JPH0363296A - トラコーマクラミジアの種特異的エピトープおよびそれを認識する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
　　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（以後、トラコーマクラ
ミジアと呼ぶ）の種特異的エピトープに対する抗体およ
びそれをつくる方法に関する。

本発明は、また、患者をトラコーマクラミジアに対して
保護するためのワクチンに関する。本発明は、また、微
生物、例えば、トラコーマクラミジアの血清学的に関係
する血清型についての共通のエピトープを同定および検
出する方法に関する。

本発明は、また、トラコーマクラミジアの共通のエピト
ープを特徴づけるペプチドに関する。なおさらに、本発
明は、トラコーマクラミジア特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ
の配列を検出するための核酸プローブに関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである：トラコーマク
ラミジアの共通のエピトープ（ｃｏｍｍｏｎ　　ｅｐｉ
ｔｏｐｅ）に対する抗体、前記抗体は動物をペプチドに
対して免疫化し、そしてこれにより産生された抗体を分
離することによって産生され、前記ペプチドは少なくと
も５つのアミノ酸を有し、前記ペプチドは次のエピトー
プ特異的自然配列： Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｔ　−Ｉ　　　
ＩＩ　　　ＩＩＩＩＶ　　　　ＶＴｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅ
ｕ　−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＶＩ　　　Ｖｌｌ　　Ｖｌｌｌ
　　ＩＸ　　　　ＸＴｈｒ−１ｉｅ ＸＩ　　　Ｘｌｌ のＩ〜ＸＩＩの配列位置を有する少なくとも４つのアミ
ノ酸から本質的に成り、ここで前記少なくとも４つのア
ミノ酸はそれらの配列位置に存在す・るが、お互いに隣
接する必要はなく、残りのアミノ酸は前記自然配列中に
存在するか、あるいは前記自然配列中のアミノ酸に対す
る免疫原的同等体であり、前記ペプチドは自然トラコー
マクラミジア抗原の１５より多くない連続するアミノ酸
を有する。

トラコーマクラミジアまたはクラミジア（ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａ）は、ヒトにおいである数の病気を引き起こす、
無条件的な、細胞内ダラム陰性バクテリアである。種は
それらの間で血清学的な類似性および非類似性に基づい
て１５の明確な血清Ｎ（血液型亜型）に再分割される。

血清型のの各々は感染のための好ましい体の部位を表す
。性交で移される病気５として、トラコーマクラミジア
の感染はある数の明確な発現（例えば、尿道炎、子宮頚
炎）を表すことがある。最も重大な合併症は婦人におい
て起こり、ここで頚部の感染は卵管へ広がり、ｌＩｉ痕
に、究極的に不妊に導く。他の重大な頚部の感染は妊娠
した婦人において起こり、ここで新生児は感染した分娩
管の通過によりトラコーマクラミジアの感染にかかる。

これらの新生児の感染は、乳児の性器、眼または肺を包
含することがあり、肺の感染は、迅速に検出されない場
合、高い死亡率を示す。

個体はしばしばほんの温和な症候を示すだけであるか、
時々感染後無症候に止まるという事実のため、多くの個
体は感染に気づかず、そしてトラコーマクラミジア１１
人口全体に広がることができ、そして広がった。現在の
推定によると、米国のみにおいて３〜５ＸＩＯ’人が毎
年トラコーマクラミジアで生殖器で感染している。

クラミジアの感染の普通の診断は、困難であり、組織の
培養の仕事を支える、高度に訓練したスタッフおよび設
備を必要とする。普通の診断は、臨床的試料を哺乳動物
細胞と培養においてインキュベージａンすることを包含
する。臨床的試料中に存在するクラミジアにより感染し
た組織培養の細胞は、特徴あるクラミジア充填封入体を
示すであろう。

次の研究者らは、トラコーマクラミジアの主要な外膜タ
ンパク質（ｍａｊｏｒ　　ｏｕｔｅｒ　　ｍｅｍｂｒａ
ｎｅ　　　ｐｒｏｔｅｉｎ）　　（ＭＯＭＰ）の研究に
おいて彼らの努力を集中している：Ｒ８Ｓ、ステフェン
ス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）、Ｇ、ムレンバッハ（Ｍｕｌｌ
ｅｎｂａｃｈ）、Ｒ，サンチェズーペスカドール（Ｓａ
ｎｃｈｅｚ−ｐｅｓｃａｄｏｒ）およびＮ、アガビアン
（Ａｇａｂｉａｎ）、ｒトラコーマクラミジア血液型亜
型り。

からの主要な外膜タンパク質遺伝子の配列の分析（Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ　　ｏｆＭａｊｏｒ
　　０ｕｔｅｒ　　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　　Ｇｅｎｅ　　ｆｒｏｍ　　Ｃｈｌａｍｄｉａ　　
ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ　　５ｅｒｏｖｏｒ　　Ｌｘ）
Ｊ、ジャーナル・オブ・バクテリオロジーＪｏｕｒｎａ
ｌ　　ｏｆ　　Ｂａｃｔｅｒｉ。

Ｉｇｙ、Ｖｏｌ、１６８、Ｎｏ、３　（１９８６）；Ｒ
，Ｓ、ステフェンス（Ｓ　ｔ　ｅ　ｐｈｅｎ　ｓ）、Ｃ
−Ｃ，クオ（Ｋｕｏ）、Ｇ、ニューボート（Ｎｅｗｐｏ
　ｒ　ｔ）およびＮ、アガビアン（Ａｇａｂｉａｎ）、
ｒ大腸菌中でトラコーマクラミジアの主要な外膜タンパ
ク質抗原の分子クローニングおよび発現（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ　　　Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ　　　ｏｆ　　　Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　　ｔｒ
ａｃｈｏｍａｔｉｓ　　　Ｍａｊｕｔｅｒ Ｍ　ｅ　ｍ　ｂ　　ｒ　　ａ　　ｎ　　ｅｒｏ　　ｔ ９８２）；Ｒ，ｓ、ステフェンス（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ）
、Ｃ，Ｊ、イノウーｎ（Ｉｎｏｕｙｅ）およびＥ、Ａ、
ウニイガ−（Ｗａｇａｒ）、「種特異的主要な外膜タン
パク質のドメイン（Ｓｐｅｃｉｅｓ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
　　Ｍａｊｏｒ　　０ｕｔｅｒ　　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　
　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　ＤｏｍＶｏｌ、４７、Ｎｏ、　　
３、７１３−７１８（１９８５）；Ｒ，Ｓ、ステフェン
ス（ＳｔｅｐｈｅｎＳ）、Ｍ、Ｒ，タム（Ｔａｍ）、Ｃ
−Ｃ，クオ（Ｋｕｏ）、およびＲ，Ｃ，ノウインスキー
（Ｎｏｗｉ　ｎ　ｓ　ｋ　ｉ）　、ｒ）ラコーマクラミ
ジアに対してモノクローナル抗体：抗体の特異性および
抗原の特徴づけ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂ
。

１ｆｉｃｉＬｉｅｓ　　　ａｎｄ　　　Ａｎｔｉｇｅｎ
Ｃｈａｒｔｅｒｉｚａｔ　１ｏｎ）Ｊ、ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ＋）、Ｖｏｌ、１
２８、Ｎ０９３、１０８３−１０８９　　（１エール（
Ｏｒｉｅりら編、ケンブリッジ大学プレス、１１０−１
１３　（１９８６）；Ｒ，Ｓ、ステフェンス（Ｓｔｅｐ
ｈｅｎｓ）、Ｒ，サンチェズーペスカドール（Ｓａｎｃ
ｈｅｚ−ｐｅｓｃａｄｏｒ）、Ｅ、Ａ、ウニイガ−（Ｗ
ａｇａｒ）、Ｃ，イノウニ（Ｉｎｏｕｙｅ）およびＭ、
Ｓ、ウルデア（Ｕｒｄｅａ）、「トラコーマクラミジア
の主要な外膜タンパク質遺伝子の多様性（Ｄ　ｉ　ｖＭ
ｅｍｂｒａｎｅ　　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　　Ｇｅｎｅ）
Ｊ、ジャーナル・オプ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃ
ｔｒｉｏｌｏｇｙ）　、　１６９．３８７９−３８８５
　（１９８７）；およびＲ，Ｓ、ステフェンス（Ｓｔｅ
ｐｈｅｎｓ）、Ｅ、Ａ、ウニイガ−（Ｗａｇａｒ）およ
びＧ、に、スクールニク（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ）、「ト
ラコーマクラミジアの主要な外膜タンパク質の血液型亜
型特異的および共通の抗原決定基の分解マツピング（Ｒ
ｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　　Ｍａｐｐｉｎｇｕ　　ｏｆ　　
５ｅｒｏｖａｒ−Ｓｐｅｓｉｆｉｃ　　ａｎｄ　　Ｃｏ
ｍｍｏｎａｎｔｉｇｅｎｉｃ　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｓｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｍａｊｏｒ　　０ｕｔｅｒ　　Ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　ｏｆ　　Ｃｈｌ
ａｍ（１９８８）　　。

米国特許第４．４２７．７８２号（Ｃａｌｄｗｅｌ＋お
よび５ｃｈａｃｔｅｒ）は、主要な外膜タンパク質およ
びトラコーマクラミジアの抗原を分離する方法を記載し
ている。

米国特許第４．１１８．４６９号（Ｃａｌｄｗｅｌ１％
ＫｕｏおよびＫｅｎｎｅｙ）は、性病性リンパ肉芽腫の
血清学的診断に有用なトラコーマクラミジア特異的抗原
を記載している。

米国特許第４，４９７，８９９号は、臨床的試料中のト
ラコーマクラミジアを検出する固相イムノアッセイを記
載している。

定義 アミノ酸の略号　　　アミノ酸 Ｄ　　　　Ａｓｐ　　　アスパラギン酸Ｎ　　　　Ａｓ
ｎ　　　アスパラギン Ｔ　　　　Ｔｈｒ　　　スレオニン Ｓ　　　　Ｓｅｒ　　　セリン Ｅ　　　　Ｇｌｕ　　　グルタミン酸 Ｑ　　　　Ｇｌｎ　　　グルタミン Ｐ　　　　Ｐｒｏ　　　プロリン Ｇ　　　　Ｇｙｌ　　　グリシン Ａ　　　　Ａｌａ　　　アラニン ＣＣｙｓ　　　システィン Ｖ　　　　Ｖａｌ　　　パリン Ｍ　　　　Ｍ　ｅ　ｔ　　　メチオニン１　　　１１ｅ
　　　イソロイシン Ｌ　　　　Ｌｅｕ　　　ロイシン Ｔ　　　　Ｔｙｒ　　　チロシン Ｆ　　　　Ｐｈｓ　　　フェニルアラニンＷ　　　　Ｔ
　ｒ　ｐ　　　トリプトファンＫ　　　　Ｌｙｓ　　　
リジン ＨＨｉｓ　　　ヒスグ・ジン ＲＡｒｇ　　　アルギニン 本発明の目的は、トラコーマクラミジアの種特異的エピ
トープに対する抗体を提供することである。

本発明の他の目的は、トラコーマクラミジアの種特異的
エピトープを提供することである。

本発明の他の目的は、トラコーマクラミジアによる感染
に対して患者を受動的に保護するための患者を処置する
組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、微生物、例えば、トラコーマクラ
ミジアの血清学的に関係する血清型の種特異的エピトー
プを同定および定義する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、トラコーマクラミジアの種特異的
エピトープを特徴づけるペプチドを提供することである
。

本発明のなお他の目的は、トラコーマクラミジア特異的
ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を検出する核酸プローブを提
供することである。

本発明の上の目的および他の目的および利点は、本発明
によって満足される。

本発明は、トラコーマクラミジアの種特異的エピトープ
に対する抗ペプチド抗体に関し、前記抗体は動物をペプ
チドに対して免疫化し、そしてこれにより産生された抗
体を分離することによって産生され、前記ペプチドは少
なくとも５つのアミノ酸を有し、前記ペプチドは次のエ
ピドーグ特異的自然配列： Ｔｈｒ−Ｖａ　Ｉ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ　−Ｉ　
　　ＩＩ　　　ＩＩＩＩＶ　　　　ＶＴｈｒ−Ｔｈｒ−
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＶＩ　　　ＶＩＩ　　Ｖｌｌ
ｌ　　ＩＸ　　　　ＸＴｈｒ−１１ｅ ＸＩ　　　　　）１１ のＩ〜ＸＩＩの配列位置を有する少なくとも４つのアミ
ノ酸から本質的に成り、ここで前記少なくとも４つのア
ミノ酸はそれらの配列位置に存在するが、お互いに隣接
する必要はなく、残りのアミノ酸は前記自然配列中に存
在するか、あるいは前記自然配列中のアミノ酸に対する
免疫原的同等体であり、前記ペプチドは自然トラコーマ
クラミジア抗原の１５より多くない連続するアミノ酸を
有する。さらに詳しくは、前記エピトープ特異的配列は
、 Ｔｈｒ−ＡＡ、−Ｐｈｅ−ＡＡ、−Ｐｒｏ−ＡＡ３ｆｌ
ｅ であり、ここでＡ　Ａ　ｒ、ＡＡ！およびＡＡＳは、そ
れぞれ、Ｖａｌ、Ａｓ　ｐ−Ｖａ　１−Ｔｈ　ｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−ＡｓｎおよびＴｈ　ｒ、またはそれらの免
疫原的同等体である。

