JPS61501777A - ペプチドワクチン又は診断系及びそのために有力なポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドワクチン又は診断系及び そのために存用なポリペプチド 記述 関連する出願の相互参照 本出願は、１９８４年４月６日に出願された米国シリアル磁５９７．４３４の一 部継続である。

技術分野 本発明は、抗原、免疫原、及びそのような免疫原を用いるワクチンに関する。よ り詳しくは、本発明は、ポリペプチド抗原、又は免疫原、そのような免疫原によ り生じられた抗体、及び淋疾の予防のために適当なワクチンに関する。

背景技術 淋菌による報告される感染の年間発生数は、約二百万ケースであると推定される 。男性における淋菌感染は通常、比較的単純な泌尿器感染を結果する。伝染淋Ｗ 感染は、淋菌による感染の１〜３％で起ると報告される。しかし現在の治療法に よるこの疾病の病的状態は軽い。

一方、淋菌に感染された女性においては、輸卵管炎が１０〜２０％で起り、十分 に処置された場合でさえ再発性輸卵管炎、子宮外妊娠、及び子育を結果しうる。

輸卵管炎は、米国において毎年１８０万ケースの開業医への受診及び２２万ケー スの入院をもたらしていると推定される。

公衆衛生手段による淋病の抑制は、今日までのところ困難である。殺した完全な （全体の）淋菌より成るワクチンは、有効でなかった（グリーンバーブ（Ｇｒｅ ｅｎｂｕｒｇ　）ら、淋菌ワクチンの開発についての予備研究、Ｂｕｌｌ、ｗｌ ｄ、旧ｔｈ、ｏｒｇ、４５　：　５３Ｈ１９７１））、淋菌のベニシリナーゼ産 生株もまた出現した。

有効なワクチンを開発する方向でいくつかの研究は、リボボリサフカライド（Ｌ ＰＳ）、ペプチドグリカン、外膜蛋白質、莢膜、１ｇＡ１プロテアーゼ及び綿毛 を含む淋菌の表面成分を調べた。上述のうち線毛が、淋菌ワクチンの必須成分で あるとして提真され、また線毛は免疫原性でありヒトに対して非毒性であると報 告された。一般に、スクールニック（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ）ら、淋病の予防のた めの線毛ペプチドワクチン、ＰｒｏｇＪ１１ｅｒｇｙ３３　：　３１４−３３１ （１９８３）参照。

線毛は、宿主上皮組織へのバクテリア細胞の付着を容易にすることにより感染性 を促進する、バクテリアの蛋白質性表面付属肢である。淋菌の場合、線毛蛋白質 が主な表面抗原である。各線毛は、各々約１８．０００ダルトンの分子量を持つ 繰返しの同じサブユニット（ビリン）から成る線毛構造を持つ。淋菌線毛の多く の血清タイプがあるが、しかし抗原的に及び免疫原的に異るピリンのペプチド地 図研究は、それらの総てが蛋白質のアミノ末端に位置する保存部を共通に持つこ とを示す。他方、蛋白質のカルボキシ末端領域は、血清タイプごとに可変である ことが判った。線毛蛋白質の一般的記載は、メイヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら、セル（ Ｃｅｌｌ）　３０４４５：５２　（１９８２）に見られる。

スクールニックら（前出）は、この蛋白質のアミノ末端の保存部を包含する免疫 原的線毛ペプチドを提案する。しかし今日まで、この特定のアプローチから有効 なワクチンは得られていない。

前述とは対照的に、蛋白質のカルボキシル末端に近い淋菌ビリン蛋白質の可変部 が、過可変配列ならびに、免疫学的にこれら抗原決定基部位を模倣しかつ哺乳類 宿主において抗体産生を誘発する抗原及び／又は免疫原を調製するのに用いうる 抗原決定部位を定義する保存配列の両者を含むことが、いま見い出された。

発明のまとめ 本発明は、天然に生じる淋菌とリン蛋白質より小さいポリペプチド及びそれの医 薬的に許容される塩を意図し、これは淋菌とリンのカルボキシル末端半分の可変 部内の保存抗原決定基部位を免疫学的に模倣することができ、また従って淋菌感 染に対する抗原又は免疫原であることができる。また本発明は、そのような免疫 原を含むワクチン、ならびに淋菌感染に対する免疫化の方法を意図する。本発明 は更に、本発明のポリペプチドを利用する診断評価法及び／又はそのようなポリ ペプチドにより誘発された受容体たとえば抗体を意図する。

本発明のポリペプチドは、淋菌ピリンの抗原決定基部位を免疫学的に模倣できる 配列を定義する、少くとも５つのアミノ酸残基かつ約６０までのアミノ酸残基を 含む少くとも一つのアミノ酸残基配列を含む、このアミノ酸残基配列は、同じポ リペプチド分子中で単位として一回又は二回以上繰返すことができる。そのよう な繰返し単位の二基上のタイプ、及び同じタイプの二つ以上の繰返し単位が、本 発明を具現する単一のポリペプチド分子中に存在することができる。

そのようなポリペプチドは、遺伝子工学技術により合成された融合蛋白質として 作ることができ、又はそれは、個々のアミノ酸残基又はアミノ酸残基ブロックか ら作り上げることができる。

本発明を具体化するポリペプチドは、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ 末端の方法に書いて式％式％ （ここでＸｌ　は正に荷電した側鎖を持つアミノ酸残基であり、ヒスチジン（Ｈ ｌｓ）、リジン（ＬＹＳ）及びアルギニン（ＡＲＣ）より成る群の一員であり、 Ｘ２およびＸ″は互に同じ又は異ることができ、ロイシン（ＬＥＵ）、プロリン （ＰＲｏ）、トリプトファン（ＴＲＰ）　、フェニルアラニン（ＰＨＥ）　、バ リン（ＶＡＬ）　、アラニン（ＡＬＡ）及びイソロイシン（ＩＬＥ）より成る各 群の員であり、Ｘ４及びＸＳは互に又は異ることができ、セリン（ＳＥＲ）、ス レオニン（ＴＨＲ）、システィン（ｃＹｓ）及びグリシン（Ｇ　Ｌ　Ｙ）より成 る各群の員である極性のしかし非荷電のアミノ酸残基である）のアミノ酸残基配 列を含むと定義できる。

望ましい抗原決定基部位を定義する好ましいアミノ酸残基配列は、左から右へか つアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式 ％式％ の配列又はこれらの抗原的に関連する変形に含まれる。また、対応するポリペプ チド自身、すなわち Ｈ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＬＩ−ＰＲＯ−５ＥＲ−ＴＨＲ−ＣＹＳ−ＡＲＧ−Ａ ＳＰ−ＱＨ：Ｈ−ＴＨｌｌ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−Ｐｌ？０−５ＥＩ？−Ｔ Ｈ１？−ＣＹＳ−ＡＩ？Ｇ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−５ＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ −ＬＹＳ−ＯＨ：及びＨ−ＧＬＹ−５ＥＲ−ＶＡＬ−ＬＹＳ−丁１？Ｐ−ＰＨＥ −ＣＹＳ−ＧＬＹ−ＧＬ、Ｎ−ＰＩ？０−ＶＡＬ−Ｔ’ＨＲ−ＡＲＧ−ＯＲ 及びこれの薬学的に許容できる塩及びこれの抗原的に近緑の変形も好ましい。

好ましい実施態様の詳細な記述 本発明のポリペプチドは、天然に生じる淋菌とリン蛋白質より小さく、淋菌とリ ン蛍白質のカルボキシ末端半分の可変部中の保存抗原決定基部位を免疫原的に模 倣する、少くとも５乃至約６０のアミノ酸残基、好ましくは５〜２０のアミノ酸 残基のアミノ酸残基配列を含む０本発明のポリペプチドは、そのままで又は医薬 的に許容しうる塩として、ワクチン中の活性成分として、接種物として又は診断 評価において有用である。

本明細書において「抗原決定基」という言葉は、同じ又は近縁の抗原により誘発 された対応する抗体（免疫グロブリン）分子との特異的相互作用に責任ある分子 の構造成分を示す０本ポリペプチド中の抗原決定基は、アミノ酸残基の化学的に 活性な表面配置を含む。

本明細書において「抗原」という言葉は、抗体により結合されるものを意味する 。

本明細書において「免疫原」という言葉は、宿主動物に抗体産生を誘発するもの を表わす、いくつかの例では、抗原と免疫原は同一であり、一方、他の例ではこ れら二つのものは異る。

「免疫学的に模倣する」という表現は、本発明の免疫学的ポリペプチドが、天然 蛋白質または天然蛋白質の開裂された片でなくて、たとえば固相合成又は遺伝子 工学技術により作られたポリペプチドであって、該ポリペプチドが、この誘発性 ポリペプチドに及びまた対応するビリン又はビリンポリペプチド部分に結合する 抗体の産生を誘発することを意味して本明細書で用いられる。

