JPS6136223A - 骨中のポリペプチド軟骨誘導因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は蛋白質化学、さらに詳しくは骨中に存在する軟
骨形成誘導用の因子で、β型形質転換成長因子（ＴＧＦ
−β）アッセイにおいても活性な２種類の蛋白質に関す
る。本明細書中においてはこれらのポリペプチドを軟骨
誘導因子（ｃＩＦＳ）と呼ぶことがある。 （技術的背景） ヒト血小板、ヒト胎盤、及びウシ腎臓由来のＴＧＦ−β
が国際特許出願明細書（ＰＣＴ／ＵＳ８３１０１４６０
．１９８４年３月２９日公開Ｎｏ、ＷＯ８４１０１１０
６）及びＥＰＡ８４４５００１６．５　（１９８４年１
２月１９日公開Ｎｏ、０１２８８４９）に記載されてい
る。 米国特許第４．４３４．０９４にはカオトロピズム試剤
での抽出、カチオン及びアニオン交換カラムでの分画、
及びｐＨ４，８でＣＭＣに吸着されたフラクションから
の活性の回復による骨発生刺激性骨由来蛋白質因子の部
分的精製が報告されている。この新しい蛋白質フラクシ
ョンは「骨形主因子Ｊ　　（ＯＦ）と命名され、分子量
約３０．０００ダルトン未満で、上述の精製工程をたど
ることを特徴とする。本発明の蛋白質は米国特許第４．
４３４．０９４号記載の方法と部分的に同様な精製手順
を用いて均質に精製した。 （発明の開示） 本発明は骨中に豊富に存在する２種類のＣｌＦ５、並び
にこれらのポリペプチドを骨から実質的に純粋な形で得
ることを基本的目的とする。いずれのＣｌＦ５も上皮成
長因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ）と組み合わせると、軟寒天中での
正常ラット腎臓（Ｎ　ＨＫ）細胞の固定（源）非依存性
成長の生体外での誘発に関するＴＧＴ−βアッセイに対
しても活性を示す。本明細書においてはこのアッセイを
時にＴＧＦ−βアッセイと呼ぶ。こうした観点において
は、ＴＧＦ−βアッセイに活性な蛋白質の骨中での存在
は、従来報告されていない。本発明のＣｌＦ５の一つは
ＣＩ　Ｆ−Ａといい、ヒト胎盤由来のＴＧＦ−βについ
て文献で報告されているのと同様の部分的（３０個のア
ミノ酸）Ｎ末端配列を有する。また、他のＣＩＦはＣＩ
Ｆ−Ｂといい、ヒト胎盤由来のＴＧＦ−β配列とは異な
る部分的Ｎ末端配列を有する。 本発明は更にＣｌＦ５の一方又は両方とＴＧＦ−β活性
化試剤を組み合わせて含む細胞増殖促進用組成物、軟骨
形成及び骨形成誘発用移植組成物、並びに一方又は両方
のＣｌＦ５を含むがその活性化試剤又は共同因子は含ま
ない結合組織沈着促進用移植組成物を提供することをも
目的とする。 従って本発明の一つの態様は、（ａ）骨中に存在し、（
ｂ）軟骨形成を誘発するための共同因子で、（ｃ）ＴＧ
Ｆ−βアッセイに活性を有し、かつ（ｄ）ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによる測定で約２６．０００ダルトンの二量体であ
ることを特徴とするポリペプチド軟骨誘発因子及びその
実質的な同等物である。 本発明の骨からの前記二つの因子の単離方法は、以下の
工程から成ることを特徴とする。 （ａ）　　非繊維状蛋白質を可溶化するカオトロピズム
性（解離性）抽出剤を使って、無機成分を除去した骨（
ＤＭＢ）から抽出し、 （ｂ）　　工程（ａ）からの抽出物をゲルろ過して分子
量１０，０００〜４０．０００ダルトンの蛋白質を含む
フラクションを回収し、 （ｃ）　工程（ｂ）によるフラクションをカルボキシメ
チルセルロース・カチオン交換体にｐＨ約４．５〜５．
５の変性条件下で吸着させ、（ｄ）　　濃度勾配をつけ
た塩化ナトリウム溶液を用いて前記カチオン交換体から
吸着フラクションを溶出し、 （ｅ）　　温度約１５０〜２５０ｍＭ（７）ＮａＣｕ溶
液で溶出された工程（ｄ）からの溶出物を逆相高性能液
体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）又は非変性ゲ
ル電気泳動に供し、（ｆ）　　前記ＲＰ−ＨＰＬＣ又は
ゲル電気泳動から前記因子を回収する。 本発明の軟骨形成／骨形成誘発用移植組成物は、前記Ｃ
Ｉ　Ｆｓの一方又は両方を有効量含むことを特徴とする
。 本発明の正常な動物細胞の増殖促進用組成物は、（ａ）
前記ＣｌＦ５の一方又は両方並びに（ｂ）ＴＧＦ−β活
性化試剤を有効量含むことを特徴とする。 本発明の組合組織沈着促進用移植組成物は、実質的に活
性化試剤又は軟骨形成共同因子を含まない、前記ＣｌＦ
５の一方又は両方を有効量含むことを特徴とする。 ４１夏尖１１１ 本発明のポリペプチドは骨から単離され、この時点で単
一の特定の分子配列を有する。このため、またＴＧＦ−
βの完全なアミノ酸配列はまだ報告されていないことか
ら、本発明のＣｌＦ５とＴＧＦ−βとの間の主要な構造
的関係は完全には判っていない。 本発明のポリペプチドは軟骨形成を誘発するための共同
因子である。これらのポリペプチドの軟骨形成活性及び
軟骨末端からの骨形成様式から考えて、これらは骨形成
においても役割を果たすものと期待される。本発明のポ
リペプチドはＴＧＦ−βアッセイにも活性で、ＴＧＦ−
β活性化試剤を伴わずに結合組織の沈着を促すことが判
っている。ヒト、サル、ウシ、及びラットからの骨誘発
性蛋白質は、異種移植物として使用する場合、軟骨末端