本発明は、また、少なくとも５つ（好ましくは７つ）の
アミノ酸を有するペプチド（トラコーマクラミジアのエ
ピトープ特異的ペプチド）に関し、前記ペプチドは次の
エピトープ特異的自然配列：Ｔｈ　ｒ−Ｖａ　１−Ｐｈ
ｅ−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　ｌ　−Ｉ　　　ＩＩ　　　ｒｌｌ
ｌＶ　　　　ＶＴｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒ
ｏ−Ｖｆ　　　Ｖｌｌ　　Ｖｆｌｌ　　ＩＸ　　　　Ｘ
Ｔｈｒ−１１ｅ ＸＩ　　　　　ＸＩＩ のＩ〜ＸＩＩの配列位置を有する少なくとも４つのアミ
ノ酸から本質的に戒り、ここで前記少なくとも４つのア
ミノ酸はそれらの配列位置に存在するが、お互いに隣接
する必要はなく、残りのアミノ酸は前記自然配列中に存
在するか、あるいは前記自然配列中のアミノ酸に対する
免疫原的同等体であり、前記ペプチドは自然トラコーマ
クラミジア抗原の１５より多くない連続するアミノ酸を
有する。さらに詳しくは、エピトープ特異的配列は、Ｔ
ｈ　ｒ−Ｖａ　Ｉ−Ｐｈｅ−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　Ｉ　−Ｔ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＴｈｒＩ　　
Ｉｅ である。

本発明は、また、有効量の前記ペプチドおよび生理学的
に許容されうる希釈剤からなる、患者、例えば、温血動
物、例えば、ヒトを、トラコーマクラミジアによる感染
に対して保護する、すなわち、トラコーマクラミジアの
病気にに対して保護する、ために処置するためのワクチ
ンに関する。

本発明は、また、有効量の前記ペプチドおよび生理学的
に許容されうる希釈剤からなる組成物で、トラコーマク
ラミジアにより感染した患者、例えば、温血動物、例え
ば、ヒトを処置するための予防法に関する。

本発明は、また、工程： （１）微生物、例えば、トラコーマクラミジアの血清型
の共通のエピトープと反応する抗体を発生させ、前記抗
体を、 （ａ）動物を微生物の第１血清型またはその断片で免疫
化し、 （ｂ）前記動物を微生物の第２の明確に関連する血清型
で免疫化することによって、動物の免疫応答を促進し、 （Ｃ）微生物の異なる血清型と交差反応するモノクロー
ナル抗体および／またはポリクローナル抗体を同定し、
次いで発生させる、 ことによって発生させ、 （２）共通のエピトープの化学的構造を、（ａ）ａ生物
を産生物のタンパク質に断片化し、（ｂ）前記タンパク
質をより小さい部分に断片化し、 （Ｃ）タンパク質断片を工程（１）（ｃ）からの抗体と
反応させ、そして抗体に結合するタンパク質断片を決定
することによって、どのタンパク質が共通のエピトープ
を含有するかを確証し、（ｄ）抗体に結合するタンパク
質断片を分離し、（ｅ）工程（２）（ｄ）からの分離し
たタンパク貿断片のアミノ酸配列を決定する、 ことによって同定する、 からなる、前記共通のエピトープを同定および定める方
法に関する。

本発明は、さらに、工程： （ａ）前述の方法の工程（２）（ｅ）のアミノ酸配列を
有するペプチドを合威し、 （ｂ）前記合皮したアミノ酸配列に対して動物を免疫化
し、そして （ｃ）これにより産生された抗体を分離する、からなる
、微生物の共通のエピトープと反応性の抗体をつくる方
法に関する。

本発明は、さらに、約４５より少ないＤＮＡまたはＲＮ
Ａ塩基から本質的に成り、そして次のエピトープ特異的
配列： Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ　−Ｔｈｒ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−１ｅ の遺伝情報を指定する配列を含む、トラコーマクラミジ
ア特異的ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を検出するための核
酸プローブに関する。

本発明は、また、試料を抗ペプチド第１抗体と接触させ
、前記抗体は上に定義したトラコーマクラミジアの共通
のエピトープに対するものであり、そして試料中の抗原
への抗体の結合を決定することからなる、試験試料中の
トラコーマクラミジアを検出する方法に関する。

上の方法において、標識した形態のエピトープ特異的ペ
プチドと接触させるか、あるいは標識した形態の抗ペプ
チド抗体と接触させることによって抗原への抗体の結合
を決定することができる。

本発明は、また、工程： （ａ）トラコーマクラミジアの抗原に対してレイズされ
た、抗血清調製物、例えば、分画されたＩｇＧを、少な
くとも５つのアミノ酸を有するエピトープ特異的ペプチ
ドと接触させ、前記ペプチドは次のエピトープ特異的自
然配列： Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｔ　−Ｉ　　　
ＩＩ　　　ＩＩＩＩＶ　　　　ＶＴｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＶＩ　　　Ｖｌｌ　　ＶｒＩＩ　
　ＬＸ　　　　ＸＴｈｒ−１１ｅ ＸＩ　　　Ｘｌｌ の■〜Ｘｌｌの配列位置を有する少なくとも４つのアミ
ノ酸から本質的に戒り、ここで前記少なくとも４つのア
ミノ酸はそれらの配列位置に存在するが、お互いに隣接
する必要はなく、残りのアミノ酸は前記自然配列中に存
在するか、あるいは前記自然配列中のアミノ酸に対する
免疫原的同等体であり、前記ペプチドは自然トラコーマ
クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　ｔｒａｃｈｏｍａ
ｔｉＳ）抗原の１５より多くない連続するアミノ酸を有
し、 （ｂ）エピトープ特異的ペプチドに結合するようになる
抗体を、そのように結合しない抗体および抗血清調製物
からの他の物質から分離し、（ｃ）ペプチドへ結合する
ようになった抗体を解離し、そして （ｄ）精製し、解離した抗体を分離する、からなる、ト
ラコーマクラミジアの共通のエピトープに対するポリク
ローナル抗体を免疫精製する方法に関する。

本発明は、さらに、工程： （ａ）試料をトラコーマクラミジアに対する第１抗体と
接触させ、そして試料からの抗原が前記第１抗体に結合
するようになるかどうかを決定することによって、試料
についてトラコーマクラミジアのアッセイを実施し、そ
して （ｂ）前記第１抗体を、工程（ａ）におけるのと実質的
に同一の条件下に、エピトープ特異的ペプチドと接触さ
せ、そして前記ペプチドが前記第１抗体Ｊこ結合するよ
うになるかどうかを検出することによって、対照反応を
実施する、 からなり、 前記ペプチドは、少なくとも５つのアミノ酸を有し、そ
して次のエピトープ特異的自然配列：Ｔｈｒ−Ｖａｔ−
Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｔ　−１’　　　ＩＩ　　　ＩＩ
Ｉ　　ＩＶ　　　　ＶＴｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−ＶＩ　　　ＶＩＩ　　ＶＩＩＩ　　ＩＸ　　
　　ＸＴｈｒ−１ｉｅ ＸＩ　　　Ｘｌｌ の■〜Ｘｌｌの配列位置を有する少なくとも４つのアミ
ノ酸から本質的に成り、ここで前記少なくとも４つのア
ミノ酸はそれらの配列位置に存在するが、お互いに隣接
する必要はなく、残りのアミノ酸は前記自然配列中に存
在するか、あるいは前記自然配列中のアミノ酸に対する
免疫原的同等体である、エピトープ特異的ペプチド試料
中のトラコーマクラミジアを検出するアッセイ法の適切
な実施をアッセイする方法に関する。

試料中のトラコーマクラミジアを検出するアッセイ法の
適切な実施をアッセイする前述の方法の好ましい実施態
様において、工程（ａ）において抗体へ結合するように
なるトラコーマクラミジアの抗原の決定は、トラコーマ
クラミジアの抗原へ結合できる第２抗体を添加し、前記
抗体はシグナル生成部分で標識されており、そして第１
抗体と関連するようになるシグナルを検出することによ
って達成される。

試料中のトラコーマクラミジアを検出するアッセイ法の
適切な実施をアッセイする前述の方法のさらに好ましい
実施態様において、ペプチドを第２抗体と同一のシグナ
ル生成部分で標識し、そして工程（ｂ）をこのような工
程（ｂ）において使用した第１抗体と関連するようにな
ったシグナルを検出することによって完結する。

試料中のトラコーマクラミジアを検出するアッセイ法の
適切な実施をアッセイする前述の方法のさらに好ましい
実施態様において、多数のペプチドを一緒に結合して、
多価のペプチドを形成し、そして工程（ｂ）は標識した
第２抗体を添加し、そしてこのような工程（ｂ）におい
て使用した第１抗体と関連するようになったシグナルを
検出することによって完結する。

トラコーマクラミジアのＭＯＭＰ抗原は、すべての既知
の血液型亜型の間で共通の領域を有することが、今回、
決定された。このエピトープ特異的ペプチド領域は、 Ｔｈｒ−ＡＡ、−Ｐｈｅ−ＡＡ２−Ｐｒｏ−ＡＡｓ　　
Ｉ　Ｉ　ｅ から本質的に成り、ここでＡＡ、〜ＡＡ、はＭＯＭＰの
タンパク質配列中に存在するアミノ酸またはアミノ酸配
列であり、すなわち、ＡＡＩはＶａｌであり、ＡＡＩは
Ａｓ　ｐ−Ｖａ　ｌ　−Ｔｈ　ｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎであり、そしてＡＡ、はＴｈｒである。しかしなが
ら、このような共通のエピトープに対する抗体を発生さ
せる目的で、上の式％式％ みが重要であり、それゆえＡＡ、、ＡＡ、およびＡＡ、
は、独立に、正常ＭＯＭＰ配列に免疫原的に同等である
アミノ酸であることができることが、こうして、さらに
決定された。このような同等のアミノ酸またはアミノ酸
配列は、実験的に決定され、そして共通のエピトープに
ついてそれにに対して発生した抗体の特異性を実質的に
変更しない、アミノ酸置換により特徴づけられるであろ
う。特異性を変更しないが、ある種の置換は、実際に、
よりすぐれた性質、例えば、共通のエピトープに対する
より高い親和性を有する抗体の発生を生ずるであろう。

上の式はエピトープ特異的抗体を産生するために使用し
ｌ；ペプチドの最小大きさを示すが、免疫化使用したペ
プチドは、ＭＯＭＰの配列に全体または一部が対応する
か、あるいはそうでないことができる、フランキングア
ミノ酸配列含むことができる。通常、ペプチドの全長は
約１５アミノ酸を越えず、より好ましくは約８単位より
少ないであろう。

本発明のペプチドは、次のように調製することができる
： （１）合成手段、すなわち、アミノ酸の合成により調製
されたペプチド、 （２）で消化してまたは切断により調製されたペプチド
、 （３）組み換え体ＤＮＡ技術により発現されたペプチド
。

本発明による合成ペプチドに関すると、ペプチドの化学
的合成は次の刊行物に記載されている：Ｓ、Ｂ、Ｈ，ケ
ント（Ｋｅｎｔ）、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　　Ｐｏｌｙ
ｍｅｒｓｓ　Ｅ、Ｐ、ゴールドバーブ（Ｇｏｌｄｂｅｒ
ｇ）およびＡ、ナヵジマ（Ｎａｋａｊ　ｉｍａ）Ｉｌｌ
、（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１ニューヨーク）、２
１３−２４２　（１９８０）；Ａ、Ｒ，ミッチェル（Ｍ
ｉｔｃｈｅｌｌ）　、Ｓ、Ｂ、Ｈ，ケント（Ｋｅ　ｎ　
ｔ）　、Ｍ、　エンゲルハルト（Ｅｎｇｅ　Ｉ　ｈａ　
ｒｄ）およびＲｏＢ、メリフィールド（ｍｅｒｒｉｆｊ
ｅｌｄ）、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミスト
リー（Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、）Ｎ　土１．２８４５−
２８５２　（１９７８）；Ｊ、Ｐ、タム（Ｔ　ａ　ｍ）
、Ｔ、−Ｗ、ウォング（Ｗｏ　ｎ　ｇ）　、Ｍ、リーメ
ン（Ｒｉ　ｅｍｅｎ）　、Ｆ、−Ｓ、ジョング（Ｔ　ｊ
　。