本明細書で特定される総てのアミノ酸残基は、特記なき限り、天然の即ちＬ配置 を持つ、標準的ペプチド命名法に従って、本明細書で用いられるアミノ酸残基の ための略記法は、下記の通りである。

一一之Ｚ土上−−−−−−ヱ亙ｌ姐−−Ｆ　ＰＨＥ　Ｌ−フェニルアラニン Ｍ　ＭＥＴ　Ｌ−メチオニン Ａ　ＡＬＡ　Ｌ−アラニン Ｓ　ＳＥＲＬ−セリン 夏　ＩＬＥ　Ｌ−イソロイシン Ｌ　ＬＥＵ　Ｌ−ロイシン Ｔ　ＴＨＲＬ−スレオニン Ｖ　ＶＡＬ　Ｌ−バリン Ｐ　ＰＲＯＬ−プロリン Ｋ　ＬＹＳ　Ｌ−リジン Ｎ　ＡＳＮ　Ｌ−アスパラギン ＨＨｌｓ　Ｌ−ヒスチジン Ｑ　ＧＬＮ　Ｌ−グルタミン Ｅ　ＧＬＵ　グルタミン酸 Ｗ　ＴＲＰ　Ｌ−）リブトラ１ン ＲＡｒｇ　Ｌ−アルギニン Ｄ　ＡＳＰ　Ｌ−アスパラギン酸 ＣＣＹＳ　Ｌ−システィン 本明細書で「医薬的に許容される塩」という言葉は、当業界で周知の方法で作ら れるナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウ ム塩などを包含する、医薬産業で一般に用いられる非毒性のアルカリ金属、アル カリ土類金属及びアンモニウム塩を言う。この言葉はまた、本発明の化合物を適 当なを機又は無機酸と反応させることにより一般に調製される非毒性の酸付加塩 をも包含する０代表的な塩としては、塩酸塩、臭酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸 塩、シェラ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸 塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、 コハク酸塩、酒石酸塩などが挙げられる。

前述の条件を満すポリペプチドは、哺乳動物宿主において抗体を誘発し、ポリペ プチドがビリン蛋白質のカルボキシ末端半分の可変部内の望む保存抗原決定基部 位を免疫学的に模倣することを可能とするβ−ターン構造を形成することができ ると考えられる。

好ましくはポリペプチドは、ｖ′Ｊ６０のアミノ酸残基より長くなく、また、正 に荷電した側鎖を持つ少くとも一つのアミノ酸残基を、各々の定義された抗原決 定基部位に含む。

前述の条件を溝す一または二基上のアミノ酸残基配列は、繰返し単位として存在 することができる。また、そのようなアミノ酸残基配列の一または二基上を含む ポリペプチドは、個々のポリペプチドを頭尾的に又はポリペプチド間システィン ジスルフィド結合により結合することによって比較的大きな合成物へと形成する ことができる。

これらのポリペプチドは、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向 に書いて式 ％式％ （ここで各Ｘはアミノ酸残基を示す）のアミノ酸残基配列を含むものであるとし て特徴づけることができる　Ｘｌ　ばＨＩＳ、ＬＹＳ又はＡＲＧのような正に荷 電した側鎖を持つアミノ酸残基である。

Ｘ２及びＸ３は、互に同じ又は異ることができ、しかしＬＥＵ、ＰＲＯｌＴＲＰ 、ＰＨＥ、ＶＡＬ、ＡＬＡ及びＩＬＥより成る群から選ばれる非極性アミノ酸残 基である。同様に、Ｘ４及びＸＳは、互に同じまたは異ることができ、しかしＳ ＥＲ，ＴＨＲ５ＣＹＳ及びＧＬＹより成る群から選ばれる極性の非荷電アミノ酸 残基である。上述の荷電は、これら残基がｐＨ７，０の水性溶液中にあるときの アミノ酸残基上のイオン的荷電に関する。たとえば、レーニンガー（Ｌｅｈｎｉ ｎｇｅｒ）、５ｈｏｒｔ　Ｃｏｕｒｓｅ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

ｐ３７、ワース　パブリッシャー社、ニューヨーク、ニューヨーク（１９７３） 参照。

上述の群に入る特に好ましいアミノ酸残基配列は、左から右へかつアミノ末端か らカルボキシ末端の方向に書いて−ＬＹＳ−１１１ｓ−ＬＥＵ−ＰＲＯ−５ＥＲ −ＴＨＲ−ＣＹＳ−＾ＲＧ−ＡＳＰ；−ＴＨＲ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＰＲ Ｏ−３ＥＲ−ＴＨＲ−ＣＹＳ−ＡＲＧ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−５ＥＲ−ＡＳ Ｐ−ＡＬＡ−ＬＹＳ、及び−ＧＩＪ−３ＥＲ−ＶＡＬ−ＬＹＳ−ＴＲＰ−ＰＨＥ −ＣＹＳ−ＧＬＹ−ＧＬＮ−ＰＲＯ−ＶＡＬ−ＴＨＲ−ＡＲＧ− （これら配列は、メイヤーら、プロシーデインダス　オブ　ナシヨナル　アカデ ミ−オブ　サイエンス　Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、ｔｌＳＡ）（１９８４）：８１：６１１０−６１１４に記載 されるように淋菌株ＭＳＩＩの６つの異る血清タイプからのピリン蛋白質のカル ボキシ末端半分の可変部内で保存されることが見い出された。）、ならびに以下 で定義するようなこれの抗原的に近縁の変形である。

上述の配列の−より多くが、同じポリペプチド中に、通常他のアミノ酸残基によ り互いに間隔を置かれて、存在することができる。また、上述のアミノ酸残基配 列の一または二以上を含む同じポリペプチドはまた、淋菌とリンの免疫劣性抗原 決定基部位を免疫学的に模倣する別のアミノ酸残基配列を含むことができる。

本発明を具体化しかつ部内（ポリペプチド内）ジスルフィドループを持たない好 ましいポリペプチドの別の群は、前述で詳しく定義されたアミノ酸残基配列の唯 一つにより個々に構成されるポリペプチド、即ち １ｌ−ＬＹＳ−１１１ｓ−ＬＥｔｌ−ＰＲＯ−５ＥＲ−ＴＩＩＲ−ＣＹＳ−ＡＲ Ｇ−ＡＳＰ−０１１゜Ｈ−Ｔ）ＩＲ−ＬＹＳ−ＨＩＳ−ＬＥＩＩ−ＰＲＯ−５Ｅ Ｒ−ＴＨ［１−ＣＹＳ−ＡＲＧ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−３ＥＲ−ＡＳＰ−＾ ＬＡ−ＬＹＳ−ＯＥ１．及びＨ−ＧＬＹ−５ＥＲ−Ｖｌ−ＬＹＳ−丁ＦＩＰ−Ｐ ＨＥ−ＣＹＳ−ＧＬ’ｌ−ＧＬＭ−ＰＲＯ−ＶＡＬ−Ｔｌｌｉｌ−ＡＲＧ−（ｌ ｌＩにより代表される。

免疫評価からの、及びオリゴマー酵素のダイマー接触におけるような種々の配列 を解明されたＸ線結晶学的構造における保存される蛋白質−蛋白質相互作用との 類似性からの生化学的証拠は、蛋白質−蛋白質認識の保存が近縁性のために配列 の厳密な保存を必要としないことを示す、単一のアミノ酸残基の変化は、置換の 性質に依存して広い程度にそのような認識に影響しうるが、一般的に言って蛋白 質−蛋白質（及び抗原及び／又は免疫原）認識に関する二つの異るアミノ酸配列 の近縁性は、７つの基本的アミノ酸パラメータによって表現できる。

（ｌｌ　疎水性 （２）　既知配列における変化の進化的発生（３）　側鎖の大きさ く４　電荷及び極性 （ω　折りたたまれた（　ｔｎｒｎｅｄ）二次構造に対する優先性１６）　ベー タストランド二次構造に対する優先性、及び（刀　へリカル二次構造に対する優 先性。

抗原及び／又は免疫原認識に関係する配列同一性の程度及び従っで免疫原的に近 縁の変化物を定義するために、近縁性について検討される配列中の各アミノ酸対 に数値を割り当てる一致マトリックスを用いることができる０本発明の目的のた めに、個々のアミノ酸残基が簡単化のために一文字符号で示されている下記の一 致マトリックスを用いることができる。

