JPS61502793A - トランス作用性転写因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トランス作用性転写因子 発明の分野 本発明は、所望の遺伝子のトランス作用性転写活性化（臣匹−ａｃｔｉｎｇ　ｔ ｒａｎｓｅｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　）を引起して所望の遺 伝子産物の発現を大きく増幅するある種のウィルス性転写制御要素（ｔｒａｏｓ ｅｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　）を含有するベク ター系を用いる遺伝子産物の大量生産に関する。より特定的には、本発明は使用 並びにこのような発現に有用な方法及び物に関する。本発明は統合（ｉｎｔｅｇ ｒａｔｅｄ　）及び非統合（ｕｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　）　Ｄ　Ｎ　Ａ上の異 ロウイルス由来の転写制御要素を利用する。本発明の転写制御因子を使用すると 異種遺伝子の転写速度が劇的に増加し、それ故所望の遺伝子産物の発現が増大す る。

発明の背景 多くの種類のレトロウィルスが公知である。レトロウィルスの転写制御要素がウ ィルスゲノムの末端長反復配列（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ、　 ＬＴ几）として知られる部分内、より特定的にはＬＴルのＵ３領域内にあるとい うことも知られている。エッチ、エム。

チミン（）Ｌ　Ｍ、　Ｔｅｍｊｎ　）、セル（伽旦）、２７：１（１９８１）： 同、２８：３（１９８２）参照。

本発明によって、ある種のウィルス及びそれらウィルスのゲノムのセグメントに よｐ遺伝情報を指定（コード）されｉｓる種の因子は、それらウィルスのＬＴ几 上セグメント制御下で機能を発揮する遺伝子が派生する産物の量を数倍増幅する 能力を有することが発色された。トランス作用性転写調節（男島−ａｃｔｉｎｇ 　ｔｒａｎａｅｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　）と呼ばれるこの 現象は、種々の型のヒトＴリンパ球ウィルス（ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｉｙｍｐｈｏｔ ｒｏｐｌｅ　ｖｉｒｕｓ。

用語はトランス作用性転写調節活性を有するウィルスを意味するものとする。

ヒ）　Ｔ　ＩＪンバ球ウィルス（ＨＴＬＶ）ｆｄＴリンハ球のＯＫ、　Ｔ　４＋ （ヘルパー）サブセットの障害に関連するレトロウィルスである。

ＨＴＬＶ　Ｉ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）け成人Ｔ細胞白血病の病因として耳望なもので ある（ビー、ジエー、ボイエツ（Ｂ、　Ｊ、　Ｐｏ１ｅｓｚ　）Ｓｃｉ、ＵＳＡ ）、７７：７４ｘｓ（］９ｓｏ＋　；ブイ、ニス、カリアナラマン（Ｖ、　８． 　Ｋａ％／ａｎａｒａｍａｎ　）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　（ｏ　ン トン）２９４二２７１（１９８１）：エム、ロバートーグロフ（Ｍ、　Ｒａｂｅ ｒｔ−（）ｕｒｏｆｆ　）ら、ジエー、エクスプ、メト、（ＬｈＬ埜ヰ）、１５ ４：１９５７（１９８１’ｌ　：エム、ヨシダ（Ｍ、　Ｙｏｓｈｉｄａ　）ら、 ブロク、ナトル、アカデ、サイ、米国（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）、７９：２０３１（１９８２）：及びエム、ボボビツク（ Ｍ、　Ｐｏｐｏｖｉｅ　）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　（ｏンドン）、 ３００：６３（１９８２）参照〕。

ＨＴＬＶ　ＩＩ型（ＨＴＬＶ−１）は毛細用白血病（ｈａｉｒｙ　ｃｅｌｌｌｅ ｕｋｅｍｉａ’　）のＴ細胞変種（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｖａｒｉａｎｔ　）をもつ患 者から最初に得られ九単離物である〔ブイ、ニス、カリアナラマン（Ｖ、　Ｓ。

Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎ　）ら、サイエンス（５ｅｉｅｎｅｅ　）、２１８： ５７１（１９８２）；アイ、ニス、ワイ、チエン（１，Ｓ、　Ｙ、　Ｃｈｅｎ　 ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　（ロンドン）、３０５：５０２（１９８ ３）：イー、ビー。

ゲルマン（＆　Ｐ、　Ｇｅｌｍａｎｎ　）ら、ブロク、ナトル、アカテ、サイ。

米国（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ）、８１　：９ ９３　（１９８４）参照〕。

ヒトＴリンパ球つィルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）は、０ＫＴ４＋（ヘルパ〜）Ｔ細 胞喪失を特徴とする伝達可能な免疫抑制性疾のとして最近同定された〔エム、ボ ボビツク（Ｍ、　Ｐｏｐｏｖｉｃ　）ら、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）、２ ２４：４９７（１９８４）　：アール、シー。

ガｏ　（Ｌ　Ｃ，ＧＪＩＩＩＯ）ら、同、５００ベージ；ジエー、シュプバツハ （Ｊ、　５ｅｈｕｐｂａｃｈ　）ら、同、５０３ベージ：エム、サーンガダラ７ 　（Ｍ、　Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ　）ら、同、５０６ページ参照〕。これは 、レトロウィルスの特徴（同上）、リバーストランスクリブターゼ（逆転写酵素 ）のマグネシウム嗜好性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　）　（同上）、０ＫＴ４＋Ｔ 　ＩＪンバ球特異性（同上）、ｐ２４及びエンベロープ蛋白とＨＴＬＶ−１及び ＨＴＬＶ−１の対応する蛋白質との交差反応性〔ニス、ケー、アーヤ（Ｓ、　Ｋ 、　Ａ、ｒｙａ　）ら、サイエンス（社園式）、２２５：９２７〜９３０（１９ ８４）：及びエム、エセックス（Ｍ、　Ｂｓ５ｅｘ　）ら、サイエンス（５ｃｉ ｅｎｃｅ　）、２２１：１０６１（１９８３）参照〕及び核酸レベルでのＨＴＬ Ｖ−１及びｌに対する類縁性の少なさく　ｄｉｓｔａｎｔ　ｒｅｌａｊｅｄｎｅ ｓｓ　）　（同上）に基、いて、ＨＴＬＶ族に属するとされた。

多くの点において、ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ　）により引起される疾病はＨ ＴＬＶ−１によるものと類似している。これらの疾患は、時にはリンパ球増加症 の後に来る長い潜伏期間を有している〔フエラー（Ｆｅｒｒｅｒ　）　ラ、キャ ンサー　レス、（Ｃａｎｃｅｒｋｌ）、３４：８９３（１９７４）：及びガロ（ ＧａＪＩｏ）ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ　）、６０：５４５（１９８２）］。い ずれの疾患でも、疾患に先立ち標的器官内で慢性のウィルス血症はみられず、腫 瘍細胞内でプロウィルスのＤＮＡ組込み（ＤＮＡ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　） が起こる好適部位はない〔パウル（Ｐａｕｌ　）ら、上記；ケラトマン（Ｋｅｔ ｔｒｒ＋ａｎ）ら、上記；グレゴワール（Ｇｒｅｇｏｉｒｅ　）ら、上記ニガｏ 　（Ｇａ１ｌｏ　）ら、上記；及びビー、ノ・−ン（Ｂ、　Ｈａｈｎ　）ら、ネ イチャース末端長反復配列（ＬＴＲ）に支配されるベクター内での異種遺伝子の 転写速度が大幅に増大することが今回発見された。これらウィルスのウィルスゲ ノムのトランス作用性転写調節を提供する部分を含有する適当なベクターによっ て宿主細胞を形質転換すると、異種遺伝子のトランス活性化が可能になｐ、従っ て、ウィルスに感染した宿主細胞を使用する必要なしに所望遺伝子産物の産生量 が劇的に増加する。

発明の要約 本発明は、レトロウィルスの転写における新規な現象、すなわち転写のトランス 活性化（ｔｒａｎｓ　−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　）の発見によるものである。こ こでは、新規なトランス活性化転写（ＴＡＴ）因子全コードする、本明細書中で ”山田“遺伝子と称する新規な遺伝子について記載する。′また、ウィルスゲノ ムのＬＴ几部内のある種のシス活性化さ扛た領域（由−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒ ｅｇｉｏｎ　）につい本発明はその１面において遺伝子産物の生産を刺激する方 法ツムの、トランス作用因子をコードしているセグメントからなるトランス作用 性ＤＮＡセグメントを宿主細胞中に挿入し、ｔｂ１発現させる遺伝子産物をコー ドしている遺伝子と、トランス作用性ＤＮＡセグメントが産生ずるトランス作用 因子に応答するシス作用性調節要素とからなる発現ベクターを宿主細胞に挿入し 、（ｅｌ宿主細胞を培養することからなる。

サラに、ＨＴ　Ｌ　Ｖエンベロープの糖蛋白質のような同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏ ｕｓ　）遺伝子及び原核性クロラムフェニコールアセチし、その有効性を測定す るためのこれら遺伝子の使用の例についても記載するっ 本発明の物と方法を使用すると組換えＤＮＡ技術による遺伝子産物の発現速度と 発現量がかなり増加する。本発明の対になりた発現糸を用いると、典型的な場合 遺伝子産物発現がこのような系を用いな−・場合より少なくとも約５倍大きくな る。好ましい場合には本発明の対になった遺伝子発現系によって発現される遺伝 子産物の童は、ここに記載した因子のない場合に産生きれる閂の少なくとも約３ ０倍のファクターで増大（７、さらに好ましい場合には少なくとも約５００倍ど なる。以下に詳Ｍ（１＆で述べるように特定の場合には本発明の方法と物を用い ると遺伝子産物生産が１１００より大きいファクターで増大し友３、図面の簡単 な説明 図１（ａ）、（ｂｌ及び（ｃ）は本発明に使用した組換えプラスミドの図式的ｆ ｒ、説明と構造を示している。これらの図はＣＡＴ遺伝子に対して５′に位置す るＬＴＲの領域を示す。

置主Ａ、（ｂｌ及び（ｅｌＨＬ　Ｔ　Ｒ転写要素が指令するＤ　Ａ　Ｔ遺伝子の 過渡的発現を示す。これらのグラフは示した時間経過に亘る典型的なＯＡＴアッ セイを示している。実験は全て少なくとも３回行ったが、結果はせいぜい３０チ までしか違わなかった。

記号はプラスミド、ｐＵ３Ｒ−１ｔＯ）、ｐｓＶ２ｃＡＴ（＄１、ｐＶ３−１　 ｔｏ＋、（「− ｐＶ３Ｒ−Ｎ■）及びｐｓＶＸｃＡＴ（ハ）によって母音されるＣＡＴ活性を示 す。挿入図はあるＯＡＴアッセイの実際のオートラジオグラムを示し、このアッ セイの直線範囲内のある時間に得られた変換を表わしている。

伝子の過渡的発現を示している。

幻はｇａｇ、凹４及びと遺伝子とｐＸすなわち止遺伝子の相対位ｆｉを示すＨＴ ＬＶ−１ウイルスＤＮＡの概略説明図である。この困遺伝子をＨＴＬＶ　ＬＴＲ が指令する合成と組み合せて用いるとトランス作用性転写が引起こされる。

図３（Ａ）はＨＴＬＶ−１ウィルスＤＮ人の同様な概略説明図であり、■遺伝子 のセグメントと、この遺伝子の解析に使用したＢａｍ　ＨＩとＣ１ａ　Ｉ制限エ ンドヌクレアーゼ部位との位置全示しを決定するのに使用した欠失グラスミドと その発現活性を示す。

図５はＨＴＬＶ−１ゲノムの３′領域とトランス作用性転写因子のヌクレオチド 及びアミノ酸配列を示す。

好適実施態様の詳細な説明 種々のＨＴＬＶのＬＴ几領領域配列が大きく異なっているＣＨＴＬＶ−１と厘の 間のＬＴＲの相違に関してはシモトー列トロウィルスの末端長反復費素が適当な 虫境申で異種遺伝子の発現を促進できること全報告する。ＨＴＬＶ　Ｌ　Ｔ　Ｒ の制御下でか生じることが発見された。ＨＴＬＶ−１，ｆｉ及び■並びにＢＬＶ の転写要素の活性に主要な相違があることも発見された。。

最も衝撃的な一連の観察によると、ＨＴＬＶに感染した細胞・、！：＝Ｌ支イし 内でけＨＴＬＶ　ＬＴＲにより促進された転写がトランス作浦楕また発現すべき 遺伝子に結合されたＬＴＲがその全体より少ないときにも真実である。ＬＴＲ領 域には、ＴＡＴ因子と共同して機能を発揮することにより所望遺伝子の非常に増 大した転写が得られ、従って発現も大きく増幅されることになる最少の遺伝子セ グメントがあることがわかる。これらのセグメントはＴ人Ｒ要素と呼ばれてお９ 、これを利用すると同種又は異種のエンハンサ−を用いても用いなくてもトラン スに活性化された応答を得ることができる。少なくとも１つのエンＩ・ンサー’ ｚＴＡＲ要素と共に使うのが好ましい。トランスに作用する転写因子はＨＴＬＶ Ｔ写要素の活性化に対しである種の型特異性（ｔｙｐｅ５ｐｅｅ山ｃｉｔｙ　） と示す。