ｎｇ）およびＲ，Ｂ、メリフィールド（ｍｅｒｒｉｆｉ
ｅｌｄ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、４０３３−４０３６　
（１９７９，）ｉｓ、モジョソウ（Ｍｏ　ｊ　５ｏｖ）
、Ａ、Ｒ，ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅ　ｌ　ｌ）および
Ｒ，Ｂ、メリフィールド（ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、ジ
ャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、Ｏ
ｒｇ、Ｃｈｅｍ、）、４５．５５５−５６０（１９８０
）；Ｊ、Ｐ、タム（Ｔａｍ）　、Ｒ，Ｄ、ジマルチ（Ｄ
ｉＭａｒｃｈｉ）およびＲ，Ｂ、メリフィールド（ｍｅ
ｒｒｔｆｉｅｌｄ）、テトラヘドロン・レターズ（工ｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２８５１
−２８５４　（１９８１）；およびＳ、Ｂ、Ｈ。

ケント（Ｋｅｎｔ）、Ｍ、　リーメン（Ｒｉｅｍｅｎ）
、Ｍ、し・ドゥクス（Ｌｅ　　Ｄｏｕｘ）およびＲ，Ｂ
、メリフィールド（ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｅｎ　　Ｐｒｅ
ｓｓ）ニューヨーク州プルックヘブン、刊行中、１９８
１゜ メリフィールドの固相手順において、Ｌ−アミノ酸の適
当な配列をカルボキシ末端アミノ酸にアミノ末端アミン
に構成する。樹脂のクロロメチル基、ベンズヒドリルア
ミン基、または他の反応性基への化学結合を経てポリス
チレン（または他の適当な）樹脂へ結合した適当なカル
ボキシ末端アミノ酸を使用して出発して、アミノ酸を次
の手順により１つずつ付加する。ペプチド−樹脂を、（
ａ）塩化メチレンで洗浄し、 （ｂ）室温において１０分間塩化メチレン中の５％（Ｖ
／Ｖ）のジイソプロピルエチルアミン（または他のヒン
ダード塩基）と混合することによって中和し、 （ｃ）塩化メチレンで洗浄し、 （ｄ）生長するペプチド鎖のモル量の６倍に等しい量の
アミノ酸を、半分のモル量のカーポジイミド（例えば、
ジシクロへキシルカーポジイミド、またはジイソプロピ
ルカーポジイミド）と１０分間０°Ｃにおいて一緒にし
て、アミノ酸の対称無水物を形成することによってアミ
ノ酸を活性化する。

使用するアミノ酸は、本来、Ｎ−アルファーｔｅｒ【−
ブチルオキシカルボニル誘導体として準備すべきであり
、側鎖はベンジルエステル（例えば、アスパラギン酸ま
たはグルタミン酸）、ベンジルエーテル（例えば、セリ
ン、スレオニン、システィンまたはチロシン）、ベンジ
ルオキシカルボニルいて普通に使用される他の保護基で
保護されており、 （ｅ）活性化したアミノ酸をペプ・チドー樹脂と２時間
室温において反応させて、新しいアミノ酸を生長するペ
プチド鎖へ付加させ、 （ｆ）ペプチド−樹脂を塩化メチレンで洗浄し、（ｇ）
Ｎ−アルファー（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）
基を最も最近付加したアミノ酸から、塩化メチレン中の
３０〜６５％、好ましくは５０％（Ｖ／Ｖ）のトリフル
オロ酢酸と１０〜３０分間室温において反応させること
によって除去し、 （ｈ）ペプチド−樹脂を塩化メチレンで洗浄し、（ｉ）
要求されるペプチド配列が構成されてしまうまで、工程
（ａ）〜（ｈ）を反復する。

次いで、ペプチドを樹脂から除去し、そして同時に側鎖
の保護基を、１０％（Ｖ／Ｖ）のアニソールまたは他の
適当な（芳香族）スカベンジャーを含有する無水塩酸と
の反応により除去する。引き続いて、ペプチドはゲル濾
過、イオン交換、高圧液体クロマトグラフィー、または
他の適当な手段により精製することができる。

ある場合において、化学的杏或は、固相樹脂を使用しな
いで、実施することができ、この場合において合成反応
は完全に溶液中で実施する。反応は同様であり、この分
野においてよく知られており、そして最終生成物は本質
的に同一である。

ペプチドの消化はタンパク質加水分解酵素、ことにアミ
ノ酸の所望の配列にすぐに隣接する部位においてポリペ
プチドを特異的に切断する基質をもつ酵素を使用して達
成することができる。

ペプチドの切断は化学的手段により達成することができ
る。アミノ酸間の特定の結合は、特定の試薬との反応に
より切断することができる。例は次のものを包含する：
メチオニンを含む結合は臭化シアンにより切断する；ア
スパラギニル−グリシン結合はヒドロキシルアミンによ
り切断する。

また、アミノ酸の所望の配列の遺伝情報を指定する、自
然源からのＤＮＡまたは合成手順またはそれらの組み合
わせにより調製したＤＮＡの小さい部分をクローニング
して、バクテリア、または他の細胞によりペプチドを産
生することが可能である。

必要に応じて、本発明の合成ペプチドは、次の部分を結
合してを有することができる：ポリペプチド、ポリアミ
ノ酸、多糖類、ポリアミドまたはポリアクリルアミド、
これらは安定化鎖として、あるいは個々の鎖のアミノ酸
間の架橋として働く。

このような鎖は商業的に入手可能であるか、あるいはポ
リアミノ酸の場合において、次の工程からなる方法によ
り形成される：所望のアミノ酸配列の溶液をアミノ酸の
Ｎ−カルボキシ無水物と混合し、そして塩基触媒重合を
起こし、これはペプチドのアミン基により開始される。

適当な動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒトなど
をエピトープ特異的ペプチドに対して普通の方法により
免疫化することができる。ペプチドは十分な大きさおよ
び特性をもつが、それは免疫原それ自体としてはたらく
。しかしながら、多くの場合において、ペプチドを免疫
原担体に結合して免疫原接合体を形成することが必要で
あるか、あるいは望ましいであろう。

「免疫原担体」は、単に生理学的に許容されうる塊であ
り、これに合成ペプチドを取り付け、そしてこれは免疫
応答を増強することが期待される。

担体は単にアミノ酸の鎖または他の部分からなることが
でき、そしてその目的で、担体として、本発明の合成ペ
プチドを定めるアミノ酸の配列の二量体、オリゴマー、
または高分子量のポリマーを使用することが特別に考え
られる。換言すると、合成ペプチドを形成するために所
望のアミノ酸配列が決定されると、これらのアミノ酸は
自然に入手可能な物質からまたは合成的に形成すること
ができ、そして重合して、反復する配列が「担体」およ
び合成ペプチドの両者として働くように、２またはそれ
以上の反復単位の鎖を構成することができる。換言する
と、独立の担体は必要ではない。

あるいは、追加のアミノ酸を、合成ペプチドを定めるア
ミノ酸鎖の１つまたは両方の端に付加することができる
。別の担体はある物質、動物、植物または鉱物物質から
なり、これは生理学的に許容されることができ、そして
合成ペプチドを表す機能をもつので、宿主の免疫系によ
り認識され、そして満足な免疫応答を刺激する。こうし
て、広範な種類の担体が考えられ、そしてこれらは不活
性であり、生物学的活性を有しおよび／または免疫応答
を促進する物質を包含する。例えば、タンパク質は担体
として使用することができる。タンパク質の担体の例は
、テタヌストキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ−ｔｏｘｏｉｄ
）、キーホールリンベットのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏ
ｌｅ　　ｌｉｍｐｅｔ　　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウ
シ血清アルブミンなどを包含す、る。

多糖類は、また、担体として考えられ、そしてこれらは
ほことに分子量ｉｏ、ｏｏｏ−ｉ、ｏｏｏ。

０００のもの、例えば、澱粉、デキストラン、アガロー
ス、フィコールまたはそのカルボキシメチル誘導体およ
びカルボキシメチルセルロースを包含する。

ポリアミノ酸は、また、担体として使用するために考え
られ、そしてこれらのポリアミノ酸は、なかでも、ポリ
リジン、ポリアラニルポリリジン、ポリグルタミン酸、
ポリアスパラギン酸およびポリ（Ｃ！　　ＣＩ＋）アミ
ノ酸を包含する。

有機ポリマーを担体として使用することができ、そして
これらのポリマーは、例えば、アミン、アミド、オレヂ
ン、ビニル、エステル、アセタール、ポリアミド、カー
ボネートおよびエーテルなどのポリマーおよびコポリマ
ーを包含する。一般に、これらのポリマーの分子量は劇
的に変化するであろう。ポリマーは２つの反復単位から
数千までの反復単位、例えば、２，０００の反復単位を
有することができる。もちろん、反復単位の数は宿主動
物におけるワクチンの使用と一致するであろう。

一般に、このようなポリマーは低い分子量、例えば、ｉ
ｏ、ｏｏｏ−ｔｏｏ、ｏｏｏを有するであろう（分子量
は超遠心により決定される）。

無機ポリマーを、また、使用することができる。

これらの無機ポリマーは、有機部分を含有する無機ポリ
マーであることができる。とくに、ケイ酸塩および水酸
化アルミニウムを担体として使用することができる。担
体は免疫学的アジュバントであるものが好ましい。この
ような場合において、アジュバントはムラミルジペプチ
ドまたはその類似体であることが特に考えられる。

担体は、また、複数の合成ペプチド含有鎖を相互に接続
するために使用する架橋剤の残基であることができる。

それらの架橋剤は、官能基として、アルデヒド（例えば
、グルタルアルデヒド）、カルボキシル、アミン、アミ
ド、イミドまたはアジドフェニル基を有する。とくに、
架橋剤として、ブチルアルデヒド、二価のイミドまたは
カーポジイミドの使用が考えられる。とくに考えられる
二価のイミドエステルは、式 ％式％ ） 式中、ｍは１〜１３であり、モしてＲは１〜４個の炭素
原子のアルキル基である、 のものである。架橋剤として特に考えられるカーポジイ
ミドは、シクロへキシルカーポジイミド、エチルジメチ
ルアミノプロピルカーポジイミド、Ｎ−エチルモリホリ
ノシクロへキシルカーポジイミドおよびジイソプロピル
カーポジイミドを包含する。

担体は要求されないが、担体を使用するとき、「担体ｊ
上の１または２以上の鎖の取り付け（ｄｅｐｏｓ　ｉ　
ｔ　１ｏｎ）は次のようにして実施することができる： １、タンパク質の担体：タンパク質および合成ペプチド
を一緒に水または他の適当な溶媒中に溶解し、モしてカ
ーポジイミドの作用により形成するアミドを介して共有
結合する。得られる生成物はタンパク質モノマー当たり
ｌまたは２以上のコピーを含有することができる。ある
いは、還元した（ｒｅｄｕｃｅｄ）ペプチドをスルフヒ
ドリル基を含有する担体に加えてジサルファイド結合を
形成することができる。なお他の方法は、還元したペプ
チドをマレイミジル基を含有するタンパク質担体に加え
て、ミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ）付加または他の共有取
り付は手段により、共有結合を形成することを包含する
。

２、多糖類の担体：オリゴ糖は１，０００−１゜ｏｏｏ
、ｏｏｏの範囲の分子量を有する。これらの合成ペプチ
ド共有結合するために、適当な官能基をまずそれに取り
付けなくてはならない。カルボキシル基は、ヨウド酢酸
と反応させてカルボキシメチル化多糖類を形成するか、
あるいはカルボニルジイミダゾールと反応させて活性化
カルボニルエステルを形成することによって、導入する
ことができる。カルボキシメチル多糖類はペプチドに、
カーポジイミド反応により結合するが、活性化カルボニ
ルエステルは自発的に反応する。合成ペプチドの多数の
コピーをオリゴ糖の単位へ取り付ける。