＞　ｇ４７７７　ｃｒ　０７　Ｔマゞ１Ｔ６１マ〒０００１ＨＭ　Ｐ２ＯＦｉ　 ｉＮ　ＯＭ　Ｎ　Ｎ　ＯＯｒＮ−Ｍ　、−１□　−Ｎ　ｍ　ＯＩＩ　Ｉ　ＩＩ　 ＩＩ　１ ３７マ？　Ｌｌ；Ｉ　Ｔ　；　？　Ｙ　ＯＯ＄４７０　＃　Ｔ、Ｔ　？　ｅ、　 Ｍ　０１−１００　Ｎ　Ｏ？　Ｆ’ｌ　Ｏｐ−４Ｎ　００口００−１’Ｑ　１４ ）　Ｍ　％１０、　１ ０ｓ　０７　ｖ４０００マへ０７ママ０７かへ一丁ママ＋４　ｉ　Ｔ　Ｔ　７０ ０７　？　ＯＮ　Ｍ　７　Ｎ　ｒ−７７０ＱＦ　Ｍ　Ｎｘ　ｔｓ＊　Ｍ　ｆ−ｉ Ｎ　ＯＯＰ４Ｎ　ＯＮｗ　Ｐ４　ｓｒｓ　Ｎ　Ｏ−００Ｆ−Ｉ　ＮＩＩＩ　ＩＩ 　ｌ　ｌ　・ Ｘ　７　ｔｎ　ＩＮ　Ｏ７Ｎ　０７　ｗ　７７　ｅＯママママ１．ｏ　７７７Ｊ 　−Ｔ　？　？　ＯＯ？　？　Ｏ？　′ｏ？　ＱＰ　Ｍマ？　ＯＦｉ　０　ＭＭ 　Ｏ’７７７°０　Ｆ；１７マ＆ｎ　４７　Ｍ　Ｎ　？　Ｔ　ＯＯＱ　４閤−＆ ｎ　Ｍ　００４−へΦ−０啼０６０−へ０へ−Ｉ　ＩＩ　１ ａ　Ｎ＆？″０″′ママ“ママママ７？１１−〒〒７＆４　Ｉ４２０　ＭＰ　Ｔ 　Ｎト？　−？　Ｔ　Ｏマフ　Ｔ　Ｃ’ｌ　ＯＩ？　７７００　Ｎ　Ｍ　−一４ ４Ｍ　＃＋Ｉ４００　Ｆｉ　０００　ｙ４　Ｍ　ｖ４００（Ｊ　６　Ｍ　Ｐ４　 ｒｄ　ｈ　Ｐ４　Ｎ−０００１Ｎ　０００　ｆｆｌ　−ｗ　（Ｍ　Ｍ　０ＩＩ　 Ｉ　ｌ　＋ ΩＮ−１”ｌ　ｒ−Ｆｌ−ＱＰ　００７７０　？　Ｔ　０　＄４０　？　７７Ｉ Ｉ　Ｉ ２　Ｆｉ　０　％ＯＭ　Ｐ４Ｍ　Ｏ＋　Ｍ　Ｆｉ　ｒｄ　ｒｄ　ｔ−Ｉ　Ｍ−Ｗ 　ｆｉ　Ｍ　ＯＦ４醤ＩＩＩＩＩ１ ｇ　ｓｎ　（）　（）？７Ｎマｕ１１′ｍ　７７　ｔＪ’％　１’；ｌ　ｌ’４ ７００ママＴ−一　暮 ベトい−ＮＯローへ一０ｓ−１閂へ一〇〇　〇　Ｍ　Ｍ　Ｐ４Ｉｌｌ　ＩＩ　Ｉ ｌ、　ＩＩ ぺｃｓｇ　２：　Ｑ　ＣＪ　Ｏｔｎ２　（５ＥＩ　Ｍ　１４　ｇ　Ｅ　ｈａ　ｏ ａ　ｔｎ　ｈ　Ｚ　Ｈ＞上述の一致マトリックスを用いる配列比較は、総ての可 能な配置の決定及びこれら配置のマトリックスによる続く配点を含む。

次に二つの配列は、一致マトリックスから最大−政点数を計算することによって 配置される。！！準偏差単位での配置点数は、最大一致点数と二つの配列のラン ダム順列に対する平均最大一致点数の間の差を取り、次にランダム点数の標準偏 差で割ることにより決定できる。

本目的のために、３標準偏差（残基当り約３の平均値）より大きい一致マトリッ クス点数は、９９．７％より大きい信頼水準で有意の近縁性を示す、これは、制 限的な判断基準である。なぜなら、それは総ての５残基ペプチドに対してｏ、　 ｏ　ｏ　ｓの度数、２２２２の既知蛋白質配列で起きる総ての１３残基ペプチド に対して０．００１４の度数を与えるからである。同様に、２標準偏差（残基当 り約２の平均値）より大きい一致マトリックス点数は、９５．４％より大きい信 領水準で有意の近縁性を示す。

本発明の目的のための近縁性を決定するために、一致マトリフクス点数は、考慮 される各々の配置されたアミノ酸残基対に対してマトリックス値を確かめ、次に そのような各対の個々の値を合計することにより計算される。得られた合計は次 に、望む信頼水準を表わす標準偏差の数に対して比べられる。もし得た合計が、 標準偏差の選んだ数と考慮下のアミノ酸残基対の数の積より太きいなら、比較さ れたアミノ酸残基配列は、指示の信銀水準において免疫原的に近縁である。

たとえば、アミノ酸残基配列 −ＬＹＳ−ＴＲＰ−ＰＨＥ−ＣＹＳ−ＧＬＹ−と −ＡＲＣ，−、Ｉ　ＬＥ−Ｆ’ＨＥ−ＣＹＳ−ＧＬＹ−の免疫原的近縁性を確か めるために、一致マトリックスは下記の値を与える。

−ＬＹＳ−及び−ＡＲＧ−又はＫ及びＲ５−ＴＲＰ−及び−ＩＬＥ−又はＷ及び ｌｏ−ＰＨＥ−及び−ＰＨＥ−又はＦ及びＲ７−ＣＹＳ−及び−ＣＹＳ−又はＣ 及びＣ７−ＧＬＹ−及び−ＧＬＹ−又はＧ及びＧ８合計　２７ ９９．７％信頼水準での免疫原的近縁性のために、一致マトリックス点数は、考 慮下のアミノ酸残基対の数の３倍すなわち５×３−１５を越えなければならない ＊　２７　＞　１５なので、望む免疫原的近緑性が実際に存在する。

本発明の目的のために、本発明の範囲に入るポリペプチド間の抗原的近緑性は、 好ましくは少（とも約９５％の信頼水準で、より好ましくは少くとも９９％の信 頼水準で存在する。

前述のポリペプチド（先に定義したように抗原的に近縁の領域を持つものを含め て）の混合物もまた、淋病感染に対するワクチン又はそれに対する診断評のため に、及び／又は抗体を生じさせる接種物を作るために使用できる。

本ポリペプチドの有効量を含むワクチンは、ワクチンを受けた個体を淋菌での感 染から保護しそして従って淋病を予防するのに十分な量の抗体の産性を誘発する 。もし必要なら、促進注射も与えることができる。

従って、種々の文法形での「ワクチン」という言葉は、宿主哺乳類の保護に関連 して本明細書で用いられる。種々の文法形での「接種物」という言葉は、免疫学 的に淋菌線毛に結合する抗体の産生のために用いられる活性成分として本発明の ポリペプチドを含む組成物を述べる。従ってワクチンと接種物は同じ成分を含み うるが、それらの用途が異る。

本目的のために抗原として又は免疫原として又は両者として適当なポリペプチド は、合成的に又は遺伝子工学的に作ることができ、ワクチン、接種物において又 は診断のために用いられるために七ツマー状ならびにマルチマー状形態であるこ とができる。ワクチンは接種物において用いられるとき、ポリペプチドは、オリ ゴマー又はマルチマーの場合のように単独で用いられることができ、又は他の担 体に結合されて接合体として用いられることができる。免疫原として単独で用い られるとき、本発明のポリペプチドは典型的には、合計約２０〜約３５のアミノ 酸残基を含む、より短いポリペプチドは好ましくは、担体に結合される。

特に有用な接合体担体としては、キイホールリンベットへモジアニン（ＫＬＩ（ ＞　、破傷風トキソイド、ポリ−Ｌ−（ＬＹＳ：Ｇ　Ｌ　ｕ　）　、ビーナツツ 凝集素、卵アルブミン、大豆凝集素、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清 アルブミンなどが挙げられる。

ここで用いられる合成ポリペプチドは好ましくは、下記の周知法を用いてキイホ ールリンペットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に結合される。ＫＬＨ担体はまず、 ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルにより活性 化され、そして次にリウ（Ｌｉｕ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）　８０　：　６９０（１９７９）に記載のようにミハエル付加反応によりポリ ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に加えられたシスティン残基を介して ポリペプチドに結合される。

本発明のポリペプチドはまた、別の手段により担体に結合されることができ、ま た前述のようなＫＬＨ以外の担体に結合されることができる。たとえば、ポリペ プチドは、周知のように０．０４％グルタルアルデヒド溶液を用いて遊離アミノ 基を介して破傷風トキソイド担体に結合されることができる。たとえばクリブス テイン（ｉ［１ｉｐｓｔｅｉｎ　）ら、Ｊ−Ｉｎｆｅｃｔ−Ｄｉｓ、　１４　？ 　＝　３１８　（１９８３）参照。