からの骨形成能力に種による特異性がなく（サンバス他
Ｓａｍｐａｔｈ、Ｔ、に、、ｅｔａｌ、Ｐｒｏｃ　　Ｎ
ａｔｌ　　Ａｃａｄ　　Ｓ　　ｃ　　１（ＵＳＡ）（１
９８３）８０：６５９１）　、ｌ：）血小板、ヒト胎盤
、及びウシ腎臓起源のＴＧＦ−βはげっ索類、ウシ類、
及び人類の間で種弁特異性であることからして、本発明
のポリペプチドは哺乳類間での維持性が極めて高いもの
と考えられる。（つまり、種の異なる哺乳類間のポリペ
プチドのアミノ酸配列には、例えあったとしても分子の
非特異的な活性に悪影響を及ぼＸない程度の１個以上の
アミノ酸残基の付加、欠落、又は置換といった変化しか
ない）。こうした観点から、「実質的な同等物」とは天
然のものであれ合成品であれ、また種又は由来には無関
係に、あるポリペプチドがＣＩＦと同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドだったり、アミノ酸配列が異なる
以外は実質的に相同で、そのアミノ酸配列の差が非特異
的な活性に悪影響を及ぼさないようなポリペプチドであ
ることを説明するために用いる。従って、本発明のポリ
ペプチドは骨や恐らくは多様な動物の組織からも得られ
るし、或いは組換え体ＤＮＡ技術によっても得ることが
できる。ブタ又はウシの長管はスキし易く高濃度のペプ
チドを含むため天然のＣｌＦ５源として好ましい。 骨からＣｌＦ５を単離する方法は次の通りである。骨を
まず機械的に又は研摩して清浄にしてから粉砕し、さら
に、例えば希酸水溶液を使って好ましくは低温で洗浄す
る。次に、エーテル又は酢酸エチル等の脂肪親和性溶媒
で抽出して脱脂する。この骨を通常はより強酸を使って
抽出して種々の形態で存在するリン酸カルシウムを除去
して無機質を除く。こうして生成した製剤（無機質を除
去した骨）が本発明のポリペプチド製剤の出発物質にな
る。 最初の抽出は無機質を除去した骨から非繊維状（例えば
、非コラーゲン質）蛋白質を除去するために行う。この
処理は（少なくとも約４モルの）グアニジンハイドロク
ロライド、（８モルの）尿素＋塩、又は（少なくともｌ
ｖｏＭ％の）ドデシル硫酸ナトリウム等のカオトロピズ
ム試剤を使用して行う。抽出された蛋白質の消化又は変
性の可能性を減少させるため、抽出は好ましくはプロテ
アーゼ抑制因子の存在下に低温で実施する。プロテアー
ゼ抑制因子の例としては、フェニルメチルスルホニルフ
ルオライド（ＰＭＳＦ）、アジ化ナトリウム、Ｎ−エチ
ルマレイン酸イミド（ＮＥＭ）、ベンズアミジン、及び
６−アミノヘキサン酸がある。抽出媒体のｐＨは用いる
抽出剤の種類により、抽出工程には通常約４時間から１
日を要する。 抽出後、抽出剤は（必要であれば限外ろ過して濃縮後、
）水に対して透析する等の適当な方法で除去することが
できる。塩類も制御条件下での電気泳動又は分子ふるい
によって除去できる。蛋白質の変性を最小限にするため
この工程の間も低温を維持するのが好ましい。 別法として、抽出剤を除去せずに、例えば限外ろ過によ
って単に溶液を濃縮するだけでも良い。 カ第１・ロピズム試剤に溶解又は再溶解した抽出物を限
外ろ過し分子肝約４０．０００ダルトン未満のフラクシ
ョンを得る過程で純度が大きく高まる。ゲル・サイジン
グは標準的な方法、好ましくはセフ７クリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ）カラムを使って室温（１０〜２５°Ｃ）で
行う。低分子量のフラクションは続いて、ｐＨ約４．５
〜５．５好ましくは約４．８で尿素等のカオトロピズム
試剤の存在下にカルボキシメチルセルロース（ｃＭＣ）
を用いてイオン交換クロマトグラフィーに供する。ポリ
アクリルアミド及び架橋デキストランからの誘導体を始
めとする他のカチオン交換体も使用できるが、セルロー
ス性カチオン交換体が好ましい。もちろん、他のイオン
交換手順と同様に、溶液中から競合イオンを除いてから
カラムに供し、徐々に溶剤の塩濃度を高めて溶出しなけ
ればならい。約１５０〜２５０ｍＭのＮａＣ文溶液でＣ
ＭＣから溶出されるフラクション中にＣｌＦ５が含まれ
る。 カチオン交換クロマトグラフィーからの溶出フラクショ
ンを次に最終精製工程としてＲＰ−ＨＰＬＣ又は非変性
ゲル電気泳動処理する。ＲＰ−ＨＰＬＣ及びゲル電気泳
動は標準的な方法を用いる。以下の実施例においては市
販のＲＰ−ＨＰＬＣカラムを用いた。この最終精製工程
により２種類のポリペプチドが実質的に純粋な形で得ら
れる。「実質的に純粋な」とはポリペプチドが約５ｗｔ
％未満しか不純物を含まないことを意味する。 （実施例） 以下に示す実施例は特定の試料に適用される精製工程を
説明するためのものであって、本発明を限定するための
ものではない。 Ａ、　無　　　を除去した骨の調製 屠殺場で屠殺したばかりの牛の中足骨を求めドライアイ
スで冷却して輸送した。この骨の骨髄及び非骨組織を洗
浄して除いてから直径１ｃｍ未満の小片に破砕後、ミル
中で４°Ｃで粉砕した。粉砕した骨を骨１ｋｇ当り９．
４文の２回蒸留水で各１５分づつ２回洗浄し、続いて４
°Ｃの０．０１ＮＨＣｕ溶液で終夜洗浄した。洗浄した
骨を容積３倍のエタノールで３回、続いて容積３倍のジ
エチルエーテルで３回脱脂した。各洗浄は全て室温で、
それぞれ２０分間かけて行った。続いて、得られた脱脂
骨粉から４°Ｃの０．５Ｎ　　ＨＣＩ溶液中（２５Ｍ／