３、ポリアミノ酸の担体：これらの担体は１゜０００−
１．０００．ｏｏＯの範囲の分子量を有する。ポリリジ
ンおよびポリオルニチンはそれらの側鎖に第一アミノ基
を有する；ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸
はカルボキシル基を有する。ペプチドはこれらにアミド
結合を介してカーポジイミド反応により結合することが
できる。

カップリングのためのアミノ基を提供する他の担体は、
リジン側鎖に取り付けることができるポリアラニンであ
る。合成ペプチドは、また、ポリアラニンに端に、また
、カーポジイミド反応により取り付けることができる。

合成ペプチドの多数のコピーを、オリゴペプチド単位へ
取り付ける。

本発明により実現される合成ワクチンは、天然に存在す
るＭＯＭＰタンパク質トラコーマクラミジアの不存在に
より特徴づけられる。

本発明のペプチドは、「中和する抗体」、すなわち、ト
ラコーマクラミジアに対して患者を保護する抗体、を形
成することができるようなものである。したがって、本
発明は、また、感染するトラコーマクラミジアに対して
患者を保護する方法に関する。

本発明によるワクチンの活性成分は、生理学的に許容さ
れうる希釈剤（媒質）、例えば、リン酸塩緩衝液ととも
に使用することができる。

ワクチンは皮下、皮肉または筋肉内注射により投与する
ことができる。好ましい道筋は特定のワクチンに依存す
るが、筋肉内注射は一般に適当である。投与の頻度はワ
クチンに依存して変化するであろう。一般に、ワクチン
は２回の投与で１月の間隔で投与し、次いで６月〜ｌ午
に促進剤を投与する。引き続く投与量または促進剤は、
最初の免疫化の結果としての血液中の抗体のレベルに依
存し、そしである場合において、不必要であることがあ
る。

本発明のペプチドは、また、宿主細胞の表面上の受容体
への有機体の結合を遮断するための予防法において使用
することができる。

本発明によるモノクローナル抗体を発生させるために、
動物、例えば、マウスを前述のペプチドで、好ましくは
担体、例えば、キーホールリンペットのヘモシアニン（
ｋｅｙｈｏｌｅ　　Ｉｉｍｐｅｔ　　ｈｅｍｏｃｙａま
たはウシ血清アルブミンとともに、免疫化する。次いで
、モノクローナル抗体は、Ｇ、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ
）およびＣ０ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）のアプ
ローチ−５１９（１９７６）］により発生させる。さら
に詳しくは、リンパ球、例えば、免疫化したマウスの牌
細胞を骨髄腫細胞、例えば、マウス骨髄腫細胞と融合し
て、雑種−骨髄腫クローン（ハイブリドーマ）を形成す
る。ハイブリドーマの各々はモノクローナル抗体を分泌
する。ハイブリドーマは、好ましくは「マウス−マウス
」融合、すなわち、マウス（ネズミ）牌細胞およびマウ
ス（ネズミ）骨髄腫細胞により形成され、培養し、そし
て抗トラコーマクラミジア抗体の産生についてスクリー
ニングする。スクリーニングは、標準のミクロ免疫蛍光
アッセイにより達成することができる。

本発明は、試料を前述した抗ペプチド抗体と接触させ、
そして試料中の抗原への抗ペプチド抗体の結合を決定す
る工程からなる、試験試料中のトラコーマクラミジアを
検出する方法に関する。

上の方法において、抗ペプチド抗体および第２抗体は、
お互いに独立に、ポリクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体であることができる。

上の方法において、抗ペプチド抗体を固体の支持体上に
固定化することができる。

上の方法において、試料中の抗原への抗ペプチド抗体の
結合は、標識にた形態の前述のエピトープ特異的ペプチ
ドと接触させるか、あるいは標識した形態の抗ペプチド
抗体使用することによって、決定することができる。

本発明は、また、前述の方法を実施するためのキットに
関する。

１つのキットは、次の１または２以上の容器からなる： （ａ）上に定義したトラコーマクラミジアの共通のエピ
トープに対する抗ペプチド第１抗体、および （ｂ）標識した第２抗体、第２抗体はトラコーマクラミ
ジア抗原へ結合することができる。

他のキットは、次の１または２以上の容器からなる： （ａ）上に定義したトラコーマクラミジアの共通のエピ
トープに対する抗ペプチド抗体、および（ｂ）トラコー
マクラミジアのエピトープ特異的ペプチドの８Ｉ識した
形態。

上の方法およびキットにおいて、標識は、放射線標識、
峰素、色素、蛍光部分、ビオチン−アビジン、またはこ
の分野において使用される他の標識であることができる
。

上の方法およびキットにおいて、トラコーマクラミジア
の共通のエピトープに対する抗体は固体の支持体上に固
定化することができる。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

実施例 実施例１ クラミジアの培養および精製 トラコーマクラミジア　Ｌ！／４３４ＢｕおよびＣ／１
ｗ−３１０ｔの分離物をＨｅＬａ２２９細胞中で、Ｃ，
−Ｃ，クオ（Ｋ　ｕ　ｏ　）　、Ｓ　、Ｐ　−ウォング
（Ｗｏｎｇ）およびＪ、Ｔ、グアイストン（Ｇｒａｙｓ
ｔｏｎ）の方法［ｒＨｅＬａ２９９細胞培養におけるト
ラコーマ有機体の増殖（Ｇｒｏｗｔｈ　　ｏｆ　　ｔｒ
ａｃｈｏｍａ　　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　　ｉｎ　　Ｈｅ
Ｌａ　　２９９　　Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅ）Ｊ、非淋
菌性尿道炎および関ｏｎ）およびに、に、ホルメス（Ｈ
ｏ　１ｍｅ　ｓ）編、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　５ｏｃｉｅ
ｔｙ　　ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｃｏｌｏｇｙｓワシントン
　Ｄ。

Ｃ３゜３２８−３３６］に従い、培養した。簡単に述べ
ると、トラコーマクラミジア濃縮接種物をＳＰＧ緩１１
液（，０，２モルのスクロース３ミリモルのに２ＨＰＯ
い８−５モルのＮ　ａ　２ＨＰ　０４％　５　。

６ミリモルのＬ−グルタミン酸）中で希釈し、そして２
．５ｍＱの希釈しｔ；接種物を全面生長のＨｅＬａ単層
９単層を含有する１５０ｃｍ”の組織培養フラスコの各
々に適用し、これから組織は接種物の添加前に除去され
ている。Ｃ血清型の場合において、接種物の添加前に、
ＨｅＬａ単層をｌ０ｍ＋２の３０ｐｇ／ｍ（ｌのＤＥＡ
Ｅ−デキストランを含有するハンクスの均等化塩溶液（
ＨＢＳＳ）、）Ｈ７，Ｏ［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）、スウェーデン国つプサラ１で３７６０におい
て３３分間予備処理した。デキストラン溶液を除去し、
単層をｌｏｍＱのＨＢＳＳで１回洗浄し、次いで接種物
を前述したように適用した。接種したフラスコの各々を
ロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）のプラットホーム上に配置し
、そして室温において２時間震盪した。次いで、接種物
を各フラスコから吸引により除去し、そして１０％の胎
児仔ウシ血清、２ミリモルのＬ−グルタミン、０．２ｎ
ｇ／ｍＱのバンコマイシンおよび１１００ｐ／ｍ１２の
ストレプトマイシンを含有する５０ｍＱのダルベツコ変
性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｏ　ＳＭｏｄｉｆｉ
ｅｄ　　Ｅａｇｌｅｓ　　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ；
Ｈａｚｅ　］　ｔｏｎ、米国ペンシルベニア州デンバー
）と置換した。フラスコを５％のＣＯ３雰囲気中で３７
℃においてインキュベーションした。１６時間インキュ
ベーションした後、エメチンを培地にｌμｇ／ｍＱの濃
度に添加した。次いで、感染した培養物を周期的に次の
２４〜３６時間にわたり、細胞封入体内の基本小体（Ｅ
　Ｂ）について検査した。典型的には、基本小体の産生
は感染後はぼ４２時間でピークに到達し、そのとき基本
小体を収穫した。基本小体の収穫は、まず培地を組織培
養フラスコから除去し、それを１０ｍ１２の氷冷ＰＢＳ
（５０ミリモルのＮａ、ＨＰＯ，Ｓ　１５０ミリモルの
ＮａＣｌ、ｐＨ７，４）と置換した。付着性ＨｅＬａ！
ｍ胞をフラスコの表面から無菌ガラスピーズをフラスコ
の各々に添加し、そしてフラスコを傾けるなどして、ビ
ーズを単層の上に転がし、それをフラスコ表面から除去
することによって除去した。次いで、ＰＢＳを除去し、
そしてこの手順を新鮮なｌｏｍＱのアリコートのＰＢＳ
で反復した。次いで、プールした細胞懸濁液を合計３０
の個々の１回のバーストで５０％の電力レベルで超音波
処理した（Ｂ　ｒ　ａ　ｎ　ｓｏｎ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｄ
ｉｓｒｕｐｔｏｒ　　２００Ｓｏｎｉｆ　ｉｅｒ、Ｍｉ
ｃｒｏｔ　ｉｐ　　超音波処理装置プローブ）。超音波
処理した懸濁液を１０００×ｇで１０分間遠心して細胞
破片を除去した。

上澄み液を１５．０００Ｘｇで６０分間再遠心して基本
小体を沈澱させた。沈澱物をＨＢＳＳ中に再懸濁させ、
モしてＨ，Ｄ、カルドウエル（ＣａＩｄｗｅ　ｌ　Ｉ）
、Ｊ、クロムホウト（Ｋｒｏｍｈｏｕｔ）およびＪ、シ
ャヒター（Ｓｃｈａｕｃｈｔ　ｅ　ｒ）　、ｒトラコー
マクラミジアの主要な外膜タンパク質（ｔｈｅ　　Ｍａ
ｊｏｒ　　ｏｕｔｅｒＭｅｍｂｒａｎｅ　　Ｐｒｏｔ、
ｅｉｎ　　ｏｆ　　Ｃｈ７６（１９８１）に記載されて
いるように、レノゲラフィン（Ｒｅｎｏｇｒａｆ　ｉｎ
）工程の勾配に適用した。勾配を１８．ＯＯＯＲＰＭで
６０分間５ｗ−２８［ベックマン（Ｂ　ｅ　ｃ　ｋｍａ
　ｎ）、米国カル７オルニア州カールスパツド］スイン
グ・パケット・ローター内で遠心した。基本小体は、４
４％〜５４％のレノゲラフィン界面にバンドを有し、取
り出し、ＨＢＳＳ中で３×に希釈し、そして２０．ＯＯ
ＯＸｇで３５分間遠心した。基本小体を含有する沈澱物
を凍結による貯蔵のためＳＰＧ中に再懸濁した。

実施例２ クラミジアの外膜複合体 精製した基本小体（１０１０〜ｌＯ目）をＳＰＧ貯蔵媒
質から遠心により取り出し、そして沈澱を１％のナトリ
ウムラウロイルサルコシン（「サルコシル（Ｓａｒｋｏ
ｓｙｌ）Ｊ）を含有する５ｍａのＰＢＳ（５０ミリモル
のリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４，０，１５モルのＮａ
ＣＩ）中で抽出した。次いで、抽出物を１００．０００
Ｘｇで４５分間２０℃において遠心した。サルコシル不
溶性沈澱は、外膜複合体を含有しく　ｒｃＯＭｃＪ　　
；Ｃａｌｄｗｅｌｌ、Ｋｏｒｍｈｏｕｔおよび５ｃｈａ
ｃｈｔｅｒ、５ｕｐｒａ）、これをＰＢＳ中に懸濁した
。

実施例３ ハイブリドーマの調製 生後６〜８週のＢａ１ｂ　　Ｃ／ＢＹＪ？ウス（Ｊａｃ
ｋｓｏｎ　　Ｌａｂｓ、米国メイン州バールハーバー）
の各々を、５０％（ｖ　／　ｖ　）フロイント完全アジ
ュバント中で３３μｇの血清Ｎｔ−ｘで皮下的に免疫化
した。融合日前、マウスの各々をＰＢＳ中のエタノール
固定した血清型Ｃの基本小体の２０μｇで静脈内に促進
し、モして１０１ｇの血清型Ｃ基本小体で腹腔内に促進
した。ある実験において、マウスの各々をさらに免疫化
し、−次の３０日後、ＰＢＳおよび５０％（Ｖ／Ｖ）の
７０インド不完全アジユバント中の２０μｇの血清型り
、ＣＯＭＧを腹腔内に投与した。