転写のトランス活性化の現象と、ＨＴ　Ｌ　Ｖ及びＢＬＶウィルスゲノムのＬＴ Ｒ領域の能力とは表１に挙げた結果が得られた実験で例示される。これらの実賊 では、原核遺伝子、すなわちクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ （ＣＡＴ）ｉ含有するプラスミドはプロモーターと（７て種々のトランスに活性 化するレトロウィルスＬＴＲ’ｒ有していた。ウサギの旦−グロビン遺伝子を用 いて同様の実験を行つ念。本発明による発現に適した他の遺伝子としては遺伝子 操作技術による適切な宿主中での産生に適したあらゆるもの、たとえば、インタ ーフェロン、インシュリン、ヒトその他の生長因子もしくは他の発現可能な遺伝 子産物をコードしている異種遺伝子、または、抗原やワクチンとして有用なＨＴ ＬＶ−１表面糖蛋白質のように有用なウィルス産物をコードしている同種遺伝子 がある。

ｌ″ｙ１ｊえば、プラスミドｐＵ３Ｒ−１（構造は図１（Ｂ）に示すはＵ３全体 全含み、ＨＴＬＶ−＠　ｃＤＮＡクローンに由来するＲ領域の約ＳＯイ岨ノヌク レオチドがクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ　）遺伝 子に対し５′に挿入されていた〔シー。

エム、ゴーマン（Ｃ，Ｍ、　Ｇｏｒｍａｎ　）ら、モル、セル２パイオール。

ン＜　Ｃ，Ｍ、Ｇｏｒｍａｎ　）ら、ブロク、ナトル、アカナ、サイ、米国（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）、７９：６７７７（ １９８２）参照〕。

このプラスミド（ｐＵ３　Ｒ−１）　ｋ　）ランスフエクションによって真核細 胞に導入し、定常状態のＣＡＴメツセンジャーＲＮ　Ａレヘルに相関するＣｊＡ Ｔ酵素活性レベル〔同上：　詠云ｔた七ｔ５紅ｍｌωる：圧士÷及びエム、ティ ー、ウォーカー（Ｍ、　Ｄ。

Ｗａｌｋｅｒ　）ら、ネイチャー（１ａｔｕ二）　（ロンドン）、３０６：５５ ７（１９８３）参照〕全トランスフェクションの４８時間後に測定ＯＡＴ遺伝子 を用い１同様に構築されたプラスミドで同様のトランスフェクションを行った。

すなわち、プラスミドｐＵ　３　Ｒ−１、ｐＵ３Ｒ−罵及びｐＢＬＶ−ＯＡＴは 、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）遺伝子に 対し５′に位置するＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶ−１及びＢＬＶのＬＴＲｔ各々含有 している〔壬吐ｊプ＝憤」劇■Ｊｉ二立力；；暑↓及びゴーマン、シー　、　ｘ 　Ａ　、　（Ｇｏｒｍａｎ、　Ｃ，Ｍ、　）ら、モレク、セル、パイオール。

（Ｍｏ１ｅｅ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）、２：１０４４〜１０５１（１９ ８２）参照〕。これらのプラスミドの構造については図１（ん、１ｆＢｌ及びＩ Ｋ３１を参照されたい。

ＣＡ　Ｔ活性は、棟々の細胞型の、外米ＤＮＡを取シ込み発現する能力の差を調 整するため、ＣＡＴ遺伝子の５′にＳＶ４０初期領域プロモーターを含有するプ ラスミドであるｐｓＶ２ｃ！ＡＴ〔：Ｉ”−？　：／　（Ｇｏｒｍａｎ　）　ラ 、上記１）のトランスフェクションで観察された活性に対して規格化した。

これらの研究に使用したＨＴＬＶ−１株のＬＴＲについての配列は図１人に示す 〔セイ式、エム、　（Ｓｅｉｋｉ２Ｍ−）ら、ブロク。

ナトル、アカデ、サイ、米国（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　）、８０：３６１８〜３６２２（１９８３）参照〕。この配列はヌク レオチド５１個の長さの不完全反復配列を２つとヌクレオチド２１個の長さの不 完全反復配列を３つ含有している。この結果によって、ＨＴＬＶ　ＬＴＲのＵ３ 領域が非リンパ様及びリンパ様細胞中で異種遺伝子の転写のプロモーターとして 働き・うろことが確認される。

トランスフェクション実験の結果を表１に示す。ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲは、撞々の 動物及びヒトのリンパ様及び非リンパ様セルライン（細胞系）で効率的なプロモ ーターとして機能する。

ＨＴ　ＬＶ−Ｉ　Ｌ　Ｔ　Ｒｔフチ■ス伸１１加Ｔ■畦−３−ラ二圧ｉニド同様 に、ＨＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲが機能的にリンパ様細胞に限定されないことは明白で ある６、ＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶ−璽又はＢ　Ｙ、　Ｖに感染した細胞内ではｐ ｕａｉｔ−１によってｌされるＯＡＴ活性は顕著に刺激されない。ＨＴＬＶ−１ ，ＨＴＬＶ−！又はＢ　Ｌ　Ｖに関連するトランス作用性の転写因子はＨＴＬＶ −ＩＬＴＲによって指令される遺伝子発現全刺激しない。

ＨＯ８ヒト骨肉ＩＦＪｆＪ胞　ＺＯＱ、９　１．０ＨＯ８／ＰＬ　ＨＴＬＶ−１ に感染し；ｔＨＯ８ｈ６　７ｓ　１．０セルライン ＦＬＫ　胎児羊腎臓細胞　１９　１．ｆｉ　１．０ＦＬＫ−ＢＬＶ　ＢＬＶに感 染したＦＬＫ細胞　！５　０．９　ＬＯ０００Ｓ＋Ｌ−ネコ上皮細胞　Ｌ、２　 ０．７　１．０ＩＬａｊｊ　ヒトＢリンパ球ライン　２．５　ｚｏ　ｔ、。

ＭＴ２　ＨＴＬＶ−１に感染したヒト　１．４　１３０　１０１９７７球ライン Ｃ３ｌ−６６−４５ＨＴＬＶ−１不死化　１　７６　１０（ｉｍｍｏｒ　ｔ　ａ ｌ　１ｚｅｄ　）非−ブライン Ｌｌ（榎チ２ Ｈ９ヒトＴリンパ球　ａ、ｓ　Ｚ５　＜αｉ　＜ｏ、ｉ　ｔ、。

１（ＴＬＶ−ＮＦＣ感染したＨ　ｘ、ｘ６ｏ　１２　＜０．１　＜０．１　１． ０９ヒｌ−Ｔリンパ球 Ｌ８４６０１）ジャーカット　１．．８　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　１．０（Ｊｕｒｋ ａｔ　）ヒトＴリンパ 球 Ｉ−（ＴＬＶ−ＩＫ感染した　５００　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＬＯＬ８４６０Ｄジ ャーカット （Ｊｕｒｋａｔ　）ヒトＴリンパ 球 上記の結果は本発明による異種遺伝子産物の産生において劇的な増加が得られる ことを示している。例えば、ＨＴＬＶ−ＩＬＴ　ｌ（に制御される発現ベクター ｐＵ３Ｒ−１をＨＴＬＶ−１に感染したＨＯｓ５胞及びヒトＴリンパ球（ＭＴ２ ）細胞内で使用すると、各々ＣＡＴ＄素活性の生成が約７５倍及び１３０倍に増 加した。同様に、ＨＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲに制御される発現ベクターＰＵ３１（− １７，ＨＨＴＬＶ−ＩＫ感染１．りＩ（９＃ａ胞及びヒトＴリンパ球（Ｌ８４６ ０Ｄ　）細胞内で使用すると各々ＯＡＴ酵素活性の生成が約１，１６０倍及びＳ ＯＯ倍に増加した。同種遺伝子産物、例えばＨＴＬＶ三■糖三日糖蛋白質ても同 様の結果が得られる。

又、ＨＴＬＶ　Ｌ　Ｔ几に指令される発現ベクターをトランスに活性に増加する ことについては以下でより詳しく暎肘する、ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）のゲ ノムは全てのレトロウィルスに特徴的なＬＴＨ，ｇａｇ、ｐｏｔ及びμ配列を含 んでいるしニス、オロツラン（Ｓ、　０ｒｏｓｚｌａ口）ら、上に己〕。さらに 、ヒト′１゛リンパ球ウィルス（ＨＴＩ、Ｖ）と同様に、Ｂ　Ｌ　Ｖゲノムげエ ンベロープ遺伝子の３′に約１６００　ｉｔｌのヌクレオチドの長（・１．Ｉ、 み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　）　（ＬＯＲ）領域金持つ 〔ダヴリュ。

ニー、ハセルチン（Ｗ、人、　Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ　）ら、サイエンス（５ｃｉ ｅｎｃｅ　）、２２５：４１９（１９８４）　〕。

ＢＬＶ　ＬＴ几配列の転写能力をテストするために、細菌のクロラムフェニコー ルアセチルトランスフェラーゼ（ｃＡＴ）ｆｆｉ伝子の５′にＢＬＶ　ＬＴＲが 位置するプラスミドを構築した（図１　（Ｃ１）〔ゴーマン（（ト）ｒｍａｎ　 ）ら、上記〕。転写活性をアッセイするために、この組換えプラスミドをトラン スフェクションによって真核細胞中に導入した〔グラハム（Ｇｒａｈａｍ　）ら 、上記〕。（ＣＡＴ酵素活性のレベルはＣＡＴメツセンジャーＲＮＡのレベルと 密接に相関しており、そのためＣＡＴ遺伝子の５′の配列が転写を促進する能力 の尺度となる〔ゴーマン（（）ｏｒｍａｎ　）ら、上記；ニス、エル、マクナイ ト（Ｓ、　Ｌ　ＭｃＫｎｉｇｈｔ　）ら、ネイチャーＣＡＴ活性が検出された（ 表２及び図２）、っこの実験に使った感染セルラインはリバーストランスクリプ ターゼレペルが高いことで示されるようにＢＬＶウィルス粒子（ｖｉｒｏｎｓ　 ）を産生した（データは示さず）。他の非感染及びＢＬＶ感染適合セルライン（ ｍａｔｃｈｅｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）を用いても同様の結果が得られた。使 用したセルラインは、非感染コラモリ肺細胞（Ｃ０Ｌ８８　）とＢＬｖを産生す るＣ０Ｌ８８ラインのクローン性単離物〔ティー。

シー、グラブス（Ｄ、　Ｃ，Ｇｒａｖｅｓ　）ら、キャンサー　リス、（−五匹 ）、３６：４１５２（１９７６））とトランスフェクションの６〜８日前にＢＬ Ｖに感染させたＦＬＫ細胞であった（表２及び図２）。

これらの実験から、ウィルスで誘発されてもウィルスでコードされていてもトラ ンスに作用する因子はＢＬＶ　ＬＴＲに制御される遺伝子発現を活性化すると結 論される。この効果は転写のし・ヘルで最も生じやすい〔ヅｆ１譜邊÷翁打０３ 姓ニドも；＝：圧二記÷マクナイト（ＭｅＫｎｉｇｈｔ　）ら、上記〕。

ＨＴＴ、Ｖ−１，ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−１ノＬ　Ｔ　Ｒ配列が指令する遺 伝子発現！ｔ′１ＨＴＬＶに感染した細胞中に存在するトランス作用性因子で増 強される＋≠≠立スキ≠４間■肯→鴨ヨ±−記視これらの因子がＢＬＶ転写制御 配列を活性化しうるかどうかについてもテストした。

＆　２　Ｋ　示り、ｆｃ　Ｌうに、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−１及びＨ’ｌ”Ｌ Ｖ−Ｉに感染したセルライン中に存在するトランス作用性因子はＢＬＶＪ、Ｔ几 によって指令されるＣＡＴ遺伝子発現を活性化できなかった。同様に、Ｂ　Ｌ　 Ｖに感染した細胞中に存在する因子は種々のＨＴＬＶ−ＬＴＲ配列によって指令 されるＣＡＴ遺伝子発現全増加することができなかった。このことが示唆してい るように、ＨＴＬＶ−１，ＨＴＬＶ−ｉｆ及びＨＴＬＶ−１に対すルトランス作 用性因子はＢＬＶ　ＬＴＲ配列を活性化する因子とは機能的に交換可能ではない 。これは、ＨＴＬＶとＢＬＶのＬＴ几配列間で一次配列の相同性が欠けているこ とを考えれば篤くべきことではない〔ティー、コラエラ（Ｄ、　０ｏｕｅｚ　） ら、ジエー、ビロール、（Ｊ。Ｖｉｒｏｌ、　）、４９二６１５（１９８４）； ニー、ツイマニス（Ａ。

Ｔｓｉｍａｎｉｓ　）ら、ヌク、アシッド、リス、　（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ、　 ）ｔｅｓ、　）、１７：６０７９（１９８３）：及びジエー、ソドロスキ（Ｊ、 　５ｏｄｒｏｓｋｉ　）能に対する主要な決定因子は、誘発されたトランス活性 化因子の存在であると思われる。この活性化因子はほとんどの場合それら自身の 型のＬ　Ｔ　Ｒプロモーターに特異的である。すなわち、ＢＬＶ　ＬＴＲｋ　＊ 有するプラスミドが指令するトランスに活性化されたＯＡＴ遺伝子発現はＢＴ４ に感染し念細胞でのみ観察された。この点に関（−１ＨＴＬＶ−Ｌと１のＬ　Ｔ 　Ｒの効率的な活性：・１犬部分ＨＴＬＶ−ト及−び−Ｈ１Ｉ’−ｂ−■−＝− ４に感染した細胞に限定されルト思ｂ　ｔｌ、　７）　タめ、Ｂ　Ｌ　ＶはＨＴ ＬＶ　−１皮ぴ−Ｈ）Ｌ：＝Ｖ＝ｔに似ている。一方、Ｈ’ｒＬＶ−Ｉ　Ｌ　Ｔ 　Ｒによって指令される転写はＬ（ＴＬＶ−１にのみ感染した少なくともいくつ かの細胞内において効率的に行われるようであった。