ｋｇ脱脂骨）で無機成分を除去した。酸をデカンテーシ
ョンで棄て、生成したＤＭＢをｐＨが４を越えるまで洗
浄後、吸引ろ過して乾燥した。 Ｂ、　　１コラーゲン　蛋白　の　１ 項Ａで作製したＤＭＢをＤＭＢｌｋｇ当り３．３１（１
）４Ｍグアニジ７　＊　ＨＣ’ｌ　、　１０　ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭＦＭＳ　Ｆ　
、１０ｍＭ　　ＮＥＭ、ｐＨ６，８を使って１６時間抽
出後、懸濁液を吸引ろ過し、不溶物を再度４時間抽出し
た。可溶性のフラクションを合体しアミコン（Ａｍｉｃ
ｏｎ）限外ろ過（ＩＯＫ）ユニットを使って限外ろ過し
て少なくとも５倍に濃縮し、濃縮物を３５容量倍の脱イ
オン水を６回交換して４日間透析後凍結乾燥した。 この項の凍結乾燥以外の工程は全て４℃で行い、凍結乾
燥は標準的な凍結乾燥条件で実施した。 Ｃ９乞ム入１ Ｂ項からの抽出物を４ＭグアニジンｅＨＣ文溶液に再溶
解し、これを４Ｍグアニジン・ＨＣｕ、０．０２％アジ
化ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ６，８）で平
衡させたセファクリル５−２０”Ｏカラムで分画した。 各フラクションについて２８０ｎｍでの吸光度及びＥＬ
ＩＳＡ（以下に説明する）による軟骨形成活性を測定し
、各フラクションを第１図に示す達りとした。第１図の
フラクションＦ２は低分子量（ＬＭＷ、ｌ　Ｏ，０００
〜４０．０００ダルトン）蛋白質フラクションで、最大
の活性を有する。これを１８０容量倍の脱イオン水に対
して水を６回交換して透析後、凍結乾燥した。なお、凍
結乾燥及び透析（４℃）以外の全ての操作は室温で実施
した。 Ｄ、　イオン　換クロマトグラフ　− ０項からのフラクションＦ２を６Ｍ尿素。 １０ｍＭ　　ＮａＣｕ、１ｍＭ　　ＮＥＭ、５０ｍＭ酢
酸ナトリウム（ｐＨ４，８）中に溶解し、１０．００Ｏ
ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上澄み液を上記
の緩衝液で平衡させたＣＭ５２（市販のＣＭＣ）カラム
で分画した。上記緩衝液中にＮａＣ’ｌをｌ　ＯｍＭ　
〜４００　ｍＭの濃度で逐次量を増やして溶解した溶出
液を用いて上記カラムから結合している蛋白質を溶出し
た。溶出液の流量２７ｍ文／　ｈ　ｒ、金星を３５０ｍ
Ｍとした。第２図に示すように３個の主要なフラクショ
ン、ＣＭ−１、ＣＭ−２、及びＣＭ−３を補集した。Ｃ
Ｍ−２及びＣＭ−３は約１５０〜２５０ｍＭ　　ＮａＣ
Ｊ１溶液で溶出された。各フラクションを容積１１０倍
の脱イオン水に対して６回（４日間）透析後、凍結乾燥
した。」二連の操作は、透析（４°Ｃ）以外、全て室温
で実施した。 Ｅ、　　ＲＰ−ＨＰＬＣ Ｄ項からの凍結乾燥したフラクションＣＭ−２とＣＭ−
３を合体して０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶
解し、この溶液の一部をヴイダ・ンク（ＶＶｄａｃ）Ｃ
１８ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（内径４　、６　ｍ　ｍ　、
長さ２５ｃｍ）に担持後、０．１％ＴＦＡを用いて１　
ｍ　１７ｍ　ｉ　ｎの速度で５分間洗浄した。溶出溶媒
としては０．１％ＴＦＡ溶液中に０〜６０％のア七ト二
トリルを加えたものを用い、溶出速度は２％／　ｍ　ｉ
　ｎとした。 ＣＭ−２とＣＭ−３を合体したもののＲＰ−ＨＰＬＣか
ら２個のピークが得られた（ピークＡ約２９．５介後、
ビークＢ　約３１，２分後）。 第３図にピークＡ及びＢの吸光度及び電気泳動プロフィ
ル（還元及び非還元状態）を示した。これらのピークの
蛋白質をそれぞれＣＩＦ−Ａ及びＣＩＦ−Ｂと呼ぶ。 これらの蛋白質を使用時まで一２０℃で０．１％ＴＦＡ
／アセトニトリル溶出液中に貯蔵した。 Ｆ、　ゲル電′泳動・による別の精製方法凍結乾燥した
フラクションＣＭ−２とＣＭ−３を合体し、ペイニム等
（Ｐａｙｎｉｍ、Ｓ。 ａｎｄ　　Ｃｈａｌｋｌｅｙ、Ｒ，、ＡｒｃｈＢｉｏｃ
ｈ　　Ｂｉｏｐｈｙｓ（１９６９）１３０　：　３３７
〜３４６）の一般法を用いて酢酸−尿素ゲル上の電気泳
動で分画した。 Ｇ、　生−外での軟骨形、′性の測定 精製時にフラクション中に所望の蛋白質が存在すること
は軟骨特異性プロテオグリカン（ＰＧ）の産生の生体外
測定で確認し、ＥＬＩ　ＳＡで固定した。この測定はラ
ット胎児の筋肉から単離した間葉細胞を用いるアガロー
スゲル培養モデルである。これにより試料のＰＧ生産誘
起能力が評価される。生体外での軟骨誘発と生体内での
骨形成の関係はセイデン等（Ｓｅｙｅｄｉｎ、Ｓ、ｅｔ
ａｌ、Ｊ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ　　ｒ１９８３）９
７：１９５０〜１９５３）が示している。 細胞培養基は生後１９日のスプラグ・ダウリー（Ｓｐｒ
ａｑｕｅ　　Ｄａｗｌｅｙ）う・ント胎児の土岐から無
菌的に筋肉組織を切断し、これを細かく切り刻んでから
、イーグル最少必須培地（ＭＥＭ）中でｌＯ％ウシ胎児
血清（ＦＢＳ）並びに１ｍＭ当りペニシリン５０ｕｎｉ
ｔとストレプトマイシン５０ｇｇを使って培養して作製
した。細胞の成長は通常１週間以内で集密に達するので
ここで細胞をトリプシン処理し、ｌ：２に分割して最初