ハイブリドーマは、免疫化したマウスの牌細胞をＰ３−
Ｘ６３ＡＧ８　（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬｌ　５８０）（
ＡＴＣＣ）と、Ｇ、コーラ−（Ｋ。

ｈｌｅｒ）およびＣ，ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
）、「曲風て規定した特異性の抗体を分泌する融合した
細胞の連続的培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅｓ　　ｏｆ　　ＦｕｓｅｄＣｅｌｌｓ　　Ｓｅｃ
ｒｅｔｉｎｇ　　Ａｎｔｉｂ。

ｄｙ　　　ｏｆ　　　Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ　　　５ｐ
ｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）Ｊ、ネイチａｒ　−（Ｎａ　ｔ　
ｕ　ｒ　ｅ）、２５６．４９５−４９７　（１９７５）
の方法により融合させて発生させ、そして２０％の胎児
仔ウシ血清、２ミリモルのＬ−グルタミン、１００単位
／ｍＱのペニシリン、１００μｇ／ｍＱのストレプトマ
イシンおよびＨＡＴ（１０””ミリモルのナトリウムハ
イポキサンチン、４０１ｐモルのアミノプテリンおよび
１．６１ミリモルのチミジン）を補充したＲＰＭｌ　　
１６４０中で培養した。

ハイブリドーマの上澄み液を酵素結合免疫吸収アッセイ
　［ＥＬＩＳＡ；Ｅ、Ｐ、Ｐｅｒ　Ｉｍａｎｎ、ｒＥｎ
ｚｙｍｅ　　Ｌｊｎｋｅｄ　　Ｉｍｍｕｎｏ　　５ｏｂ
ｅｎｔ　　Ａｓ５ａｙ　（ＥＬＩＳＡ）、Ｑｕａｎｔｉ
ｔａｔｉｖｅ　　Ａｓ５ａｙ　　ｏｆＩｍｍｕｎｏｇｌ
ｏｂｕｌｕｍ　　Ｇ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　　Ｃｈｅｍ、
、８．８２１　（１９７１）］の方法によりアッセイし
て、抗クラミジア抗体を検出した。ＥＬ　Ｉ　ＳＡ抗原
はＣ０ＭＣ懸濁液（実施ｆ１２参照）を１％のドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１０ミリモルのジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）に調節し、そして３７℃におい
て３０分間インキュベーションすることによって調製し
た。次いで、可溶化したＣＯＭＧを１／１０容積の５０
０ミリモルのヨードアセトイミドの添加によりアルカリ
性とし、そして室温において３０分間インキュベーショ
ンした。アルカリ性にした物質を、０１％のドデシル硫
酸ナトリウムおよび１ミリモルのジチオスレイトールを
含有するＰＢＳ、　ｐＨ７，４、中で７７５−１Ｏ０ｐ
／ｍ（１の最終濃度に希釈し［０，Ｈ，Ｌｏｗｒｙ、Ｎ
。

Ｊ、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、Ａ、Ｌ、ＦａｒｒおよびＲ
，Ｊ、Ｒａｎｄａｌｌ、”ＰｒｏｔｅｉｎＭｅａｓｕｒ
ｅｍｅｎｔｏ　　Ｗｉｔｈ　　ｔｈｅＦｏｌｉｎ　　Ｒ
ｅａｇｅｎｔ”、ジャーナル・（１９５１）］　そして
この原ＥＬ　Ｉ　ＳＡ抗原を１００ｐ（ｌのアリコート
でシリコン化管中に一８０℃において貯蔵した。ハイブ
リドーマのスクリーニングの前日に、原ＥＬ　Ｉ　ＳＡ
抗原をＰＢＳ、ｐＨ７，４、中で１：１００に希釈し、
そしてマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ　　
Ｉ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に１００μＱ／ウエルで塗布の
ため適用した。プレートを４℃において１６〜２０時間
インキュベージＢンした。塗布溶液を除去し、そしてプ
レートを２００μα／ウエルのＰＢＳＴ　（ＰＢＳ、ｐ
Ｈ７，４，０，０５％の「ツイーン−２０」を含有する
）＋１％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ　　Ｆｒａ
ｃｔｉｏｎ　　Ｖ　　ＲＩＡ等級）で室温において４５
分間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、そ
して１００μＣのハイグリドーマからの培地を細胞に添
加した。グレートを室温において１時間インキュベーシ
ョンして、抗クラミジア抗体を固定化したｃ。

ＭＣ抗原に結合させた。無菌のハイブリドーマ培地を陰
性の対照として使用し、そして融合プロセスにおける使
用した免疫化マウスからの血清を陽性の対照として使用
した。次いで、プレートを２００　ｐＱ　／ウェルのＰ
ＢＳＴで５回洗浄し、ウェルの各々を６０分間抗（マウ
スＩｇＧ）（重鎮および軽鎖特異的、Ｃａｐｐｅｌ　　
Ｉａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国ペンシルベニア州マル
ベルン）抗体と１％のウシ血清アルブミンを含有するＰ
ＢＳＴ中でｉ：ｓｏｏの希釈においてインキュベーショ
ンした。プレートを前述したように６回洗浄し、結合し
た抗体をウェルの各々を１５０μａの酵素基質（Ｋｏｄ
ａｋ、米国ニューヨーク州ロチェスター）、４０ｒｒｌ
の３０％の過酸化水素（Ｍａｌ　１１ｎｋｒｏｄｔ、米
国ミゾリー州セントルイス）（！：、１００ｍ（２の２
５ミリモルのクエン酸、５０ミリモルのリン酸ナトリウ
ム、ｐＨ５，０゜中でインキュベーションすることによ
り検出した。

プレートを基質とともに室温においてミニ−オービタル
（ｍｉｎｉ−ｏｒｂｉｔａｌ）震盪機（Ｂｅｌｌｏ、米
国ヌージャージイ州パイランド）上で１５分間インキュ
ベーションし、そしてウェルの各々に５０μαの８モル
のＨｔ　Ｓ　Ｏ４を添加して反応を停止させた。ウェル
の各々吸収を４９２０ｍにおいてタイターチク（Ｔｉｔ
ｅｒｔｅｋ）（Ｆｌｏｗ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、米国バージニア州マクリーン）分光光度計で決定した
。

陽性のＥＬＩＳＡの結果を与えるハイブリドーマを制限
希釈によりクローニングし、そしてクローンを前述した
ようにＥＬ　Ｉ　ＳＡによりＣ０ＭＣ抗原との反応性に
ついて再試験しｌ；。次いで、陽性のクローンを腹水と
して増殖し、これを０．５ｍＱのブリスタン（Ｐｒｉｓ
ｔａｎｅ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ライスコンシン州ミ
ルウオーキー）ノ注射でブライミングしたＢａ１ｂ　　
Ｃ／ＢＹＪマウス内で増殖させ、次いで１０日後、１０
’ハイブリドーマ／細胞動物で腹腔内に注射した。腹水
および精製したＩｇＧ（実施例５）をミクロ免疫蛍光ア
ッセイにおいてアッセイした。すべての１５のトラコー
マクラミジア血清型と反応した、ある数のモノクローナ
ル抗体を同定した。これらの抗体の１つ、以後種特異的
モノクローナル抗体（ｒ−ＳＳＭＡＢ−ＩＪまたはｒＳ
ＳＭ−ＩＪ　と呼ぶ、を選択して、下の実験における種
特異的抗原を同定した。

ＳＳＭＡＢ−１はトラコーマクラミジアの種特異的モノ
クローナル抗体であり、２つの広く発散する血液型亜型
の間で共有されるエピトープの選択的認識に向かう、マ
ウスの免疫系を検出する方法によって産生された。ＳＳ
ＭＡＢ類はＥＬＩＳＡおよびミクロ免疫蛍光（ＭＩＦ）
アッセイにおけるスクリーニングにより同定された。モ
ノクローナル抗体は、Ｂ−複合体のＬ２血清型の全トラ
コーマクラミジアの外膜（ｃｏＭＣ）でマウスを免疫化
することによって調製した。マウスをＣ−ｃｘ分離物、
Ｃ血液型亜型の固定した基本小体で促進した。Ｂ細胞を
Ｂ−複合体抗原決定基に対して増感し、次いでＢ細胞の
増殖を刺激する方法は、発生した４つの雑種細胞系、そ
れらの１つは「ＳＳＭＡＢ−ＩＪ　　（分泌種特異的モ
ノクローナル抗体）と表示する、Ｃ−複合体で促進する
ことにより、共有された決定基について使用した。

東盈旦亙 マウス腹水からのＴｇＧの精製 モノクローナル抗体ＳＳＭＡＢ類１を、プロティンＡ−
セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

米国カリフォルニア州すッチモンド）カラムの親和クロ
マトグラフィーにより精製した。ＳＳＭＡＢ−１腹水を
２５００Ｘｇで１０分間遠心し、そして上澄み液を０．
１４モルのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，０中で１
０倍に希釈した。希釈した腹水を、同一の緩衝液と平衡
化したプロティンＡ−セファローズのカラムに適用した
。通過する流れを２８０ｎｍにおいてウビコード（Ｕｖ
ｉｃｏｒｄ）（ＬＫＢ　　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

米国ヌージャージイ州）モニターで決定し、そして通過
する流れの吸収が０．０１になるまでカラムを洗浄した
。結合した免疫グロブリンを０９１モルのクエン酸ナト
リウム、ｐＨ４，０、で溶離し、ＨＣＩで中和し、そし
て４℃において０．　１モルのホウ酸ナトリウム緩衝液
、ｐＨ８，０、ｌ：＝対して透析した。次いで、溶離の
ピークの分画をドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリル
アミドゲルの電気泳動［５ＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｕ、に、Ｌ
ａｅｍｍｌｉ、ｒバクテリオ７アージＴ４のヘッドのア
センブリーの間の構造タンパク質の切断」、ネイチャー
　（Ｎａ　ｔ　ｕ　ｒｅ）　　（ロンドン）、２２７．
６８０−６８５　（１９７０）］により純度について分
析し、そして抗原結合活性をＥＬ　Ｉ　ＳＡにより分析
した。次いで、この精製したＩｇＧを凍結乾燥し、そし
てさらに使用するまで、−２０℃において貯蔵した。

２００〜５００μｇの血清型り、ＣＯＭＧを、タンパク
質に対して１００〜５００モル過剰の臭化シアン（ＣＮ
Ｂｒ）を含有する７０％のギ酸中Ｊこ溶解した。消化は
密閉した管内で室温において２０時間実施し、次いで３
７℃において窒素の流れの下でほぼ乾固まで蒸発させた
。消化物を２回蒸留水で洗浄し、そして窒素下に乾燥し
た。

実施例７ 逆相ＨＰＬＣによる臭化シアン発生したペプチドの精製 乾燥した臭化シアン消化物を０．０５％のトリフルオロ
酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）中に再懸濁し、そしてシンクロバッ
ク（Ｓｙｎｃ　ｒｏｐａｃｋ）ＲＰ−ｇ逆相ＨＰＬＣカ
ラム（４，１ｍｍｌｍｍＸ１Ｏ上に注入した。０．０５
％のトリフルオロ酢酸〜ｌＯＯ％のアセトニトリル中の
０．０５％のトリフルオロ酢酸の勾配を、１２０分の期
間にわたり１ｍＱ１分の流速で展開した。溶離液を２１
０ｎｍにおいて０．５の全目盛りの吸収で監視した。溶
離のプロフィルを第１Ａ図に示す。全体の溶離液を集め
、そしてピークの分画の一部および出発物質の試料をウ
ェスタン・プロットによりＳＳＭＡＢ−１との反応性に
ついて分析した。溶離した分画のウェスタン・プロット
分析は、ピーク分画（第１Ａ図のインセット上に１およ
び２で示す）が免疫反応性であり、そして出発物質中に
見られる免疫反応性物質（第１Ａ図のウェスタン・プロ
ットのインサートの一番右のレーンとして示す）に対応
することを明らかにした。ＨＰ　Ｌ　Ｃの溶離のプロフ
ィルにおける免疫反応性の位置は、第１Ａ図において矢
印で示されている。主要な免疫反応性の分画（分画１）
を真空乾燥し、２０ミリモルのＮａＨ，ＰＯいｐＨ７、
中に再懸濁し、そして前述のシンクロパックＲＰ−カラ
ム上に注入した。