合成ポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端に加えられたシスティン残基は、 ジスルフィド結合及びミハエル付加反応生成物により接合体を形成するために特 にを用であることが見い出された。しかし、接合体を調製するために当業界で周 知の他の方法もまた用いることができる。別の結合（リンキング）法の例として は、グルタルアルデヒド（前述）などのようなジアルデヒドの使用、又は担体と ポリペプチドの間にアミド結合を形成するために水溶性カルボジイミドたとえば １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの使用のよう なカルボジイミド法の使用が挙げられる。

当業界で周知のように、中間の結合基により合成ポリペプチドを担体に結合する ことがしばしば有利である。前述のように、グルタルアルデヒドはそのような結 合基の一つである。

しかし、担体への結合のためにシスティンが用いられる場合、中間結合基は好ま しくは前述したｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス テル（ＭＢＳ）である、ＭＢＳは典型的には、最初にエステル−了ミド交換反応 により担体に結合される０次に上述のミハエル反応が行われるか、又はＭＢＳ付 加の後に、ブロックされたメルカプト基たとえばチオール酢酸（ＣＩｌ、Ｃ０５ Ｂ　）のマレイミドニ重結合を横切るミハエル付加が行われる。７シルプロツキ ング基の１！離後に、ブロックをはずされた結合基メルカプタンと合成ポリペプ チドの加えられたシスティン残基のメルカプタンの間にジスルフィド結合が形成 される。

担体の選択は、免疫原の決定基部分によりも、免疫原ポリペプチドの意図される 最終用途により依存し、本発明に詩には含まれない判断基準に基づく、たとえば 、もし接種物がたとえば淋菌線毛の存在の評価のために用いられる抗ポリペプチ ド抗体の産生のために動物において用いられるのであれば、この特定の動物にお いて不都合な反応を起さない担体が選ばれるべきである。もし、淋菌に対するワ クチンがヒトで用いられるのであれば、主な配慮は、ヒトでの使用を意図される 任意のワクチンに妥当するのと同じ配慮すなわち担体及び／又は得られる免疫原 の免疫化学的又は他の副次的反応のないこと、安全性及び有効性を含む。

本明細書において「作られた」という言葉は、ポリペプチドの分子又はポリペプ チド繰返し単位が化学的手段により合成的に構成された即ち化学的に合成された か、又はヒトが仲介する生化学手段たとえば遺伝子工学技術により構成されたこ とを意味する。

すなわち、本発明を具体化する作られたポリペプチドは、天然に生じた蛋白質及 びそのフラグメントを含まない、ブロックされたアミノ酸残基が望むポリペプチ ドを得るために順々に加えられるところの周知の固相化学合成が、合成の好まし い方法であり、以下で極めて詳しく述べられる。

前述のように、本発明の目的に適するポリペプチドは、周知の固相法により合成 できる。たとえばホウテン（ｌｌｏｕｇｈｔｅｎ　）ら、Ｉｎｔ、Ｊ−Ｐｅｐｔ −Ｐｒｏｃ、Ｒｅｓ、　ｌ　６　：　３１１−３２０　（１９８０）　、及びメ リフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）　、ジャーナル　オブ　アメリカンケミ カル　ソサエティ（ＪＪｍ−Ｃｈｅｍ、５ｏｃ−）　８５　二２１４９−２１５ ４（Ｌ　９６３）を参照されたい、これらの開示は、引用することにより本明細 書に組み込まれるやポリペプチド合成の固相法は、ベックマン　インス′ンルメ ン′ン（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社・バークレイ、カリフォ ールニア、米国、から市販入手できるベックマンモデル９９０Ｂペプチド合成機 を用いて実施できる。

上の面相法により本発明の合成ポリペプチドを調製するにおいて、アミノ酸残基 はカルボキシ末端残基からのエステ結合を介して樹脂（固相）に結合される。ポ リペプチドがＣＹＳ残基を介して担体に結合されるべきである場合、樹脂にエス テル結合されたカルボキシ末端残基としてのＣＹＳ残基を用いることが便利であ る。

各々の加えられるアミノ酸のαアミノ基は典型的には、アミノ酸が成長するポリ ペプチド鎖中に加えられる前に第三ブトキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）基により 保護される０次にｔ−ＢＯＣ基は、次のアミノ酸が成長するポリペプチド鎖に加 えられる前に除去される０反応性アミノ酸側鎖はまた、ポリペプチドの合成の間 保護される。残留するアミノ酸残基のために用いられる通常の側鎖保護基は以下 のようなものである；チロシンのために０−（ｐ−ブロムベンゾキシカルボニル ）、スレオニン、セリン、アスパラギン酸及びグルタミン酸のために０−ベンジ ル、及びシスティンのためにＳ−メトキシ−ベンジル、保護されたアミノ酸は、 薄層クロマトグラフィで単一スポットを与えるべく適当な溶剤から再結晶される 。カップリングは典型的には、当初のＮ末端アミノ酸のミリ当量数の共に１０倍 モル過剰の保護されたアミノ酸及びジシクロへキシルカルボジイミドの両者を用 いて行われる０両反応剤の二倍モル過剰も用いることができる。アスパラギンに ついては等モル量のＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールが保護されたアミノ酸 に加えられ、溶剤としてジメチルホルムアミドが用いられる。総てのカップリン グ反応は典型的には、ギシン（Ｇｉｓｉｎ）、Ａｎａｌ、Ｃｈｅｓ＋−Ａｃｔａ 、　５８　：　２４８−２４９　（１９７２）のピクリン酸テストで９９％より 高く完了される。

得た保護された、樹脂に結合したポリペプチド（１グラム）の一部が２　ｗａｌ ｌのアニソールで処理され、２ｏＩＩｌｌの無水フン化水素がドライアイス温度 で反応容器中に凝縮される。得た混合物は、保護基を解離しかつ樹脂からポリペ プチドを取り去るために、４℃でＬＯ時間攪拌される。Ｎｚ流で４℃でフン化水 素を気化させり後に、残渣は、アニソールを除去するために無水ジエチルエーテ ルで３度抽出され、残渣は真空乾燥される。

真空乾燥された物質は初めに５％酢酸水溶液で抽出され（各５０ｍＡで３度）、 次に５０％酢酸水溶液で抽出される（５０ｍｊ！で４度）、最初の抽出は、低分 子量ポリペプチド及びチロシン（ＣＹＳメルカプト基を保護するためにい（っか の調製において用いられる）を除去する。第二の抽出は、遊離のポリペプチドを 樹脂から分離する。１０〜２０％酢酸の濃度に水で希釈後に、得た溶液を真空凍 結乾燥して、モノマー状の非酸化ポリペプチドを得る。

ポリペプチドマルチマーは、上述の固相法を用いて頭尾的に合成ポリペプチドモ ノマーを互に結合することにより作ることができる。すなわち、一つの完全なポ リペプチド配列が樹脂上で合成され、次に一または二辺上の同じ又は異るポリペ プチド配列が続き、その後に全マルチマ一単位が樹脂から解離され、本明細書記 載のように使用される。

あるいは、アミノ及びカルボキシ末端両者に加えられたシスティン残基を含む合 成ポリペプチドモノマー（ジｃＹｓポリペプチド）は、免疫原ポリマーを形成す るために酸化手順を用いて分子内、分子間シスチンジスルフィド結合により互に 結合されることができる。このように作られたポリマーは、本発明のポリペプチ ドの多数を繰返し単位として含む、これら繰返し単位は、上述の酸化されたシス ティン残基により互に結合される。

ポリペプチドを担体に結合する又はポリマーを作る目的のための本発明のポリペ プチドにおける−又は二つの末端ＣＹＳ残基の存在は、ポリペプチド繰返し単位 のアミノ酸配列を淋菌とリンの抗原決定基部位を免疫学的に模倣する配列とは違 うように変えると解釈されるべきではない。

典型的な実験室調製において、ジＣＹＳポリペプチド（非酸化形のアミノ及びカ ルボキシ末端システィン残基を含む）の１０■が、約８の９Ｈ値を持つ０．１Ｍ 重炭酸アンモニウム緩衝液２５０ｓ＋ｊ！に溶解される。溶解されたジＣＹＳポ リペプチドは次に、得た溶［を約１８時間又はエルマンテスト〔エルマン（ｊＥ ｌｌｍａｎ　）、Ａｒｃｈ−Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｔｏｐｈｙｓ−８２＝　７０− ７７　（１９５９）　）により検出できる遊離メルカプタンがなくなるまでゆっ （りと攪拌することにより空気酸化される。このように作られたポリマーは次に 典型的には、凍結乾燥、再溶解及びクロマトグラフィ精製により単離される。