の３継代以内に実験に用いた。 細胞をアガロースゲル培養基中に対照培地又は試験用試
料と共に入れた。手順は基本的にベニヤ等（Ｂｅｎｙａ
、ｅｔ　　ａ　　ｌ　　、　　Ｃｅ　　ｌ　　１（１９
８２）旦：２１５）に準じた。すなわち、細胞の単分子
層をトリプシン処理により採取して血球計で計数し、試
験用蛋白質フラクションが存在する又は存在しない培地
に最終的な細胞濃度の２倍の濃度で再懸濁した。対照培
地はそれぞれ１０％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＨａｍｓ
Ｆ−１２，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ最小必須培地（ＤＭＥ
Ｍ）、又はＣＭＲＬ１０６６（Ｇｉｂｃｏ）とした。０
．ＯＩＮ　　ＨＣ交中の試験用蛋白質クラクションを所
望の蛋白質濃度まで直接的に希釈後、Ｆ−１２中の１％
低融点アガロース（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａｄ　、＃１６２−
００１７）を等容敬使って希釈し、この希釈溶液０．２
ｍＭを１％高融点アガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ。 ＃１６２−ＯＺｏｏ）０．１５ｍ、ｌで被覆した１７ｍ
ｍのウェルに塗布した。作製した培養基を３７°Ｃで５
分間培養後４°Ｃで１０分間冷却し、続いて１ｍＭの相
当する培地（対照又は試験蛋白質）で覆った。次いで細
胞をＣｏ、５％、空気９５％の湿度を高めた雰囲気中で
培養し、その後対照培地で完全に替えて３〜４日ごとに
養分を供給した。７日後に培養基を凍結し、測定まで−
８０°Ｃで保存した。 培養基を４°Ｃで融解後、酢酸ナトリウム５０ｎＭ、Ｅ
ＤＴＡ　ｌ　３ｍＭ、ＮＥＭ６ｍＭ、及びＰＭＳＦ　　
３ｎＭを含む４Ｍグアニジン−ＨＣＩ溶液中にＰＩ（５
、８で均等に分散し、さらに４°Ｃで終夜振とう抽出し
て測定した。４℃、２５．０００Ｘｇで４０分間遠心分
離して得た上澄み液を容積５０倍の０．２ＭＮａＣ見　
。 ５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７，４）に対して４°
Ｃで終夜透析した６透析した上澄み液をレナルド等（Ｒ
ｅｎａｒｄ、ｅｔ　　ａｌ、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ（
１９８０）１０４：２０５．及び米国特許第４．４３４
．０９４号）の記載に準じてＰＧについてＥＬＩＳＡ測
定した。 ＥＬＩＳＡについて簡単に説明すると、ヒアルロン酸又
はう・ントの骨から抽出されたＰＧとの交差反応性を示
さない標準的な技術を用いてウサギ中でＰＧに対する抗
血清を増大させた。スオーム（Ｓｗａｒｍ）ラットの軟
骨肉腫組織からの精製ＰＧ（Ｓｅｙｅｄｉｎ、Ｓ、、ｅ
ｔ　　ａ　１　、前掲）を標準抗原として用いた。透析
した試料をツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　０．０５％、
ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ　）　１　ｍ　ｇ　／
　ｍ文を含む、リン耐塩で緩衝した食塩水（ＰＢＳ）（
ｐＨ７，２）中に加えて１：１（容量）に耗釈して測定
した。ホースラディツシュｅペルオキシダーゼ抱合型（
ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｔａｇｏ
）を０−フェニレンジアミンを基質とする第２の抗体と
した。 ＲＰ−ＨＰＬＣで精製したＣ　Ｉ　Ｆ−Ａ及びＣＩＦ−
ＢのＥＬＩＳＡの結果を第４図に示す。 測定感度は培養基の１〜５　ｎ　ｇ　／　ｍ文以内であ
る。 Ｆ項のゲル会スライスについてのＥＬＩＳＡの結果を第
５図に示す。これらの結果はＲＰ−ＨＰＬＣにより得た
Ｃ　Ｉ　Ｆ−Ａ及びＣＩＦ−Ｂ（ゲル・スライス７と６
に相当）の結果と対応する。 Ｈ，”　　ＣＩＦ−Ａ　　びＣＩＦ−Ｂ　　　、・

【Ｃ
Ｉ　Ｆ−Ａはラエムリ等（Ｌａｅｍｍｌ＋。 Ｕ、に、、ａｔ　　　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　　（１９７
０）Ａ又７：６８０）の記載に準じてＳＤＳ溶液中の１
５％Ｌ　ａ　ｅ　ｍ　ｍ　Ｉ　＋ポリアクリルアミドゲ
ル中での蛋白質の易動度の測定（第３図）から分子量２
５．８００ダルトンで、還元すると分子量１４．８００
ダルトンのポリペプチドになることが判った。この様に
して求めた分子量は概数に過ぎず、これらの値は測定方
法によって変化することはいうまでもない。蛋白質の配
座がこの系における易動度に影響するので、得られる分
子量は大体同程度になると考えられるが、他の方法を用
いた場合には必ずしも全く同一になるとは限らない。還
元した蛋白質のプロフィルに単一の帯域しか存在しない
ことは、恐らくこの蛋白質がアミノ酸配列が実質的に等
しい２木のポリペプチド鎖から成る二部体（つまり、ホ
モダイマー）であることを示している。二量体の実測分
子量と個々の鎖の実測分子量の矛盾は測定方法によるも
のである。 ＣＩＦ−Ａは、ＰＢＳ中でのｌ　ＯＯ’Ｃ１３分間の加