トランス−活性化現象と工、ＯＢ領領域存在は他の非急性レトロウィルスからＢ ＬＶ及びＩＩＴＬ■の両者を識別する。我々は、ＨＴＬＶ　ＬＴＲのトランス− 活性化がＨＴ　Ｌ　Ｖ　用遺伝子の蛋白質産物によｊ）媒介されることを発見（ ７た。、ＢＴ、Ｖのゲノムがそのエンベロープ遺伝子の３′にＬ　Ｏル領域金含 有する〔ダブリュ、ニー、ハセルチン（Ｗ、　Ａ、　Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ　）ら 、サイエンス（５ｅｉｅｒ＋ｅｅ　）、２２５：４ｔ９（ｔｅｓ４））ので、そ のために、ＢＬＶ提起さ７′する。このような蛋白質をコードしうる２キロ塩基 の情ｆＪｉ　（ｍｅｓｓａｇｅ　）はＢＬＶに感染した細胞で検出された〔ギス ダエル（Ｇｈｙｓｄａｅｌ　）ら、′−２ニー、ビロール−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ 、　）、２９　：　１０８７（１９７９））っ ヒトＴ　ＩＪンバ球ウィルス１型（ＨＴＬＶ−１）の３′末端の配列を決定し、 ＨＴＬＶ−１、ウシ白血裔ウィルス（ＢＬＶ）及びマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴ Ｖ）のゲノムの３′末端と比較した。これらのウィルスは全て３８〜４０，００ ０の分子量領域−〇）蛋白質全コードするのに十分な長い読み取り枠を含有して いる。

ＨＴＬＶ−１の３′末端領域の１．５５７塩基のヌクレオチド配列は２つのドメ インに分けることができる。５４７ヌクレオチド長の１方のドメインは配列の５ ′末端にあり、ＨＴＬＶ−１の対応領域に対し全くあるいは非常にわずかにしか 配列の相似点けない。このドメインをここでは非保存領域（ｎｏｎ−ｅｏｎｓｅ ｎ’ｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ・列して並べることができ、１．　ＯＸ　１ヌクレオチ ドのうち７１６（７０％）という相同性で同じである。。

ＨＴＬＶ−１ゲノムの１，０１１ヌクレオチド長配列の周囲（ｐｅｒｉｍｅｔｅ ｒｓ　）は３３７アミノ酸長のポリペプチドをコードしうる１つの長い読み取り 枠と正確に対応する。っＨＴＬＶ−１の対、応配列も３５９アミノ酸長のポリペ プチドをコードしうる１つの長い読み取り枠を囲んでいる。

ＨＴＬＶ−１及び厘にコードされる蛋白質はほとんど同じ長さであり、３３７の アミノ酸の２７８個が等しい（８２チ同一）。

Ｃれら２つの蛋白質の類似の程度は保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉ ｖｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）を考えると更に一 層著しくなる（９５チ類似）。これら蛋白質の親水性領域及び疎水性領域の分布 は著しく似ている。

他のいくつかの長い読み取り枠がｌ型及び１ｍのＨＴＬＶの及びＨＴＬＶ−１の 両者に共通するものでｉｔないことが判る。上記で検討した３′末端配列は注目 に値する例外であるが、Ｉ−ＩＴＬＶ−１及び厘ウィルスのコーディング能を比 較すると、どの読み取り枠でも３′領域内に予期された蛋白質配列の類似する領 域ｉづ一層められなかった。特にセイキ（５ｅｉｋｉ　）ｃセイキ（５ｅｉｋｉ 　）ら、上記〕が認めたｐＸｌ、Ｘ２及びＸ３の長い読み取り枠はＨＴ　Ｌｖ− ｉの３′配列内に同等物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ　）を全く持たず翫一方）ｐ Ｘ４は上述の長い読み取り枠のカルボキシル末端に対応する０ＨＴＬＶ−１に比 べてＨＴＬＶ−ＣのＮＯＲ領域では／／塩基対が欠失しているが、これがウィル スの生物学的活性に作用しないことは明白である。

ＨＴ　Ｌ　Ｖ−１及び克の３′末端領域は、ＨＴＬＶ−刊の場合には約４２ｋｄ の、そしてＨＴＬＶ−１の場合には約３８ｋｄの分子量の七白質全コ・−ドする 新しい遺伝子を含／しでいる。これらの市内質はアミノ酸ｌノベルでは９０％以 上相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　）であり、主として感染細胞の核内に位置する 。ＨＴＩ、Ｖ−１に感染したセルラインの分子量４０〜４２．０００の蛋白質は 、ＨＴＬＶ−１に感染した人の血清で認識されるが対照のヒト血清では認識され ないことを銘記し、ておく。

今回、ＨＴＬＶ−１及び蔦のこれらの長い読み取り枠は各々１（ＴＬＶ−１及び 脂に対するトランス−活性化転写因子全コードすることが発見された。従って、 （以前には時々ＰＸ又はｚ−ｆｏｒ遺伝子と云われて〜・た）これらの遺伝子全 ここでＨＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−１に対する男遺伝子と云う１゜ＨＴＬＶ− １及び腹のＵ」遺伝子はイニシエーターメチオニンコドンを持たないが、その５ ′端にスプライスアクセプターコンセンサス配列を示す。ｔａｔ遺伝子産物蛋白 質は、Ｌ　Ｔ　１４−及び困相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　）領域に加えてｐｏ Ｌ　−ｅｎｖ連結（ｊｕｎｃｔｉｏｎ　）を囲む配列全含有することが多いスズ ライスされた２キロ塩基の情報から作られる。天然ｔｘｔ遺伝子産物蛋白質の組 成を洞察するために、ＨＴＬＶ−１で不死化した（　ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ 　）　Ｃ８１−６６−４５セルライン中の選択されたスプライスドナー及びアク セプターの遺伝子地図を作ｆｆＬ′ｆｃｏこのセルラインは２キロ塩基のＨＴ　 Ｌ　ｖ関連メツセンジャー几ＮＡのみを示し、ＨＴ　ＬＶ−１４２ｔｘｔ遺伝子 産物蛋白質のみを発現する、この蛋白質は成人Ｔ細胞白血病／リンパ、１１（ｘ Ｔｒ、ｒ、）、１者からの抗血清で検出できる。０８１−６６−４５のマツピン グによって、ＨＴＬ　Ｖ　−１の長い読み取９枠中でコード可能な情報に対して 以前に決定されたのと同じ位置で、ＨＴＬＶ−１ｅｎｖ遺伝子開始コドンの３′ のすぐ隣にあるスプライスドナーコンセンサス配列とｔａｔ遺伝子内のＣｔａ　 １部位の５′から１７２ｂｐにあるスプライスアクセプターコンセンサス配列と が同定された。天然の工情報及び蛋白質の産生についての可能な図式を図３に示 す。二元のスプライス事象（ｄｕａｌ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｅｖｅｎｔ　）によ り、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　仁ホ遺伝子はその開始コドンと１つのグアノシン残基をＷ遺 伝子に与え、枠内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ　）コーディング配列が得られる。

圧情報に対するスプライシングパターンについての知見から、ＨＴＬＶ−１及び ＨＴＬＶ−１ｉ７）ゲ／ムノｅｎｖ−Ｘ領域に対し５′にＨＴＬＶ−１のＩ、Ｔ ルを配置することにより、天然の用産物が真核細胞中で発現されうろことが示唆 された。この場合、これらプラスミドはＨＴ　Ｌ　Ｖゲノムの３′側の半分から エンベロフタ−で発現されえ、かつこのベクター針畦倖しうろこと全確認するた めに、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝 子にコードされる９つのアミン末漏残貼シ 基とｌスプライスアクセプターから終結コドンまでわたる完全なＨＴ　Ｌ　Ｖ　 ＝　Ｉ　ｔ　ａ　を遺伝子の産物とからなる融合イＨ白質のみ？発現するように プラスミド（ｐＯＡＴＬＯＲユ）を設計した。っこのハイブリッド遺伝子をプラ スミドｐＵ３几−！及びｐＵ３−１と共に種々のセルライン内にコトランス７エ クト（ｅｏｔｒａｎｓｆｅｅｔ　）　シた。ｐＵヨ几−１によるＣＡＴ　ＬＯＲ ｉのコトラ／スフオーマントによって、ヒトＴリンパ球（ＨＵＴ７８　）、サル 腎ｈａ胞（Ｃ０８＝１）及びネズミ線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３　）における効率 的な転写が明らかになった。ＨＴＬＶ−１及び扉のＬ　Ｔ　Ｒ配列によって指令 される遺伝子発現の速度に影響するこれらプラスミドの能力を検討した。

融合産物又はプラスミドＣＡＴＬＯ１ｔ４ば、ＣＡＴ遺伝子がＨＴＬＶ　ＬＴＲ の制御下に置かれたプラスミドでコトランスフエクトしたときに、過剰産生クロ ラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼという形態でトランス活性化の証 拠を示した。他のインティケータ−プラスミドで得られた結果とこの結果とから 、ＯＡ、ＴＬＯＲｉプラスミドの融合産物の１部であると思われるＩ（Ｔ　Ｌ　 Ｖ−１の艮い読み取り枠（困遺伝子）の遺伝子産物がトランスに活性化する因子 であることが示される。また、ＨＴ含有するＬＴ）Ｌに制御された発現ベクター 又はその他のベクターでコトランスフエクトすることにより、所望の宿主細胞に こ子を発現ベクターそのものに含有させることもできる。

ここに開示したトランス活性化因子のもう一つの用途はセルラ・インの不死化（ ｉｍ−ｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ　）である。ＨＴＬＶ−１による細胞の不死 化は、多分、リンパ球の増殖制御に関与する細胞遺伝子のトランス活性化を介し て、ｉ１！接的又は間接的にＨＴ　Ｌ　Ｖ部産物によって媒介される。疾患特性 及びトランス活性化現象によりＢＩ、Ｖ及びＨＴ　Ｌ　Ｖが他の非急性レトロウ ィルスから識別されるので、ＨＴＬＶｔａｔ遺伝子の産物は形質転換プロセスで 重・をな役割を果す。

（見、！５−白） Ｂ、ＨＬＶ　−ｔａｔ”　’Ｊｌｉ。

トランス活性化を決定するためにはＨＴＬＶ−１のどの領域が必要であるかを決 定するために、ＨＴＬＶ−１プロウイルスゲノムに欠失を導入した。欠失プラス ミドは、ラトナー（Ｒ，Ｉｔｎｅｔ　）ら、ネイチャー（連想ヱ）、と、３：２ ７７（１９８５）によるＨＴＬＶ−ｉゲ、ツムの配列に基き、欠失終点のヌクレ オチド番号を用いて命名する。プラスミド（ｐＨＸＢｅ２　）■欠失変異体のト ランス活性化能を上記と同様のコトランス７エクション実験でテストした。欠失 体をテストするための受容体としてはヒーラ（Ｈｅ１ａ　）　Ｉｆ１１１胞を用 いた。何故ならば、このセルライン中では本来ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲの活性が低い のでトランス活性化の存否について正確に評価できるからである。欠失プラスミ ドとそれ奢るトランス活性化因子をコードする部分の同定にある。ゲ、２ムのこ の部分は欠失プラスミドｐＤ（８３−５３６５１５６０７−７７１９／８０３３ −９２６６）によって規定されたものに対応する。ＨＴＬＶ−Ｉゲノムの田領域 の可能性のある産物の予期きれるアミノる点で注目すべきものである。核酸と結 合する能力を示すいくつかの核蛋白質でこのようなアルギニン／リシンの多い領 域が発見された。配列決定した種々の１（ＴＬＶ−１単離体の中でこの塩基性の 部分（５ｔｒｅｔｃｈ）は不変であシ、このことはそれが機能を維持するために 保存されているかもしれないことを示唆して仕存壱佳４傅さ枦 ＨＴＬＶ−１の場合にはし」遺伝子とその産物はＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−１ と同様の方法で使用して、例えば宿主細胞の感染、宿主細胞ゲノムに対する加遺 伝子の永久的付加、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−ＩＬ　Ｔ　Ｒで促進される発現ベクターによ るコト５ンスフエクション、又はこのようなベクター内への取シ込みにより大ｔ の遺伝子産物産生を得ることができる。

トランス作用性因子に応答するシス作用性調節要素の位置Ａ、ＨＴＬＶ−１末端 長反復配列内のシス作用性調節配列の位磁ＨＴ　Ｌ　Ｖ′ウィルス中の統合プロ ウィルス（ｉｎｔｅｇｒａｔｍ　ｐｒｏｖｉｒｕｓ　）にフランク（ｒｌａｎｋ ）する末端長反復配列は宿主のＲＮＡポリメラーゼと相互作用する認識信号を含 有している。この信号はポリメラーゼ用の開始部位、プロモーター及び近くのプ ロモーターでの転写速度を支配するエンハン型−と呼ばれる配列を含んでいる。

ＨＴＬＶ−ＩＬＴ几が、エンハンサ−とプロモーター要素に加えて、ＨＴＬＶ− １に感染した細胞の中に存在するトランスに作用する調節因子に応答するシス作 用性の調節要素を含有していることが判明するだろうと予期された。

Ｌ　Ｔ　Ｒの“ＴＡＴλ′配列に対し、５′のシス作用性調節要素を同定するた めに、一連の５′欠失変異体を構築した。上述しかつ図１に示した、細菌のＯＡ Ｔ遺伝子の構造コーディング配列の５′にＨＴＬＶ−ＩＬＴ几配列配列有してい る７にプラスミドｐＵ３）Ｌ−１で欠失を作製した。欠失プラスミドを真核細胞 中にトランスフェクトレ、トランスフェクションの４８時間後に調整した細胞抽 出物のＯＡＴ酵素活性を測定した。

非リンパ様細胞及びリンパ様細胞での転写速度（対する欠失の影響を図２Ｃに示 す。先ず７０個のヌクレオチドを欠失させると転写活性が実質的に失われた。更 に１０個のヌクレオチドを欠失させると活性は部分的に回復した（図２ｅ）。従 って、負の調節要素はＵ３配列の位置−２９４と−２８６の間に位置しうる、っ 欠失−？６２及び−２４０の場合は、リンパ様細胞での転写ト比ベヒーラ（Ｈｅ １ａ　）細胞での転写に対する欠失の影響に驚ろくべき相違があることが観察さ れた。これらの欠失はヒーラ（Ｈｅ１ａ　）　ａｔ胞中でのＣＡ、　Ｔ活性のレ ベルを約１０倍減少させるが、リンパ様細胞中では転写レベル全約２倍減少させ るのみである。この知見により、非リンパ様細胞内の効率的な転写に必要な配列 はヌクレオチド−２８６と−２６２の［）Ｘｌに位置する、′。

と、及びこのような配列はある塊のリンパ様細胞での効率的な転写には必要では ないことが示唆される。位ｉＦｊ’、−２３０−まぐさらに１０個のヌクレオチ ドが欠失すると検討した全細胞で転写活性のレベルが実質的に減少する。後者の 欠失では上流の５１１）　ｐ反復配列のほぼｈと２１ｂｐ反復配列全体とが除去 される。

このように、５１ｂｐと２１ｂｐの不完全反復配列はＬＴＲ内で各各２回及び３ 回重復して繰り返されるにもかかわらず、以上のデータの意味することは最も５ ′の反復配列か完全な転写活性に必要であるということである。

欠失研究の解析によって、トランスに調節される領域の５′境界についての情報 も得られる。非感染細胞と比べＨＴ　Ｌ　Ｖに感染した細胞では（ＳＶ４０初期 領域プロモーター要素に対し規格化したときに）ＯＡＴ遺伝子発現のレベルが約 ７５〜１５０倍高い。位置−２３０全通って伸びる欠失でもこの倍率は一定のま まである（図２ｅ）。従ってウィルスに関連するトランス調節はＬＴＲの５′末 端と位置−２３０との間の配列に依存しない１、さらに、転写開始部位の上流に ５５個のヌクレオチドを保持した欠失体ｐＣ５５はＯＡＴ活性をほとんど指令し ないので、トランス−活性化に必要なある配列が除去されていると推測される。

Ｔ　Ａ、　Ｔ　Ａボックスの５′側に離れている反復配列は明らかにＨＴＬＶ− Ｉ　Ｌ　Ｔ　ｌ（の転写活性の役割を持つので、Ｕ３領域内のこのような配列が エンバンサー要素、すなわち配向に関係なく異種プロモーター上での転写速度を 増すことのできる配列とし２て働くかどうかを決定しようとした〔ベノイスト、 シー。

（Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｏ，）ら、ネイチャー四ｎ包Ｅ）、２９０：３０４〜３１ Ｇ（１９８１）　：バナージ、ジエー、　（Ｂａｎｅｒｊｉ、　Ｊ、　）ら、セ ル（９出）、２７：２９９〜３０８（１９８１）：及びグルス、ピー（Ｇｒｕｓ ｓ。

Ｐ、）ら、ブロク、ナトル、アカデ、サイ、米［Ｂ　（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳ　Ａ　）、７８：９４３〜９４７（１９８１）参照 〕。

ＬＴＲの５′末端からＴＡＴＡ開始配列のヌクレオチド３５個分上流の位置まで 伸びる部分を、ｐＳＶＩＸ　ＯＡＴ内で自身のエンハンサ−要素を欠（ＳＶ４０ 初期領域プロモーターの５′に挿入した。同じ転写配向でＵ３配列のコピーを、 １つもしくは２つ、又は反対の配向で１つのコピーを含むプラスミドを構築した （図１ｃ）。

ヒーラ（１（ｅｌａ　）　ｄｉ胞のトランスフェクションに際してのＣＡＴ活性 レベルを図２ｂに示ず。ＨＴＬＶＵ３配列がないと活性はほとんど検出されな力 ）つた。しかしながら、１つ又は２つのＵ３配列コピーを含有するプラスミドに ついてはＯＡ、　Ｔ遺伝子の発現はそれぞれ４５又は１３０倍高かった。Ｕ３配 列が反対の配向にあるときには、ＯＡＴ活性のレベルはｐｓＶｌｃＡＴの１３倍 であった。これらのＤ　Ｎ　Ａ、を他の非リンパ様細胞及びリンパ様細胞にトラ ンスフェクトし°〔も同様な結果が得らｎだ（表３）、、これらの細胞のいくつ かはＨＴ　Ｌ　Ｖに関連するトランス作用因子を含有している。こうして、Ｔ、 　Ｔ　Ｈのこの部分内にある配列が効率的な転写エンハンサ−として機能するは ずであると結論した。

エンハンサ−プラスミド　Ｈｅ１ａ　Ｃ８１−６６４５ＨＴＬＶ　ｐＨＥ３０Ａ Ｔ　ＬＯＯ，１５ｐＨＸＩＯＡＴ　３１　よ２０ Ｒ８Ｖ　ｐ几ＥＳ１　２　ＮＩＰ＊ ｐ）ＬＥＨＩ　７　Ｌ２ 表３はＨＴ　Ｌ　ＶとＳＶ４０のプロモーター配列の比較活性を示している０Ｈ ＴＬＶ又はＳＶ４０のプロモーター配列の５′にＨＴ　Ｌ　Ｖ及び１（ＳＶのエ ンハンサ−配列を持つ組換えプラスミドを表示した。細胞型にトランスフェクト した。４８時間φインキュベーションした後にＯＡＴアッセイを行った。表示し た値は、プラスミドｐＵ３Ｒ−１でトランスフェクトした同様の細胞中に存在す る活性に対して規格化したＣＡＴ活性のバー・センデータを表わす。

＊ＮＤは実施せず。

このエン・・ンサー効果は調べた全細胞で同様であシ、リンパ様起源の細胞に限 定されない。池のレトロウィルスエンハンサ−要素について観察されている〔ラ イミンズ、エル、ニー。

（Ｌａ１ｍ１ｎｓ、　Ｌ、人、）ら、ジエー。ビロール。（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、 　）、４９：１８３〜１８９（１９８４）及びフロム、エム（Ｆｒｏｍｍ、　Ｌ 　）ら、モル、セル、パイオール、　（Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　） 、３：９９１〜９９９（１９８３）参照〕ように、転写配向には多少優先性があ るように思われる。

さらに、この領域は他のウィルスエンハンサ−で観察された反復配列に形の上で は類似しているかもしれない反復配列要素を含有しているにもかかわらず、この 領域は多くの真核及びウィルスのプロモーター安素の５′で観察されるコンセン サスコア配列に相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　）な配列は含有しない〔ワイ／・ −、エイチ（Ｗｅｉｈｅｒ、　Ｈ，）ら、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）、２ １９：６２６（１９８３）及びライミンズ、エル、ニー、　（Ｌａ１ｒｎｉｎｓ 、　Ｌ、　Ａ、　）ら、ブロク、ナトル、アカデ、サイ、米国（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７９：６４５３〜６４５７（１９８２）参照〕。そのため 、ウィルスＬＴＲ内に存在する他の配列がこの機能を果たすはずである。

Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ開始配列に隣接する領域が異種エンハンサ−要素に対するプロモ ーターとして働きうるかどうかを決定するために、Ｕ３領域の、ＴＡＴＡ配列に 対し５′の３５ヌクレオチド、ＲＮＡ開始配列を通って延びる部分を含むプラス ミドｆｃ＃Ｉｔ築した（図２）。この配列の５′にＨＴＬＶのＵ３領域（反対の 配向で）又はＴＡＴＡ開始配列のないラウス肉腫ウィルス（Ｒ８■）のＵ３領域 を含むプラスミドも構築した。ＳＶ４０初期プロモーター領域とＨＴＬＶ及びｉ ｔ　ｓ　ｖのＵ３エンハンサ−領域を含むハイブリッドプラスミドも構築した。

こうしてＨＴＬＶとＳＶ４０のプロモーター機能の比較ができた。

ＨＴＬＶエンハンザ−及びＳＶ４０プロモーター領域を含有するプラスミドと対 比して、ＨＴＬＶプロモーター及びエンハンサ−配列を持つプラスミドでトラン スフェクトした細胞ではＣＡＴ遺伝子発現が２０〜３０倍高かった（表３）。活 性の上昇は、それ自身のプロモーターと並んだ逆向きのＨＴ　Ｌ　Ｖエンハンサ −の機能ではない。ＲＳ　Ｖエンハンサ−配列がＨＴＬＶ及びＳＶ４０のプロモ ーター配列の両方の５′にあったときには、１（Ｔ　Ｌ　Ｖプロモーターを含有 する構築物は類似のＲ８Ｖエンハンサ−構築物の少なくとも３倍強力であった（ 表３）。この観察によって示されるように、ＴＡＴＡボックスの周りのＨＴＬＶ 配列の領域は異種エンハンザ−要素に対するプロモーターとして働くことができ る。

これらのプラスミドで０８１−６６７４５リンパ様細胞ヲト乏ンスフエクトする と、ヒーラ（Ｈｅ１ａ　）細胞で得られたと同様のＣＡＴ活性レベルが得られる （表３）。従って、ハイブリッド転写領域は有効なプロモーターだが、これら細 胞内に存在するトランス作用因子には応答しない。従って、トランスに調節され ているこの完全な機能性領域はＨＴＬＶＬ　Ｔ　Ｒの−３５と＋３１５の間には 存在しない。

ここに示したデータによって、ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲのＵ　３部分のいくつかの機 能性ドメインの定義も得られる。この領域は他のエンハンサ−要素で見られるコ ンセンサス配列と類似する配列を欠いて−・るにもかかわらず、ＬＴ凡の−３３ ５と−３５との間にある領域げ転写エンハンサ−要素として働く。さらにＨＴＬ Ｖエンハンサ−はマウスイムノグロブリンＨ鎖遺伝子〔ギリーズ、ニス、ティー 、　（Ｇ１１ｌｉｅｓ、　Ｓ、Ｄ、　）ら、セル（自旦）、３３ニア１７〜７２ ８（１９８３）及びバナージ、ジエー、　（Ｂａｎｅｒｊｉ。

Ｊ、）ら、セル（笠）、３３ニア２９〜７４０（１９８３）参照〕及びいくつか の他のレトロウィルス〔ライミンズ（Ｌａ１ｍ１ｏｓ　）ら、上記及びリニー、 イー、　（Ｌｉｎｎｅｙ、　Ｆ−）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、３０８ ：４７０〜４７２（１９８４）参照〕のエンハンサ−が示すような検出しうる組 織指向性（優先性）を示さない。

これらのデータは、位置−２８６と−２６２の間に存在する配列が非リンパ様細 胞内の調節機能全付与することを示唆している。この可能性は、この配列を持た ないＨＴＬＶ−１のＬ　Ｔ　Ｒ〔ソドロスキー、ジエー、　（８ｏｄｒｏｓｋｉ 、　Ｊ、）ら、ブロク、ナトル。

アカテ、ザイ、米国（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅ’、　ＵＳＡ 　）、８１：４６１７〜４６２１（１９８４）及びシモトーノ、ケー、　（Ｓｈ ｉｍｏｔｏｈｎｏ、　Ｋ、　）ら、ブロク、ナトル、アカデ、ナイ、米国（Ｐｒ ｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）、８１：１０７９〜１０８３（１９８４）参照〕が非リン パ様細胞内では有効なプロモーターではない〔チェン、アイ、ニス。

ワイ、　（０ｈｅｎ、　１．　Ｓ、　Ｙ、　）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　 ）、３０９：２７６〜２７９（１９８４）参照〕のであるから興味深い。゛また これらのデータは、トランスに活性化される領域が位置−３５と−３８５の間又 は位＃−３５と＋３１５の間のいずれの間にも完全な形では存在しないことも示 し′Ｃいる６、このことからトランスに調節される領域はこれら２つの領域全通 って伸びていること金示同様の方法を用い、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−１のＬ１４中のシス に作用する調節要素の位置を決定した。認められた種々の要素を図６に示す。こ のＬ　Ｔ　１４はエンハンサ−要素、プロモーター、ウィルスに感染した細胞内 でＨＴＬＶ−ＩＬＴＲが指令する遺伝子発現のレベルを大幅に上昇させるために 必要な領域、並びにＨＴＬＶ−ＩＬＴＲプロモーター及び異種プロモーターによ って指令される遺伝子発現を負に調節する領域を含有している。