遺伝子工学的技術による融合蛋白質のｔｉ製のための典型的手順は、ベルマン（ Ｂｅｒｍａｎ）　、バイオテクニクズ　上（４）：１７Ｂ−１８３（１９８３） 　、シルハビイ　（Ｓｉｌｈａｖｙ）ら、マイクロバイオロジカル　レビューズ 、４７（３）１１３−３４４　（１９８３）、及びヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、Ｆ ｒ０ｅ−Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ−５ｃｉ、ＬＩＳＡ　８０：１１９４−１１９８（ １９８４）に記載されている。

本ワクチン及び接種物は、上述のポリペプチドの−又は二辺上を、医薬的に許容 される希釈剤たとえば生理的食塩水、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又は他の 注射しうる液体と共に含む、ワクチン又は接種物において慣用される添加物もま た、もし望まれるなら存在しうる。そのような添加物の例は、安定剤たとえばラ クトース又はソルビトール、及び補剤たとえば水酸化アルミニウム、硫酸塩又は リン酸塩、明ばん、又はアルギン酸塩である。沈澱リン酸アルミニウム（Ａ＃Ｐ Ｏ，）が、ワクチンのために特に適当な補剤であり、一方、完全なフロイントの アジュバント（ＣＦＡ）及び不完全なフロイントのアジュバントが接種物におけ る使用のために好ましい。

本発明のワクチン及び接種物は、注射、通常、筋肉内又は皮下注射により、腸内 分解カプセル又は錠剤により経口的に、座薬として、鼻スプレーとして、及び他 の適当な投与経路で投与されることができる。ヒト患者の場合、ポリペプチドの 適当な投与量は、選択された投与経路及び他の多数の因子に部分的に依存する。

これら因子には、免疫化されるべき哺乳動物の体重、担体（使用される場合）、 補剤（使用される場合）及び行われることが望まれる接種の数が含まれる。

ヒト患者のための個々の接種は典型的には、ポリペプチドが結合されている担体 があればこれを除外したポリペプチドの約１０μｇ〜約１００■の単位投与量を 含む、もし望むなら、最適の免疫のために一連の投与量をある期間に亘って投与 できる。ワクチンの単位投与形態は、もし望むなら上述の量のポリペプチドを含 めて用意されることができる。

いずれにしても、ワクチン又は接種物に含まれる免疫原は「有効量」で存在し、 この量は免疫学の分野で周知のように種々の因子たとえば免疫化されるべき哺乳 動物の体重、用いられる担体、用いられる補剤、求められる保護の期間及び望む 免疫化手順に依存する。

本発明のポリペプチドに対して生じられた完全な（全体の）抗体ならびに実質的 に完全な抗体、及びそのような抗体から調製された抗体結合部位がまた、本発明 の別の一面を成す、これら分子は、集合的に受容体と呼ばれる。

受容体は、上述した接種物を用いる免疫化により、ラビット、ヤギ、ウマなどの ような哺乳動物において生じられる。免疫化手順は、ワクチン接種において用い られたのとほぼ同じである。但し、ヒトでの使用が許されないＣＦＡ及び／又は ｒＦＡのような強力な補剤が、動物接種物では含められうる。

典型的な接種貯蔵溶液は、ＣＦＡ、ＩＦＡ又は明ばんを用いて下記のように作ら れる。接種当り望む有効量のポリペプチドを与えるに十分な量のポリペプチド、 合成ポリペプチド接合体又はポリマー状ポリペプチドがｐＨ７，２のＰＢＳに溶 解される０次に、水対オイル比が約１＝１である、ポリペプチド、水及び補剤を 含む接種物を与えるぺ（、ポリペプチド溶液に等量のＣＦＡ又はＩＦＡが混合さ れる。混合物はその後、均質化されて、接種物貯蔵溶液を与える。明ばんが用い られる場合、貯蔵接種物を調製するために約２００μｇの接合体が約４■の明ば んに吸収さ托る。

本明細書で、抗ポリペプチド抗体を生じるためにラビットを用いることができる 。そのように用いられる場合、宿主ラビットは典型的には、ＣＦＡ中に乳化され たポリペプチド接合体（ポリペプチド＋担体）の２００μｇを含む接種物、ＩＦ Ａ中のポリペプチド接合体の２００μｇを皮下的に；そして４■の明ぽんと共に ポリペプチド接合体の２００１１ｇを腹膜内的に、各々免疫化スケジユールの第 ０．１４および２１日に注射される。各接種（免疫化）は、接種物の４回の注射 より成る。−往射当り上述の投与量の約十分の−を用いて、同様の方法でマウス を免疫化できる。

動物は典型的には、最初の注射後４及び１５週に採血される。

対照の免疫化部血清は、最初の免疫化の直前に各動物から採血されて得られる。

対照接種物貯蔵溶液がまた、キイホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）　、 ＣＦＡ又はＩＦＡ中のＫＬＨ，ＫＬＨ−明ばん吸収、ＫＬＨ−明ばん吸収−百日 咳、エデスチン、チログロブリン、破傷風トキソイド、ＩＦＡ中の破傷風トキソ イド、コレラトキソイド及びＩＦＡ中のコレラトキソイドなどを用いて調製され うる。

上述の免疫化手順の有効性は典型的には、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより測定される。そ れでは、本発明の免疫原性ポリペプチドが、上述の採血から得た希釈された血清 中に存在する抗体の量を測定するために抗原として用いられる。少くとも約１： １６０の抗ポリペプチド抗体力価（希釈）を与える血清は、本発明の抗体を与え るにおいて有用であると考えられる。典型的に用いられるＥＬＩＳＡは、ビトル （Ｂｉｔｔｌｅ）ら、ネイチア（Ｎａｔｕｒｅ）　２９８　：　３０−３３　（ １９８２）に詳細に記載されており、これを引用することにより本明細書に組み 込む。

適当なモノクローナル受容体、典型的には完全な（全体の）抗体、はまた、ニマ ン（Ｎｉｍａｎ　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、＋υ５ Ａ８０：４９４９−４９５３　（１９８３）に記載されるようなハイプリドーマ 技術を用いて作ることができる。上述の文献を引用することによりここに組み込 む。モノクローナル受容体は、ハイプリドーマ上澄みからのみ必ずしも得る必要 はなく、望むハイブリドーマが導入されたところの哺乳動物の腹水から一般によ り多量に得ることができる。腹水を用いるモノクローナル抗体の生産は周知であ り、ここで更に述べることはしない。

本発明の受容体は、これが生じられた相手であるポリペプチド、及びその抗原決 定基部位を本発明のポリペプチドが免疫学的に模倣するところの対応するピリン 蛋白質の両者に結合する。すなわち本発明のポリペプチドは、免疫原かつ抗原で ありうる。

本発明の受容体は、天然に生じるポリクローナル抗体に比べて少くともオリゴク ローナルである。なぜなら、それらは、全ビリン分子のエピトープに比べて比較 的少しのエピトープを持つ免疫原に対して生じられるからである。従って本発明 の受容体は、本ポリペプチドのエピトープに結合し、一方、淋菌とリンに対して 生じられた天然に起った抗体はとリン分子全体のエピトープに結合する。

ポリペプチド、これらポリペプチドにより与えられた抗体及び抗体結合部位、及 び本発明の方法はまた、イムノアッセイのような診断テストのために用いうる。

そのような診断法としてはたとえば、酵素イムノアッセイ、酵素多重イムノアッ セイ法（ＥＭＩＴ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）　 、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、シングル又はダブル 抗体法、及び抗体結合部位又は抗原が何らかの検出しうる目印でラベルされると ころの他の方法が挙げられる。一般的にはマギオ（Ｍａｇｇｉｏ）　、酵素イム ノアッセイ、ＣＲＣブレス、クリーブランド、オハイオ（１９８１）、及びゴー ルドマン（Ｇｏｌｄ＋ｓａｎ　）、Ｍ、、　蛍光抗体法、アカデミツクプレス、 ニューヨーク、ニューヨーク（１９８０）を参照されたい。

淋菌を検出するための本発明を具体化する診断系の例は、受容体分子、たとえば 本発明のポリペプチドに対して生じられた抗体、はぼ完全な全体の抗体、又は抗 体結合部位を含む、この系はまた、受容体と抗原の間の免疫反応の存在をシグナ ルするための指示手段を含む、この指示手段は、免疫反応を検出することを可能 にする８体サンプルたとえば頚状部又は泌尿部塗抹標本と混合されたとき、受容 体分子はピリン抗原と免疫反応して免疫反応生成物を形成し、そして存在する指 示手段が免疫反応をシグナルする。

そのような実施態様の一例は、頚状部又は泌尿部塗抹標本が無地の顕微鏡スライ ドにアセトン固定される免疫蛍光評価である。

本発明に従いたとえばラビットで生じられた抗体の一部一般には約１０μｇ〜約 ５００μｇが、周知の方法を用いてスライド上でインキュベートされる。

何らかの免疫反応しなかった抗体をすすぎ去り、スライド上の非特異的結合部位 をＢＳＡのような蛋白質でブロックした後に、もし望むなら第二の抗体たとえば ヤギ抗ラビット抗体をテストスライド上でインキュベートできる。第二の抗体は 、蛍光染料たとえばフルオロセイン　イメチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合さ れることによりラベルされる。

この第二のインキュベーションの後に、第二抗体の過剰があればすすぎ落され、 テストスライド上で第一抗体に結合したＦＩＴＣラベルされたヤギ抗ラビット抗 体が残る。ＦＩＴＣラベルされた抗体の存在は、蛍光顕微鏡で検出でき、それに より淋菌感染の存在をシグナルする。

受容体分子のために、全体の完全な、生物学的に活性な抗体を用いることは、多 くの診断系たとえば上述の免疫蛍光評価では必要ない、むしろ、抗体分子の免疫 学的に活性な、イディオタイプ含有の、抗原結合性及び認識受容体部位；すなわ ち抗体結合部位のみを用いることができる。そのような抗体結合部位の例は、当 業界で周知の方法により作られるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）ｇのような当業界で知 られているものである。

本発明の別の診断法は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ評価である。ここで、本発明のポリペプ チド抗原は、固体支持体たとえば微小力価プレートの壁に結合される。微小力価 くぼみ壁土の非特異的結合部位はその後、ＢＳＡのような蛋白質でブロックされ る。非結合ポリペプチド及びＢＳＡは、たとえばすすぎによって微小力価くぼみ から除去される。

上述のような体サンプルが、水溶液中の過剰の本発明の抗体と混合され、混合物 は、抗体と存在する何らかの淋菌線毛抗原との間の免疫反応を形成するのに十分 な時間維持される。この液状混合物を次に、上述のポリペプチド結合固体支持体 と混合して、固体及び液相を含む第二の混合物を形成する。固／液相混合物は、 以前に反応していない抗体がポリペプチド抗原と反応するのに十分な時間維持さ れる０次に液相が固相から分離される。

初めに述べた抗体と反応する第二のラベルされた抗体の溶液を次に、固相と混合 する。第二の抗体の例は、初めに述べた抗体がラビットで生じられたものである 場合に、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラビット抗体である。固相及び第二のラベ ルされた抗体溶液から形成される混合物は、二つの抗体の間の免疫反応を形成す るのに十分な時間維持される。その後、固相と液相が分離される。

過酸化水素のような酵素のための基質及び０−フェニレンジアミンのような色形 成性染料前駆体を含む溶液を次に固相と混合する０次に、予め選択された波長（ たとえば４０５ｎｍ）で光学的密度を、所定の時間たった後に測定し、淋菌抗原 が体サンプル中に存在したかどうか決定するために対照の光学的密度と比較され る。

本発明を以下の詳細な実施例により更に例示する。

実施例１；ポリペプチド合成 そのアミノ酸残基配列が淋菌ピリン蛋白質の小さなセグメントに対応する一連の 短い合成ポリペプチドが、ホウテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）ら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　 Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｒｅｓ、＋　１６　：　３１１−３２０　（１９８０ ）により修正されたメリフィールドの方法、Ｊ、　Ａａ＋、　Ｃｈｅｓｓ、　Ｓ ｏｃ、＋８５：２１４９−２１５４　（１９６３）に従い、ベックマン　モデル ９９０Ｂペプチド合成機（ベックマン　インストルメンツ社、バークレー、カリ フォールニア、米国）を用いて合成された。ポリペプチドの名称、及びその対応 するアミノ酸残基配列の淋菌とリン蛋白質における位置を、下記の表１に示す。

表１ 淋菌とリンセグメントに対応する合成ポリペプチド−各施−−位置」ｅ−アミノ 　配 ４４　’　１４０−１５９　ＫＥＩＤＴＫＨＬＰＳＴＣＲＤＫＡＳＤＡＧ　Ｃ４ ’　１４５−１５３　ＫＩＩＬＰＳＴＣＨＤＧ　Ｃ５’　１４４−１５９　ＴＫ ＢＬＰＳＴＣＲＤＫＡＳＤＡＫＧＣ６’　１１５−１２７　ＧＳＶＫＷＦＣＧＱ ＰＶＴＲ１一実施例２に述べるグルグルアルデヒド法を用いて破傷風トキソイド に結合されたポリペプチド ２−位置は、メイヤー（Ｍｅｙｅｒ　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　（１９８４）８１：６１１０−６１１４に記載される淋菌とリン蛋白質 配列のアミノ酸残基位置に対応する。

実施例２：ポリペプチド−担体カップリンググルグルアルデヒド法を用いる破傷 風トキソイド担体へのポリペプチド接合は、等量のペプチドと破傷風トキソイド をＰＢＳ中で２■／ｍｌの最終濃度に混合することにより行われた。特定のペプ チドを溶解するのが困難であった場合には、作られた混合物のｐＨ値は約８．０ に上げられた。

水冷ＰＢＳ中で２５％ＣＰＢＳ中ｗ　／　ｖ　）グルタルアルデヒド貯蔵溶液を １＝６５に希釈することにより、各カンプリングの前の新鮮なグルタルアルデヒ ド作業希釈液を作った。新鮮なグルタルアルデヒド溶液を次に、上で得たペプチ ド−担体溶液に、各々１２４μｌ対１ｍｌの比で加えた。得た反応組成物を室温 で一夜攪拌下にインキュベートした。

インキュベーション後に、反応生成物を蒸留水に対して少くとも６時間透析し、 次に真空凍結乾燥した。

実施例３：抗ポリペプチド抗体についてのラビット血清のスクリーニング ラビット抗血清は、酵素結合免疫吸着体評価（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）を用いて抗ポリ ペプチド抗体の存在についてスクリーンされた。上の実施例１に述べたようにし て作られたポリペプチド抗原が、固相結合ターゲット抗原を用意するために微小 力価プレートくぼみの壁に吸着された。

固相結合ポリペプチドを調製するために、約５ピコモルのポリペプチドを含む０ ．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳの２５ｔｔｌを、微小力価プレートくぼみに入 れ、完全な気化まで３７℃でインキュベートした。このようにして沈積されたポ リペプチド抗原は、各くぼみで５０μＥのメタノールを室温で５分間インキュベ ートすることにより固相に固定された。インキュベーション後に、プレートヲサ カさにして振り、５〜１ｏ分間風乾することによりメタノールを除去した。

その後、微小力価くぼみ壁土の非特異的結合部位が、各くぼみで５０．ｃ＋ｆｆ ｉの３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳを３７℃で加湿室中で４時間インキュベート することによってブロックされた。インキュベーション後に過剰のＢＳＡは、プ レートをさかさにして振ることによって除かれた。非特異的結合部位がブロック されている固相支持体に結合されたポリペプチドがこのようにして、ターゲット 抗原としての使用のために用意された。

抗ポリペプチド抗体の存在についてラビット血清を評価するために、各血清の一 部を１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳで順次２倍に希釈した。各希釈物の２５μ！ を、上述で作られた適当な微小力価くぼみ中で混合することによって、面相結合 ポリペプチドと接触させた。接触は、加湿室中で３７℃で約１６時間くぼみをイ ンキュベートすることにより維持され、かくして血清希釈物中に存在するかも知 れない抗ポリペプチド抗体が固相結合ポリペプチドターゲット抗原と免疫反応で きるようにした。インキュベーション後に、くぼみに蒸留水を満し、さかさにし 、そして振ることを順次１０回行って、固相と液相を分ける。

抗ポリペプチド抗体と固相抗原の間の免疫反応の存在を検出するために、指示手 段としてのペルオキシダーゼでラベルされたヤギ抗ラビットＩｇＧ　（ボーリン ガ−マンハイム　バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｆ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　、インジアナポリス、インジアナ）の２５μｌを 各ぐぼみに混合した。加湿室中で３７℃で１．５時間のインキュベーション後に 、くぼみを前述のように蒸留水で１０回洗った。５０μＪの現像液（ＡＢＴＳ　 （２，２’−アジノージー（３−エチルベンズチアゾリンスルホネート）霊ボー リンガ−マンハイム）の５５■〕及び０．１クエン酸ナトリウム（ｐＨ４，２） 　ノｌ　ＯＯｓｍ！ニ溶解した３　０　％ＨｚＯ＊　（Ｄ　Ｉ　００μｌを次に 混合し、各くぼみにおいて室温で約４５〜６０分間インキュベートした。指示反 応は、５０μ１０５％（Ｗ／Ｖ）　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／ＨｇＯ を各くぼみに加えることにより停止された。指示反応（発色）の量は、４１４ｎ ■で各くぼみの吸光度を測定して定量された。