熱、０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，４，５ｍＭ　　Ｃ
ａＣｕ２．０．０２ｍＭ　　ＰＭＳＦ中でのコラ−ゲナ
ーゼによる３７℃、２時間の処理（コラーゲンと蛋白質
の比は４００ｕｎｉｔｓコラ一ゲン／ｍｇ蛋白質とした
）、及び５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７，４，１０ｍＭ　　
ＣａＣｕ２中でのトリプシンによる３７°Ｃ，２時間の
処理（トリプシンと蛋白質の比は１００ｕｎｉｔｓ）リ
プシン／ｍｇ蛋白質とした）の後でさえも、上記Ｇ項の
ＥＬＩ　ＳＡ測測定活性を維持した。しかしながら、ジ
チオトレイトール（ＤＴＴ）５ｍＭを含むＰＢＳ中、室
温で１時間処理すると蛋白質は活性を失い、この試薬は
ジスルフィド結合を還元するものと考えられた。同様に
、ＳＤＳ処理するかＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画すると蛋白
質は失活し、これは恐らく変性のためかＳＤＳとの複合
体形成のためと考えられる。ＣＩＦ−Ａの部分的なアミ
ノ酸組成を第１表に示す。 第　　１　　表 アミノ酸　　　測定値（Ｍｏｌｓ／１００Ｎｏｌｓ）Ａ
ｓｐ　　　　　９．２ Ｇｌｕ　　　　　９．２ Ｓｅｔ　　　　　７．０ ）＋ｉｓ　　　　　　　　　２・７ ＧＩＹ　　　　　１８．５ Ｔｈｒ　　　　　２・７ Ａｒｇ５．９ Ａｌａ　　　　　Ｂ、８ Ｔｙｒ　　　　　３．２ Ｍｅｔ　　　　　Ｏ，０ Ｖａｌ　　　　　７．５ Ｐｈｅ　　　　　３・０ Ｉｌｅ　　　　　３．９ Ｌｅｕ　、　　　　８．６ Ｌｙｓ　　　　　１３．９ Ｐｒｏ　　　　　　　　検出されず Ｃｙｓ　　　　　　　　検出されず Ｔｒｐ　　　　　　　　検出されず ＣＩＦ−Ａのアミノ酸配列分析の結果、次の様な単一の
Ｎ末端配列を持つことが判った。 Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈ　ｒ−Ａｓｎ−Ｔｙ　
ｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−９ｅ　ｒ　（Ｓｅ　ｒ）　Ｔｈ　
ｒ　−Ｇ　Ｉｕ−Ｌｙ　５−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−
Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔ　ｙ　ｒ−Ｉｌ
ｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−。 （）＝推定 このＮ末端配列はヒト胎盤由来のＴＧＦ−βについて報
告されているものと等しい。 ＣＩＦ−Ｂは同一手順で測定した分子量が若干具なり２
６．０００ダルトンだった。この差は分析方法に基づく
ものと考えられる。従って、いずれの蛋白質も５ＯＳ−
ＰＡＧＥで測定した分子量が約２６，０００ダルトンと
見なすことができる。この蛋白質のピークＢを還元する
と分子量約１４．２００ダルトンの単一の帯が認められ
、この蛋白質も恐らくホモダイマーであることを示して
いる。これは第２表に示すアミノ酸組成を有する。 第　　２　　表 アミノ酸　　　測定値（Ｍｏｌｓ／１００Ｍｏ１ｓ）Ａ
ｓｐ　　　　　１２．０ Ｇｌｕ　　　　　８．５ Ｓｅｒ　　　　　１０．８ ＨｉｓＩ）、９ Ｇｌｙ　　　　　２２．０ Ｔｈｒ　　　　　Ｏ，Ｏ Ａｒｇ　　　　　４．３ Ａｌａ　　　　　８．？ Ｔｙｒ　　　　　１．９ Ｍｅｔ　　　　　０．０ Ｖａｌ　　　　　２．４ Ｐｈｅ　　　　　３．０ Ｉｌｅ　　　　　２．２ Ｌｅｕ　　　　　８．２ Ｌｙｓ　　　　　１７．３ Ｐｒｏ　　　　　　　　検出されず Ｃｙｓ　　　　　　　　検出されず Ｔｒｐ　　　　　　　　検出されず アミノ酸配列分析の結果、ＣＩＦ−Ｈの単一のＮ末端配
列は以下の通りであることが判った。この蛋白質につい
て定性的に評価した他の特性は、Ａ　Ｉａ−Ｌｅ　ｕ−
Ａ　５ｐ−Ａ　Ｉａ−Ａ　Ｉａ−Ｔｙ　ｒ−Ｃｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａ　Ｉ　−】５２０ Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａｓ　ｐ−Ａ　ｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔ　ｙ　ｒ　−Ｉ　Ｉ
　ｅ　−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−。 ＣＩＦ−Ａについて上記したことと同様だった。 １、ＴＧＦ−゛　の旺 ＣＩＦ−Ａ及びＣＩＦ−Ｂをバイオアッセイで試験した
。バイオアッセイは「血清を含まない動物細胞の培養に
用いる培地、サブリメント、及び基質の作製方法Ｊ　　
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｅ　ａｒａｔｉｏｎ　
ｏｆＭｅｄｉａ　　Ｓｕｐ　Ｉｅｍｅｎｔｓ、　ａｎｄ
　５ｕｂｓｔｒａｔａ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ
　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　１９８
