North Carolina State University | Tobacco inbred and hybrid plants and tobacco products made thereof |
| TW201542093A (zh) | 2014-03-21 | 2015-11-16 | 艾格里遺傳學股份有限公司 | 用於控制玉米穗蟲之Ｃｒｙ１Ｄ |
| CA3192494A1 (en) | 2014-12-30 | 2016-07-07 | Corteva Agriscience Llc | Modified cry1ca toxins useful for control of insect pests |
| CN108026149B (zh) | 2015-08-17 | 2022-04-29 | 美国陶氏益农公司 | 工程化的cry6a杀虫蛋白 |
| KR20190003504A (ko) | 2016-03-24 | 2019-01-09 | 유니버시타이트 라이덴 | 식물을 형질주입하고 무작위 통합 사건을 감소시키는 방법 |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| EP3502259A1 (en) | 2017-12-19 | 2019-06-26 | Universiteit Leiden | A combinational strategy for reducing random integration events when transfecting plants |
| US11946057B2 (en) | 2018-12-20 | 2024-04-02 | Benson Hill, Inc. | Pre-conditioning treatments to improve plant transformation |
| WO2021260632A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Benson Hill, Inc. | Plant cell treatments to improve plant transformation |
-
1984
- 1984-06-04 NL NL8401780A patent/NL8401780A/nl not_active Application Discontinuation
-
1985
- 1985-06-03 JP JP60118982A patent/JPH0740941B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-03 AT AT85200871T patent/ATE52803T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-03 DE DE8585200871T patent/DE3577724D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-03 EP EP85200871A patent/EP0176112B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIOTECHNOLOGY=1983 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL8401780A (nl) | 1986-01-02 |
| EP0176112A1 (en) | 1986-04-02 |
| DE3577724D1 (de) | 1990-06-21 |
| JPH0740941B2 (ja) | 1995-05-10 |
| EP0176112B1 (en) | 1990-05-16 |
| ATE52803T1 (de) | 1990-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS6152294A (ja) | 植物ゲノムへの外来性ｄｎａの導入方法 | |
| US5149645A (en) | Process for introducing foreign DNA into the genome of plants | |
| JP2528270B2 (ja) | 外来性遺伝子を含むシャトルプラスミド | |
| Tinland | The integration of T-DNA into plant genomes | |
| Hernalsteens et al. | The Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid as a host vector system for introducing foreign DNA in plant cells | |
| De Framond et al. | Mini–Ti: a new vector strategy for plant genetic engineering | |
| Teeri et al. | Identification of plant promoters in situ by T‐DNA‐mediated transcriptional fusions to the npt‐II gene | |
| US6252140B1 (en) | Promoters from chlorella virus genes providing for expression of genes in prokaryotic and eukaryotic hosts | |
| OoNo et al. | SHORT PAPER The TL-DNA gene of Ri plasmids responsible for dwarfness of tobacco plants | |
| JPS6070080A (ja) | 双子葉植物の染色体への外来性ｄνａの組込方法 | |
| Baribault et al. | Transgenic grapevines: Regeneration of shoots expressing β-glucuronidase | |
| Hoekema et al. | Delivery of T‐DNA from the Agrobacterium tumefaciens chromosome into plant cells | |
| JPS61502166A (ja) | 植物細胞の形質転換のための改良された方法及びベクタ− | |
| US5073675A (en) | Method of introducing spectinomycin resistance into plants | |
| US7029908B1 (en) | Plasmids for plant transformation and method for using the same | |
| EP1781082A2 (en) | Biological gene transfer system for eukaryotic cells | |
| Haring et al. | A comparative study of Tam3 and Ac transposition in transgenic tobacco and petunia plants | |
| US6521408B1 (en) | Method for assessing a function of a gene | |
| EP0224287A1 (en) | A process for the incorporation of foreign DNA into the genome of dicotyledonous plants | |
| US5217902A (en) | Method of introducing spectinomycin resistance into plants | |
| EP0841402B1 (en) | High capacity binary shuttle vector | |
| Senior et al. | Transformation of Antirrhinum majus using Agrobacterium rhizogenes | |
| US4605627A (en) | Plasmid vehicle for cloning in Agrobacterium tumefaciens | |
| US20050289667A1 (en) | Biological gene transfer system for eukaryotic cells | |
| US20050289672A1 (en) | Biological gene transfer system for eukaryotic cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |