JPS6135831B2 - - Google Patents
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- JPS6135831B2 JPS6135831B2 JP56143520A JP14352081A JPS6135831B2 JP S6135831 B2 JPS6135831 B2 JP S6135831B2 JP 56143520 A JP56143520 A JP 56143520A JP 14352081 A JP14352081 A JP 14352081A JP S6135831 B2 JPS6135831 B2 JP S6135831B2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝標識として宿主にテトラサイク
リン耐性、アンピシリン耐性及びトリメトプリム
耐性を付与するための遺伝子を有するプラスミド
ベクター及びその製造方法に関するものである。
リン耐性、アンピシリン耐性及びトリメトプリム
耐性を付与するための遺伝子を有するプラスミド
ベクター及びその製造方法に関するものである。
近年、遺伝子工学の発展を背景に、遺伝子組替
え手法、例えば大腸菌などの細菌に異種DNAを
導入し、その遺伝子を発現させるなどの手法によ
つて有用な物質を生み出す方法が脚光を浴びつつ
あり、最近では、この遺伝子組替え手法により、
インターフエロン、インシユリン、ヒト成長ホル
モン、グルタチオンなどの極めて有用な物質の実
用化に向けて研究開発が行われている。
え手法、例えば大腸菌などの細菌に異種DNAを
導入し、その遺伝子を発現させるなどの手法によ
つて有用な物質を生み出す方法が脚光を浴びつつ
あり、最近では、この遺伝子組替え手法により、
インターフエロン、インシユリン、ヒト成長ホル
モン、グルタチオンなどの極めて有用な物質の実
用化に向けて研究開発が行われている。
上記の異種DNAを導入し、その遺伝子を発現
させるための手段として、一般にプラスミドと呼
ばれる環状DNAが利用されているが、このプラ
スミドのうち、外来性遺伝子を宿主細胞に移入
し、その中でこれを増やす役割をもつように改造
されたものがプラスミドベクターであつて、この
ものは、宿主に導入された場合、導入されてない
宿主と識別しうるように宿主に薬剤などに対する
抵抗性を与える遺伝子、すなわち遺伝標識（以下
マーカーと略す）を有することが必要である。例
えばプラスミドベクターpBR322はテトラサイク
リン耐性（以下Tc耐性と略す）及びアンピシリ
ン耐性（以下Ap耐性と略す）を、PMB9はTc耐
性及びコリシンEI免疫性を、またpACYC184は
クロラムフエニコール耐性及びTc耐性を、それ
ぞれ宿主に付与する遺伝子をマーカーとして有し
ている。
させるための手段として、一般にプラスミドと呼
ばれる環状DNAが利用されているが、このプラ
スミドのうち、外来性遺伝子を宿主細胞に移入
し、その中でこれを増やす役割をもつように改造
されたものがプラスミドベクターであつて、この
ものは、宿主に導入された場合、導入されてない
宿主と識別しうるように宿主に薬剤などに対する
抵抗性を与える遺伝子、すなわち遺伝標識（以下
マーカーと略す）を有することが必要である。例
えばプラスミドベクターpBR322はテトラサイク
リン耐性（以下Tc耐性と略す）及びアンピシリ
ン耐性（以下Ap耐性と略す）を、PMB9はTc耐
性及びコリシンEI免疫性を、またpACYC184は
クロラムフエニコール耐性及びTc耐性を、それ
ぞれ宿主に付与する遺伝子をマーカーとして有し
ている。
ところで、プラスミドベクターに異種遺伝子を
挿入する方法として、適当な制限酵素によつてプ
ラスミドベクターを切断し、直鎖状となつた
DNAの両端に直鎖状の異種DNAを連結して再び
環状化する方法が、一般に行われている。この異
種DNAを挿入する際に、プラスミドベクターの
マーカーを不活性化することによつて異種DNA
挿入の成否を検討することができる。例えば、プ
ラスミドベクターpBR322における制限酵素
BamHの切断部位へ異種DNAを導入することに
より、Tc耐性マーカーが不活性化する。このよ
うな部位は挿入失活部位と呼ばれ、この挿入矢活
部位へ異種DNAを挿入すればマーカーが１個失