４）、　Ａｌａｎ　Ｒ。 Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、）　（７）　１８１〜１９４頁に
記載の方法に準じて行った。分析結果を第６図に示す。 図示したように、いずれの蛋白質もバイオアッセイで明
瞭な投与応答を示し、活性化には活性化試剤（Ｅ　Ｇ　
Ｆ）の存在を必要とした。活性水準はヒト血小板、ヒト
胎盤、及びウシ腎臓由来のＴＧＦ−βについての報告値
とほぼ等しかった。 ＣｌＦ５のトリプシン処理に対する活性維持能力のため
、これらは無機成分を除去した骨粉がら酵素消化によっ
て単離することができる。この工程においては、無機成
分を除去した骨粉をトリプシン及び／又は本発明の蛋白
質を劣化させないような他のプロテアーゼの水溶液で、
これらの酵素が活性化する条件下で消化する。この処理
によって骨粉中の他の蛋白質成分の大半が消化される。 目的とする蛋白質は消化後の液から、前述の万両方法（
ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰ
ＬＣ，又は非変性ゲル電気泳動）の幾つかを用いて精製
することができる。 ＣｌＦ５の骨基質からの遊離の程度、及び他の物質との
複合体形成の程度によっては可溶化試剤を用いずに済む
こともある。なお、純粋な蛋白質は実質的に水溶性であ
る。 本発明のＣｌＦ５は人間を含む動物の軟骨及び骨組織を
補修、代替、又は増大させるために軟骨や骨の成長を誘
発する効果がある。軟骨形成及び骨形成に有効な量の本
発明の蛋白質は骨中に存在する軟骨形成及び骨形成共同
因子と組み合わせて薬学的、生理学的に適当な液体又は
移植用精製コラーゲン等の固形担体と調合することがで
きる。 担体に対する活性蛋白質の重量比は典型的には１：５０
〜１　：　１．０００である。移植物は、活性成分とし
ての注入を含む、通常の外科技術で患者の予め定めた部
位に挿入することができる。 活性成分としてＣＩＦＬか含まない（つまり、活性化試
剤や共同因子を全く含まない）コラーゲン質移植物は、
担体に対するＣＩＦの比が約１：６，０００を越えると
、コラーゲン質結合組織の沈着を促進した。 本発明のＣｌＦ５はヒト血小板、ヒト胎盤、及びウシ腎
臓起源のＴＧＦ−βと同様に使用して非特異的な細胞増
殖を促す（刺激又は支持する）こともできる。こうした
用途では、ＣｌＦ５の一方又は両方をＥＧＦ又はＴＧＦ
−α等のＴＧＦ−β活性化試剤と適当な化学量論比で組
み合わせる。 これらの組成物の細胞増殖活性の医療上への応用方法と
しては、火傷や傷の治癒のための局所的な投与、組織増
強用の移植、及び白傷治療用の系統的投与等がある。こ
うした用途ではＣＩＦ及び活性化試剤を、特定の投与形
態に適する薬学上妥当な担体と共に、細胞の増殖を誘発
するに十分な量調合する。局所的な投与では、通常、ス
プレー、ゲル、又は軟こう等の形に製剤する。また、系
統的投与のためには、腸内投与用（例えば、液剤、ピル
、錠剤）又は腸管外注入用製剤とする。これらの用途に
用いる投薬量は、細胞増殖の性質並びに傷等の傷害の多
様性のため、特定することができない。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例０項のゲルろ過フラクションの光学密度
（吸光度（２８０ｎｍ））及び体外での軟骨形成活性を
示す、セファクリルＳ−２００から抽出された蛋白質の
クロマトグラム。 第２図は実施例り項のイオン交換クロマトグラフィーか
らの溶出フラクションの光学密度（２８０ｎｍ）を示す
（セチルメチルセルロース上での低分子量蛋白質のクロ
マトグラム）。 第３図は実施例Ｅ項のＲＰ−ＨＰＬＣのピークＡ（ｃＩ
Ｆ−Ａ）及びＢ（ｃＩＦ−Ｂ）についてのＵＶ吸光度並
びに電気泳動プロフィルを示す（ＨＰＬＣ逆相方逆相フ
ラムシＯＦの単ｌａ）。 第４図は実施例Ｅ項のＲＰ−ＨＰＬＣで得られたＣＩＦ
−Ａ及びＣＩＦ−Ｂの生体外での軟骨形成に関する酵素
結合（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ）イムノソルベント
・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す（ＯＦの精製、
ＨＰＬＣフラクションＡ及びＢ）。 第５図は実施例Ｆ項の酸−尿素ゲル電気泳動フラクショ
ンのＥＬＩＳＡの結果を示す（酸−尿素ゲルからのＯＦ
活性成分の溶出、軟骨プロテグリカンについてのＥＬＩ
ＳＡ）。 第６図は実施例１項に記載のＴＧＦ−βアッセイの結果
を示す（軟質寒天培養基中におけるＥＧＦ及び、ＣＩＦ
−Ａ又はＢで処理したＮＨＫ細胞による集落形成）。 出Ｉ！人　　コラーゲン　コーボレイション代理人　　
弁理士　加　藤　朝　道（他１名）＋＋ａＭ／○ｄ５ｎ 手続ネ市正書（自発） 昭和６０年１０月ＩＧ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）哺乳類の骨に存在し、（ｂ）軟骨形成を誘発
   するための共同因子であり、（ｃ）ＴＧＦ−βアッセイ
   で活性を示し、かつ（ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した
   分子量が約２６，０００ダルトンの二量体であることを
   特徴とする、ポリペプチド軟骨誘導因子及びその実質的