ネカチブ対照よりも４倍高い力価を示すラビット抗血清は、抗ポリペプチド抗体 の存在についてポジティブであると考えられた。

それらの誘発性ポリペプチドと免疫反応する抗体が、上述の表１で示した総ての ペプチドに対してラビットにおいて生じられた。

実施例４：ウェスターン　プロット評価ラビット抗血清は更に、ウェスターン　 プロット評価で淋菌ピリン蛋白質と免疫反応するその能力を測定するためにスク リーンされた。淋菌とリン蛋白質は、下記に概様を述べる手順により淋菌株ＭＳ −１１（メイセーら、前出）から単離された。

淋菌ＭＳ−１，１は、１５×１００ｆｉペトリ皿中のＧＣＢ基礎培養基（ティフ コ　（Ｄｉｆｆｃｏ）社、デトロイト、ミシガン）に塗られ、集団（ｃｏｎｆ　 Ｉｕｅｎｃｙ）まで増殖された。５０個の皿からの培養物をｐＨ１，０，５の５ ０ｍＭエタノールアミンの３５ｍ！中に洗い落した。

た０℃の浴中で３０秒間渦動し、３０秒間浸しておくことを順次４回行うことに よって線毛をバクテリアから切り取った。

切断シた線毛は、ＪＡ２０ローター（ペンクマン　インストルメンツ、フレルト ン、カルフォールニア）で１０．００　Ｏｒｐｍで２０分間の遠心分離によりバ クテリアから分離された。ピリン蛋白質を含む上澄みを次に、線毛緩衝液（０， ’ｈ　５　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１，０、０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７，５）に対し て約１６時間透析した。透析の間に、存在するピリン蛋白質の多くは不溶性凝集 物を形成した。

これら凝集物は次に、上述のローターで１０．　ＯＯＯｒｐｍで１５分間の遠心 分離により分離された。ピリン蛋白質のベレットを次に、５０ｍＭエタノールア ミン（ｐＨ１０，５）中に１Ｉｌｌｒ／＋ｊ！の濃度に再懸濁した。ピリンを更 に、１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分離し、２５ｍ ＭＴｒｉｓ　、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール及び０．０１％ＮａＮ！ より成る転移緩衝液を用いてエレクトロ−プロッティング装置（ＣＢＳサイエン ティフィック、デルマール、カリフォルニア）でニトロセルロース（シュライヒ ャー　アンド　シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌ）、カタロ グ隘ＢＡ８５、キーン、Ｎ、　Ｈ，）に転移した。

このようにして得た、ニトロセルロース固体支持体に結合した淋菌ビリン蛋白質 （ウェスターン　プロット）は次に、抗ビリン抗体を検出するためのウェスター ンプロット評価においてターゲット抗原として用いられた。

ラビット抗ポリペプチド抗血清を、３％（ｖ　／　ｖ　）　Ｂ　Ｓ　Ａ　／ＰＢ Ｓ又はＢＬＯＴＴＯ（５０ｇ／ｌ無脂乾燥ミルク、Ｑ、ｌ　ｍ　Ｉｔ／ｌ消泡剤 消泡剤層エマルジョンマ　ケミカル社、セントルイル、ミズリー）及び１　ｍ　 ｊｌ　／　Ｉｔチメロザール（ｔｈｆｅｒｏｓａｌ）を含むＰＢＳ）中に約１＝ １００で希釈した。ウェスターンプロットを次に、抗血清中に存在する抗ポリペ プチド抗体が面相結合ピリン蛋白質と接触するように一定攪拌下に各２５ｍ１の 希釈抗血清中で４℃で約１６時間インキュベートした。

インキュベーション後に、プロットを、０．５％オクチルフェノキシポリエトキ シエタノールを含むＴＢＳ緩衝液（０，９％ＮａＣｌ　。

１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、、ｐ［１７，４）　（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　ｉ　００）の ２’５ｍｊ！で三度洗い、ＴＢＳのみの２５ｍｊ！で三鷹洗い、次に３％（１１ ／Ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳ２５ｍ！で洗った。

淋菌とリン蛋白質に結合した抗ポリペプチド抗体は、最初にプロットを、３％（ Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳ又はＢＬＯＴＴＯ中約１　：　２０００に希釈されたペ ルオキシダーゼラベルされたヤギ抗ラビットＩｇＧ　（ボーリンガ−マンハイム ）と一定ｆｉ押下に４℃で１６時間反応させることにより検出された。プロット を次に、前述したように洗い、上述の実施例３記載のＡＢＴＳ現像溶液２５１１ １で約４５〜６０分間インキエベーシッンにより現像した。

ウェスターンプロット評価結果は、表１に示すポリペプチドで免疫化されたラビ ットで生じた抗ポリペプチド抗血清の総てがまた、淋菌ビリン蛋白質と免疫反応 する抗体を含むことを示す。

実施例５：ナイセリア株のＥＬ　Ｔ　ＳＡ上述の実施例４のウェスターンプロッ ト評価において淋菌とリン蛋白質と免疫反応した抗ポリペプチド抗体は、ＥＬ　 Ｉ　ＳＡで固相ターゲット抗原として用いられた全体バクテリアと免疫反応する 能力について検査された。１０の病原性淋菌株を含む１１のアイセリア株は、ジ エイ・ナツプ・ナイセリア・リファレンス　ラブ（Ｊ、　Ｋｎａｐｐ、　Ｎｅ１ ｓｓｅｒｉａ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｌａｂ　）　、シアトル、ワシントン、か ら得られた。これら株は、５％ＣＯｓ加湿インキュベーター中でＧＣチッコレー トアガー上で３５℃で増殖され、当業界で周知のようにダラム株、オキシダーゼ 反応、コロニー形態及びＨＩＱ酵パターンにより確認された。

表　２ テストされた株 」朱二トニＲＬ＃　晋己　・、 ７１２２　淋菌　ＰＯＭＰ　１” ８６５８　淋菌　ＰＯＭＰ　２ ７９２９　淋菌　ＰＯＭＰ　３ ６６１１　淋菌　ＰＯＭＰ　４ ５７６７　淋菌　ＰＯＭＰ　５ ８０３５　淋菌　ＰＯＭＰ　６ ５７６６　ｍ菌　ＰＯＭＰ　Ｔ ８０３８　淋菌　ＰＯＭＰ　８ ８６６０　淋菌　ＰＯＭＰ　９ １９５５　淋菌　Ｗｌｌ１ ９２０６　髄膜炎菌Ｂ ナイセリア抗原株は、上述のように増殖された培養物をＰＢＳ（ｐ）Ｉ　７．４ 　）中に洗い落す（ｓｗａｂ）ことにより調製された。各バクテリア懸濁物の光 学密度を次に、ＰＢＳ　（ｐ［１７，４）を用いて７５０ｎｍで０．１に調節し 、分割し、凍結した。

固相に結合したナイセリア抗原は、微小力価くぼみ（Ｉｏ＋＋ｗｕｌｏｎ１”　 （商標）細片くぼみ）に５０μｌのナイセリア株懸濁物を加えることにより用意 された。このバクテリアは、４℃のテーブルトップ遠心分離機でｌｏｏｏｇで５ 分間遠心分離することにより、くぼみの壁土に溶液からペレット化された。

遠心分離の後にナイセリア抗原は、各（ぼみに４℃でＰＢＳ中０．２５％のグル タルアルデヒド２００μｌを加えることにより面相に架橋結合された。４℃で５ 分間のインキュベーション後に、くぼみをＰＢＳで４度洗った。非特異性結合部 位は、各（ぼみにおいて、０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン　 モノラウレー）　（Ｔ＠ｅｅｎ　２０　）を含む５％　Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ　Ｂ　Ｓ の３５０μ！を３７℃で２時間インキュベートすることによりブロックされた。

ＢＳＡブロック化溶液は次にアスピレーシッンにより除かれ、かくして微小力価 くぼみの壁に結合したターゲット抗原としてのナイセリアが用意された。

抗ナイセリア活性について検査されるべきラビット抗ポリペプチド抗血清は、１ ％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳで２倍に順次希釈された。各希釈物の２００ｍｊ！ を、上述のように用意されたくぼみに加えて、固／液相免疫反応組成物を形成し た。接触は、くぼみを３７℃に１時間インキュベーションすることにより維持し 、かくして血清希釈物中に存在する抗ポリペプチド抗体が固体結合ナイセリア抗 原と免疫反応できるようにする。インキュベーション後にくぼみを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳでの１分間洗滌に３回付すことによって固相と液 相を分離した。

固相ナイセリアに免疫学ｃ′Ｔに結合した抗ポリペプチド抗体は、クーパー（Ｃ ｏｏｐｅｒ）バイオぐミカル、マルバーン、ペンシルバニア、の一部門であるラ ベル（Ｃａｐｐｅｌ）から得たペルオキシダーゼラベルしたヤギ抗うビソ）Ｉｇ Ｇ指示手段で検出した。ヤギ抗ラビットＩｇＧは、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢ Ｓで１１０００に希釈され、２００μ！が各くぼみに加えられた。混合物を３７ ℃で１時間インキュベートし、それによりヤギ抗うビットＩｇＧ抗体と面相ナイ セリアに結合して存在するかも知れないラビット抗ポリペプチド抗体との間の免 疫反応を可能にする。インキュベーション後に、くぼみを上述したように各１分 間５度洗った。