ヌクレオチド−１３７と−１７の間にある（　ｃａｐ　＝　＋　１　）ＨＴＬＶ −１エンハンサ−Ｕ多くのウィルス又ｉ細胞のエンハンサ−配列に典型的なタン デム反復要素とコアコンセンサス配列の両者を欠いている。これは同様にコアコ ンセンサス信号を欠＜ＨＴＬＶ−［エンハンサ−に類似している。非リンパ様セ ルラインと同様にリンパ様セルラインで異種プロモーター配列の活性を機能的に 補完するエンハンサ−の能力は注目すべきである１、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−１エンハン ナ・−の多くの荀ｊ胞型で働くｉ能力から、ｉｆ　ＴＬ　Ｖ　−１の０ＫＴ４＋ 細胞指向性（ｔｒｏｐｉｓｍ　）はＬ　Ｔ　Ｒのみの機能によるものではないと 結論できる。

エンハンザ−要素自身はウィルスに関連するトランス作用性調節因子に応答し５ ない。この点において、これらの要素はＩ−Ｉ　ＴＬＶ−１のエンハンザ−に類 似しているが、同種ウィルスによる感染に関連する因子に弱（・と云えども応答 するＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ−１及びＢＬＶのエンハンサ−要素とは云なる。

ゲノムのＲＮ　Ａ開始部位を囲む配列は同種及び異種の両方のエンハンサ−配列 に応答するプロモーター配列として働くことができる。しかしなから、機能的な エンハンサ−が存在しないとこわらの配列はウィルスに関連したトランス作用性 調節因子に応答しえない。明らかに、−１７と＋８０との間にある配列は応答性 表現型には十分なものである。これらの配列はＨＴ　Ｌ　Ｖ−■エンハンサーの 配列と重ならず、プロモーター配列と共通の末端（ｃｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　） をもたない。この理由のために、この領域がトランスに作用する応答性又はター ゲット要素に対する新しい型の調節要素、すなわちＴＡル要素を含有していると 思われる。

異種エンハンサ−プロモーターと同様に同種のものからも指令される遺伝子発現 のレベルに負に影響するＨＴＬＶ−Ｉ　Ｌ　Ｔ　ｌ（の５′末端にある配列の同 定は予想外であった。この配列は離れた位置から配向に関わりなく’ＯＡＴ遺伝 子発現のレベルに負に作用する。Ｎ　ＲＥ配列は感染及び非感染細胞の両者でＨ Ｔ　Ｌ　Ｖ−ＩＬＴＲによって指令される遺伝子発現を下向きに調節することは 注目すべきことである。ＮＲＥの作用はエンハンサ−要素の作用と反対である。

工要素とｔａｒ　９素ならびに遺伝子産物生産におけるそれらの使用に重きを置 いて来たが、業界の技術者は認識できるように、ここで記載した発現系にその機 能を変更または改良するために他の要素を含ませることができる。たとえば、こ こに記載した発現ベクターおよび／または活性化ベクターはポリアデニル化シグ ナルのような他の要素、ネオマイシン耐性やＧＰＴ耐性のような１種以上の選択 マーカー、等を含んでいてもよい。

たとえば適切な宿主の範囲を拡大するために別のエンハンサ−要素をさらに含ま せてもよい。その他の修正は当業者には全く自明であろう。

以下の実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明を理 解するためのものであって、本発明の範囲と限定するためのものではない。Ｘｈ ｏ　Ｉ及びＨｉｎｄ　＠合成りＮ人すンカ−の使用も言め全ての組換えＤＮＡ手 法は標準的手順による。

本発明ベクターは、マン（Ｍａｎｒｌ　）ら、セル（リノ）３３：１５３（１９ ８３）　に記載された手順に従って製造されるもののようなウィルスベクター又 はプラスミドの形でありうる。

イ重々のセルラインはトランスフェクトされたＤＮＡを取り込み、発現する能力 が異なっている。各実績で、ＨＴ　Ｌ　Ｖ配列金持つプラスミドが指令するＯＡ Ｔ活性はＳＶ４０エンノ・ンサープロモーター要素を含むグラスミドのものに対 し規格化した。

ＳＶ４０転写要素は非常に多くの細胞、型で機能することが示され、同様の研究 の比較的中立の参照プロモーターとして利用されている〔ゴーマン（Ｇｏｒｍａ ｎ　）ら、上記；及びエム、ティー。

ワーカ−（Ｍ、　Ｄ、　Ｗａｌｋｅｒ　）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、 ３０６：５５７（１９８３））。

実施例Ｉ ＨＴＬＶ−ＯＡＴ　ｍ換ｇプラスミトノ構築動物のレトロウィルスＬＴ几の転写 制御要素はＵ３領域内に含まれている〔エイチ、エム、チミン（Ｈ，Ｍ、　Ｔｅ ｍ１ｎ　）、セルＴｅｍｊｎ）、セル（出旧）、２８二３（１９８２，１参照〕 。ＨＴＬＶ　Ｌ　Ｔ　Ｒの通常エリ長いＲ領域は転写調節の役割を演すると思わ れたので、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−１のＵ３及びＩＬ領領域全体をクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ−Ｔ）遺伝子の５′に挿入した（ｐ＋Ｊ３Ｒ Ｉ及びｐＵ３Ｂ、−ｎ　、）（図１及びシー、エム、ゴーマン（Ｃ，Ｍ、　Ｇｏ ｒｍａｎ　）ら、モル、セル。パ・イオール、　（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１゜匹患） 、２：１０４４（１９８２）ニジ−、エム。ゴーマン（０，Ｍ。

Ｇｏｒｍａｎ　）ら、ブロク、ナトル、アカデ。サイ、米国（匹μＮａｔ１．　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）、７９：６７７７（１９８２）　 参照〕。ＩＴＪ、Ｖ−１のＵ３とＲ領域の１部とのみを含有する第３のプラスミ ドも構築した（ｐＵ３−Ｉｆ）（図１）。

Ａ渡的トランス７エクシヨンアツセイにおける０人ＴＩＪＩ云子ノ活性ｋ、ＣＡ Ｔ遺伝子の５′にある、ＳＶ４０エンハンサーーへプロモーター領緘全体（ｐｓ Ｖ２ｃＡＴ　）、Ｓ　Ｖ　４　Ｑ　：ｒ−７ハ７サー金含む７２塩基反復領域全 持たないＳＶ４０のプロモーター（ｐｓＶＩＸｃＡＴ）、又は、ラウスザ／Ｌ／ 　コ−マウイルスノＬ　Ｔ　Ｒ全体（ｐＲ８ＶＡＴ　）ｆ含む他のプラスミドの 活性と比較した〔シー、エム、ゴーマン（Ｃ！−Ｍ、　Ｇｏｒｍａｎ　）ら、モ ル。セル、パイオール。（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｉ、　）、２：１０４ ４（１９８２）ニジ−、エム、ゴーマン（０，Ｍ、　Ｇｏｒｍａｎ　）ら、ブロ ク、ナトル、アヵデ。

サイ、米国（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　７９ 　：６７７７（１９８２）参照〕。

挿入したＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ配列の転写活性をテストするために、リン酸力ルンウノ 、法文はＤＥＡ　Ｅ−デキストラン法〔エフ、エル。

グラ”　ム（ＲＬ、　Ｇｒａｈａｍ　）ら、ジュー。ピロロジー（Ｌ４　）、５ ２：４５６（１９７３）；シー、クイーン（０，Ｑｕｅｅｎ　）ら、セル（す旦 ）、３３ニア２９（１９８３）を各々参照−１，〆を用い、トランスフェクショ ンによってプラスミドＤ　Ｎ　Ａを細胞内に導入した。、。

実施例２ 夕維芽及び上皮セルラゴ、、？−玉少−１ｔｆ　ｈ　ＣＡ　Ｔ選廿の発現マウス 、サル及びヒト由来の線維芽及び上皮細胞中において転写要素として作用するＩ −（ＴＬＶ−１及び尊のＬ　Ｔ　Ｒ配列の能力を下記のようにテストしたつ 表４及び図２のデータは、（ＮＩＨ３Ｔ３　’）マウス線維芽細胞〔ジー、ジエ ー、トダロ（Ｇ、　Ｔ、　Ｔｏｄａｒｏ　）ら、ジュー。セル、パイオール、　 （ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）、１７二２９９（１９６３）参照〕では、 ＨＴＩ、Ｖ−１のＬＴ几配列を含有するプラスミドの活性がｐｓＶ２ＣＡＴのも のに匹敵し、ＳＶ４０プロモーター配列のみ全持つプラスミドのレベルより非常 に高いことを示している。このセルラインでは、ｐ）ｔｓＶ　ＣＡ　Ｔでトラン スフェクトした細胞内でのＣＡ　Ｔ活性レベルが最も高かった。またＨＴＬＶ− １配列はサル（ｃｖ−＋）ｉ胞にトランスフェクトしたときにも〔エフ、シー、 ジャンセン（Ｐ、　Ｃ，Ｊａｎｓｅｎ　）ら、ブロク、ナトル、アカテ、サイ、 米国（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ）、５３：５３ （１９６４）参照〕、ｐＳＶ２ＣＡＴプラスミドについて観察されたものよシ低 いがかなりのレベルのＯＡＴ活性を与えた。ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−１のＬＴＲ配列げ これらマウス及びサルのセルラインの両方で非常に低いレベルのＯＡＴ活性を指 令した。これらの実験から、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−ＩのＬ　Ｔ　Ｒ配列は種々の種の細 胞で有効な転写要素として機能することができ、ＨＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲ配列と比 較するとこれらの細胞型で非常に強い促進力を示すことが示される。

表４ ＣＶＩ　サル、線維芽セ　１．０　０．２　ｂ　ｂ　ＮＤルライン ＮＩＨ３Ｔ３マウス線碓芽セ　１、ＯＯ，９２ｂ　ｂ　ＮＤルライン ＭＩ　ＳＶ４０”Ｃ−形賀転　］−０１２ｂ　ｂ　ＮＤ換したセルライン Ｈｅ１ａ　ヒト端層ライン　１．０　Ｚ／１６　ｂ　ｂ　Ｌ６ＮＣ３７ＥＢＶで 不死化Ｌ　１０　４５　ｂ　ｂ　ＮＤたヒトＢリンパ球 ライン ＨＵＴ７８　形質転換したヒト　１．０　４５　ｂ　ｂ　１１リンパ球ライン ０８１６６　ＨＴＬＶ−１に感染　１−０　７４　ｂ　ｂ　ＮＤした非カケシャ ー ＨＵＴ１０２　ＨＴＬＶ−１プロ＝　Ｌｏ　２８　】−＜　Ｌ７　ＮＤ−サーＴ リンパ球ラ イン ＭＴ２　ＨＴＬＶ−１プｏ７−Ｌ　ｈｏ　１８０　ＮＤ　ｓ、ｓ　ｚ４−サーＴ リンノ勺求ラ イン ０３４４　ＨＴＬＶ−璽プロチ　１．０　１４０　４０　４５　ＮＤユーサー ＨＯ８ヒト骨肉腫セルライン　ＬＯＯ，７ｂ　ｂ　ＮＤＨＯ８／ＭＨＴＬＶ−１ ＄３　１０　７５　ｂ　ｂ　１．Ｏａ）示した値はｐ８Ｖ２ＣＡＴと対比した各 プラスミドによるＣＡＴ活性の動力学的分析を示す。

ｂ）ＣＡＴ活性は定量できない程低かった。

ｃ）　ＮＤ−データなし７、 ＨＴＬＶ−ＩＬＴＲ配列を含むプラスミド１ｃヒト線維芽細胞、上皮細胞、ヒー ラ（Ｈｅ１ａ　）　Ｃジー、オー、ゲ・イ（Ｃ０，Ｏｃｙ　）ら、キャンサー　 リス、　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）、１２：２６４（１９５２）参照〕及び Ｎ１１（ビー、ローヤーーポコラ（Ｂ、Ｒｏｙｅｒ−Ｐｏｋｏｒａ　）ら、エク スブ、セル、リス、　（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、　）、１５Ｉ　：４０ ８（１９８４）参照〕にトランスフェクトしたときのＯＡＴ活性のレベルは、同 じ細胞にｐｓＶ２ＣＡＴ含有プラスミドをトランスフェクトして観察されたもの より大きかった。これらの細胞を、ＨＴＬＶＩ型配列を音配列るプラスミドでト ランスフェクトしたときには、ＣＡＴ活性はほとんど観察されなかった。このよ うに、ＨＴＬＶ−感染の天然の標的（ｔａｒｇｅｔ　）ではないヒト細胞内で、 ）（ＴＬＶ・−ＩＬＴＲ配列は転写制御要素どして働くことができるが、ＨＴＬ Ｖ−Ｉ　ＬＴＲ配列は働くことができない。

発現細胞内でのＬＴ几に媒介されたレトロウィルス遺伝子の発現は宿主細胞ゲノ ムに安定に組込まれたプロウィルスから起こり、一方、過渡的アッセイではトラ ンスフェクトされたＤＮＡが指令する転写は主として染色体外状態で存在する〔 ビー、ホワード（Ｂ、　Ｈｏｗａｒｄ　）ら、バイオケム、バイオフイズ、アク タ（：ヒ胎）ハロにり）、２２ｓ：ｘｏｓ（４ｃ＋１ｔ）；及びニー、。

イタ−（人、　Ｌｏｙｌｅｒ　）ら、ブロク、ナトル、アカテ、サイ、米国（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、　Ｓ、ん）７９二４２２（ １９８２）参照〕。

ｄ４渡的アツ七イから侍た結果が組込まれたプロウィルスいｎｔｅｇｒａｔｅｄ 　ｐｒｏｖｉｒｕｓ　）でのＨＴＬＶ　Ｌ　Ｔ　Ｒ，機能を理解するために適切 かどうかを決定するために、ＣＡＴ発現を指令するために使用すれるＨＴＬＶ　 ＬＴｌｔ配列をネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）遺伝子の上流 に置（・た〔ビー、ジエー。