   な同等物。 ２、前記骨が牛骨であることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の因子。 ３、前記二量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列を有
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項
   に記載の因子： Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃ
   ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（Ｓｅｒ）Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ
   −Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ　−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
   −Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−。 ４、前記二量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列を有
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項
   に記載の因子： Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｃ
   ｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ一Ｇｌｕ−Ａｓ
   ｐ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
   −Ｌｅｕ−丁ｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
   Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−。 ５、（ａ）哺乳類の骨に存在し、（ｂ）軟骨形成を誘発
   するための共同因子であり、（ｃ）ＴＧＦ−βアッセイ
   で活性を示し、かつ（ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した
   分子量が約２６，０００ダルトンの二量体であるポリペ
   プチド軟骨誘導因子の少くとも一を含むことを特徴とす
   る軟骨形成及び骨形成誘導用移植組成物。 ６、前記骨が牛骨であることを特徴とする特許請求の範
   囲第５項に記載の移植組成物。 ７、前記二量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列を有
   することを特徴とする特許請求の範囲第５項又は第６項
   に記載の移植組成物： Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃ
   ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（Ｓｅｒ）Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−ＬＹ
   ｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ
   −Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
   Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−。 ８、前記二量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列を有
   することを特徴とする特許請求の範囲第５項又は第６項
   に記載の移植組成物： Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｃ
   ｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓ
   ｐ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
   −Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
   Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−。 ９、（ａ）哺乳類の骨に存在し、（ｂ）軟骨形成を誘発
   するための共同因子であり、（ｃ）ＴＧＦ−βアッセイ
   で活性を示し、かつ（ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した
   分子量が約２６，０００ダルトンの二量体であるポリペ
   プチド軟骨誘導因子の少くとも一を含み、該因子の活性
   化試剤又は共同因子を含まないことを特徴とする結合組
   織沈着促進用移植組成物。 １０、前記骨が牛骨であることを特徴とする特許請求の