２０ミリモルのＮａＨ２ＰＯ，から５０％のアセト・ニ
トリルを含有する２０ミリモルのＮＩＬＨ，ＰＯ。

の勾配を、６０分にわたり１ｒｒｌ／分の流速で展開し
た。溶離液を０．２５全目盛りの吸収で２１Ｏｎｍにお
いて監視した。この再度クロマトグラフィーにかけた免
疫反応性の物質の溶離のプロフィルを第１ＢＩ！ｌに示
す。すべての分画を集め、そしてピーク分画の各々の一
部をウェスタン・プロットによりＳＳＭＡＢ−１との反
応性について分析した（実施例８）。第１Ｂ図に示す結
果から明らかなように、単一の免疫反応性のピーク（第
１Ｂ図のウェスタン・プロットのインセットにおいて矢
印で示す）が得られた。ＨＰＬＣの溶離のプロフィルに
おける、この免疫反応性の分画の位置を、第１Ｂ図にお
いて矢印で示す。第１Ｂ図のインセット中に示される免
疫反応性の物質の相対的移動度は、予備着色した分子量
の標準（第１Ｂ図のウェスタン・プロットの７ランキン
グで示す）の相対的移動度との比較により、６Ｋｄであ
ると計算された。この免疫反応性の物質を含有する分画
の残りを、分析してアミノ酸配列を決定した（実施例９
）。

同定 ＨＰＬＣのピーク分画の各々の小さい部分を、ドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）試料緩衝液に溶解した。

試料を５分間沸騰させ、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥにより
分離した。ペプチドをニトロセルロース紙（ＮＣＰ、０
．２μｍの孔大きさ、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　　ａｎｄ
　　５ｃｈｕｅｌｌ、米国ニューハングシャイヤー州ケ
ーネ）にＴＧＭ緩衝液（２５ミリモルのトリス、１２５
ミリモルのグリシン、２０％のメタノール）中において
０．６アンペアの電流で４°Ｃにおいて１．５時間）移
した。ＮＣＰを３％のウシ血清アルブミンを含有するＰ
ＢＳ中で４５分間ブロッキングし、次いでＰＢＳ＋ウン
血清アルブミン中でｌ　：　５００に希釈したＳＳＭＡ
Ｂ−１と室温において１〜２時間インキュベーションし
た。ＮＣＰをＰＢＳ中で３回洗浄し、そして１％のウシ
血清アルブミンを含有するＰＢＤＴ中でｌ：５００に希
釈した、ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗（マウスＩｇＧ）
（重鎮および軽鎖特異的；Ｃａｐｐｅｌ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅＳ）と室温において１時間インキュベーシ
ョンした。種特異的エピトープを含有するペプチドは、
ＮＣＰをペルオキシダーゼ基質（６０ｍｇの４−クロロ
−■−す７トール、６０μＱの３０％のＨ，Ｏ，，２０
ｍ、Ｑのメタノールおよび１００ｍ（２のＰＢＳ）と室
温において３０分間インキュベーションしｔ；後、可視
となった。

実施例９ 種特異的臭化シアンペプチドのアミノ末端アミノ酸の配
列決定 第１Ｂ図に示す免疫反応性の分画を真空乾燥し、０．１
４４モルのＮ　ａ　Ｈ！Ｐ０４％　Ｉ）　Ｈ７、Ｏｓ中
に懸濁し、そして３ｍｇのポリプレンおよび０．２ｍｇ
のＮａＣｌが添加されている、予備循環したフィルター
へ適用した。試料をアプライド・バイオシステムス（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（米国カリ７
オルニア州７オスターシテイー）４７０Ａ型タンパク質
配列決定装置で、標準のエドマン化学および２５％のト
リフルオロ酢酸の変換サイクル（サイクル０３ＣＰＴＨ
）を使用して配列決定した。ＰＴＨ−アミノ酸の同定は
、オンライのアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１２０Ａ型ＰＴＨア
ナライザイでペン・システムス（Ｐ　ｅ　ｎｓｙｓｔｅ
ｍｓ）（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、米国カリフォルニア州）
２６００型のクロマトグラフィーのソフトウェアを使用
して実施した。次ぎの配列が得られた、０．８７ピコモ
ル（ｐｍｏ＋）の初期のカップリングおよび９５．４％
の反復収率：Ｘ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｘ−Ｖ
ａｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａｌａ−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｘ　−Ａ
ｌａ Ｘで示すいくつかの残基は、高いパックグラウンドまた
はその特定のアミノ酸の低い収率のために、同定されな
かった。この部分的アミノ酸配列を、存在するり、ＭＯ
ＭＰアミノ酸配列のデータ［Ｒ、Ｓ、５ｔｅｐｈｅｓ１
Ｇ、Ｍｕｌ　ＩｅｎｂａｃｈＳ　Ｒ，５ａｎｃｈｅｚ−
ＰｅｓｃａｄｏｒおよびＮ、Ａｇａｂｉａｎ、ｒトラコ
ーマクラミジア血液型亜型り、からの主要な外膜タンパ
ク質遺伝８．１２７７−１２８２　（１９８６）］　と
比較して、Ｌ、ＭＯＭＰ内の種特異的臭化シアン誘導ペ
プチドを整列させた。この比較により、種特異的エピト
ープは、Ｌ、ＭＯＭＰの一部分内にＭｅｔ残基により境
界されて成熟り、ＭＯＭＰのアミノ酸位！！２６２およ
び３２０に存在することが示された。

実施例１０ ペプチドの合皮 免疫反応性臭化シアン誘導ペグチド断片内の種特異的エ
ピトープをより正確に探すために、ＭＯＭＰの２６２〜
３２０アミノ酸残基領域を重複する方法でカバーする、
ｌ系列のペプチドを合皮した。ペプチドはアプライド・
バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）４３０Ａペプチド合或装置で合皮した。カルボ
キシ末端アミノ酸を樹脂にフェニルアセトアミドメチル
結合で０．７ミリモル／ｇ樹脂の置換で結合した。典型
的には、０．５ミリモルのペプチドが合皮ごとに産生さ
れた。、Ｎ−末端ｔ−ＢＯＣをジクロロメタン（ＤＣＭ
）中の６０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、
そしてアル７アーアミンをジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）中の１０％のジイソプロピルエチルアミンで中和し
た。ｔ−ＢＯＣアミノ酸（２ミリモル）を、２ｍＱのジ
クロロメタン中の１ミリモルのジシクロへキシルカーポ
ジイミドの添加により転化して、対称無水物を予備生成
した。ｔ−ＢＯＣアミノ酸の側鎖は、次のように保護し
た：Ａｒｇ　（ＴＯ３）、Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）Ｃｙｓ
（４−ＣＨＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、Ｈｉｓ　（
ＴＯ５）、Ｌｙｓ　（ＣＩ−Ｚ）　、Ｓｅ　ｔ　（Ｂｚ
　Ｉ）　、Ｔｈ　ｒ　（Ｂｚ　１）およびＴｙｒ　（Ｂ
ｒ−Ｚ）ｏ　　ｔ−ＢＯＣアミノ酸、Ａｌａ、Ａｓｎ５
ＧｉｎＳｃ＋ｙ、Ｉｌｅ、ＬｅｕＳＭｅ　ｔ、Ｐｈｅ、
Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＶａｌは保護しなかった。ｔ−Ｂ
ＯＣ−Ｌ−Ｈｉ　５（ＴＯ５）のジシクロヘキシルアミ
ン塩は、ＡＧ−５０−Ｘ８　（Ｈ＋）樹脂（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ、米国カリフォルニア州すッチモンド）のイオン交
換により１時間のカップリング以内に、遊離アミノ酸に
転化された。ｔ−ＢＯＣアミノ酸Ａｓｎ、Ａｒ　ｇ　ｓ
　およびＧｉｎ（２ミリモル）を、２ミリモルのＨＯＢ
ｔおよび２ミリモルのＮ、Ｎ’　−ジシクロへキシルカ
ーポジイミド（ＤＣＣ）の添加により予備形成したヒド
ロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢｔ）活性エステルを
使用してカッブリ・ングした。Ｎ−末端ｔ−ＢＯＣを完
成したペプチドから除去し、そしてペプチド樹脂を一夜
真空乾燥した。

ペプチドを、１０％のアニソールを含有する無水ＨＦで
ＯｏＣにおいて６０分間処理することによって、完全に
脱保護しかつ樹脂から切断した。樹脂を酢酸エチルで洗
浄し、そしてペプチドを樹脂から１．ＯＮの酢酸で抽出
した。抽出物液体Ｎ２中で凍結乾燥し、そして使用する
まで−２０９０において貯蔵した。

粗製ペプチドをＯ，１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
中に再懸濁し、そしてアルテックス（Ａｌ　ｔｅｘ）Ｃ
−１８［ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）、米国カリフォ
ルニア州カールスパッド］、５ミクロン、４．ｌｍｍＸ
２５ｃｍのカラムにより精製した。調製量のペプチド（
１００ｍｇ）をダイナマクス（Ｄｙｎａｍａｘ）（Ｒａ
　Ｉｎ　ｉｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国マサチュセ
ッツ州つォボー７）Ｃ−１８（２，５Ｘ２５ｃｍ）カラ
ムでｙ！４製した。溶媒ＡはＯ，１％のトリフルオロ酢
酸であり、そして溶媒Ｂは０．１％のトリフルオロ酢酸
、５０％のアセトニトリルであった。

溶媒Ａから溶媒Ｂへの１００分の勾配は直線であった。

溶離液を２８０ｎｍにおいて監視し、そしてピークの分
画を集め、１８時間加水分解した後、アミノ酸分析によ
り分析した（ミリポア／ウォーターズＷＩＳ０　７１０
Ｂアミノ酸分析装置）。

ペプチドの各々アミノ酸配列は、アプライド・バイオシ
ステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓ、ｙｓｔｅｍｓ
）４７０Ａ型タンパク質配列決定装置および標準のエド
マン化学を使用して確証した。

この方法により合皮したペプチド後完全なリストを下表
１に記載する。

表　　　Ｌ 群 ＣＮＢｒ　ＭＯＭＰペプチド ＭＯＭＰ　　２９１−２９６ ＴＶＦＤＶＴＹＣ なし ＭＯＭＰ　　２９１−３０２ ＴＶＦＤＶＴＴＬＮＰＴＩＹＣ あり ＭＯＭＰ　　９Ｇ４Ｃ ＴＶＦＤＶＴＴＬＮＧＴＩＹＣ なし 実施例Ｌｌ 合成ペプチドへ種特異的モノクローナル抗体ＳＳＭＡＢ
−１が結合する能力を、競合イムノアッセイを使用して
決定した。この研究において使用したペプチドは、チロ
シルシスティン類を使用してそれらのカルボキシ末端に
おいて合成して、化学的カップリング（システィン類に
よる）および溶液中のペプチドの精確なモル定量（２７
４，６ｎｍにおけるチロシンのモル吸光係数を使用する
）の両者を促進した。

定量のため、ｍｇ量の精製した合成ペプチドを１０分間
３７°Ｃに１ｍ１２の容積のＰＢＳ−ｒツイーンＪ　　
（０，１５モルのＮａＣｌ、７ミリモルのＮ　ａ　ｚＨ
Ｐ　０４　：　７　ＨｚＯ１３ミリモルのＮａＨ３ＰＯ
４：　Ｈ，Ｏ，ｐ）（’７．４　；　０．０５％の「ツ
イーン−２０」）中で加温し、１５分間超音波処理しく
Ｂｒａｎｓｏｎ　　Ｂ３２超音水浴）そして２分間遠心
した（Ｂｅｃｋｍａｎ　　ｕｌｒｒａｆｕｇｅ　１１）
。上澄み液の各々の光学密度を２４゜５ｎｍにおいて決
定し、そして溶解したペプチドの各々のモル濃度をその
波長におけるチロシンのモル吸光係数から計算した。ペ
プチド溶液の各々をＰＢＳ−ｒツイーン」で５０μモル
の出発濃度の希釈した。９４倍の系統的希釈をＰＢＳ−
ｒツイーン」で実施して、ある範囲のペプチド濃度を得
てアッセイした。

この系列の各ペプチド希釈物の２００μａのアリコート
を、シラン化ガラス管内に配置した。１゜０−１０の間
の４９２ｎｍにおけるＥＬＩＳＡのシグナルをそれ自体
で与えるように前もって決定した希釈において、１％の
ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ−ｒツイーン」中
の、等しい体積のＳＳＭＡＢ−１を添加した。これらの
管を周囲温度において一夜震盪した（Ｍｉｎｉ　　０ｒ
ｂｉｔａｌ　　５ｈａｋｅｒ、Ｂｅ１ｌｃｏ）。