われることになる。したがつて、プラスミドベク
ターは、なるべく多くの種類のマーカーを有する
ことが望ましい。
挿入する方法として、適当な制限酵素によつてプ
ラスミドベクターを切断し、直鎖状となつた
DNAの両端に直鎖状の異種DNAを連結して再び
環状化する方法が、一般に行われている。この異
種DNAを挿入する際に、プラスミドベクターの
マーカーを不活性化することによつて異種DNA
挿入の成否を検討することができる。例えば、プ
ラスミドベクターpBR322における制限酵素
BamHの切断部位へ異種DNAを導入することに
より、Tc耐性マーカーが不活性化する。このよ
うな部位は挿入失活部位と呼ばれ、この挿入矢活
部位へ異種DNAを挿入すればマーカーが１個失
われることになる。したがつて、プラスミドベク
ターは、なるべく多くの種類のマーカーを有する
ことが望ましい。
本発明者らは、このような事情に鑑み、多種の
マーカーを有するプラスミドベクターを得るべく
鋭意研究を重ねた結果、プラスミドベクター
pBR322はTc耐性及びAp耐性の２種のマーカー
を有していること、ジヒドロ葉酸還元酵素はトリ
メトプリムによつて強力に阻害されるが、その遺
伝子を細胞内において増幅させることによりトリ
メトプリム耐性（以下Tp耐性と略す）を獲得で
きること、さらにこの遺伝子は1000塩基対以下の
大きさであつて有利であることなどに着目し、プ
ラスミドベクターpBR322にジヒドロ葉酸還元酵
素遺伝子を含むDNAを挿入することによつてTc
耐性、Ap耐性及びTp耐性の３種のマーカーを有
するプラスミドベクターが得られることを見出
し、この知見に基づいて本発明を完成するに至つ
た。
マーカーを有するプラスミドベクターを得るべく
鋭意研究を重ねた結果、プラスミドベクター
pBR322はTc耐性及びAp耐性の２種のマーカー
を有していること、ジヒドロ葉酸還元酵素はトリ
メトプリムによつて強力に阻害されるが、その遺
伝子を細胞内において増幅させることによりトリ
メトプリム耐性（以下Tp耐性と略す）を獲得で
きること、さらにこの遺伝子は1000塩基対以下の
大きさであつて有利であることなどに着目し、プ
ラスミドベクターpBR322にジヒドロ葉酸還元酵
素遺伝子を含むDNAを挿入することによつてTc
耐性、Ap耐性及びTp耐性の３種のマーカーを有
するプラスミドベクターが得られることを見出
し、この知見に基づいて本発明を完成するに至つ
た。
すなわち、本発明はマーカーとしてTc耐性遺
伝子Ap耐性遺伝子及びTp耐性遺伝子を有するプ
ラスミドベクター及びプラスミドベクター
pBR322にジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む
DNAを挿入することによつて上記３種のマーカ
ーを有するプラスミドベクターを製造する方法を
提供するものである。
伝子Ap耐性遺伝子及びTp耐性遺伝子を有するプ
ラスミドベクター及びプラスミドベクター
pBR322にジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む
DNAを挿入することによつて上記３種のマーカ
ーを有するプラスミドベクターを製造する方法を
提供するものである。
本発明に用いるプラスミドベクターpBR322
は、分子量が2.6×106ダルトンでTc耐性及びAp
耐性の２種のマーカーを有し、そのTc耐性遺伝
子上に制限酵素Hind、BamH及びSelによ
つてそれぞれ認識される挿入失活部位を、また
Ap耐性遺伝子上に制限酵素Pst及びPvuによ
つてそれぞれ認識される挿入失活部位を有してお
り、これまで開発されたベクターのなかで、最も
広く利用されているベクターである。
は、分子量が2.6×106ダルトンでTc耐性及びAp
耐性の２種のマーカーを有し、そのTc耐性遺伝
子上に制限酵素Hind、BamH及びSelによ
つてそれぞれ認識される挿入失活部位を、また
Ap耐性遺伝子上に制限酵素Pst及びPvuによ
つてそれぞれ認識される挿入失活部位を有してお
り、これまで開発されたベクターのなかで、最も
広く利用されているベクターである。
ところでトリメトプリムはジヒドロ葉酸還元酵
素の強力な阻害剤であり、例えば大腸菌などの細
菌においては、トリメトプリムによつてジヒドロ
葉酸還元酵素が阻害され、その生成物であつてア