   範囲第９項に記載の移植組成物。 １１、前記二量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列を
   有することを特徴とする特許請求の範囲第９項又は第１
   ０項に記載の移植組成物： Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃ
   ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（Ｓｅｒ）Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ
   −Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
   Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−。 １２、前記二量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列を
   有することを特徴とする特許請求の範囲第９項又は第１
   ０項に記載の移植組成物： Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｃ
   ｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓ
   ｐ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
   −Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
   Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−。 １３、（ａ）哺乳類の骨に存在し、軟骨形成を誘発する
   ための共同因子であり、ＴＧＦ−βアッセイで活性を示
   し、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約２６，
   ０００ダルトンの二量体であるポリペプチド軟骨誘導因
   子の少くとも一を含み、さらに （ｂ）ＴＧＦ−β活性化試剤を含むことを特徴とする、
   正常な動物細胞の増殖促進用組成物。 １４、前記骨が牛骨であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１３項に記載の組成物。 １５、前記二量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列を
   有することを特徴とする特許請求の範囲第１３項又は第
   １４項に記載の組成物： Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃ
   ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ（Ｓｅｒ）Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ
   −Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
   Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−。 １６、前記二量体の各々の鎖が以下に示すＮ末端配列を
   有することを特徴とする特許請求の範囲第１３項又は第
   １４項に記載の組成物： Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｃ
   ｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓ
   ｐ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
   −Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
   Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−。 １７、（ａ）無機成分を除去した骨を非繊維状蛋白質を
   可溶化するカオトロピズム抽出剤で処理し、 （ｂ）工程（ａ）からの抽出物をゲルろ過して分子に１
   ０，０００〜４０，０００ダルトンの蛋白質を含むフラ
   クションを回収し、 （ｃ）工程（ｂ）からのフラクションをｐＨ約４．５〜
   ５．５の変性条件下でカルボキシメチルセルロース、カ
   チオン交換体に吸着させ、 （ｄ）前記吸着フラクションを濃度勾配をつけた塩化ナ
   トリウム溶液を使って前記カチオン交換体から溶出し、 （ｅ）塩化ナトリウム濃度約１５０〜２５０ｍＭで溶出
   する工程（ｄ）の溶出物をＲＰ−ＨＰＬＣ又は非変性ゲ
   ル電気泳動に供し、そして （ｆ）ＲＰ−ＨＰＬＣ又は非変性ゲル電気泳動から前記
   因子を回収する工程から成ることを特徴とする、哺乳類
   の骨に存在し、軟骨形成を誘発するための共同因子であ
   り、ＴＧＦ−βアッセイで活性を示し、かつＳＤＳ−Ｐ
   ＡＧＥで測定した分子量が約２６，０００ダルトンの二
   量体であるポリペプチド軟骨誘導因子を骨から単離する
   方法。