ザザン（Ｐ、　Ｊ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ　）ら、モル、アブル、ジエン、（Ｍｏ ｌ。

Ａｐｐｌ、（３ｅｎ、）１：２２７（１９８２）］。これらのブラスミドヲマウ ス及びヒトのセルライン（表５）にトランスフェクトし、安定にトランスフェク トしたコ０ご、−をネオマイシン　アナローブＧ〜４１８の存在下で選択（−た 。侍らｌ、たＧ〜４１８耐性コロニー数をＳＶ４０で促進されたネオマイシンホ スホトランスフェラーゼ遺伝子と比べると、過渡的発現のデータでは非常に良く 似ていた。過鍼的アッセイでのＯＡＴ活性レベルにより、テストしている転写要 素が宿主染色体内に組込まれたときに機能する能力がかなり合理的に洞察できる 。

表５ ｐＵ３Ｒ−１ｐＵ３１　ｐｓＶ２ＮＥｏ　Ｒ８ＶＮＥＯＮＩＨ３Ｔ３　２４　０ 　２４　８２ ヒーラ（Ｈｅｌａ）　１５　０　７　９７表５に示した組換えプラスミドは、Ｈ ｉｎｄ　Ｉ　−Ｂａｍ　ＨＩでＨＴＴ、Ｖ−ＣＡＴ組換え体を開裂し、ＣＡＴコ ード配列をネオマイシン耐性をコードする遺伝子で置き換えることにより構築１ 〜た。

トランスフェクションの２４時間前に、１００ｃｊｄの皿にＩ　Ｘ　１０’個の 細＠を播種した。３μｑのＣ５Ｃｔ結合１　ｂａｎｄｅｄ　）　Ｄ　Ｎ　Ａを使 うリン酸カルシウム０４−ＤＮＡ共沈共沈法日用トランスフェクションを行った 。４８時間後に、細胞ｆ　１５０−の皿に移し、Ｇ−４１８（４００／ｊり／Ｗ ｌｔ）含有培地中で選択した。トランスフェクションの２〜３　］後にコロニー ’、ｒ計測り、＊。

（以１・゛余白） 実施例　３ と）　ＩＪンノ耐球様細胞での発現 天然に起こるＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖの感染では感染細胞の多くはＴ細胞由来である〔ア ール、シー、ガ”　（Ｒ，Ｃ、Ｇａ１ｌｏ）ら、ブロク、ナトル、アカデ、サイ 、米国（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　、Ｓ　、　Ａ、　） 、７９：５６８０（１９８２）参照〕。しかしながらＢ細胞マーカーを発現する ＨＴＬＶ産生細胞がいくつか単離された〔例えば、エヌ、ヤマモト（Ｎ　、　Ｙ ａｍａｍｏｔｏ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ｏンドン）、２９９　：３ ６７（１９８２）参照〕。リンノぐ球内でのＬＴＲ配列の相対的な促進力を決定 するだめＫ、リン・？球様細胞由来のセルラインに上記のプラスミドをトランス フェクトした。使用したセルラインは、Ｉ（ＵＴ７８、すなわちセザリー症候群 （Ｓｅｚａｒｙ３ｙｎｄｒｏｍｅ　）のＨＴＬＶ−陰性患者由来の０ＫＴ４＋ヒ トＴセルライン（このセルラインはＨＴＬＶプロウィルス配列を持たない−との セルラインの特徴及びオリジナルな参考文献としては、ブイ、マンザリ（ｖ、■ ｃｎｚａｒ　ｉ　）ら、ブロク、ナトル、アカデ、す（１９８３）参照〕；ＮＣ ３７、す々わち正常ドナーから樹立されたエプスタインーバーウ・イルスで不死 化したＢセルライン（同上）：及びＬ６９１、すなわちＴ細胞マ・−カーを発現 するマウスリンパ様セルラインであった。

ＨＴＬＶ−１のＬ　Ｔ　Ｒ配列はかなりのレベルのＣＡＴ遺伝子産物の合成を指 令し２、これ対ｐ　Ｓ　Ｖ　２　ＣＡ　Ｔ活性のそれは線維芽細胞及び上皮細胞 セルラインでのこの比の約２倍窩かった。プラスミｒｐＶ３Ｒ−Ｉ　をトランス フェクトしたマウスセルラインではｐＳＶ２ＣＡＴによって訪発されだ（／はル と比べＣより高いＣＡ、Ｔ活性が観察さｉ″Ｌだ。これらの発見は種特異性及び 細胞型判異性因子がＨＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲの活性を調節することを示している。

驚くべきことに、ＨＴＬＶ−ＩＩ　ＬＴＲ配列を含有するプラ認識できる１／ベ ルのＣＡＴ活性は得られなかった。このことは、ヒドリン、ｅ球様細胞の環境は ＨＴＬＶ−ＩＩ　ＬＴＲの有効力機能には十分でなく、ＨＴＬＶ−１及びＨＴ　 Ｌ　Ｖ−１１のＬＴＲ機能の要件には差があることを示唆していた。

実施例　４ ＨＴＬＶ感染細胞での発現 リンパ球様細胞セルラインでＨＴＬＶ−ＩＩ　ＬＴＲが不活性であることは、Ｈ Ｔ　Ｌ　Ｖ標的細胞に特異的な因子がＨＴ　Ｌ　ＶＬ　Ｔ　Ｒの制御下でのイイ 効なＣＡＴａ伝子発親子発現であろうことを示唆した。このために、感染個体由 来のＨＴ　５．　Ｖ産生セルライン又はヒトー次リン−髪球の共培養から確立し たセルライン内 使用セルラー（ン１ｄＨＵＴ　１０２、及びＨＴＬＶ関連Ｅ′ｙ、大型Ｔ羅胞白 血病／′リン・？腫（きのと状フンダスー同上）患昔から確立し＆、ＨＴＬＶ− ｉ産生０ＫＴ４＋−１＝ルライ７：ＭＴ２．及びＨＴ　Ｌ　Ｖプロデユー・ザー ＋ルラインと共培養した後−次Ｔ１）ンー耐球を不死化し−２で確立したＨＴＬ Ｖ−１産生ＯＫＴ・４＋セＡ−ジイン〔アイ、ミヨシ（Ｉ　、　Ｍｉｙｏｓｈｉ 　）ら、ネイｆヤー　（Ｎａｔｕｒｅ　）　（＊ンドン）、２９４’７７０（１ ９８１）参照コニＣ３−４４、すなわち患者細胞と一次リンノ？球を共培養する ことに二って得られた不死化ＨＴＬＶ−■産生セルライン（マンザリ、上記）； 及びＣ８１−６６、すなわちウィルスを産生じないＨＴＬＶ−１不死化０ＫＴ４ 十−次Ｔｉｍ胞〔ビー。バーン（Ｂ、Ｈａｎｈ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ Ｘ　’ンドン）、３０３：２５３（１９８３）参照〕を包含していた。

１（ＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲ配列を含むシラスミドでこれらのセルラインをトランス フェクトして得られた結果は顕著で予期しないものだった。ｐＳＶ２ＣＡＴＯも のと比しＣＡＴ活性レベルは劇的に上昇し２．２５〜１８０倍の増加であった。

■型ＬＴＲＡＴ活性がこのように大きいととに寄与しているのはとれらの細胞中 のｐＳＶ２ＣＡＴ及びｐＳＶＣＡＴプラスミドの活性が一貫して減少することで ある。これは、これらの要素の取込みと促進活性の効率の低下によるものかもし れない。トランスフェクトしたＤＮＡの発現をこれらの細胞によセ又は特異的も しくは非特異的因子に対して規格化すると、これらの要素の促進活性が下方に調 整される。ＤＮＡの取込み釦ついて規格化すると、感染細胞中のｐＵ３−ＲＩプ ラスミドによって指令されるＣＡＴ活性のレベルの上昇は真の増加であって非感 染ＭＢ胞中のしＲルと比較した相対的なもののみではないことを表わすことが示 される。過渡的に発現するＤＮＡの染色体外状態は有効なシス−活性化を妨げる ことから、これらの結果はＨＴＬＶに感染した細胞内のトランス作用因子がＨＴ 　Ｌ　Ｖ　Ｌ　Ｔ　Ｒの転写能を刺激することを示唆している。低いとはいえ、 ＨＴＬＶ−ｎＬＴＲ配列を含有するプラスミドによって指令されるＣＡＴ活性は ＨＴＬＶ−Ｉプロウィルスを含有するほとんどの細胞内では非感染細胞内より実 質的に高い。

■型ウィルスを産生ずるセルライン内でＨＴＬＶ−１’［ＬＴＲ配列が機能しう るかどうかを決定するために、同じプラスミドを使°つてＣ３−４４セルライン を・トランスフェクトした。このセルラインでは、ｐＵ３Ｒ−ＩｔとｐＵ３−Ｉ Ｉの両者のプラスミド（てついて非常に高いレベルのＣＡＴ活性が観察された。

ＣＡＴ活性のレベルｕｐｓＶ２ｃＡＴ　ＤＮＡをトランスフェクトした同じ細胞 のものの約４０倍である。このことは、適切な細胞環境ではＨＴ　Ｌ　Ｖ　−［ Ｉ　Ｌ　Ｔ　Ｒも有効々転写ｇ素として働くことを示している。

ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ　Ｌ　Ｔ　Ｒ配列を含有するプラスミドのＣＡＴ活性はＣ３ −４４細胞中でも非常に高く、ｐＳＶ２ＣＡＴの約１３５倍であった。すなわち 、ＨＴＬＶ−ＩＩ感染の標的細胞でさえも、ＨＴＬＶ−ｎ　ＬＴＲ，１：りもＨ ＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲがｉ大きな促進力を示している。

ＨＴＬＶに感染したＴリン／髪球はマイトジェン刺激又は抗原刺激に露出するこ とにより活性化したＴ細胞の特性でもある変化を示す。〔エム、ボボビツク（Ｍ 　、　Ｐｏｐｏｖｉｃ）　ｔ）、ブロク、ナ８０：５４０２　（１９８３））。

Ｔ細胞活性化のみが細胞環境を変えてＨＴＬＶ　ＬＴＲの転写活性を増加させる のかどうかを検討するために、ＨＴＬＶ−ＣＡＴと対照プラスミドを、Ｔ細胞マ イトジェンフィトへマグルチニン（ＰＩ−ｆＡ）の存在下及び不在下の両方にお いて未成熟ヒトＴセルライン、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ　）にトランスフェ クトした〔マンザリ（Ｍａｎｚａｒｉ）、上記、参照〕。ＣＡＴ活性の相対レベ ルに対するＰ　Ｆ（Ａ刺激の作用はいずれのプラスミドによっても認められなか った。Ｔ細胞のＰＨＡ−活性化のみでは、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−ＣＡ　Ｔプラスミドで トランスフェクトした感染細胞中で見られるＣＡＴ活性の刺激を説明するには不 充分であると結論した。

実施例　５ ウィルス関連トランス作用因子のテストＨＴＬＶＫ感染した１９７７９球のサブ セットでＨＴＬＶ　ＬＴＲ機能の程度が高いというこの現象に、ウィルスがコー ドしている又は誘導する因子が役割を演じているかどうかを直接的にテストする ために、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でヒト骨肉腫ライン（ＨＯ８）にＨＴ ＬＶ−ｉ　を感染させて確立したセルラインであるＨＯ８／’Ｍ細胞にプラスミ ｒを導入した。ＨＯＳ／Ｍ細胞はＨＴＬＶ−Ｊピリオンを産生し、ウィルス蛋白 質を発現するにもかかわらず、Ｔ細胞増殖因子のレセプター、ＯＫＴ抗原、新規 なＨＬ　Ａ抗原又はリンホカインを発現しない。これはＨＴＬＶ感染リン／す球 の特徴である性質である〔ピー、クラファム（Ｐ。

照］。従って、ウィルス蛋白質が産生きれるにもかかわらず、ＨＯ８／Ｍの細胞 環境はＨＴＬＶに感染した肺瘍細胞とは非常に異り、上記の他のものと区別する 助けとなる。

上記に示したように、ＨＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲが非感染ＨＯ８細胞内で働く機能は ＳＶ４０初期プロモーターより幾分効果的ではなかった。対照的に、ｐｖ３■ｔ −１によって指令されるＣＡＴ発現はＨＯ８−Ｍ細胞内でけ１）ＳＶ２ＣＡＴの ものの５５倍高かった。さらに、ＨＴＬＶ−１に感染したリンパ球における我々 の結果と一致して、ｐｖＲＲ−１１及びｐＶ３Ｒ−ＩＩはトランスフェクトした ＨＯ８／Ｍ細胞内でＣＡＴを顕著なレベルでは発現しない。

実施例　６ 欠失分析 （ａ）　明白にするために、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＣＲ株ノＨＴＬＶ−Ｉ　ＬＴＲＵ ３領域内に存在する配列を図１に示す。５１　ｂｐの不完全反復配列にはオーバ ーラインし、２１　ｂｐ　の不完全反復配列には下線をつけた。矢印は下記（ｂ ）で記載する各欠失の位置を示す。