ミノ酸及び核酸の生合成反応に必須なテトラヒド
ロ葉酸の供給が止められる。このことからトリメ
トプリムは抗細菌剤として用いられる。
素の強力な阻害剤であり、例えば大腸菌などの細
菌においては、トリメトプリムによつてジヒドロ
葉酸還元酵素が阻害され、その生成物であつてア
ミノ酸及び核酸の生合成反応に必須なテトラヒド
ロ葉酸の供給が止められる。このことからトリメ
トプリムは抗細菌剤として用いられる。
上記の理由から、このトリメトプリムに対する
低抗性を宿主に付与させるためには、ジヒドロ葉
酸還元酵素遺伝子をプラスミドベクターに組み込
んで宿主に挿入し、細胞内におけるこの遺伝子の
含量を高めてジヒドロ葉酸還元酵素を多量に生産
させればよい。
低抗性を宿主に付与させるためには、ジヒドロ葉
酸還元酵素遺伝子をプラスミドベクターに組み込
んで宿主に挿入し、細胞内におけるこの遺伝子の
含量を高めてジヒドロ葉酸還元酵素を多量に生産
させればよい。
したがつて、本発明の宿主にTc耐性、Ap耐性
及びTp耐性を付与するためのプラスミドベクタ
ーを得るには、Tc耐性及びAp耐性の２種のマー
カーを有するプラスミドベクターpBR322の挿入
失活部位以外の制限酵素切断部位へジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子を含むDNAを挿入すればよい。
及びTp耐性を付与するためのプラスミドベクタ
ーを得るには、Tc耐性及びAp耐性の２種のマー
カーを有するプラスミドベクターpBR322の挿入
失活部位以外の制限酵素切断部位へジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子を含むDNAを挿入すればよい。
また、ジヒドロ葉酸還元酵素の分子量は約２万
ダルトン程度であることが知られている。したが
つてその遺伝子の大きさは、Tc耐性遺伝子が約
2000塩基対であるのに対して約1/2以下の1000塩
基対以下であると考えられ、このことは、Tc耐
性遺伝子をマーカーとすることが有利であること
を意味する。しかしながら、現在までTp耐性遺
伝子をマーカーとしたプラスミドベクターはまだ
開発されていなかつた。
ダルトン程度であることが知られている。したが
つてその遺伝子の大きさは、Tc耐性遺伝子が約
2000塩基対であるのに対して約1/2以下の1000塩
基対以下であると考えられ、このことは、Tc耐
性遺伝子をマーカーとすることが有利であること
を意味する。しかしながら、現在までTp耐性遺
伝子をマーカーとしたプラスミドベクターはまだ
開発されていなかつた。
次に本発明の実施態様について説明する。
まず、プラスミドベクターpBR322に、大腸菌
K12株から得られたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
を含む約9200塩基対より成るDNA断片を、制限
酵素BamHI及びT4DNAリガーゼを用いて挿入し
混成プラスミドを得る。pBR322の制限酵素
BamHによる切断部位は、Tc耐性遺伝子の挿
入失活部位であるため、得られた混成プラスミド
は宿主にTp耐性及びAp耐性を付与する。この混
成プラスミドを大腸菌K12株に導入し、その菌体
をアンピシリンナトリウム及びトリメトプリムを
含む栄養寒天培地を用いて培養し、成長した菌体
から約13.6キロ塩基対の大きさのプラスミド
（pTPと呼称する）を分離する。このプラスミ
ドは宿主にAp耐性及びTp耐性を与える遺伝子を
有しており、また、第１図に示すように制限酵素
EcoR、Hind、BamH、Sal、Pst、
BstE、Bst、Xno、によつて切断される部
位を有している。
K12株から得られたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
を含む約9200塩基対より成るDNA断片を、制限
酵素BamHI及びT4DNAリガーゼを用いて挿入し
混成プラスミドを得る。pBR322の制限酵素
BamHによる切断部位は、Tc耐性遺伝子の挿
入失活部位であるため、得られた混成プラスミド
は宿主にTp耐性及びAp耐性を付与する。この混
成プラスミドを大腸菌K12株に導入し、その菌体
をアンピシリンナトリウム及びトリメトプリムを
含む栄養寒天培地を用いて培養し、成長した菌体
から約13.6キロ塩基対の大きさのプラスミド
（pTPと呼称する）を分離する。このプラスミ
ドは宿主にAp耐性及びTp耐性を与える遺伝子を
有しており、また、第１図に示すように制限酵素
EcoR、Hind、BamH、Sal、Pst、
BstE、Bst、Xno、によつて切断される部
位を有している。
次に上記プラスミドpTPを制限酵素BamH
によつて２か所切断し、次いで２本鎖DNAに特
異的に働いて両端から核酸を分解する酵素ヌクレ
アーゼBAL31を作用させ、Tp耐性遺伝子を含む
直鎖状DNAの断片を得る。この直鎖状DNAの両
端は平滑末端である。
によつて２か所切断し、次いで２本鎖DNAに特
異的に働いて両端から核酸を分解する酵素ヌクレ
アーゼBAL31を作用させ、Tp耐性遺伝子を含む
直鎖状DNAの断片を得る。この直鎖状DNAの両
端は平滑末端である。
一方、プラスミドベクターpBR322に制限酵素
EcoR、を作用させ、挿入失活部位以外の部位
を切断して直鎖DNAとし、次いで一本鎖DNAに
特異的に働く酵素ヌクレアーゼＳを作用させ、
直鎖DNAの両端に突出している一本鎖部分を消
去として平滑末端とする。この際、EcoR切断
部位は消去される。
EcoR、を作用させ、挿入失活部位以外の部位
を切断して直鎖DNAとし、次いで一本鎖DNAに
特異的に働く酵素ヌクレアーゼＳを作用させ、
直鎖DNAの両端に突出している一本鎖部分を消
去として平滑末端とする。この際、EcoR切断
部位は消去される。
このようにして得られた直鎖状DNAと、前記
のpTPから得られたTp耐性遺伝子を含む直鎖
状DNA断片とを、T4DNAリガーゼを用いて平滑
末端連結を行い、環化して混成プラスミドを得
る。この混成プラスミドを大腸菌K12株に導入
し、その菌体をアンピシリンナトリウム、塩酸テ
トラサイクリン及びトリメトプリムを含む栄養寒
天培地を用いて培養し、成長した菌体からプラス
ミドを分離して分子量の最も小さい約6.3キロ塩
基対の大きさのブラスミドを選び、目的のプラス
ミドベクター（pTP30―５と呼称する）を得る。
のpTPから得られたTp耐性遺伝子を含む直鎖
状DNA断片とを、T4DNAリガーゼを用いて平滑
末端連結を行い、環化して混成プラスミドを得
る。この混成プラスミドを大腸菌K12株に導入
し、その菌体をアンピシリンナトリウム、塩酸テ
トラサイクリン及びトリメトプリムを含む栄養寒
天培地を用いて培養し、成長した菌体からプラス
ミドを分離して分子量の最も小さい約6.3キロ塩
基対の大きさのブラスミドを選び、目的のプラス
ミドベクター（pTP30―５と呼称する）を得る。
このようにして得られたプラスミドベクター
pTP30―５は、宿主に対してTc耐性、Ap耐性及
びTp耐性を付与し、また第２図に示すように制
限酵素EcoR、Hind、BamH、Sal、Pst
、BstEによつて切断される部位を有してい
る。
pTP30―５は、宿主に対してTc耐性、Ap耐性及
びTp耐性を付与し、また第２図に示すように制
限酵素EcoR、Hind、BamH、Sal、Pst
、BstEによつて切断される部位を有してい
る。
そして、pTP30―５はEscherichia coli K12
C600株に導入されて安定状態に保たれ、pTP30
―５を含有するEacherichia coli K12 C600株は
微工研にFERM Ｐ―7680として寄託されてい
る。
C600株に導入されて安定状態に保たれ、pTP30
―５を含有するEacherichia coli K12 C600株は
微工研にFERM Ｐ―7680として寄託されてい
る。
また、次の方法によつても本発明のブラスミド
ベクターは得られる。
ベクターは得られる。
すなわち、プラスミドベクターpBR322に制限
酵素EcoRを作用させ、挿入失活部位以外の部
位を切断して直鎖状DNAとし、次いで酵素ヌク
レアーゼＳを作用させ、両端に突出している一
本鎖部分を消去して平滑末端とする。一方、大腸
菌K12株から得られたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子を含む約9200塩基対より成るDNA断片を酵素
ヌクレアーゼBAL31によつて短縮する。この短
縮されたDNAの両端は平滑末端となつており、
このものと、前記のpBR322にEcoR及びヌクレ
アーゼＳを作用させて得られた平滑末端を有す
る直鎖状DNAとを、T4DNAリガーゼを用いて平
滑末端連結を行い、環化して混成プラスミドを得
る。この混成プラスミドを大腸菌K12株に導入
し、その菌体をアンピシリンナトリウム、塩酸テ
トラサイクリン及びトリメトプリムを含む栄養寒
天培地を用いて培養し、成長した菌体からプラス
ミドを分離し、分子の大きさについてスクリーニ
ングして約6.3キロ塩基対の大きさのプラスミド
をベクターとして得る。このプラスミドベクター
は宿主に対してTc耐性、Ap耐性及びTp耐性を
付与する。
酵素EcoRを作用させ、挿入失活部位以外の部
位を切断して直鎖状DNAとし、次いで酵素ヌク
レアーゼＳを作用させ、両端に突出している一
本鎖部分を消去して平滑末端とする。一方、大腸
菌K12株から得られたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子を含む約9200塩基対より成るDNA断片を酵素
ヌクレアーゼBAL31によつて短縮する。この短
縮されたDNAの両端は平滑末端となつており、
このものと、前記のpBR322にEcoR及びヌクレ
アーゼＳを作用させて得られた平滑末端を有す
る直鎖状DNAとを、T4DNAリガーゼを用いて平
滑末端連結を行い、環化して混成プラスミドを得
る。この混成プラスミドを大腸菌K12株に導入
し、その菌体をアンピシリンナトリウム、塩酸テ
トラサイクリン及びトリメトプリムを含む栄養寒
天培地を用いて培養し、成長した菌体からプラス
ミドを分離し、分子の大きさについてスクリーニ
ングして約6.3キロ塩基対の大きさのプラスミド
をベクターとして得る。このプラスミドベクター
は宿主に対してTc耐性、Ap耐性及びTp耐性を
付与する。
本発明のプラスミドベクターは、これを含む宿
主細胞を容易に識別しうるマーカーを３種、すな
わちTc耐性、Ap耐性及びTp耐性のマーカーを
有し、かつ多種の制限酵素による切断部位を有し
ているため、外来性DNA断片を負荷する能力が
大きく、そのうえ分子量が小さくて不必要な遺伝
情報をもたらすことの少ない極めて優れたベクタ
ーである。
主細胞を容易に識別しうるマーカーを３種、すな
わちTc耐性、Ap耐性及びTp耐性のマーカーを
有し、かつ多種の制限酵素による切断部位を有し
ているため、外来性DNA断片を負荷する能力が
大きく、そのうえ分子量が小さくて不必要な遺伝
情報をもたらすことの少ない極めて優れたベクタ
ーである。
本発明で使用するプラスミドベクターpBR322
は市販品として入手でき、例えばBethesda
Research Laboratories，Inc、より購入できる。
また、Escherichia coli K12株は、トリメトプリ
ムに対して感受性であればどのような菌株でもよ
く、例えば（財）発酵研究所（IFO）より入手す
ることができる。
は市販品として入手でき、例えばBethesda
Research Laboratories，Inc、より購入できる。
また、Escherichia coli K12株は、トリメトプリ
ムに対して感受性であればどのような菌株でもよ
く、例えば（財）発酵研究所（IFO）より入手す
ることができる。
実施例においては、プラスミドベクター
pBR322は、Bethesda Research Laboratories，
Inc、より購入したもの、Escherichia coli K12
株は、発酵研究所より入手したもの（IFO
3301）、また、Escherichia coli K12 C600株は、
三菱化成生命科学研究所より入手したものを用い
た。
pBR322は、Bethesda Research Laboratories，
Inc、より購入したもの、Escherichia coli K12
株は、発酵研究所より入手したもの（IFO
3301）、また、Escherichia coli K12 C600株は、
三菱化成生命科学研究所より入手したものを用い
た。
次に実施例によつて本発明をさらに詳細に説明
する。
する。
なお、実施例における菌体からのプラスミドの
分離はTanaka及びWeisblumの方法（T.
Tanaka，B.Weisblum；J.Bacteriology，121，
354，（1975））に従つた。
分離はTanaka及びWeisblumの方法（T.
Tanaka，B.Weisblum；J.Bacteriology，121，
354，（1975））に従つた。
実施例
Satito及びMiuraの方法（H.Saito，K.Miura；
Biochim.Biophye.Acta，72，619（1963））に従
つて、Escherichia coli K12株から得たジヒドロ
葉酸還元酵素遺伝子を含むDNA約１μｇとプラ
スミドベクターpBR322約１μｇを、75μの反
応液（7mM Tris―HCl PH7.4，7mM MgCl2，
7mM2―メルカプトエタノール、60mM NaCl）
中で、１〜５ユニツトのBamHを用いて、37
℃、１時間消化させた。さらに65℃で５分間保つ
てBamHを失活させたのち、水中に保ち、15μ
の50mM MgCl2，15μの0.1Mジチオトレイ
トール（以下DTTと略す）、15μの
5mMATP，７μの1M Tris―HCl PH7.4，23
μの水及び１〜２ユニツトのT4DNAリガーゼ
を加え、４℃で18時間反応させることによつて
BamHで消化したDNA混合物を連結した。この
連結混合物をNorgardらの方法（M.V.Norgard，
K.Keem，J.JMonahan；Gene，３，279，
（1978））に従つてEscherichia coli K12C600株に
取り込ませた。この処理した菌体を20μｇ／ｍ
アンピシリンナトリウム及び２μｇ／ｍトリメ
トプリムを含む栄養寒天培地上にまき、生長する
菌体（Ap耐性及びTp耐性菌）を得た。この菌体
から約13.6キロ塩基対の大きさのプラスミドを分
離した。このブラスミドをプラスミドpTP（以
下pTPと略す）と呼称する。
Biochim.Biophye.Acta，72，619（1963））に従
つて、Escherichia coli K12株から得たジヒドロ
葉酸還元酵素遺伝子を含むDNA約１μｇとプラ
スミドベクターpBR322約１μｇを、75μの反
応液（7mM Tris―HCl PH7.4，7mM MgCl2，
7mM2―メルカプトエタノール、60mM NaCl）
中で、１〜５ユニツトのBamHを用いて、37
℃、１時間消化させた。さらに65℃で５分間保つ
てBamHを失活させたのち、水中に保ち、15μ
の50mM MgCl2，15μの0.1Mジチオトレイ
トール（以下DTTと略す）、15μの
5mMATP，７μの1M Tris―HCl PH7.4，23
μの水及び１〜２ユニツトのT4DNAリガーゼ
を加え、４℃で18時間反応させることによつて
BamHで消化したDNA混合物を連結した。この
連結混合物をNorgardらの方法（M.V.Norgard，
K.Keem，J.JMonahan；Gene，３，279，
（1978））に従つてEscherichia coli K12C600株に
取り込ませた。この処理した菌体を20μｇ／ｍ
アンピシリンナトリウム及び２μｇ／ｍトリメ
トプリムを含む栄養寒天培地上にまき、生長する
菌体（Ap耐性及びTp耐性菌）を得た。この菌体
から約13.6キロ塩基対の大きさのプラスミドを分
離した。このブラスミドをプラスミドpTP（以
下pTPと略す）と呼称する。
pTPの制限酵素EcoR，Hind，BamH
，Sal，Pst，BstE，Sst，Xhoによ
る切断切図を第１図に示す。
，Sal，Pst，BstE，Sst，Xhoによ
る切断切図を第１図に示す。
このpTPをEscherichia coli K12 C600株に
導入するとAp耐性及びTp耐性菌に変態するこ
と、pBR322のTc耐性遺伝子はBamHによつて
切断されること、及びpBR322は宿主にAp耐性及
びTc耐性を付与することから、pTPのTp耐性
は、pBR322のBamH切断部位へEscherichia
cori K12株から得たDNAのBamHによつて切り
とられた断片が挿入されることによつて得られた
ものであると結論される。
導入するとAp耐性及びTp耐性菌に変態するこ
と、pBR322のTc耐性遺伝子はBamHによつて
切断されること、及びpBR322は宿主にAp耐性及
びTc耐性を付与することから、pTPのTp耐性
は、pBR322のBamH切断部位へEscherichia
cori K12株から得たDNAのBamHによつて切り
とられた断片が挿入されることによつて得られた
ものであると結論される。
上記pTP約５μｇを400μの反応液（7mM
Tris―HCl PH 7.4，7mMMgCl2，7mM2―メル
カプトエタノール，60mM NaCl）中で、５〜10
ユニツトのBamHを用いて37℃１時間消化させ
たのち、８μの1M Tris―HCl PH８，４μ
の1M MgCl2，５μの1M CaCl2，８μの5M
NaCl及び１μの0.25MEDTAを加えて25℃に保
つた。この反応液に１μのヌクレアーゼ
BAL31を２ユニツト加え、５，10，15，20，
25，30分後に各50μずつとり、これに50μの
水飽和フエノールを加えて５分間かきまぜたの
ち、水層を集めた。このようにして得た水層をす
べてまとめて、50mMのTris―HCl PH 7.4に透
析した。透析されたDNA混合物は後述の処理に
用いる。
Tris―HCl PH 7.4，7mMMgCl2，7mM2―メル
カプトエタノール，60mM NaCl）中で、５〜10
ユニツトのBamHを用いて37℃１時間消化させ
たのち、８μの1M Tris―HCl PH８，４μ
の1M MgCl2，５μの1M CaCl2，８μの5M
NaCl及び１μの0.25MEDTAを加えて25℃に保
つた。この反応液に１μのヌクレアーゼ
BAL31を２ユニツト加え、５，10，15，20，
25，30分後に各50μずつとり、これに50μの
水飽和フエノールを加えて５分間かきまぜたの
ち、水層を集めた。このようにして得た水層をす
べてまとめて、50mMのTris―HCl PH 7.4に透
析した。透析されたDNA混合物は後述の処理に
用いる。
一方、pBR322約１μｇを100μの反応液
（7mM Tris―HCl PH7.4，7mM MgCl2，7mM
２―メルカプトエタノール、60mMl）中で、１
〜５ユニツトのEcoRを用いて37℃，１時間消
化させたのち、18℃に保ち、あらかじめ18℃に保
持された24mM ZnSO4及び60mM NaClを含んだ
0.2M酢酸ナトリウム緩衝液PH5.0を100μ加
え、次いで100ユニツトのヌクレアーゼＳを１
時間作用させて、EcoRの消化によつて生じた
両端の一本鎖部分を除去した。次に200μの水
飽和フエノールを加えてヌクレアーゼＳによる
消化を停止させ、さらに５分間かきまぜたのち、
遠心分離により水層とフエノール層とに分け、水
層を分取して50mMのTris―HCl PH 7.4に透析
した。このようにして得られた液40μと、前述
のpTPをBamHで消化したのち、ヌクレアー
ゼBAL31で処理して得た液50μとを混ぜ、さ
らに15μの50mM MgCl2，15μの
0.1MDTT，15μの5mM ATP，７μの1M
Tris―HCl PH7.4，８μの水及び10〜20ユニ
ツトのT4DNAリガーゼを加え、４℃で18時間反
応させて混合DNAを連結した。
（7mM Tris―HCl PH7.4，7mM MgCl2，7mM
２―メルカプトエタノール、60mMl）中で、１
〜５ユニツトのEcoRを用いて37℃，１時間消
化させたのち、18℃に保ち、あらかじめ18℃に保
持された24mM ZnSO4及び60mM NaClを含んだ
0.2M酢酸ナトリウム緩衝液PH5.0を100μ加
え、次いで100ユニツトのヌクレアーゼＳを１
時間作用させて、EcoRの消化によつて生じた
両端の一本鎖部分を除去した。次に200μの水
飽和フエノールを加えてヌクレアーゼＳによる
消化を停止させ、さらに５分間かきまぜたのち、
遠心分離により水層とフエノール層とに分け、水
層を分取して50mMのTris―HCl PH 7.4に透析
した。このようにして得られた液40μと、前述
のpTPをBamHで消化したのち、ヌクレアー
ゼBAL31で処理して得た液50μとを混ぜ、さ
らに15μの50mM MgCl2，15μの
0.1MDTT，15μの5mM ATP，７μの1M
Tris―HCl PH7.4，８μの水及び10〜20ユニ
ツトのT4DNAリガーゼを加え、４℃で18時間反
応させて混合DNAを連結した。
この連結混合物をNorgardらの方法に従つて、
Escherichia coli K12 C600株に取り込ませた。
この処理菌体を20μｇ／ｍアンピシリンナトリ
ウム、10μｇ／ｍ塩酸テトラサイクリン及び２
μｇ／ｍトリメトプリムを含む栄養寒天培地上
にまき、生長する菌体（Ap耐性、Tc耐性及び
Tp耐性菌）を数10株得た。これらの菌体からプ
ラスミドを分離したところ、13.6キロ塩基対から
6.3キロ塩基対の大きさに分布していた。このプ
ラスミドのなかから分子量の最も小さい6.3キロ
塩基対の大きさのプラスミドをベクターとして選
んだ。このものをプラスミドベクターpTP30―５
と呼称する。
Escherichia coli K12 C600株に取り込ませた。
この処理菌体を20μｇ／ｍアンピシリンナトリ
ウム、10μｇ／ｍ塩酸テトラサイクリン及び２
μｇ／ｍトリメトプリムを含む栄養寒天培地上
にまき、生長する菌体（Ap耐性、Tc耐性及び
Tp耐性菌）を数10株得た。これらの菌体からプ
ラスミドを分離したところ、13.6キロ塩基対から
6.3キロ塩基対の大きさに分布していた。このプ
ラスミドのなかから分子量の最も小さい6.3キロ
塩基対の大きさのプラスミドをベクターとして選
んだ。このものをプラスミドベクターpTP30―５
と呼称する。
pTP30―５の制限酵素EcoR，Hind，
BamH，Sal，Pst，BstEによる切断地図
を第２図に示す。
BamH，Sal，Pst，BstEによる切断地図
を第２図に示す。
このpTP30―５をEscherichia cori K12 C600
株に導入すると、アンピシリン、テトラサイクリ
ン及びトリメトプリムの３種の薬剤に対して抵抗
性に変態した。
株に導入すると、アンピシリン、テトラサイクリ
ン及びトリメトプリムの３種の薬剤に対して抵抗
性に変態した。
また、pTP30―５のEcoR切断部位に異種
DNAを挿入したプラスミドをEscherichia cori
K12 C600株に導入すると、もはやトリメトプリ
ムに対する抵抗性は失われた。
DNAを挿入したプラスミドをEscherichia cori
K12 C600株に導入すると、もはやトリメトプリ
ムに対する抵抗性は失われた。
pTP又はpTP30―５を導入したEscherichia
coli K12 C600株から得たジヒドロ葉酸還元酵素
の量は、これらプラスミドをもたない
Escherichia coli K12 C600株から得た量の約10
倍であつた。したがつて、Tp耐性はジヒドロ葉
酸還元酵素が細胞内で増産されたため、トリメト