ラビット抗ポリペプチドー淋菌免疫反応生成物に結合したヤギ抗ラビットＩｇＧ の存在は、ペルオキシダーゼ基質として０−フェニレンジアミンを与えることに より検出された。Ｏ−フェニレンジアミン現像液（ＯＤＳＩ−カルピンチリア（ Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ　）、カルピンチリア、カルフォールニア）の２００μ Ｅを各くぼみに加え、室温で３０分間インキュベートした０発色反応は、各くぼ みに２Ｎ　ＨＣｌの５０μＥを加えることによって停止された。

存在する指示反応の量は、グイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ 　Ａプレートリーダーを用いて４９０ｎａ＋で各くぼみの吸光度を測定すること により直ちに定量された。

上述のＥＬ　Ｉ　ＳＡが、＋１１病原性と片利共生性のナイセリア種を区別する ；及び（２）淋菌病原性株の代表的なものと免疫反応する能力について抗淋菌ピ リンポリペプチド抗体を調べるために用いられた。　＜、 第一のシリーズの実験において、抗ポリペプチド抗体は、病原性淋菌株ＰＯＭＰ Ｉセロバール（ｓｅｒｏｖａｒ　）　（ＮＲＬ　７１２２）及び月利共生髄膜炎 菌Ｂ株（ＮＲＩ、９２０６）に対して免疫反応された。病原性と片利共生性の株 を区別する能力が次に、病原性株ＥＬＩＳＡで得られた吸光度対片利共生性株Ｅ Ｌ　Ｉ　ＳＡでの吸光度の比を計算することによ’、＝ｍべられた。この手順に より抗ポリペプチド抗体を検査した結糸を下記の表３に示す。

表　１ ラビット抗淋菌ビリンペプチド特異性研究４９０ｎ−での ペプチド　ラビット抗　淋　菌　髄膜炎菌Ｂ　比１皿足丸−鬼遺風定丸　（豊■ 跋）　（株９２０６）　□９４３１”　０．０３７　０．１３６ ９４３２”　０．０６８　０．０１３ ４４　７４４　０．８４Ｂ　０．５９９　１．４ＧＣ４ＧＣ４−９３０７０，６ ６１０，３２４２，０ＧＣ４６Ｃ４−９３０９０，２３９０，２８３０，８ＧＣ ６ＧＣ６−９３１００，２７４０，１１９２，３１−淋菌／髄膜炎菌吸光度値の 比；抗血清希釈１：３２００２−ネガラブ対照 上の表３から判るようにへ本発明に従い作られたポリペプチドにより誘発された 抗体、とくに表１に示すポリペプチドＧＣ４及びＧＣ６に対する抗体は、月利共 生性髄膜炎菌株とは対照的に病原性淋菌株に対して有意な免疫特異性を示す。本 発明のポリペプチドは、病気を起すナイセリア種に対する宿主の免疫応答を指令 するので、適当なワクチン及び接種物成分である。

ナイセリア抗原ＥＬＩＳＡを用いる第二のシリーズの実験は、本発明に従い作ら れた抗ポリペプチド抗体が淋菌病原性株の代表的なものと免疫反応する能力を調 べた。下記の表４に示すこれら実験結果は、好ましいポリペプチドＧＣ４及びＧ Ｃ６に対し生した抗体が病原性淋菌株に対する幅広い免疫特異性を持つことを示 す。抗血清ＧＣ４−９３０７は、１　：　１６００希釈で用いて免疫前対照血清 を比べるとき、スクリーンされた１０の病原性株のうちの９つ（すなわちＮＲＬ ８０３５を除く総て）を認識できる十分を抗ポリペプチド抗体の力価を含んだ。

同様に、抗血清ＧＣ６−９３１０は、１　：１６００希釈で１０の病原性株のう ち７つ（すなわちＮＲＬ８０３５、ＮＲＬ５７６６及びＮＲＬ８０３８を除く総 て）を認識した。

表　４ ラビット抗血清対ナイセリア株 ７１２２　０．６７Ｂ　０．１３３　０．０２１８６５８　０．５４１　０．２ ２９　０．００３？９２９　０．６１６　０．２０５　０゜６６１１　０．６９ ７　０．１９７　０．０６０５７６７　０．６５．９　０．１９１　０．０９８ ８０３５　０．６９０　０．２４３　０．８４３５７６６　＞　１．５　０．２ ３１　０．３０２８０３Ｂ　１．０６９　０．１６９　０．２２０８６６０　０ ゜８３３０゜２７３　０．１２１９５５　０．５５０　０．２２０　０．０８４ ９２０６　０．６２６　０．１２０　０．０２０１−抗血清希釈１　：　１６０ ０ ２一対照抗血清 上の表４の結果により示される病原性株免疫特異性の範囲（交叉反応性）は、本 発明のポリペプチドが広いスペクトルの抗体を誘発することを示す、広いスペク トルの抗体を誘発する能力は、ワクチン設計において極めて望ましい要素である 。なぜなら、淋菌を含む多くの病原体は、抗原（株）バリエーションにより宿主 の免疫系による破壊を逃れるからである。従って表４の結果は更に、広いスペク トルの淋菌ワクチン中の成分として本発明のポリペプチドの利用の有用性を示し ている。

国際調査報告 −Ｎ自−＾−ｍｓｅ　ｐＣτ／σ５８５１００５６５

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．少くとも５つのアミノ酸残基かつ約６０までのアミノ酸残基により構成され るアミノ酸残基配列を含み、かつ淋菌ピリンのカルボキシ末端半分の可変部内の 保存抗原決定基部位を免疫学的に模倣することができる、天然に生じる淋菌ピリ ン蛋白質よりも短いポリペプチド。
2. ２．約６０よりも多くないアミノ酸残基を含み、左から右へかつアミノ末端から カルボキシ末端の方向に書いて式−Ｘｌ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５− （ここでＸ１は正に荷電した側鎖を持つアミノ酸残基であり、ＨＩＳ、ＬＹＳ及 びＡＲＧより成る群の一員であり、Ｘ２及びＸ３は互に同じ又は異る、ＬＥＵ、 ＰＲＯ、ＴＲＰ、ＰＨＥ、ＶＡＬ、ＡＬＡ及びＩＬＥより成る群からの員であり 、Ｘ４及びＸ５は互に同じ又は異る、ＳＥＲ、ＴＨＲ、ＣＹＳ及びＧＬＹより成 る群の員である極性の非荷電アミノ酸残基である）のアミノ酸残基配列を含むポ リペプチド及びその医薬的に許容される塩。
3. ３．Ｘ１がＨＩＳであり、Ｘ２がＬＥＵであり、Ｘ３がＰＲＯであり、Ｘ４がＳ ＥＲであり、Ｘ５がＴＨＥである請求の範囲第２項に従うポリペプチド。
4. ４．Ｘ１がＬＹＳであり、Ｘ２がＴＲＰであり、Ｘ３がＰＨＥであり、Ｘ４がＣ ＹＳであり、Ｘ５がＧＬＹである請求の範囲第２項に従うポリペプチド。
5. ５．アミノ酸残基配列 【配列があります】 を含む請求の範囲第２項に従うポリペプチド。
6. ６．アミノ酸残基配列 【配列があります】 を含む請求の範囲第２項に従うポリペプチド。
7. ７．アミノ酸残基配列 【配列があります】 を含む請求の範囲第２項に従うポリペプチド。
8. ８．式 【配列があります】 により示されるポリペプチド及びその医薬的に許容される塩。
9. ９．式 【配列があります】 により示されるポリペプチド及びその医薬的に許容される塩。
10. １０．式 【配列があります】 により示されるポリペプチド及びその医薬的に許容される塩。
11. １１．医薬的に許容される希釈剤及び請求の範囲第１項により定義されるポリペ プチドを含む淋病の予防のために適するペプチドワクチン。
12. １２．ポリペプチドが約１０μｇ〜約１００ｍｇの量で存在する単位投与量の請 求の範囲第１１項に従うペプチドワクチン。
13. １３．感受性の患者を淋菌感性に対して免疫化する方法において、患者に医薬的 に許容される希釈剤及び請求の範囲第１項により定義される有効量のポリペプチ ドを投与することを含む方法。
14. １４．淋菌線毛蛋白質について評価するために適する診断系において、（ａ）請 求の範囲第１項において定義されるポリペプチドにより動物宿主で誘発された受 容体分子及び（ｂ）受容体分子と線毛蛋白質との免疫反応をシグナルできる指示 手段を含んでいる系。
15. １５．請求の範囲第１項により定義されるポリペプチドに対して生じられた受容 体。
16. １６．受容体が抗体の全体である請求の範囲第１５項に従う受容体。
17. １７．受容体が抗体結合部位である請求の範囲第１５項に従う受容体。