（ｂ）　欠失ＤＮＡを構築するために、先ずプラスミドｐＵ３Ｒ−１”をＬＴＲ 内の唯一の部位Ｓｍａ　１部位（位置−３２２）で開裂した。

消化したＤＮＡをエキソヌクレアーゼＢａｌ　３１と共にインキュベートした。

種々の時点でアリコートを取り、ＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出Ｉ〜、次 いでエタノール沈殿し７た。全ての突き出した末端をＴ４ポリメラーゼで充填し 、次に　Ｘｈｏ　Ｉ　’）ンカーに連結しまた。リンカ−・を付加した後、ＤＮ Ａを再び環化いくつかのす・イズで選択１−１．たクローンを制限酵素分析で特 性決定した。次いで、Ｘｌｌ０　１部位で所望クローンを末端ラベルし、マキリ ーム及びギルバートの配列分析［マキサム、ニー、エム。

（Ｊ’ｌａｘａｍ、　Ａ　、　Ｍ　、　）ら、ブロク、ナトル、アカデ、ゲイ、 米国（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＴＪ　、　Ｓ　、Ａ 　、　）、７４：　５６０〜５６４（１９７７）参照〕にかけて末端を決定した 。各プラスミ）２の名ギＪけ転写開始部位に関ｊノＣ存在するヌクにオチドの数 を示している。

（ｃ）　ＤＥＡＥデキストシン共沈法の変法〔クイーン、シー。

（Ｑｕｅｅｎ、　Ｃ，）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、３３ニア２９（１９８３）参照 −１に二り、欠失ＤＮＡを下記の細胞型にトランスフェクトし、た。

ヒーラＣＩ−（ｅｔａ）、すなわちヒト上皮セルライン：　）（ＵＴ　７８、寸 なわち）＝プリー症候群のＨＴ　Ｌ　Ｖ陰性患者由来の０ＫＴ４＋ヘル、ｅ　／ インデューサー上１−　Ｔセルラ・イン〔ゲイ（Ｇｅｙ）ら、キャンサーリス、 （Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、１２：２６４（１９５２）参照〕；ＮＣ３７、す なわち健常人ドナーから樹立されエプスタインバー／ｌ／　（Ｅｐｓｔｅｉｎ　 Ｂａｒｒ　）ウィルスで不死化した８９７２球う・イン〔マンザリ、ブ・イ、（ 胤ｎｚａｒｉ　、　Ｖ　、　）ら、ブロク、ナトル、アカデ。

１５　（１９８３）、：］　：及び］Ｃ８１−６６／４５すなわち−次１ｉ奮帯 赤血球とＨＴＬＶ−１産生細胞セルラインとの融合によるもの〔サラフジン、ニ ス、ゼット、　（Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎ　、　Ｓ　、Ｚ　、　）ら、ピロａｋジ インはウィルスを産生じないがＨＴＬＶ−１関連トランス作用因子を含有してい る。　トランスフェクションの４８時間後に、細胞抽出物を作製し、前述のよう にＣＡＴアッセイを実施し７た。

示しまた値は、１．０とする親プラスミドｐＵ３Ｒ−１でトランスフェクトした 同様な細胞中に存在するＣＡＴ活性に対し、規格化し２である。カッコ内の数字 は、ＳＶ４０エンハンザ−プロモーター配列を含むＰＳＶ２ＣＡＴ−ナラスミ１ ２全トランスフェクトシタ非感染リンパ球ラインに存在゛Ｊる活性に対し規格化 Ｌ７’ｊＣ８１−６６／４５４ｔｌ胞内の相対ＣＡＴ活性を示す〔ライミンズ（ Ｌａｉｍｉｎｓ）ら、」：記〕。

実施例　７ 組換えシラスミド°の構築 上の輪はベクタープラスミドｐＳＶＩＸＣＡＴを示す。プラスミＦ　ｐ　Ｓ　Ｖ 　Ｉ　ＸＣＡ　’Ｉ’、ば７２　ｂｐ反復エンハンサ−配列のほとんどを掲だな いが、ＣＡ’Ｉ”遺伝子の５′にｉチ乙８Ｖ４０初期プ１ゴモ・−ター領域は保 持し２ている。Ｓ　Ｖ　４０初期ゾ゛ロモーターの５′にあるＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　 Ｕ　３配列を含有するプラスミドｐＨＥＩＣＡＴ　。

ｐＨＥ２ＣＡＴ及びｐＨＥ３ＣＡＴは次のように構築し、た。すなわち、プラス ミｆ’ｐＵ３Ｒ−Ｉを、ｐＢＲ３２２配列内ＴＨＴＬＶ　ＴＡＴＡ配列の５′側 ３５ｂｐで一度切断するＮｄｅ　ｌで開裂した。４５（１ｂｐ　フラグメントを デル単離し、Ｎｄｅ　Ｉで開裂しまたＰＳＶＩＸＣＡＴに連結した。ＤＮ、Ａを ＨＢＩＯＩにトランスフェクトし、　ＨＴＬＶ挿入物の存在及び配向洸ついてコ ロニーに刻み目（ｓｃｏｒｅ）をつげた。同じｉ（Ｔ　ＬＶ　Ｕ　３配列を含有 するがＨＴ　Ｌ　Ｖプロモーターに対し逆の配向に位置しているプラスミドｐＨ Ｘ１ｃＡＴは、Ｎｄｅ　１でｐＵ：３Ｒ−１を開裂し、ＤＮＡを再連結し、逆の 配向の挿入物の再閉鎖（ｒｅｃｌｏｓｕｒｅｓ　）をスクリーンすることにより 構築した。

プラスミドｐＲＥＨ１と　ｐＲＥｓｌは各々ＬＴＲエンハンサー配列を含有して いる。ｐＳＶ２ＣＡＴをＡｃｃＩ　−５ｐＨＩで開裂してＳＶ４０エンハンサ− 配列を欠失させることによりプラスミドｐＲＥｓｌを構築し７だ。突き出した末 端をＴ４ポリメラーゼで充填【−５平滑末端ＤＮＡをＸｈｏｌ’Ｊンカーに連結 した。次いで、ＤＮＡをＸｈｏ　１−　Ｂａｍ　Ｈｌで開裂し、８ｖ４０初助プ ロモーター領域とＣＡ　Ｔ遺伝子をへ有するフラグメントをＸｈｏ　１−　Ｂａ ｒｎ　Ｈｌで開裂し欠Ｒ８ＶＣＡＴの変異体（′Ｃ５１１！結した。このように して、Ｒ８ｖエンハンザ−をＳＶ４０初期プ「ゴモ・−、ターに対し５′に配置 した。ｐＲＥＨｌを構築するために、ＰＯ３Ｈ−ＩのＮｄｅ１部位をＸｈｏ　１ 部位に変換した。Ｘｈｏ　Ｌ　−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで消化した後、ＨＴ　Ｌ　Ｖ プロモーター配列を含有するフラグメントを用いてｐＲＥＳＩのＸｈｏ　Ｉ　− Ｈｉｎｄ　ＩＩ　７ラグメント置換した。全ての組換えＩ）　Ｎ　Ａ手法は標準 約手Ｉ哩に従って実施したマニアチス、ティー　、　（Ｍａｎｉａｔｉｓ　、　 Ｔ、）、フリッチ、イー・、エフ、（Ｆｒｉｔｃｈ、Ｅ。

Ｆ、）及びサムブロック。ジエー　、　（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、）、「分子ク ローニング（＆１ｏ１ｅｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）　Ｊ　（ゴーｙｖドー スプリング＋　７％　−／８−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）、（Ｉ９８２））参照〕。酵素消化＃−ｉ 、製造業者の仕様書に従って行った。黒及び斜線の長方形の棒は各々ＨＴＬＶと Ｒ８Ｖの配列を表わす。矢印の方向はＬＴＲ中でその配向に関する配列の配向を 示す。黒と白の四角は各々ＨＴ　Ｌ　ＶとＳＶ４０のプロモーター配列を表わす 。プラスミドＰ１３２２からの配列は実線で示す。

実施例　８ ＳＶ４０初期プロモーター領域ノ５′にＨＴＬＶ　Ｕ３配列を持つ組換えプラス ミドをＣａＰＯａ共沈法〔グラノ仏、エフ−（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、）及びパン デルニブ　、ニー、　（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　、　Ａ、）、ピロロジー（Ｖｉ 　ｒｏ　ｌ　ｏｇｙ）、５２：４５６〜４６７（１９７３）参照〕によリヒーラ （Ｊ（ｅｌａ）細胞にトランスフェクトした。４８時間のインキュベージヨシ′ の後に、細胞抽出物を調製した。細胞抽出物（蛋白質２００〜４００μ２）を１ ４０クロラムフエニコールとアセチルＣｏＡ（２４ｍＭ）と共にインキュベート した。経時アッセイを行ない、上行（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ）薄層クロマトグラフ ィー〔ゴーマン（Ｇｏ　ｒｍａｎ、）ら、モレク、セル、／々イル化基質からク ロラムフェニコールのアセチル化型を分離した。

構築物によって指令されるＣＡＴ遺伝子発現を、ｐＳＶＩＸＣＡＴでトランスフ ェクトした細胞中に存在するＣＡＴ活性を１．０とし、これに対比して表わす。

結果は少なくとも２つの別な実験の平均を表わす。挿入図は典型的なＣＡＴアッ セイのオートラジオダラムを示す。

実施例　９ 受容体ベクターはプラスミドｐ　ｓ　Ｖ　Ｉ　ＣＡＴの変異体である、プラスミ ！−＝ｐｓＶＩＸｃＡＴの１（ｉｎｄ　４−ｘｈｏ１７５ｆ１７ト’Ｆｒ含有シ ている。ｐｓＶ２ｃ、ＡＴは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー ゼ（ＣＡＴ）の産生金コードする遺伝子の５′にあるＳＶ４０？７［１プロモー ターエンハンサ−領域を含有している。

７２　ｂｐエンハンサ−領域を欠くことを除いて１−ｉＰｓＶＩＸｃＡＴはＰＳ Ｖ２ＣＡＴと同じである。）（ｉｎｄ　ｌ　−ｘｈｏ　Ｉ　テ消化すると、ＳＶ ４０プロモーター領域が除去されてＨＴＬＶ配列がＣＡＴの５′に位置するよう になる。次のプラスミド′ｆ構築した：　ＰＶ３ａ−１：　３’ＬＴＲ又はＨＴ ＬＶ−１を含有するプロウィルスクローンをＲ８Ａ　ｌで開裂し、　ｘｈｏ　ｌ ！、）ンカーに連結し、次いでＤＮＡをＭｂｏｌで開裂し、Ｔ４ポリメラーゼで 充填しくｆｉｌｌｅｄｏｕｔ）、Ｈｉｎｄｌリンカ−に連結した。Ｈｉｎｄ　１ ｌ−ｘｈｏ　Ｉ　Ｔ開裂し九後、５ｏｏｂｐフラグメントをＣＡＴベクターに連 結した。

Ｉ）Ｖ　３−　Ｉｔ　：　５’　ＬＴＩＬ含有ＨＴＬＶ　−ＩＩプロウイルスク ローンヲＥｃｏＲｉで開裂し、Ｔ４ポリメラーゼで充填し、Ｈｉｎｄｌリンカー ト連結し、Ｈｉｎｄ　ｌ　−ｘｈｏ　ｌで開裂し、次いでｂｐフラグメントをＣ ＡＴベクターに連結した。ＰＶ　３−　ＲＩｔ　：　３’ＬＴＲを含有するＨＴ ＬＶ−１プロウイルスクローンをＢＡＭＨＩで開裂し、Ｔ　４ポリメラーゼで充 填（ｆｉｌｌ　ｏｕｔ　）にし、ＨＩＮＤｌリンカ−に連結した。ＨＩＮＤ覆− ｘｈｏ　ｌで消化して得られたフラグメントをＣＡＴベクターに連結した。全構 築は制限酵素地図（マツピング）で確認した。塩化セシウム勾配中で遠心してグ ラスミ）’ＤＮＡを精製した。

実施例　１０ リン酸カルシウム共沈法の変法〔グラハム（Ｇｒａｈａｍ　）、上記〕でＮＩＨ ３Ｔ３とｃｖ−ｉ細胞をトランスフェクトした。Ｃａｐｏ４−ＤＮＡ沈殿物を添 加する２４時間前に、１０ｃｒｌの皿に約１×１０’個の細胞を播種した。５〜 １０μｙのＤＮＡを含有する沈殿１−を培地に加え、細胞を３７０で４時間イン キュベートし、仄いて３分間のグリセロールショックにかけた。トランスフェク ションの２４時間後にＣＶ−１細胞を１０分間のＤＭＳＯショックにかけた。他 の全てのセルラインはＩ）Ｂ　Ａ　Ｅ−デキストラン法（’）ｆ法〔クイーン（ Ｑｕｅｅｎ　）ら、上記〕によシトランスフェクトした。トランスフェクション の２４時間前に、付着細胞を１０ｄの皿当り１０’細胞の密度で播種した。トラ ンスフェクション直前（て、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、飽和以下を示す 量の５〜・８／１．！ｇのＩ）Ｎ　Ａにより懸濁液中でトランスフェクトした。

リン／？球ラーブラー５〜１０μｙのＤＮＡを使用して１−当り１〜５Ｘ１０’ 細胞の密度でトランスフェクトした。ドツトプロット分析で全セルラインでのか なりの取り込みを確認した。トランスフェクションの４８時間後に細胞を採取し 、凍結／解凍（３回）により細胞抽出物を調製した。簡単に遠心して細胞の破片 を除去した後、アセチルコエンザイムＡが２４０で存在することを除いてはゴー マン（Ｇｏｒｍａｎ　）が記載したように抽出物をＣＡＴ活性について分析した 。クロラムフェニコールがアセチル化型に変換する・（−セントは、上行薄層ク ロマトグラフィと、プレートから切り取ったスポットを液体シンチレーションカ ウンターで計測すること１ｃより決定した。