プリムによる同酵素への阻害が解除又は緩和され
たためと考えられる。
coli K12 C600株から得たジヒドロ葉酸還元酵素
の量は、これらプラスミドをもたない
Escherichia coli K12 C600株から得た量の約10
倍であつた。したがつて、Tp耐性はジヒドロ葉
酸還元酵素が細胞内で増産されたため、トリメト
プリムによる同酵素への阻害が解除又は緩和され
たためと考えられる。
第１図はpTPの制限酵素による切断地図、第
２図はpTP30―５の制限酵素による切断地図であ
り、図中符号は制限酵素を表わし、ＥはEcoR
，H3はHind，ＢはBamH，SalはSal，
BstEはBstE，PstはPst，SstはSst及
びXhoはXhoを示す。また、数字の単位はキ
ロ塩基であり、円部の円弧はプラスミドベクター
pBR322に由来するDNAを示す。
２図はpTP30―５の制限酵素による切断地図であ
り、図中符号は制限酵素を表わし、ＥはEcoR
，H3はHind，ＢはBamH，SalはSal，
BstEはBstE，PstはPst，SstはSst及
びXhoはXhoを示す。また、数字の単位はキ
ロ塩基であり、円部の円弧はプラスミドベクター
pBR322に由来するDNAを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 分子量が約6.3キロ塩基対であり、遺伝標識
としてテトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリ
ン耐性遺伝子及びトリメトプリム耐性遺伝子を有
し、かつ下記地図に示される制限酵素開裂地図を
有するプラスミドベクターpTP30―５。 プラスミドベクターpTP30―５開裂地図 （地図中符号は制限酵素を表わし、ＥはEcoR
，ＨはHind，ＢはBamH，SalはSal，は
BstE，PstはPst，を示す。） ２ 制限酵素EcoR及びヌクレアーゼSlを作用
させたプラスミドベクターpBR322とエシエリシ
ア・コリ（Escherichia coli）K12株から得られ
たジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むDNA断片
にヌクレアーゼBAL31を働かせて得られる短縮
DNA断片とを結合して混成プラスミドを得て、
これをエシエリシア・コリ（Escherichia coli）
K12株に導入し、テトラサイクリン、アンピシリ
ン及びトリメトプリムに対して耐性を示すように
変態した菌体からプラスミドを分離することを特
徴とするテトラサイクリン、アンピシリン及びト
リメトプリム耐性遺伝子を有するプラスミドベク
ターの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56143520A JPS5846100A (ja) | 1981-09-11 | 1981-09-11 | ３種の遺伝標識を有するプラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56143520A JPS5846100A (ja) | 1981-09-11 | 1981-09-11 | ３種の遺伝標識を有するプラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5846100A JPS5846100A (ja) | 1983-03-17 |
| JPS6135831B2 true JPS6135831B2 (ja) | 1986-08-15 |
Family
ID=15340644
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56143520A Granted JPS5846100A (ja) | 1981-09-11 | 1981-09-11 | ３種の遺伝標識を有するプラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5846100A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59198979A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-10 | Agency Of Ind Science & Technol | 特定プラスミドを含む宿主菌体の安定化 |
| DE3624453A1 (de) * | 1986-07-19 | 1988-01-28 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung von humanem antithrombin iii (atiii), dafuer geeignete vektoren und wirtszellen, so erhaltenes, biologisch aktives atiii und dieses enthaltende arzneimittel |
-
1981
- 1981-09-11 JP JP56143520A patent/JPS5846100A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5846100A (ja) | 1983-03-17 |
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