各ペプチド−５ＳＭＡＢ−１混合物の反復実験の試料を
、Ｌ　！　　ＣＯＭ　ＣＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ抗原テ前も
って被覆したＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートに、ｌｏｏｍａ／
ウェルで配置した。次いで、ＥＬＩＳＡを実施例４にお
けるように実施した。合成ペプチドが種特異的エピトー
プを含有する場合、それはプレートへ吸着したＣ０ＭＣ
へＳＳＭＡＢ−１が結合するのを阻害するであろう。合
成ペプチドへのＳＳＭＡＢ−１の結合は、対照（合成ペ
プチドの不存在下のＣＯＭＧへのＳＳＭＡＢ−１の結合
能力）と比較して、４９２ｎｍにおける吸収の減少百分
率として表した。このフォーマットにおけるＥＬＩＳＡ
のシグナルを有意に減少することができるペプチドを表
１に示す。

阻害ＥＬ　Ｉ　ＳＡの結果は、ＳＳＭＡＢ−１により認
識される種特異的エピトープは、成熟Ｌ２ＭＯＭＰのア
ミノ酸残基２９１−３０２により定められる、次の配列
から成ることを示した：ＴＶＦＤＶＴＴＬＮＰＴ１．こ
のエピトープの外側の境界は、位置２９１におけるＴｈ
ｒ残基（Ｔ）により、そして位Ｒ３０２においてＩｌｅ
残基（１）により定められる。なぜなら、このペプチド
からのこれらの残基のいずれの省略も（表１、群５およ
びまた第２図参照）ペプチドのＳＳＭＡＢ−１へ結合す
る能力を排除したからである。２９１−３０２領域内の
選択した残基においてＧＩｙｆｆｉＥ換を含有する、２
つの他のペプチド（群７、表１および第３図参照）は、
位置２９３におけるＰｒ。

のＧｌｙよる置換か、あるいは位置３００におけるＰｒ
ｏ残基のｃｒｙによる置換が、ＳＳＭＡＢ−１に結合す
るペプチドの能力を壊滅させることを示した。この結果
が示すように、このペプチドのＰｈｅおよびＰｒｏ残基
は種特異的エピトープ抗体ＳＳＭＡＢ−１の為の重要な
認識要素である。

プチドの使用 配列ＴＶＦＤＶＴＴＬＮＰＴＩ　ＹＣ（実施例１１）の
合成ペプチドを、種特異的抗クラミジア抗体の産生にお
いて使用した。合成ペプチドをカルボキシ末端システィ
ンを経てキーホールリンベットのヘモシアニン（ｋｅｙ
ｈｏｌｅ　　Ｉｉｍｐｅｔ　　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）
（ＫＬＨＳＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（米国カル７オルニ
ア州ラジヨラ）に、ヘテロ２官能性試薬ｍ−マレイミド
ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホンスクシンイミド（
Ｓ−ＭＢＳ；Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、米国
イリノイ州ロック７オード）を使用してカップリングし
た。ＫＬＨ（６０ｍｇ／ｍＱ、５０ミリモルのＮａＨ，
ＰＯ，，１０２９モルのＥＤＴＡ。

ｐＨ７，０）を使用して、グリセロールおよび他の低分
子量の汚染物質を除去した。ＫＬＨを含有する空隙の分
画を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）（米国マサチュセッツ
州ダンバース）の正圧濃縮装置を使用してほぼ５０ｍｇ
／ｍＩ２に濃縮した。

５−ＭＢＳをＫＬＨに１００：１の５−ＭＢＳ：ＫＬＨ
のモル比で添加して、ＫＬＨについて１０ｏ、ｏｏｏダ
ルトンの分子量を推定した。周囲温度において３０分後
、遊離の５−ＭＢＳをｓ　−ＭＢＳ−ＫＬＨ付加物から
前述したようにゲル濾過により分離した。ｓ　−Ｍ　Ｂ
　Ｓ　−Ｋ　Ｌ　Ｈを含有する空隙の分画を添加して、
２０：ｌのペプチド対ＫＬＨのモル比でペプチドを乾燥
した。、接合反応を室温において４時間後に完結し、そ
してペプチド−ｓ−ＭＢＳ−ＫＬＨ接合体を、さらに使
用するまで、−２０’Ｏにおいて貯蔵した。

−次免疫原をペプチド−ｓ−ＭＢＳ−ＫＬＨ接合体を等
しい体積のフロイント完全アジュバント（Ｇｉｂｃｏ１
米国ニューヨーク州グランドアイランド）で乳化してζ
２ｍｇの接合体７ｍ（ｌの乳濁液の最終濃度を生皮する
ことによって調製した。

雌のＮＺＷウサギを、免疫化の計画の開始直前に採血し
て、免疫前の血清を得た。ウサギに２ｍｇの前述したよ
うに調製したＫＬＨ−ペプチド接合体の一次皮肉注射を
、背中に沿ってほぼ２０部位に分布させて、投与した。

４週後、５０％のフロインド不完全アジュバント中の２
ｍｇのＫＬＨ−ペプチド接合体で同一の方法でウサギを
促進した。

２週後、１．０ｍＱのＰＢＳ（５０ミリモルのＮａ　Ｈ
ＨＰ　Ｏイ１０ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ７゜４）中の
４００μｇのＫＬＨ−ペプチド接合体の最後の静脈内促
進剤を投与した。１０日後、ウサギを耳の静脈から採血
し、そして血清を集めた。

マウスの各々をＰＢＳおよび７０インド完全アジユバン
トの５０　：　５０　（Ｖ／Ｖ）混合物の５０μα中の
ＫＬＨ−ペプチドの５０μｇで足を経て免疫化した。１
月後、各マウスをＰＢＳ　：　７０インド不完全アジユ
バントの５０　：　５０　（ｖ／ｖ）混合物の５０μα
中の５０μｇのＫＬＨ−ペプチドで腹腔的注入により促
進した。３日後、免疫血清を採取し、そしてマウスをハ
イブリドーマの産生のために使用した。次の４つの技術
を選択して、これらの抗血清とクラミジア抗原との反応
性について評価した： （１）ＣＯＭＣＥＬＩＳＡ抗体を結合する能力の分析、 （２）トラコーマクラミジアをウェスタン・プロットす
る能力、 （３）生体内でトラコーマクラミジアを結合する能力、
および （４）ミクロ免疫蛍光（ＭＩＦ）によるトラコーマクラ
ミジア血清型を検出する能力。これらの４つの技術を、
次の４つの実施例に記載する。

東（四１Ｌユ 性の評価 実施例１２従い調製した、ウサギおよびマウスの抗血清
を、１％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳＴ中で
系統的に希釈し、そして標準のＥＬＩＳＡ（実施例４）
により血清型り、Ｃ０ＭＣとの反応性について分析した
。対照の目的で、２つの種特異的モノクローナル抗体（
ＳＳＭＡＢ−１およびＳＳＭＡＢ−２）からの腹水をま
た希釈し、そして同一プレート上でこのＥＬＩＳＡにお
いて使用した。結果（第４図）が示すように、合成ペプ
チドで免疫化すると、ウサギおよびマウスのために両者
は天然に存在するＣ０ＭＣ抗体に対する抗体を高い力価
で産生した。

次いで、ウサギからのポリクローナル抗ペプチド抗血清
を、合成ペプチドのセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
）カラムで親和性精製した。ペプチドをセファローズに
ヘキサンジアミン、５−ＭＢ５リンカ−を介してカップ
リングした。簡単に述べると、１モルの炭酸ナトリウム
、Ｉ）Ｈｌｌ−９、中のセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）ＣＬ−４Ｂの２５％（Ｖ／Ｖ）のスラリーの４０
０ｍＱを、５ｇのＣＮＢｒ　（４ｍ１２のアセトニトリ
ル中で）活性化した。０°Ｃにおいて２分後、セファロ
ーズを焼結ガラスの漏斗で濾過し、１．０１２の氷冷Ｈ
ＩＯで洗浄し、次いで１．ＯＱのリン酸塩−クエン酸塩
緩衝液（ＰＣＢ；４部の０．２モルのＮａ１ＨＰＯａ：
　１部の０．１モルのクエン酸）で洗浄した。充填した
樹脂を１００ｍ１＋の２０ｇのヘキサンジアミンを含有
するＰＣＢ中に再懸濁し、そして室温において２時間反
応させた。ヘキサンジアミン樹脂をＨＩＯでよく洗浄し
た。樹脂を２０ミリモルのＮａＨ，ＰＯい　ｌＯミリモ
ルのＥＤＴＡ、ｐＨ７，０（Ｐ−ＥＤＴＡ）中に再懸濁
し、そして２μモルの５−ＭＢ５を１ｍ１２の樹脂につ
き添加した。１０分後、樹脂をＰ−ＥＤＴＡで洗浄シ、
そして２〜６μモルのペプチドを１ｍｇの樹脂につき添
加した。０℃において一夜カツブリングした後、樹脂を
Ｐ−ＥＤＴＡでよく洗浄した。

ペプチド−特異的抗体の精製を次のように実施した。１
ｍ１２の血清を、２ｍｇの前述の親和性樹脂を含有する
充填したカラムに適用した。溶離液を２８０ｎｍ（２，
０ＡＵＰＳ）におイテ監視した。カラムを０．２モルの
トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０で通過する流れが＜０．０
ＩＡＵＦＳとなるまで洗浄し、次いで結合した免疫グミ
ゾリンを１゜ＯＮの酢酸で溶離した。溶離液を直ちに１
．０モルのトリスで洗浄し、そして０．１モルのホウ酸
ナトリウム、ｐＨ８，０，０２％のアジ化ナトリウムを
含有する１ミリモルのＥＤＴＡ中に透析した。抗体はさ
らに使用するまで４℃において貯蔵した。

この親和性精製したウサギ抗ペプチド抗体は、そのＡ２
８０における吸収により定量し、そして実施例４に記載
するように血清型り、ＣＯＭＣＥＬＩＳＡ抗原への結合
についてアッセイした。

精製した抗ペプチド抗体の相対的親和性は、精製した種
特異的モノクローナル抗体ＳＳＭＡＢ−１のそれより大
きいことが示された。なぜなら、等しい抗体濃度におい
て、親和性精製したウサギ抗ペプチド抗体はＥＬＩＳＡ
アッセイにおいてほぼ１０倍大きいシグナルを生皮した
からである（第５図）。

実施例１５ ０フト ５００ｍ＋２における１、１ｍｇの精製した血清型Ｌ２
２部小体（実施例１参照）を等しい体積の可溶化緩衝液
（１２５ミ！Ｊモルのトリス、ｐＨ６゜８、ｌＯミリモ
ルのＥＤＴＡ、１５％のＳＤＳ。

２０％のスクロースおよび１０％のメルカプトエタノー
ル）と−緒にし、そして５分間沸騰させた後、１０−１
５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した（実施例８）。

ニトロセルロース（ＮＣ）紙への移送はＴＭＧ緩衝液（
実施例８）中で６０ｖで一夜実施した。ニトロセルロー
ス紙を２時間１％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢ
ＳＴ中でブロッキングした。ＳＳＭＡＢ−１，ポリクロ
ーナル免疫血清および対照血清を、ブロッキングしｔ；
フィルターのストリップと２時間、第６図に示す希釈度
で、インキュベーションした。

フィルターのストリップを、３部５分間ＴＰＳＴ（１０
ミリモルのトリス、ｐＨ８，１５０ミリモルのＮａＣｌ
、０．０５％の「ツイーン−２０」）中で洗浄した。抗
（マウスＩｇＧ）および抗（ウサギ１ｇＧ）（Ｆｃ領域
特異的；Ｃａｐｐｅ　ＩＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米
国ペンシルベニア州マルベルン）アルカリ性ホスファタ
ーゼ接合体を、ＴＰＳＴ中で１：７５００の希釈で１時
間のインキュベーションの間使用した。洗浄を上に示し
たように実施した。フィルターのストリップに結合した
抗体を、アルカリ性ホスファターゼ基質にストリップを
暴露した後、視的に検出した。前記基質は、１０ｍＱの
アルカリ性リン酸塩緩衝液（１００ミリモルのトリス−
ＨＣｌ５　ｐＨ９，５，１００ミリモルのＮａＣＩおよ
び５ミリモルのＭｇＣ１□）中の６６μａのニトロブル
ーテトラゾリウム（５０ｍｇ／ｒｒｌ　ＤＭＦ）および
３３ｍＱの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホ
スフェート（５０ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉ　Ｄ　Ｍ　Ｆ　）
から構成されていｔ；。第６図に示す結果から明らかな
ように、マウスおよびウサギ抗ペプチド抗血清はＭＯＭ
Ｐと特異的に反応した。マウスおよびウサギの免疫前の
血清はいずれもこのアッセイにおいてクラミジア抗原と
結合しなかった。