実施例　１１ ＨＴＬＶ　−１ｔａｔ転写因子を産生ずる安定なセルラインの確立真核性の選択 可能なマーカーであるｐｓＶ２　、Ｐ　ｐｔをＣＡＴＬＯＲ■プラスミドに挿入 した。この１．）ＮＡをＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＣＣＣ８＋Ｌ−ネコ腎 臓細胞及びヒーラ（）（ｅｌａ　）ヒト頚癌細胞にリン酸カルシウム沈殿により トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を、その染色 体内にＣＡＴＬＯＲｊｌ−ｐｓＶ２１ｐｔプラスミドが安定に組込まれた細胞の コロニーを選択するキザンチン：マイコフェノール酸含有培地中に入れた。これ ら細胞のコロニーを単離し、ＨＴＬＶ−ＬＴＲＫ７Ｌって指令される転写を％異 的に活性化するトランス作用性因子の存在についてテストした。

とり蛋白質を発現し、他のＨＴ　Ｉ、　Ｖウィルス蛋白質は発現し女いいくりか のクローンを単離した。親の対照セルラインと比較してとれらのセルラインでは 、Ｈ，ＴＬＶ　Ｔ、ＴＲはプロモーター活性の劇的な増加を示す。従って、ＨＴ Ｔ、Ｖ　ＬＴＲの制御下にあるどんな遺伝子でもこれらのクローン化したセルラ インでは非ｔＫＸいレベル（ＳＶ　４０初期プロモーターで得たレベルの約３０ 倍）で発現されえる。

本発明のＨＴＬＶ　ＬＴＲ配列は遺伝子で発現されうる蛋白質や同様の物質を過 剰に製造するのに有用である。この過剰生産を起すためにはＨＴＬＶ　Ｔ、ＴＲ を先ず、プロモーター領域としてのＨＴＬＶ　ＬＴＲを使用するのに適切な配置 で所望の特電な異種遺伝子と結合し、次にその構築物を、トランス作用性にカ＜ ＨＴＬＶゲノムを含有する細胞のトランスフェクションニ用いる。

所望に応じ、ＨＴＬＶ　Ｔ、ＴＲの完全領域を利用する必要はない。

例えば、ＨＴＬＶ−ＩＫついては、−１５９〜＋３１５の領域がトランス作用因 子に応答するのて十分である。それ自身の又は異種のエンハンサ要素で補完して トランスに活性化されたプロモーは発現可能な物質の過剰生産のための異種構築 を利用する。

蛋白質又は同様の産物の過剰生産の第二の実施態様はｔａｔ配シリ、ＨＴＬＶ　 ＬＴＲ配列及び異種遺伝子を含むベクターの構築を含む。スプライシングと発現 とが可能になるよって異種遺伝子及びＨＴＬＶ　ＬＴＲによって高活性レベルと なり、異種遺伝子産物の過剰生産が導かれる。

本明細書中で使用したように、一般用語ＨＴＬＶＨ３つのウィルス、Ｉ、ＩＩ及 び夏型の全てを表わす−どのＨＴＬＶ−Ｉｓを使用したかには関係なく、異種遺 伝子産物は適当なｔａｔ遺伝子産物及びＨＴＬＶ　ＬＴＲの存在下で犬きく刺激 されるであろう。

本発明のＨＴＬＶ　ＬＴＲベクターについて考えられるもう１つの用途は、細胞 に結合しているか又は表ｉ…蛋白質を発現する遺伝子ＫＨ’ｌｌ’ＬＶ　ＬＴＲ を掛は留めると、その４１１胞を識別でき、枡いてモノクローナル又はポリクロ ーナル抗体を使ってその細胞を破壊できるという事実を使用する。このことは、 ＡＩＤＳを含めてＨＴＬＶが媒介する疾患の治療に特に重要である。

最後に、本発明のＨＴＬＶ　ＬＴＲベクターはワクチンの製造に使用できること に注意されたい。ワクチンの第１の型は、ピリオンカプシド産生に不可欠ではな い領域の欠失により産生されうる空のカプシド（ｅｍｐｔｙ　ｃａｐｓｉｄ　） 　Ｃ？　７　（Ｍａｎｎ　）ら、上記〕を用いる。これらのプラスミドは例えば １−（Ｏ８又はヒーラ（Ｈｅ−１ａ）のようなピリオン蛋白質を発現することが 知らり、ている細胞をトランスフェクトするために使用できる。ここで、Ｌ　’ ］’　Ｌ（、はトランス作用因子（ｔａｔ、以前はＩｕｋと呼ばれていた）の不 在下でも低いレベルでピリオンを発現するだろう。この低いピリオンレベルは免 疫を誘発するが、ウィルス病は誘導しない。

ワクチンの製造は、異なる染色体部位に、発現のために予め工学処理した（しか し他のウィルス蛋白質の発現のためではない）　ｔａｔ遺伝子を含有する細胞の 感染も含んでいる。プロウィルス中の欠失は先ず、他のウィルスＲ，ＮＡけ持た すＨＴＬＶのＬＴＲを２倍とｔａｔ領域とを含有する細胞に挿入される。この構 築物は次に、この細胞内にトランスフェクトされた第２のウィルスをトランスに 活性化して、高度の、増殖性（ｙｉｒｉａｌｉｔｙ　）を生じる。どのＨＴＬＶ 　ＬＴＲ９素でもこの構築に使用できる。例えば、ＨＴＬＶ　−Ｉ　ＬＴＲ自身 が有害であることが発見されたら、ＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−１のＬ　Ｔ）七 をそれと換えることができる。

希釈した生ワクチン全作るためには、里領域の機能性の部分を欠失させてビ１１ オンのトランス活性化能全制限する。このウィルスは未だ細胞に感染することが できるが、過剰生産はもうできず従って疾患を引き起こすことはできない。

本発明のＨＴＬＶ　ＬＴＲやその部分（特に組織特鴇性決定基）のさらに別の延 長又は用途はこれらの種の第一の製薬的使用である。例えば、ＨＴＬＶ　ＬＴＲ を、組織特異性の実体の呻乳動物へ分配（投与）するだめの適当な製剤キャリア と組み合せることができる。さらに、この組織特異性イクターを抗癌剤や同様の 薬剤、例えばフイジシャンズ・デスク・レファレンス（ｉ’ｈｙ二５ｉｅｉａｎ ｓ’　Ｄｅｓｋ　１（ｅｆｅｒｅｎｃｅ　）、３８版、メデイカルーエコノミッ クス社（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｃｏ、、　）、オラーデン（０ ｒａｄｅｎ　）　。

Ｎ、　Ｊ　、　（１，９８４）に記載されている薬剤の分配にも使用できる。

＾１丁記文献の開示内容も引用によって本明細書にＴ１れる。

ＦＩＧ、　ＩＡ ＦＩＧ、　Ｉｃ Ｅｅｏ　Ｒ１ 浄書（内容（こ変更なし） 〇 一 浄書（内容に変更なし） 寸　浄書（内容に変更なし） 浄８（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＨＴＬＶ−Ｋ　ＬＴＦ？、内砂ズ庄弔・崩Ｓ黒竿頒亀＼ＦＩＧ、６ 手続ネ市正Ｊ４（，５式） １．事件の表示　ＰＣＴ、ＵＳ　８５／’００９８５２、発明の名称　トランス 作用性転写因子３、補正をづる石 を件との関係　特許出願人 名　称　ディナーファーバー・キャンサー・インステイテユート ４゜代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル（郵便番号１６ ０）電話（０３）　３５４−８６２３５、補正命令の日付　昭和６１年７月３日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象　図面の翻訳文 ８、補正の内容 （１）Ｆｉｇ、　１Ａ、１Ｃ１２Ｂ、２Ｃ１３，４，５及び６に関する国際ｙ４ を報告

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．発現ベクターとトランス作用性ＤＮＡセグメントからなる遺伝子発現系であ つて、発現ベクターが発現すべき遺伝子とトランス活性化性レトロウイルスのゲ ノムのセグメントによつて産生されるトランス作用性因子に応答するシス作用性 調節要素とからなつており、トランス作用性ＤＮＡセグメントが、シス作用性調 節要素が応答するトランス作用性因子をコードしているトランス活性化性レトロ ウイルスのゲノムのセグメントからなつており、発現ベクターが完全なトランス 活性化性レトロウイルス以外の産物をコードしている遺伝子発現系。
2. ２．発現すべき遺伝子が異種遺伝子である請求の範囲１の遺伝子発現系。
3. ３．トランス作用性ＤＮＡセグメントがトランス活性化性レトロウイルスのｔａ ｔ遺伝子からなる請求の範囲１の遺伝子発現系。
4. ４．トランス作用性ＤＮＡセグメントがＨＴＬＶ−Ｉ，ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＴＬ Ｖ−ＩＩＩまたはＢＬＶのｔａｔ遺伝子からなる請求の範囲１の遺伝子発現系。
5. ５．トランス作用性ＤＮＡセグメントがＨＴＬＶ−Ｉ，ＨＴＬＶ−ＩＩまたはＨ ＴＬＶ−ＩＩＩのｔａｔ遺伝子からなる請求の範囲１の遺伝子発現系。
6. ６．発現ベクターがレトロウイルスゲノムの１部だけの発現をコードしている請 求の範囲１の遺伝子発現系。
7. ７．発現ベクターがウイルスの表面糖蛋白質の発現をコードしている請求の範囲 ６の遺伝子発現系。
8. ８．シス作用性調節要素がトランス活性化性レトロウイルスのｔａｒ要素からな る請求の範囲１の遺伝子発現系。
9. ９．シス作用性調節要素がＨＴＬＶ−Ｉ，ＨＴＬＶ−ＩＩ，ＨＴＬＶ−ＩＩＩま たはＢＬＶのｔａｒ要素からなる請求の範囲１の遺伝子発現系。
10. １０．ａ）トランス活性化性レトロウイルスのゲノムのトランス作用性因子をコ ードしているセグメントからなるトランス作用性ＤＮＡセグメントを宿主細胞に 挿入し、ｂ）発現すべき遺伝子産物をコードしている遺伝子と、トランス作用性 ＤＮＡセグメントによつて産生されるトランス作用性因子に応答するシス作用性 調節要素とからなる発現ベクターを宿主細胞に挿入し、 ｃ）この宿主細胞を培養する ことからなる、遺伝子産物の産生を刺激する方法。
11. １１．発現すべき遺伝子が異種遺伝子である請求の範囲１０の方法。
12. １２．トランス作用性ＤＮＡセグメントがトランス活性化性レトロウイルスのｔ ａｔ遺伝子からなる請求の範囲１０の方法。
13. １３．トランス作用性ＤＮＡセグメントがＨＴＬＶ−Ｉ，ＨＴＬＶ−ＩＩＨＴＬ Ｖ−ＩＩＩまたはＢＬＶのｔａｔ遺伝子からなる請求の範囲１０の方法。
14. １４．トランス作用性ＤＮＡセグメントがＨＴＬＶ−Ｉ，ＨＴＬＶ−ＩＩまたは ＨＴＬＶ−ＩＩＩのｔａｔ遺伝子からなる請求の範囲１０の方法。
15. １５．発現ベクターがレトロウイルスゲノムの１部だけの発現をコードしている 請求の範囲１０の方法。
16. １６．発現ベクターがウイルスの表面糖蛋白質の発現をコードしている請求の範 囲１０の方法。
17. １７．シス作用性調節要素がトランス活性化性レトロウイルスのｔａｒ要素から なる請求の範囲１０の方法。
18. １８．シス作用性調節要素がＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ またはＢＬＶのｔａｒ要素からなる請求の範囲１０の方法。
19. １９．トランス作用性因子の存在下での遺伝子産物の産生レベルがトランス作用 性因子の不在下てのレベルより少なくとも５倍大きい請求の範囲１０の方法。
20. ２０．宿主細胞が線維芽細胞、リンパ様細胞、上皮細胞またはハムスター卵巣細 胞である請求の範囲１０の方法。
21. ２１．宿主細胞がヒト、ネズミ、ネコまたはサルに由来する請求の範囲２０の方 法。
22. ２２．宿主細胞が線維芽細胞、リンパ球または上皮細胞である請求の範囲２１の 方法。
23. ２３．遺伝子産物をコードするＤＮＡとトランス活性化性レトロウイルス由来の トランス作用性転写因子に応答するシス作用性調節要素とからなる、遺伝子産物 の発現に用いるベクター。
24. ２４．シス作用性調節要素がトランス活性化性レトロウイルス由来のｔａｒ要素 からなる請求の範囲２３のベクター。
25. ２５．トランス活性化性レトロウイルスがＨＴＬＶ−Ｉ．ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＴ ＬＶ−ＩＩＩ又はＢＬＶである請求の範囲２３のベクター。
26. ２６．更に発現すべき遺伝子に対し５′に位置するエンハンサーを含む請求の範 囲２３のベクター。
27. ２７．エンハンサーがシス作用性調節要素に対し同種である請求の範囲２４のベ クター。
28. ２８．更にｔａｔ遺伝子を含む請求の範囲２１のベクター。
29. ２９．トランス作用性調節因子をコードしているトランス活性化性レトロウイル ス遺伝子と宿主細胞およびトランス活性化性レトロウイルスの両者に異種のＤＮ Ａセグメントとからなり、前記トランス活性化性レトロウイルス遺伝子が宿主細 胞内発現に適した同種または異種のシス作用性調節要素の制御下にある、宿主細 胞内での転写を刺激するためのＤＮＡセグメント。