実施例１５ ラミシア検出 ＨｅＬａ２２９細胞を、単層として、直径１ｃｍの円形
ガラスカバースリップ上で全面生長に増殖させた。次い
で、これらの単層（はぼ２×ｌＯ′細胞／カバースリツ
プ）Ｌ１基本小体で感染させた（実施例１）。感染後２
４時間に、単層を５０ミリモルのリン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７，４，１５０ミリモルのＮａＣ１（ＰＢＳ）でおだ
やかに洗浄した。洗浄液を吸引し、そして単層を１００
％のエタノールで４℃において一夜固定した。固定した
単層を１ｍ（２のＰＢＳで水和した。単層の各々の上に
３５μＱの一次抗体を横たえた。これらの−次抗体は、
ＰＢＳ中でｌ：１（）またはｌ：１００に希釈したウサ
ギ抗ペプチド抗血清およびマウス抗ペプチド抗血清、Ｐ
ＢＳ中で１：１０に希釈したウサギまたはマウスの免疫
前の血清、およびＰＢＳ中でｌ：１０またはｌ　：　１
００に希釈したＳＳＭＡＢ−１抗体から戊っていた。単
層を一次抗体と３７°Ｃにおいて３０分間湿った環境に
おいてインキュベーションし、ＰＢＳ中ですすび、次い
で３５μＱのヤギ抗（ウサギＩｇＧ）−ＦＩＴＣ（フル
オレセインイソチオシアネート）またはウサギ抗（マウ
スＩｇＧ）−ＦＩＴＣ（重鎮および軽鎖特異的；Ｃａｐ
ｐｌｅ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のいずれかを０
．０２％のエバンスブルー（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を対比染
色として含有するＰＢＳ中のｌ：１００希釈でオーバー
レイした。

単層を二次抗体と３０分間湿った環境においてインキュ
ベーションし、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで蒸留水で洗浄
し、そいて顕微鏡のスライド上でに５０％（ｖ／ｖ）の
グリセロールを含有する１０μＱのトリス、ｐＨ１３，
０，とともに倒立して取り付けた。着色した封入体は４
００×の倍率でツアイス（Ｚｅｉｓｓ）（Ｔｈｏｒｎｗ
ｏｏｄ１米国ニューヨーク州）蛍光顕微鏡で可視化し、
そして「エフタフローム（ＥＫＴＡＣＨＲＯＭＥ）Ｊ４
００”　　（Ｋｏｄａｋ、米国ニューヨーク州ロチェス
ター）フィルムで写真撮影した。

第７図の結果が示すように、ウサギ（第７図、パネルＩ
Ａ）およびマウス（第７図、パネルＢ）抗ペプチド抗体
は感染したＨｅＬａ細胞内のクラミジア封入体を着色す
ることができる。この実験におけるＳＳＭＡＢ−１，陽
性の対照はこの封入体を同様に着色する（第７図、Ｃ）
が、対照マウス血清（正常ウサギ血清、第７図、パネル
Ｄ；正常マウス血清；ｎｍ特異的マウスモノクローナル
）のすべては着色することができなかった。

実施例１６ 抗ペプチドポリクローナル抗体についてのミクロ免疫蛍
光試験 種々のウサギ抗ペプチド抗体と種々のトラコーマクラミ
ジア血清型との反応性のパターンを検査するために、こ
の抗体およびＳＳＭ’ＡＢ−１のアリコートをミクロ免
疫蛍光試験した［Ｓ、−Ｐ。

つオング（ンＷｏ　ｎ　ｇ）　、Ｃ−Ｃ，クノ（Ｋｕｎ
Ｏ）、Ｊ、Ｔ、グアイソン（Ｇｒａｙｓｏｎ）、「トラ
コーマ−封入体結膜炎−性病性リンパ肉芽腫有機体の免
疫学的タイピングの簡素化された方法（Ａ　　Ｓｉｍｐ
ｌｉｆｉｅｄ　　Ｍｅｔｈｏｄｆｏｒ　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　　Ｔｙｐｉｎｇ　　ｏｆ　　Ｔｒａｃ
ｈｏｍａ−１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　　Ｃｏｎｊｕｃｔｉｖ
ｔｉｓｉ−Ｌｙｍｐｈｏｇｒａｎｕｌ、ｏｍａ　　Ｖｅ
ｎｅｒｅｕｍ　　０ｒ３５６−３６０　（１９７３）］
。下表２の示す結果から理解されるように、ウサギ抗ペ
プチド抗体は、前に種特異的反応性を決定した陽性の対
照ＳＳＭＡＢ−ｌと同様に、トラコーマクラミジアと種
特異的方法で反応した。

この明細書および特許請求の範囲は例示を目的とし、そ
して限定を目的とせず、そして種々の変更および変化は
本発明の精神および範囲を逸脱しないで可能であること
が明らかであろう。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、　　ｌ−ラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
　　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の共通のエピトープを特
徴づけ、少なくとも５つのアミノ酸を有するエピトープ
特異的ペプチドであって、前記ペプチドは次のエピトー
プ特異的自然配列：Ｔｈｒ−Ｖａｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−
Ｖａｌ　−Ｉ　　　ＩＩ　　　ＩＩＩＩＶ　　　　ＶＴ
ｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＶＩ　　　Ｖ
ｌｌ　　ＶＩＩＩ　　ＬＸ　　　　ＸＴｈｒ−１１ｅ ＸＩ　　　Ｘｌｌ の■〜Ｘｌｌの配列位置を有する少なくとも４つのアミ
ノ酸から本質的に成り、ここで前記少なくとも４つのア
ミノ酸はそれらの配列位置に存在するが、お互いに隣接
する必要はなく、残りのアミノ酸は前記自然配列中に存
在するか、あるいは前記自然配列中のアミノ酸に対する
免疫原的同等体であり、前記ペプチドは自然トラコーマ
クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　ｔｒａｃｈｏｍａ
ｔｉＳ）抗原の１５より多くない連続するアミノ酸を有
することを特徴とする、エピトープ特異的ペプチド。

２、前記エピトープ特異的配列は、 Ｔｈ　ｒ−ＡＡ、−Ｐｈｅ−ＡＡＩ−Ｐｒｏ−ＡＡ。

Ｉｌｅ であり、ここでＡ　Ａ　ｒ、ＡＡ、およびＡＡ３は、そ
れぞれ、Ｖａｌ、Ａｓ　ｐ−Ｖａ　１−Ｔｈ　ｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−ＡｓｎおよびＴｈｒ、またはそれらの免疫
原的同等体である、上記第１項記載のペプチド。

３、前記エピトープ特異的配列は、 Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ　−Ｔｈｒ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−１ｅ である、上記第１項記載のペプチド。

４、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　ｔ
ｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の共通のエピトープに対する抗
ペプチド抗体であって、前記抗体は上記第１〜３項のい
ずれかに記載のペプチドに対して動物を免疫化すること
によって産生されたものである、抗ペプチド抗体。

５、有効量の上記第４項記載の抗体および生理学的に許
容されうる希釈剤からなる、トラコーマクラミジア（Ｃ
ｈｌａｍｙｄｉａ　　ｔｒａｃｈ。

ｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）による感染に対して患者を受動的に
保護するための組成物。

６、有効量の上記第１〜３項のいずれかに記載のペプチ
ドおよび生理学的に許容されうる希釈剤からなる、トラ
コーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　ｔｒａｃｈ
ｏｍａｔｉｓ）のワクチン。

７、工程： （ａ）トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　
ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）抗原に対してレイズされた（
ｒａｉｓｅｄ）抗血清調製物を、上記載１〜３項のいず
れかに記載のエピトープ特異的ペプチドと接触させる、 からなる、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
　　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の共通のエピトープに対
するポリクローナル抗体を免疫精製する方法。

８、前記抗血清ｍＩｌ物は分画したＩｇＧである、上記
第７項記載の方法。

９、工程： （ａ）前記抗血清１ｉ製物を、固体の支持体へ固定した
前記ペプチドを含有するカラムへ適用し、（ｂ）結合し
ない物質を溶離し、そして（ｃ）抗体を固相ペプチドか
ら分離する条件下に、エピトープ特異的抗体を溶離する
、からなる、上記第７項記載の方法。

１０、工程： （ａ）試料をトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉ
ａ　　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に対する第１抗体と接
触させ、そして試料からの抗原が前記第１抗体に結合す
るようになるかどうかを決定することによって、試料に
ついてトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　
ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）のアッセイを実施し、そして （ｂ）前記第１抗体を、工程（ａ）におけるのと実質的
に同一の条件下に、上記第１〜３項のいずれかに記載の
エビドーグ特異的ペプチドと接触させ、そして前記ペプ
チドが前記第１抗体に結合するようになるかどうかを検
出することによって、対照反応を実施する、 からなる、試料中のトラコーマクラミジア（ｃｈＩａｍ
ｙｄｉａ　　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）を検出するアッ
セイ法の適切な実施をアッセイする方法。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、トラコーマクラミジアのＣＮＢ　ｒ消化し
た外膜複合体の逆相ＨＰＬＣカラムからの溶離のプロフ
ィルのプロットである。 第１Ｂ図は、異なる溶媒系を使用して再びクロマトグラ
フィーにかけた、第１Ａ図に示すモノクローナル反応性
分画の逆相ＨＰＬＣカラムからの溶離のプロフィルのプ
ロットである。 第２Ａ図は、トラコーマクラミジア種特異的エピトープ
のＮＨ，末端の「欠失」、すなわち、ＮＨ２末端の輪郭
についてのＥＬ　Ｉ　ＳＡの結果を描くグラフである。 第２Ｂ図は、種特異的トラコーマクラミジアエピトーグ
のＣ０ＯＨ末端の「欠失」、すなわち、Ｃ０ＯＨ末端の
輪郭についてのＥＬ　Ｉ　ＳＡの結果を描くグラフであ
る。 第３図は、本発明による１２アミノ酸ペプチドについて
の内部の置換のＥＬ　Ｉ　ＳＡの結果を描くグラフであ
る。 第４図は、プロットにより４つの種特異的抗体試薬の相
対的力価を比較する。 第５図は、２つの抗体のクラミジアの外膜複合体抗原に
対する相対的親和性を記載するグラフである。 ｔＪＧ図は、いくつかの抗クラミジア抗体とクラミジア
の外膜複合体抗原との反応性のウェスタン・プロット分
析の結果を描く。 ｔＪ７図は、４つの抗体試薬を使用するクラミジア感染
ＨｅＬａ細胞の間接免疫蛍光を示す。 図凶の浄書ｒ内容に豐更なし） 第」Ａ図 コ　　　：Ｉ　　　） ◆　　　１　　　■ 誕伸× ペプチドの　ｎＭ 第２Ａ口 ペプチドのｙｔ閂 犠？只同 第４図 ｍｗの浄書（内容に変更なし） −２「ノ　−２ ・ンリ　、へ １、事件の表示 平成１手持許願第１６８２５０号 ２、発明の名称 （１〉　明細書の「図面の簡単な説明ｊの欄の第８９頁
末行の「プロット分析の結果を描く、」とあるを「プロ
ット分析（電気泳動）の結果を示す写真である。」と訂
正する。 （２〉　同第９０頁１行の「第７図は、」とあるを１第
７図は、生物の形態の写真、すなわち１と訂正する。 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願Å 以上 ５、補正命令の日付 平成１年９月２６日（発進口）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａ
   ｃｈｏｍａｔｉｓ）の共通のエピトープを特徴づけ、少
   なくとも５つのアミノ酸を有するエピトープ特異的ペプ
   チドであって、前記ペプチドは次のエピトープ特異的自
   然配列： 【遺伝子配列有り】 の I 〜ＸIIの配列位置を有する少なくとも４つのアミ
   ノ酸から本質的に成り、ここで前記少なくとも４つのア
   ミノ酸はそれらの配列位置に存在するが、お互いに隣接
   する必要はなく、残りのアミノ酸は前記自然配列中に存
   在するか、あるいは前記自然配列中のアミノ酸に対する
   免疫原的同等体であり、前記ペプチドは自然トラコーマ
   クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉ
   ｓ）抗原の１５より多くない連続するアミノ酸を有する
   ことを特徴とする、エピトープ特異的ペプチド。